Protocol
すべての実験は、スタンフォード大学の人間の被験者のガイドラインに沿って行われ、治験審査委員会のプロトコルを承認しました。
1.関節軟骨細胞の単離
- 人工膝関節全置換術の際に廃棄された組織から軟骨を取得し、以前に説明したように8解剖。
- 視覚滑らかな表面のための軟骨サンプルの内側または外側大腿骨顆を選択して、軟骨下骨に影響を与えることなく、4〜5ミリメートルの軟骨生検を除去するためにメスを介して軟骨の表面に切り込みを入れます。
- 精製されたコラゲナーゼでO / N処理と組織の酵素解離によって細胞外マトリックスから軟骨細胞を分離します。 37℃での軟骨細胞の増殖培地にコラゲナーゼII（125 U / ml）およびコラゲナーゼIV（160 U / ml）を1：1の比を使用してください。
- 翌日、70を介して分離した細胞を含む消化された組織をフィルタリングミリメートル孔径ナイロンメッシュ。 5分間600×gでDMEM / F12と遠心の20mlで2回洗浄します。
- プレート10％ウシ胎児血清（FBS）、25 / mlのアスコルビン酸、2mM L-グルタミン、抗菌剤を補充したDMEM / F12中に再懸濁以下、1×10 6細胞 / 60mm培養ディッシュの密度で単離された軟骨細胞（100 U / mlペニシリン、100μg/ mlのストレプトマイシン、および0.25 / mlのファンギゾン）。プレートを37℃で維持し、生体模倣ヒドロゲルでカプセル化の前に、高密度の単層としての一次軟骨細胞培養を維持します。
2.バイオミメティックハイドロゲルの作製
注：この方法は、DPBS中で、ポリ（エチレングリコールジアクリレート）（PEGDA、MW 5,000グラム/モル）、コンドロイチン硫酸 - メタクリレート（CS-MA）を含有する生体模倣ヒドロゲルの合成を可能にします。光開始剤の添加は、光活性化架橋を可能にします。最終のヒドロゲル組成物は、7％の重さが含まれW / V CS-MAの3％、および重量/体積の光開始剤の0.05％、PEGDAの（w / v）のT /体積。
- メタクリレート基でCSポリマーを官能することにより、CS-MAを合成します。
- MESの1.952グラムおよび脱イオン水200ml中のNaClの5.84グラム（DIH 2 O）を溶解させて緩衝50mMの2-モルホリノエタンスルホン酸（MES）の溶液及び0.5 M塩化ナトリウム（食塩）を準備します。緩衝液中のコンドロイチン硫酸ナトリウム塩を5g溶解します。
- （：EDC = 1：2 NHSのモル比）を0.532グラム（4.62ミリモル）のN-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）および1.771グラム（9.24ミリモル）の1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル） - カルボジイミド塩酸塩（EDC）を加えます5分間溶液と、撹拌。
- 溶液を24時間、室温で反応を維持する（2：1：EDC：NHS AEMA = 1のモル比）0.765グラム（4.62ミリモル）の2-アミノエチルメタクリレート（AEMA）を加えます。
- 透析チューブ（12-14 kDaのMWCO）を使用して、4日間脱イオン水（DIH 2 O）に対する透析により混合物を精製します。
- Pをフィルタリング0.22μmのフィルターを通してurified解決し、デシケーター、真空O / Nでの溶液を含むオープンチューブを配置します。すべてのチューブは、光から保護されていることを確認します。光と湿気から保護-20℃で溶解したポリマーを保管してください。
3.細胞のカプセル化
- （セルを含んだ3Dハイドロゲルを打ち抜くための）PCRフィルムと円筒形ロッドをオートクレーブUV光の下で組織培養フードで0.2μmのフィルタ処理70％エタノールに浸漬して、カスタムメイドの円筒状のゲル型を滅菌します。
- 漏れを防止するために、気泡や隙間なくオートクレーブPCR膜とゲル型の底部を密封します。無菌の150mmプレートに保管してください。
- 前生体模倣ヒドロゲル中の細胞カプセル化する日は、コラゲナーゼIIおよびコラゲナーゼIV溶液中のO / N処理と高密度軟骨細胞単層を解離します。軟骨細胞の増殖培地に各コラゲナーゼIIおよびコラゲナーゼVI mlの160 U / 125 U / mlで使用37℃。
- 50 mlチューブに取り、5％重量/容積、ポリ（エチレングリコールジアクリレート）（PEGDA、MW = 5,000グラム/モル）（w / v）の3％重量/体積コンドロイチン硫酸 - メタクリレート（CS-MA）を追加し、そしてDPBS中のV光開始剤/ wの0.05％。溶液を混合し、それを脇に保つためにボルテックスチューブ。光からチューブを保護します。
- 50mlのファルコンチューブに解離した細胞を回収し、5分間460×gでカウントし、遠心します。吸引物は、すべてのセルチューブからメディア及び15×10 6細胞/ mlの密度で細胞を再懸濁するために上記混合ゲル材料を追加します。気泡の形成を回避しながら、徹底的に30回にそれを混ぜます。
- ピペット72カスタムメイドの円筒状のゲル型に細胞ヒドロゲル懸濁液又は単独のヒドロゲルのμL、5分間3ミリワット/ m 2のUV光（波長365nm）への暴露によりゲル化を誘導します。無細胞内容のいくつかのヒドロゲル溶液を準備します。将来の生化学的および機械的試験のための陰性対照として、これらの構築物を使用してください。 Measu紫外線強度計でUV光の強度を再。強度を調整するには、UV光源とゲル中のヒドロゲル足場の間の距離を変更します。
注：ヒドロゲルは、CSが含まれているため、無細胞の寄与は細胞のGAGのみを表現するために、細胞を含んだヒドロゲルの生化学GAG含有量から差し引かれます。 - オフイージーピール用のフィルムをカットするメスを使用して、慎重に取り外し。円筒状の棒の助けを借りて、未重合ゲルとゆるい細胞を洗い流し、無菌DPBS 5mlで6ウェルプレートにゲルを押し出します。
- 培養物を各ウェルに軟骨細胞増殖培地1.5 mlを含有する24ウェルプレート中の細胞を含んだハイドロゲル。ウェルに洗浄ヒドロゲルを転送するために使い捨てへらを使用してください。
- 生存性/細胞毒性キットを使ってライブ死んで染色後24時間カプセル化することによって、細胞の生存率を評価します。文化新鮮な軟骨細胞GROへの変更3-6週間のセルを含んだヒドロゲルおよび空のヒドロゲル2日ごとに解析のために回収する前にメディアWTH。
4. RNA抽出および遺伝子発現解析
- 慎重にメディアを吸引し、細胞を含んだだけでなく、空の制御ヒドロゲルに滅菌PBS 1Xを置きます。
- 無菌のへらの助けを借りて、きれいな1.5mlのエッペンドルフチューブに各ヒドロゲルを転送し、各チューブにトライ試薬の250μlを添加します。 RNAを単離するために、メーカーの指示に従ってください。
- 各サンプルからのRNAの単離および定量化の使用後は、それを1μgと高容量cDNAを逆転写キットを用いてcDNAに逆転写を行います。
- 定量的PCRのために興味のある遺伝子の発現の検査のためのTaqMan遺伝子発現アレイを使用しています。 GAPDHの内部遺伝子発現レベルを正規化します。
- PCR条件のために10に続くウラシルDNAグリコシラーゼを用いた以前のアンプリコンを、不活性化するために50℃で2分間のインキュベーションを含みます60; 95℃でのインキュベーションminのTaqポリメラーゼを活性化します。その後、95℃で15秒間からなる40サイクルのPCRを行い、60℃で1分間。
5.生化学分析
- 各セルヒドロゲルの構築のためのDNAと以下のように硫酸化グリコサミノグリカン（sGAG）の生産を定量化します。
- 慎重にメディアを吸引し、細胞を含んだだけでなく、空の制御ヒドロゲルに滅菌PBS 1Xを置きます。空のチューブを計量し、ティッシュペーパーの上にブロッティングした後、内部にヒドロゲルを入れて、ヒドロゲルの重量または湿重量を記録します。
- 酵素消化のために別々の1.5mlのエッペンドルフチューブ中で-20℃で各ハイドロゲルを凍結し、後で（GAG用）（DNA用）ピコグリーンアッセイおよびジメチルメチレンブルーアッセイを実行するために、消化産物の一部を使用しています。
- ヒドロゲルの酵素消化のためpapainase溶液を調製します。
- まずナトリウムphosphatの7.1グラムを計量することによりPBEバッファを用意Eの二塩基性（ の Na 2 HPO 4）、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩（EDTA-2ナトリウム）を1.6g。 、のdH 2 O 500mlに溶解し、pHを6.5に調整し、0.22 mmのフィルターを介して精製した溶液を濾過します。
- PBEバッファー20ml中のL-システインの0.035グラムを溶解します。溶液および滅菌パパイン酵素を100μlをフィルタリングします。
- 準備ができてアッセイを実施する場合には、-20°Cからチューブを取り、凍結されたヒドロゲルに準備パパイン溶液を300μlを添加します。乳鉢と乳棒を用いてゲルを粉砕し、モータ乳棒でよく混ぜます。
- 追加のパパイン溶液で500μlにボリュームを持参してください。対照ゲルと同じ手順を実行します。 16時間3,9、60℃でインキュベートします。消化されたヒドロゲルを含む溶液は、従って、DNAおよびGAGの定量のために使用することができます。標準以下の製造業者のPRとしてラムダファージDNAとのピコグリーンアッセイを用いてDNA含量を測定otocol。
- 1,9-ジメチルメチレンブルー（DMMB）標準10としてサメのコンドロイチン硫酸と色素結合アッセイを使用して硫酸化GAG含有量を定量化します。対応湿重量のために、GAGの量を分割することにより、GAGの内容を決定します。
6.機械的試験
- 10 Nロードセルを取り付けたインストロン5944試験システムを用いて、一軸圧縮試験を行います。
- インビトロ培養の希望日後、細胞ヒドロゲル足場および無細胞制御ハイドロゲルの圧縮試験を行います。
- RTでPBS浴中で標本を水没し、負荷条件の下で軟骨組織が 経験する生理学的な歪みは10〜20％であると報告されているので、15％の最大ひずみ11,12に1％のひずみ/秒の速度で圧縮します13,14。
- 三次多項式を用いたひずみ曲線と曲線フィット対ストレスを作成します。 COMPRを決定15％の歪み値でカーブフィット式から能格接線係数。
Representative Results
PEGおよびCS部分を含有する生理活性ヒドロゲル（ 図1）は、ヒト関節軟骨細胞2,3,5,7の文化と成熟のための理想的なプラットフォームを表します。異なる年齢および疾患状態の軟骨細胞は記載された方法を用いて培養し、それらの表現型、遺伝子発現、生成、軟骨組織の生化学的および機械的特性のために分析することができます。三軟骨細胞サンプル、若年6ヶ月、adult- 34年と74年osteoarthritic-は、3Dバイオミメティックハイドロゲルで培養3週間後に回収しました。遺伝子発現は、正常な軟骨細胞の分析、若年および成人の両方が、軟骨細胞遺伝子COL2A1およびCOL6A1の発現の増加を示しました。 COL6A1（ 図2）の発現を維持し、良好なバイオミメティック環境で培養されているにもかかわらず、軟骨形成表現型の損失を示しながら逆に、病気の軟骨細胞は、COL2A1の劇的な減少を示しました。
CS-PEGヒドロゲルはまた、軟骨細胞、増殖PEGおよびCSの既存のマトリックスを消化し、その細胞周囲および細胞外マトリックスを堆積させる、成熟した軟骨組織の主要な構成要素のための動的な環境として働きます。これらの能力を考えると、 インビトロ培養の3週間後の軟骨細胞の拡大は、ピコグリーン色素とDNAを定量することによって推定することができます。細胞の三つのグループの比較分析は、OA軟骨細胞は、培養の1日目に比べて劇的な減少を示しながら、少年と成人の集団の細胞密度が変化しなかったことを示しています。 DNA含量の損失はまた、長期培養（ 図3）の間の可能な細胞死を示唆している他のOA軟骨細胞のためではなく、観察されました。分泌されたマトリックスは、培養の3週間後に終点段階でDMMB色素結合アッセイにより硫酸化GAG含有量として定量化しました。 GAG含量はrecorとしてヒドロゲルの湿重量によって正規化されますDED酵素消化および無細胞の貢献の前に減算されます。 図4に示すように、軟骨は、3Dヒドロゲルにおける培養の3週間GAGの同様の有意な量の堆積します。
物理的な足場の存在は、一軸圧縮試験の2,3を通じてサンプルの生体力学的特性を評価することができます。無細胞ヒドロゲルは、圧縮弾性率の低下を受けている間、細胞を含んだ構築物は、培養3週間後（ 図4）の後に、圧縮弾性率を維持しました。表現型は、ここで説明する生化学的および生体力学的分析は、エンジニアリング軟骨のための異なった軟骨細胞集団の可能性を評価し、理解するのに有用です。
図3Dの軟骨細胞CUL 1. PEG-CS生体模倣ヒドロゲルチャー。軟骨細胞は、ポリ（エチレングリコールジアクリレート）（PEGDA）およびコンドロイチン硫酸-メタクリレート（CS-MA）を含む混合物中に再懸濁し、カスタムメイドの円筒ゲルモールド内に鋳造されています。 UV露光した後、ゲルを型から収集され、細胞の生存率がライブ死んで染色後24時間カプセル化することによって評価される固化。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
3Dバイオミメティックハイドロゲルで培養したヒト軟骨細胞における軟骨形成の遺伝子の発現を図2。少年、成人およびOA軟骨細胞による軟骨マーカーCOL2A1とCOL6A1の定量的遺伝子発現3Dバイオミメティックハイドロゲルで培養3週間後。値は、1日目誤差Bでの遺伝子の発現レベルに正規化されていますARSは、平均±SDを表します。 P、両側スチューデントt検定によって決定される* <0.05。 Smeriglio らから変更された。2 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
3Dバイオミメティックハイドロゲルで培養したヒト軟骨細胞における図3のDNA含有量。3Dバイオミメティックハイドロゲルで培養3週間後、少年、成人およびOA軟骨細胞におけるピコグリーンアッセイによるDNA定量。値は、1日目にDNAレベルに正規化されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
<BR /> 図4のGAG含有量測定と1日目と3次元バイオミメティックハイドロゲルで培養3週間後のヒト軟骨細胞の一軸圧縮試験を行った。1日目とで培養3週間後の軟骨細胞におけるDMMBアッセイによって（A）のGAG定量3Dバイオミメティックハイドロゲル。値は重量（WW）を濡らすように正規化され、μgの/ gと表現した。1日目と3次元バイオミメティックハイドロゲルで培養3週間後の無細胞と細胞を含んだヒドロゲルの（B）圧縮弾性率（kPaで）。 ご覧になるにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。
Discussion
このプロトコールで報告されたように、3Dヒドロゲルは、通常、単層培養物15で遭遇する線維軟骨細胞への細胞脱分化の過程を回避し、培養中の軟骨細胞表現型を維持することができます。また、chondrocytes-ヒドロゲル構築物の長期培養は、年齢や疾患に関連する本質的な細胞機能を維持し、良好な環境を明らかにしました。
3次元生体模倣ヒドロゲルの使用は、いくつかの利点を有します。まず、コンドロイチン硫酸（CS）、関節軟骨に見出される主要なコンポーネントを含めることは、コンドロイチナーゼを分泌することによってヒドロゲルマトリックスを分解し、新たに合成された軟骨細胞外マトリックス5、16を敷設するために細胞を可能にします。また、CSが示されています関節炎の関節における抗炎症特性を有すること。生体模倣ヒドロゲルはまた、軟骨修復における細胞送達のための足場材料として用いることができ、化学的に修飾することができますより良い組織生体材料統合17,18を容易にします 。
PEG-CSのヒドロゲルの使用は、長期的な軟骨細胞の文化や生化学的および機械的特性を評価することができます。ここでは、このプラットフォームは、軟骨工学のための最適な細胞タイプを定義するために、分化した軟骨細胞のさまざまなソースの比較分析のために有用であることができる方法を示しています。興味深いことに、ヒドロゲルにカプセル化された軟骨細胞は、それらの固有の能力に応じて生存したままと増殖します。 図2に示すように、ヒドロゲル組成物は、実際には、健康な若年成人軟骨細胞の増殖を支持する。グリコサミノグリカン（GAGによって評価機能細胞外マトリックスの沈着によって示されるように記述さヒドロゲルの組成及び構造はまた、軟骨組織の形成を促進します）定量。
追加の利点は、軟骨細胞ハイドロゲル構造物であります新たに形成された軟骨組織の機械的特性について評価することができます。一軸圧縮試験は、比較のために無細胞ヒドロゲル上で実行されるべきであることに注意してください。ヒドロゲルは、実際には、CSによる部分の剛性に固有の剛性を有します。負荷条件下で軟骨組織が 経験する生理学的な歪みが10~20であることが報告されているので（歪み率1％/ sで）5〜20％の一軸圧縮歪みが軟骨組織11,12の機械的試験に適用することができます％13,14。機械的試験への細胞を含んだし、無細胞ヒドロゲルの両方の応答は、培養エンドポイントで評価しました。私たちは、OA軟骨細胞を含む構築物の低い剛性とは対照的に、成人および若年性の軟骨細胞を含む構築物の同等の剛性を観察し、上記の例では。細胞 - ヒドロゲル構造体の機械的特性は、機能的特性の評価を可能にします細胞成熟性の詳細な分析を与えるに形成された組織。
結論として、軟骨組織を生成するために、別の軟骨細胞集団の可能性を研究するための3次元生体模倣ヒドロゲルの使用は、広く適用することができます。ここで説明したin vitro試験のほかに、細胞を含んだ構成物のin vivoでの移植は生理的な文脈で細胞成熟と再生可能性を研究するために想定することができます。追加の生体模倣因子とヒドロゲルプラットフォームのさらなる修飾はまた、軟骨細胞の増殖および成熟を最適化するように想定することができます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| juvenile chondrocytes (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System ) | Lonza | CC-2550 | |
| adult chondrocytes (Clonetics Normal Human Chondrocyte Cell System) | Lonza | CC-2550 | |
| poly(ethylene glycol diacrylate) | Laysan Bio | ACRL-PEG-ACRL-1000-1g | |
| 2-morpholinoethanesulfonic acid | Sigma | M5287 | |
| photoinitiator | Irgacure | 2959 | |
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| chondroitin sulfate sodium salt | Sigma | C9819 | |
| N-hydroxysuccinimide | Sigma | 130672 | |
| 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride | Sigma | E1769 | |
| 2-aminoethyl methacrylate | Sigma | 516155 | |
| dialysis tubing | Spectrum Laboratories | 132700 | |
| Collagenase 2 | Worthington Biochemical | LS004177 | |
| Collagenase 4 | Worthington Biochemical | LS004189 | |
| DMEM/F12 media | HyClone, Thermo Scientific | SH3002301 | |
| live/dead assay | Life Technologies | L3224 | |
| Tri reagent | Life Technologies | AM9738 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P11496 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S3264 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt | Sigma | E5134 | |
| L-Cysteine | Sigma | C1276 | |
| 1,9-dimethylmethylene blue | Sigma | 341088 | |
| Instruments | |||
| UV light equipment - XX-15LW Bench Lamp, 365 nm | UVP | 95-0042-07 | |
| Instron 5944 testing system | Instron Corporation | E5940 |
References
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