Protocol
Alle forsøkene ble utført i samsvar med Stanford University menneske fagenes retningslinjer og godkjent Institutional Review Board protokollen.
1. Ledd chondrocyttransplantasjon Isolation
- Skaff brusk fra vev forkastet under total kne protesekirurgi og dissekere som tidligere beskrevet åtte.
- Visuelt velge de mediale og laterale femurkondyler av brusk prøver for jevne overflater og gjøre innsnitt på overflaten av brusken gjennom en skalpell for å fjerne 4-5 mm brusk biopsier uten å påvirke den subkondrale ben.
- Isolere kondrocytter fra den ekstracellulære matriks ved enzymatisk dissosiering av vevet med O / N behandling med renset collagenase. Bruke 1: 1 forhold av Kollagenase II (125 U / ml) og IV collagenase (160 U / ml) i kondrocytt vekstmedier ved 37 ° C.
- Dagen etter, filtrere fordøyd vev som inneholder de dissosierte cellene gjennom en 70mm porestørrelsen Nylon mesh. Vask to ganger med 20 ml DMEM / F12 og sentrifuger ved 600 xg i 5 minutter.
- Plate de isolerte kondrocytter med en tetthet på 1 x 10 6 celler / 60 mm dyrkningsskål følgende re-suspensjon i DMEM / F12 supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 25 ug / ml askorbat, 2 mM L-glutamin, antibiotika (100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, og 0,25 ug / ml Fungizone). Hold platene ved 37 ° C og opprettholder den primære kondrocytt kulturer som en høy tetthet monolaget før innkapsling i biomimetic hydrogeler.
2. Biomimetic Hydrogel Fabrication
NB: Denne metoden muliggjør syntesen av en biomimetisk hydrogel inneholdende poly (etylenglykol-diakrylat) (PEGDA, MW 5000 g / mol), chondroitin-sulfat-metakrylat (CS-MA) i DPBS. Tilsetningen av fotoinitiator muliggjør photoactivated tverrbinding. Den endelige hydrogel komposisjon inneholder 7% veiet / volum (w / v) av PEGDA, 3% vekt / volum av CS-MA, og 0,05% vekt / volum av fotoinitiator.
- Syntetisere CS-MA ved funksjon CS polymer med metakrylatgrupper.
- Forbered bufret oppløsning av 50 mM 2-morpholinoethanesulfonic syre (MES) og 0,5 M natriumklorid (NaCl) ved oppløsning av 1,952 g av MES og 5,84 g NaCl i 200 ml avionisert vann (DIH 2 O). Oppløs 5 g av chondroitinsulfat natriumsalt i bufret oppløsning.
- Legg 0,532 g (4,62 mmol) N-hydroksysuksinimid (NHS) og 1,771 g (9,24 mmol) 1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) -karbodiimid-hydroklorid (EDC) (molforhold av NHS: EDC = 1: 2) for å løsningen og omrør i 5 min.
- Legg 0,765 g (4,62 mmol) 2-aminoetyl-metakrylat (AEMA) (molforhold av NHS: EDC: AEMA = 1: 2: 1) til løsningen og hold reaksjonen ved RT i 24 timer.
- Rens blandingen ved dialyse mot deionisert vann (DIH 2 O) i 4 dager ved bruk av dialyserør (12-14 kDa MWCO).
- Filtrere purified løsningen gjennom et 0,22 um filter og plassere de åpne rør inneholdende oppløsningen i eksikator og vakuum O / N. Sørg for at alle rør er beskyttet mot lys. Lagre den oppløste polymer ved -20 ° C beskyttet mot lys og fuktighet.
3. Cell Innkapsling
- Autoklavere PCR film og sylindriske staver (for punching ut celle-laden 3D hydrogelene) og sterilisere den skreddersydde sylindrisk gel mold ved neddykking i 0,2 mikrometer filtrert 70% etanol i vevskultur panseret under UV-lys.
- Forsegle bunnen av gelen formen med autoklavert PCR film uten bobler eller hull for å hindre lekkasjer. Oppbevar den på et sterilt 150 mm plate.
- Dagen før celle innkapsling i biomimetisk hydrogel, distansere high-density kondrocytt enkeltlag med O / N behandling i Kollagenase II og Kollagenase IV løsning. Bruk 125 U / ml for Kollagenase II og 160 U / ml for Kollagenase VI hver i chondrocyttransplantasjon vekstmedierved 37 ° C.
- Ta et 50 ml rør og tilsett 5% vekt / volum (w / v) poly (etylenglykol-diakrylat) (PEGDA, molekylvekt = 5000 g / mol), 3% w / v chondroitinsulfat-metakrylat (CS-MA), og 0,05% w / v fotoinitiator i DPBS. Vortex røret for å blande løsningen og holde den til side. Beskytt røret mot lys.
- Samle de dissosierte cellene i et 50 ml Falcon rør, telle og sentrifuger ved 460 xg i 5 minutter. Aspirer all media fra cellene rør og tilsett ovenfor blandet gel materiale for å re-suspen celler med en tetthet på 15 × 10 6 celler / ml. Bland det 30 ganger grundig og samtidig unngå luftbobler formasjon.
- Pipetter 72 mL av celle-hydrogel suspensjon eller hydrogel alene inn i skreddersydde sylindrisk gel mold og indusere gelering gjennom eksponering for UV-lys (365 nm bølgelengde) på 3 mW / m 2 for 5 min. Forberede noen hydrogel løsning uten celleinnhold. Bruk disse konstruksjonene som negative kontroller for fremtiden biokjemisk og mekanisk testing. Målere intensiteten av UV-lys med en UV-intensitet meter. For å justere intensitet, endre avstanden mellom UV-lyskilden og hydrogel stillaset under gelering.
MERK: Siden hydrogel inneholder CS er acellulær bidraget trekkes fra den biokjemiske GAG innhold av celle-laden hydrogeler å representere kun mobil GAG. - Bruk en skalpell til å kutte filmen for lett løsner og forsiktig fjerne den. Ved hjelp av de sylindriske stenger, presse ut gelen inn i en 6-brønners plate med 5 ml sterilt DPBS for å vaske av upolymerisert gel og løse celler.
- Kultur celle-laden hydrogelene i 24 brønners plater som inneholder 1,5 ml chondrocyttransplantasjon vekstmedier i hver brønn. Bruk en engangs spatel for å overføre den vaskede hydrogel inn i brønnen.
- Vurdere celleviabilitet av levende døde flekker 24 timer etter innkapsling ved hjelp av en levedyktighet / cytotoxity kit. Kultur celle-laden hydrogelene og de tomme hydrogelene for 3-6 uker skiftende å friske chondrocyttransplantasjon growth media hver 2 dager før høsting for analyser.
4. RNA Utvinning og genuttrykk Analyser
- Aspirer nøye media og sette steril PBS 1X på celle-laden samt de tomme kontroll hydrogelene.
- Ved hjelp av en steril spatel, overfør hver hydrogel til et rent 1,5 ml eppendorf-rør og tilsett 250 ul av Tri-reagens til hvert rør. Følg produsentens instruksjoner for å isolere RNA.
- Etter RNA isolering og kvantifisering bruk en mikrogram av det fra hver prøve og utføre en omvendt transkripsjon til cDNA ved hjelp av High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit.
- For kvantitativ PCR bruke TAQMAN Gene Expression Arrays for undersøkelse av uttrykket av gener av interesse. Normalisere genuttrykk nivåer internt til GAPDH.
- For PCR-betingelsene omfatter en 2 minutters inkubering ved 50 ° C for å inaktivere tidligere amplikoner med uracil-DNA-glykosylase, etterfulgt av en 1060; minutters inkubering ved 95 ° C for å aktivere Taq polymerase. Deretter utfører førti sykluser med PCR, bestående av 15 sekunder ved 95 ° C, og 1 min ved 60 ° C.
5. Biokjemiske analyser
- For hver celle-hydrogel konstruksjoner kvantifisere DNA og sulfatert glykosaminoglykan (sGAG) produksjon som følger.
- Aspirer nøye media og sette steril PBS 1X på celle-laden samt de tomme kontroll hydrogelene. Veie et tomt rør og sette hydrogel inne etter blotting det på silkepapir og registrere vekten eller våtvekt av hydrogeler.
- Fryse hver hydrogel ved -20 ° C i et separat 1,5 ml Eppendorf-rør for enzymatisk spaltning, og senere benytte en alikvot av spaltet produkt til å kjøre Picogreen analyse (for DNA) og dimetyl-metylen blått analyse (for GAG).
- Forbered papainase løsning for enzymatisk fordøyelse av hydrogelene.
- Først fremstille PBE buffer ved å veie ut 7,1 g Natrium phosphate dibasisk (Na 2 HPO 4) og 1,6 g etylendiamintetraeddiksyre dinatriumsalt (EDTA-Na 2). Oppløses i 500 ml dH 2 O, justere pH til 6,5, og filtrere den rensede løsningen gjennom et 0,22 mm filter.
- Løs opp 0,035 g av L-cystein i 20 ml PBE buffer. Filtrer løsningen og 100 ul steril enzym papain.
- Når den er klar til å utføre analysene, ta rørene fra -20 ° C og tilsett 300 ul av papain klar løsning på de frosne hydrogeler. Knus gel med en morter og støter og blande den godt med motoren pistill.
- Bringe volumet til 500 ml med ekstra papain løsning. Utfør den samme prosedyren for kontroll gels. Inkuber ved 60 ° C i 16 timer 3,9. Oppløsningen som inneholdt det spaltede hydrogel kan derfor anvendes for DNA og GAG kvantifisering. Mål DNA innhold ved hjelp av Picogreen analysen med Lambda fag-DNA som standard følger produsentens protocol.
- Kvantifisere sulfatert-GAG innhold ved hjelp av 1,9-dimethylmethylene blå (DMMB) dye-bindingsassay med hai chondroitin sulfate som standard 10. Bestem GAG innholdet ved å dividere mengden av GAG for tilsvarende våtvekt.
6. Mekanisk Testing
- Utfør ubegrensede kompresjonstester ved hjelp av en Instron 5944 testsystem utstyrt med en 10 N last celle.
- Etter at de ønskede dager in vitro kultur, utføre kompresjonstest på celle-hydrogel stillaset og acellulære kontroll hydrogeler.
- Senk prøvestykkene i en PBS-bad ved romtemperatur, og komprimere med en hastighet på 1% belastning / sek til en maksimal belastning på 15% 11,12 ettersom den fysiologiske belastningen for bruskvev under belastning tilstand har blitt rapportert å være 10-20% 13,14.
- Skape stress vs. belastningskurver og kurve ved hjelp av en tredje ordens ligning. Bestem compressiv tangent modulus fra kurvetilpasningen ligningen ved strekk verdier på 15%.
Representative Results
Bioaktive hydrogelene inneholder PEG og CS-grupper (figur 1) representerer en ideell plattform for kultur og modning av menneske artikulære chondrocytes 2,3,5,7. Kondrocytter fra forskjellige aldre og sykdomstilstander kan dyrkes med den beskrevne fremgangsmåte og analysert for deres fenotype, genekspresjon og biokjemiske og mekaniske egenskaper av bruskvevet generert. Tre chondrocyttransplantasjon prøver, juvenile- 6 måneder, voksen- 34 år og osteoarthritic- 74 år, ble høstet etter 3 uker med kultur i 3D biomimetic hydrogelene. Genekspresjon analyser av normale kondrocytter, både juvenile og voksne, viste en økning i ekspresjon av gener kondrocytt Col2a1 og Col6a1. Tvert imot, syke kondrocytter viste en dramatisk reduksjon i Col2a1 samtidig opprettholde ekspresjon av Col6a1 (figur 2) viser et underskudd på chondrogenic fenotypen til tross for at dyrkes i et gunstig miljø biomimetisk.
CS-PEG hydrogeler også tjene som et dynamisk miljø for chondrocytes å spre seg, fordøye den pre-eksisterende matrise av PEG og CS og sette deres pericellulær og ekstracellulære matrise, de viktigste komponentene i den modne bruskvev. Gitt disse evner, kondrocytt utvidelse etter 3 uker med in vitro-kultur kan anslås ved kvantifisering av DNA med Picogreen fargestoff. Komparativ analyse av de tre grupper av celler viser at celletettheten av unge og voksne befolkningen var uendret, mens OA chondrocytes viste en dramatisk nedgang i forhold til dag 1 av kultur. Et tap av DNA-innholdet ble også observert for OA, men ikke andre kondrocytter som indikerer mulig celledød under langtidskultur (figur 3). Den utskilte matrise ble kvantifisert som sulfatert-GAG-innhold ved DMMB fargestoff-bindingsanalysen ved endepunktet trinnet etter 3 ukers kultur. GAG innhold er normalisert ved den våte vekten av den hydrogel som registded før enzymatisk fordøyelse og acellular bidraget trekkes. Som vist i figur 4, kondrocytter avsatt et tilsvarende betydelig mengde GAG løpet av 3 uker med kultur i 3D hydrogeler.
Tilstedeværelsen av en fysisk stillas tillater evaluering av biomekaniske egenskaper av prøvene gjennom uinnspent trykkprøver 2,3. Mens acellulære hydrogeler gjennomgår en reduksjon i kompresjonsmodulene, celle-laden konstruksjoner holdes kompresjonsmoduler etter 3 uker i kultur (figur 4). Den fenotypiske, biokjemiske og biomekaniske analyser som er beskrevet her er derfor nyttig for å vurdere og forstå potensialet i ulike kondrocytt populasjoner for ingeniør brusk.
Figur 1. PEG-CS biomimetic hydrogeler for 3D chondrocyttransplantasjon Culture. Chondrocytter resuspenderes i en blanding som inneholder Poly (etylenglykol diacrylate) (PEGDA) og chondroitin sulfate-metakrylat (CS-MA) og støpt inn i skreddersydde sylindrisk gel mold. Etter UV eksponering, trygget gels er hentet fra formene og celle levedyktighet vurderes av levende døde flekker 24 timer etter innkapsling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Expression of chondrogenic gener i menneske chondrocytes dyrket i 3D biomimetic hydrogelene. Kvantitativ genuttrykk av brusk markører Col2a1 og Col6a1 av juvenile, voksne og OA chondrocytes etter 3 uker med kultur i 3D biomimetic hydrogelene. Verdiene er normalisert til genuttrykk nivå på dag 1. Feil bars representerer gjennomsnitt ± SD. * p <0,05 som bestemt ved en to-halet Student t-test. Modifisert fra Smeriglio et al. 2 Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. DNA-innhold i menneskelig chondrocytes dyrket i 3D biomimetic hydrogelene. DNA kvantifisering av Picogreen assay hos unge, voksne og OA chondrocytes etter 3 uker med kultur i 3D biomimetic hydrogelene. Verdiene er normalisert til DNA nivå på dag 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
<br /> Figur 4. GAG innhold måling og unconfined kompresjonstest av menneskelige chondrocytes på dag 1, og etter 3 uker med kultur i 3D biomimetic hydrogelene. (A) GAG kvantifisering av DMMB analysen i chondrocytter på dag 1, og etter 3 uker med kultur i 3D biomimetic hydrogeler. Verdier er normalisert til våt vekt (ww) og uttrykt som mg / g. (B) Trykk modulus (kPa) av acellulære og celle-laden hydrogelene på dag 1, og etter 3 uker med kultur i 3D biomimetic hydrogelene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Som rapportert i denne protokollen, 3D hydrogeler er i stand til å opprettholde kondrocytt fenotype i kultur, unngår den type av celle dedifferentiation inn Fibrocartilage celler vanligvis påtreffes med monolagskulturer 15. Videre langsiktige kulturer i chondrocytes- hydrogel konstruere avdekket en gunstig miljø som holder den indre cellefunksjoner knyttet til alder og sykdom.
Bruken av en 3D-biomimetisk hydrogel har flere fordeler. Først, inkludering av chondroitin-sulfat (CS), en hovedkomponent som finnes i leddbrusk, aktiverer cellene til å degradere hydrogelmatriks ved å skille kondroitinase og legge ned nysyntetiserte brusk ekstracellulære matriks 5, 16. I tillegg har CS vist å ha anti-inflammatorisk egenskaper i leddgikt felles. Den biomimetisk hydrogel kan også brukes som en stillasmateriell for celle levering i bruskreparasjon, og kan være kjemisk modifisertå legge til rette for bedre vev-biomateriale integrering 17,18.
Bruken av PEG-CS hydrogeler muliggjør langtidskulturer av kondrocytter og evaluering av biokjemiske og mekaniske egenskaper. Her viser vi hvordan denne plattformen kan være nyttig for de komparative analyser av ulike kilder til differensierte chondrocytes for å definere optimal celletype for brusk engineering. Interessant, kondrocytter innkapslet i hydrogeler forblir levedyktige og proliferere i henhold til deres iboende egenskaper. Hydrogelmaterialet bærere, faktisk, veksten av friske unge og voksne kondrocytter som vist i figur 2. Sammensetningen og strukturen av de beskrevne hydrogeler også fremmer bruskvev dannelse som angitt ved avsetning av en funksjonell ekstracellulær matriks bedømt ved glykosaminoglykan (GAG ) kvantifisering.
En ekstra fordel er at kondrocytt-hydrogel konstruksjonerkan evalueres for de mekaniske egenskaper for det nydannede bruskvev. Merk at unconfined kompresjonstest bør utføres på acellulær hydrogel for sammenligning. De hydrogeler, faktisk har en iboende stivhet på grunn av stivheten til CS grupper. Unconfined komprimering stamme av 5-20% (til en tøyning 1% / s) kan brukes for mekanisk testing av bruskvev 11,12 siden den fysiologiske belastningen oppleves av brusk vevet under lasting tilstand har blitt rapportert å være 10-20 % 13,14. Responsen fra både celle-laden og acellulære hydrogelene til mekanisk testing ble evaluert på kultur endepunktet. I det beskrevne eksempel ovenfor, observerte vi en tilsvarende stivhet i de konstruksjoner som inneholder voksne og unge kondrocytter i motsetning til den mindre stivhet av konstruksjonene som inneholder OA kondrocytter. Slike mekaniske egenskapene til celle hydrogel-konstruksjon tillater vurdering av de funksjonelle egenskaper avdannet vev som gir en grundig analyse av cellemodning evne.
Som konklusjon kan bruken av 3D biomimetic hydrogeler å undersøke potensialet til forskjellige kondrocytt befolkning for å generere bruskvev bli mye brukt. Foruten de in vitro studier er beskrevet her, kan in vivo transplantasjon av celle-laden konstruksjoner tenkes å studere cellemodning og regenererende potensial i fysiologisk sammenheng. Ytterligere modifikasjoner av den hydrogel-plattform med flere biomimetic faktorer kan også tenkes å optimalisere kondrocytt proliferasjon og modning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| juvenile chondrocytes (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System ) | Lonza | CC-2550 | |
| adult chondrocytes (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System) | Lonza | CC-2550 | |
| poly(ethylene glycol diacrylate) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-1000-1g | |
| 2-morpholinoethanesulfonic acid | Sigma | M5287 | |
| photoinitiator | Irgacure | 2959 | |
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| chondroitin sulfate sodium salt | Sigma | C9819 | |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma | 130672 | |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride | Sigma | E1769 | |
| 2-aminoethyl methacrylate | Sigma | 516155 | |
| dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132700 | |
| Collagenase 2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
| Collagenase 4 | Worthington Biochemical | LS004189 | |
| DMEM/F12 media | HyClone, Thermo Scientific | SH3002301 | |
| live/dead assay | Life Technologies | L3224 | |
| Tri reagent | Life Technologies | AM9738 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P11496 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S3264 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt | Sigma | E5134 | |
| L-Cysteine | Sigma | C1276 | |
| 1,9-dimethylmethylene blue | Sigma | 341088 | |
| Instruments | |||
| UV light equipment - XX-15LW Bench Lamp, 365 nm | UVP | 95-0042-07 | |
| Instron 5944 testing system | Instron Corporation | E5940 |
References
- Roberts, S., Menage, J., Sandell, L. J., Evans, E. H., Richardson, J. B. Immunohistochemical study of collagen types I and II and procollagen IIA in human cartilage repair tissue following autologous chondrocyte implantation. Knee. 16, 398-404 (2009).
- Smeriglio, P., et al. Comparative Potential of Juvenile and Adult Human Articular Chondrocytes for Cartilage Tissue Formation in Three-Dimensional Biomimetic Hydrogels. Tissue engineering. Part A. , (2014).
- Lai, J. H., Kajiyama, G., Smith, R. L., Maloney, W., Yang, F. Stem cells catalyze cartilage formation by neonatal articular chondrocytes in 3D biomimetic hydrogels. Scientific reports. 3, 3553 (2013).
- Taipale, J., Keski-Oja, J. Growth factors in the extracellular matrix. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 11, 51-59 (1997).
- Varghese, S., et al. Chondroitin sulfate based niches for chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Matrix Biol. 27, 12-21 (2008).
- Park, J. S., et al. The effect of matrix stiffness on the differentiation of mesenchymal stem cells in response to TGF-beta. Biomaterials. 32, 3921-3930 (2011).
- Wang, T., Lai, J. H., Han, L. H., Tong, X., Yang, F. Chondrogenic Differentiation of Adipose-Derived Stromal Cells in Combinatorial Hydrogels Containing Cartilage Matrix Proteins with Decoupled Mechanical Stiffness. Tissue engineering. Part A. , (2014).
- Smith, R. L., et al. Effects of intermittent hydrostatic pressure and BMP-2 on osteoarthritic human chondrocyte metabolism in vitro. J Orthop Res. 29, 361-368 (2011).
- Buschmann, M. D., Gluzband, Y. A., Grodzinsky, A. J., Kimura, J. H., Hunziker, E. B. Chondrocytes in agarose culture synthesize a mechanically functional extracellular matrix. J Orthop Res. 10, 745-758 (1992).
- Farndale, R. W., Buttle, D. J., Barrett, A. J. Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue. Biochim Biophys Acta. 883, 173-177 (1986).
- Lai, J. H., Levenston, M. E. Meniscus and cartilage exhibit distinct intra-tissue strain distributions under unconfined compression. Osteoarthritis and cartilage / OARS, Osteoarthritis Research Society. 18, 1291-1299 (2010).
- Li, L. P., Buschmann, M. D., Shirazi-Adl, A. Strain-rate dependent stiffness of articular cartilage in unconfined compression. Journal of biomechanical engineering. 125, 161-168 (2003).
- Armstrong, C. G., Bahrani, A. S., Gardner, D. L. In vitro measurement of articular cartilage deformations in the intact human hip joint under load. The Journal of bone and joint surgery. American. 61, 744-755 (1979).
- Macirowski, T., Tepic, S., Mann, R. W. Cartilage stresses in the human hip joint. Journal of biomechanical engineering. 116, 10-18 (1994).
- Benya, P. D., Shaffer, J. D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels. Cell. 30, 215-224 (1982).
- Buckwalter, J. A., Mankin, H. J. Articular cartilage: tissue design and chondrocyte-matrix interactions. Instructional course lectures. 47, 477-486 (1998).
- Wang, D. A., et al. Multifunctional chondroitin sulphate for cartilage tissue-biomaterial integration. Nat Mater. 6, 385-392 (2007).
- Simson, J. A., Strehin, I. A., Allen, B. W., Elisseeff, J. H. Bonding and fusion of meniscus fibrocartilage using a novel chondroitin sulfate bone marrow tissue adhesive. Tissue engineering. Part A. 19, 1843-1851 (2013).
