Summary
신규 모델의 병적 알츠하이머 병 (AD)과 입력 조건을 조사하기 위해, 세 가지 동작 태스크 모터 제어,인지 행동 모두를 평가하는 것이 기재되어있다. 이러한 작업은 빔 도보 작업, 실린더 작업 및 모리스 물 미로를 포함한다.
Abstract
(AD) 알츠하이머 병은 신경 퇴행 및 메모리 손실을 초래 쇠약 신경 퇴행성 질환이다. 나이가 AD의 주요한 위험 인자이지만, 뇌졸중 또한 위험 인자 및 악화 인자로서 연루되어왔다. 악화 스트로크 관련 모터 제어 및 AD 관련된인지 결핍 뇌졸중 및 AD 결과의 공동 이환율 단독 각 조건에 비해. 아밀로이드 전구체 단백질의 DNA에 통합 (AD의 개발에 참여 핵심 단백질)의 돌연변이 형태와 뇌졸중, AD, AD의 새로운 형질 전환 쥐 모델의 결합 상태를 모델링하기 위해, 작은 일방적 인 선조체 스트로크를 주어집니다.
뇌졸중 및 AD 둘의 조합을 가진 모델의 경우, 뇌졸중 관련 모터 제어, 운동 및 AD와 관련된인지 기능을 평가하는 행동 테스트를 구현해야합니다. 실린더 작업은 자발적 앞다리 모터 사용을 평가하는 비용 효율적이고, 범용 장치가 포함. 이 작업에서, 래트는 원통형 장치 내에 어디에 래트 것 자발적 후면 배치와 앞다리와 실린더의 벽을 접촉한다. 이 연락처는 앞다리 모터 사용으로 간주하고 테스트 후 비디오 분석에서 정량한다. 또 다른 구현 비용 효율적인 모터 태스크 앞다리 제어, 제어 및 뒷다리 운동을 평가 빔 도보 작업이다. 이 작업은 앞다리 전표, 뒷다리 전표와 폭포의 분석을 통해 사지 모터 제어의 평가를 허용 나무 빔을 가로 질러 쥐 산책을 포함한다. 학습과 기억의 평가는이 행동 패러다임에 대한 모리스 물 미로 완성된다. 이 프로토콜은 쥐가 고정 숨겨진 플랫폼의 위치를함으로써 공간 학습을 시작합니다. 공간 학습 후, 플랫폼 제거하고, 단기 및 장기 참조 메모리 공간 모두가 평가된다. 이러한 작업의 세이 항을 만들고, 행동의 차이에 민감하고이 모델을 28 일 이내에 완료됩니다다임 시간 효율적이고 비용 효율적인.
Introduction
알츠하이머 병 (AD)은 노인 인구에서 치매 및 쇠약 신경 퇴행성 질환의 가장 일반적인 형태입니다. 조직 병리학 적, AD는 아밀로이드 플라크, 신경 섬유 엉킴 및 신경 세포의 손실 자체를 선물한다. 아밀로이드 플라크는 β 및 γ 세 크레타 제 효소 크레타 1,2,3- 의한 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 변형 된 단백질 분해 절단에 의해 제조 된 베타 - 아밀로이드 펩티드 (Aβ)로 주로 이루어져있다. 절단 제품은 Aβ는 뇌의 예금은 병적 인 아밀로이드 플라크를 생성하고 특성 학습 장애와 기억 상실로 이어질 수있는 뇌에 독성을 가지고있다. 함께 이러한 모든 단계는 "아밀로이드 캐스케이드 가설"3,4라고합니다. AD를 조사 할 때이 가설이 중요하지만, 다른 세포 변화는 원래 아밀로이드 캐스케이드 경로에서 벗어나있는이 플라크 형성을 선행하는 것으로 밝혀졌다. 이 다른세포 변화는 장애 전에 플라크 형성 -3,5,6-에 AD에 관련된 다른인지 기능 장애, 학습 초기 기억 상실에 기여할 것으로 생각된다.
AD가 점점 널리 사용되고으로 AD 현상의 위험 인자 연구의 초점 매우 중요 해지고있다. 연령은 AD의 산발적 인 형태의 주요 위험 인자이지만, 다른 위험 인자는 스트로크 7,8 포함 확인되었다. 스트로크는 위험 인자 아니지만, 이미 본 치매를 악화시킬 수있다. 예를 들어, 임상 적으로, AD의 진행 이전 스트로크 9를 겪은 환자에서 악화 될 것으로 나타났다. 또한, 증가 APP 발현과 Aβ의 축적을 유도 선 10, 11와 결합 Aβ 독성의 실험 동물 모델에서 발견되었다. 뇌졸중과 AD 사이의 중요한 상호 작용이 존재하기 때문에, 이들 두 가지 병리 더욱 연구하는 것이 중요함께 공동 병적 모델에서 더 나은 두 조건에 연루 병태 생리와 행동을 이해합니다.
병적 조건을 조사하기 위해, 적절한 모델이되는 스트로크 AD 같은 병리를 생성 Aβ와 상호 작용할 수있는 개발했다. 처음으로, 그 DNA에 통합 돌연변이 된 인간 APP 유전자를 갖는 형질 전환 쥐 APP21 AD의 적절한 모델을 달성하기 위해 사용되었다. 돌연변이는 모두 AD 4,8,12의 가족 형태로 연루되어 스웨덴 더블 과오와 인디애나 하나의 과오 돌연변이입니다. 추가 모독 없으면, 특성 Aβ 플라크 나 신경 섬유의 개발없이이 쥐 모델 연령 12 엉킴. 따라서, AD와 같은 병리 행동을 유도하기위한 노력으로, 작은 스트로크는 치매 환자 9 종종 본 피질 작은 스트로크를 모방 오른쪽 선조체로 도입된다. APP21 형질 전환 라의 스트로크t는 공동 병적 상태를 구현하고 두 질병 상태에 연루 행동 변화의 다양한 종류의 조사를 할 수 있습니다. 특히, 성인 쥐에서 AD-같은 병리인지 결손이 유도는 우리가 AD에 선행하는 최초의 분자인지 변화를 조사 할 수 있습니다.
목표는 병적 모델을 연구 할 때 스트로크 AD 모두 매우 뚜렷한 행동 병변이 있기 때문에 행동 변화의 첫 번째 표시를 결정하기 때문에, 동작 태스크 행동 표현형의 다양성을 평가할 필요가있다. 패러다임과 다양한 장비를 포함하는 설치류 모델에서 모터인지 행동을 분석 할 수있는 비교적 민감한 테스트 전지가있다. 구체적 앞다리와 뒷다리의 모터 기능을 분석하기 위해, 실린더 작업 및 빔 도보 태스크 모터 적자를 감지하고이 모델 식 이동을 모니터하기 위해 구현되었다. 특히 fo를 벌금을 평가하기위한 다른 민감한 작업relimb 모터 기술 (즉, 계단 작업 및 단일 펠릿에 도달하는 작업) 음식 부족 11,13,14이 필요합니다. 질병의 병리 15, 16, 17 음식 부족의 알려진 효과 중 하나를 방지하기 위해, 이러한 테스트는이 연구를 위해 적합하지 않은 것으로 간주되고있다. 실린더 작업은 새로운 환경에서 양육하는 동안 쥐의 앞다리의 자발적인 사용을 평가하고 일방적 인 행정 10,18와 쥐의 앞다리 사이의 비대칭를 검색 할 수 있습니다. 이 작업의 주요 이점은 장치가 예 Porsolt 강제 수영 태스크 (19)와 같은 다른 동작 작업에 이용 될 수 있다는 것이다. 실린더 작업과는 달리, 빔 걸음 작업도 10,14를 locmotion 외에도 뒷다리와 앞다리 모터 제어의 분석을 허용한다. 빔 산책는 전위의 구성 요소, 균형 성분과 숙련 된 발 배치를 포함한다. 이러한 검사는 모두 경제적 인 간단하고 시간 효율이고 D 스트로크와 AD의 영향을 밝히기 사지 기능에 ifferences.
이외에도 운동 기능의 변화에서, AD는 질병 진행의 초기 단계에 표시 할 수 있습니다 메모리 적자를 포함한다. 설치류 모델에서 AD 같은 병리를 해결하면, 해마 중요한 뇌 구조는 크게 2 AD의 영향을 받으므로 해마 의존적 학습 및 기억을 평가되는 것이 중요하다. 해마 설치류 다양한 미로 패러다임을 사용하여 테스트 할 수있는 공간 학습 및 기억과 기능에 필수적인 뇌 영역이다. 다른 질환의 설치류 모델의 대부분 널리 미로 작업 중 하나는 모리스 물 미로 (20)이다. 모리스 물 미로 고정 숨겨진 플랫폼을 찾는 데 래트를 돕기 위해 공간 큐를 이용하여 플랫폼이 제거 될 때 공간 참조 메모리를 테스트한다. 물 미로 설정의 중요한 장점은 제안 된 연구 문제 (20)에 따라 매우 융통성 있다는 것이다.
처음 텐트 ">에서 설명 된 기술은 스트로크와 AD의 신규 병적 쥐 모델에서 모터 및인지 기능을 평가하기 위해 사용되었다. APP21 형질 전환 생쥐 모델에서 작은 스트로크를 포함. 동반 질환을 유도하여 이루어졌다 선조체에서 혈관 수축을 APP21 형질 전환 쥐의 작은 스트로크를 생성한다.이 뇌졸중 모델 아니라 AD (11)의 대안적인 쥐 모델에서 병적 조건으로 설정되어있다. 선진화 APP21 형질 전환 생쥐 모델이 의도 된이 신규로 행동 태스크가 병적 스트로크 AD 쥐 모델을 사용하여 설명되지만 더욱 병진 유용한 모델을 생성한다. 이러한 작업은 또한 다른 스트로크 모델 또는 다른 신경 질환의 모델 (예, 파킨슨 씨병). 일반에 적용 할 수있다 설명 방법이 다른 질병 상태에 광범위하게 적용 할 수 있지만 행동 일정과 패러다임은 제안 입술을 기반으로 변경을 요구할 수있다earch 질문 모델입니다. 또한 비용 및 시간 절약하면서 적응 것에 더하여, 설명 된 작업은 작은 결손을 보여주는 효과적이다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
해당 기관의 동물 윤리위원회는 이전에 실험을 시작하기에 행동 절차를 모두 승인해야합니다. 여기에 설명 된 모든 동물의 작업은 웨스턴 대학교 동물을 사용 분과위원회의 승인 및 동물 관리 지침에 캐나다위원회를 다음과되었다. 이들 동물 실험은 빛 단계에서 수행되었다.
총 앞다리 모터 평가 1. 실린더 작업
- 장비 설치
- 실험에 사용 된 쥐의 크기를 수용하는 천공 뚜껑 플렉시 유리 실린더를 획득. 실린더의 크기는 부양 할 때 쥐의 상단에 도달하는 것을 허용하지 말아야하고 벽과 쥐의 코와 쥐의 꼬리의베이스 사이 2cm 허용한다. 실린더의 표준 크기는 직경 23cm와 6 개월 (400~600그램) 쥐에 대한 높이 40cm입니다.
- 실린더가 PLE에 앉아 실린더 장치 아래 45도 각도로 거울을 배치xiglas 스탠드 또는 약 30cm 테이블 탑 위의 지원의 다른 형태.
- 비디오 카메라에 거울 실린더의 전체 직경을 시각화하기 위해 적절한 거리에서 삼각대에 비디오 카메라를 설정합니다.
- 디머 설정으로 조명을 켜고 갑자기 큰 소음의 영향을 줄이기 위해 방 (즉, 낮은 볼륨, 미묘한 음악)에 백색 잡음을한다. 이 운동을 장려 인해 시끄러운 소리에 동결을 방지한다.
- 실험 절차
- 첫 번째 재판의 시작은 음악 재생 및 조광기 조명 방에 쥐 순응하기 전에 실험 방 30 분에 쥐를 이동합니다.
- 작은 화이트 보드에 (타임 라인 및 시험 번호, 즉 동물의 수, 일) 해당 동물 및 시험 정보를 작성합니다. 거울 앞에서이 보드를 놓습니다.
- 거울 앞의 화이트 보드와 비디오 카메라를 눌러 기록,베이스 오 근처 쥐를 데리러꼬리 f를 실린더에 쥐를 넣고 뚜껑을 고정합니다. 녹화 방해되지 않도록 통의 측면에 스탠드 오프.
- 거울 앞에서에서 화이트 보드를 제거하고, 비디오 카메라 레코드 5 분간 실린더 쥐 (화이트 보드를 제거 할 때 5 분을 기록하는 타이머를 사용한다)하자. 이것은 하나의 실험이다.
- 시험 후 종이 타월과 물 실린더를 청소합니다.
- 반복 실험 세 총 달성 1.2.2-1.2.5 두 번 더 단계. 실린더에 습관화의 가능성을 줄이기 위해 20 ~ 30 분 간 시험 시간이 있어야합니다. 이 시간 동안 다른 쥐에 대한 실린더 시험을 실행합니다.
- 영상 분석
- 비디오 편집 프로그램으로 가져 비디오 카메라 파일 (즉, iMovie에서)
- 각 시험에 대한 클립으로 동영상을 컴파일합니다. 영상의 볼륨을 음소거 원래의 25 %까지 비디오의 속도를 감소시킨다.
- 앞다리 접점의 수를 계산좌우의 앞다리에 대한 실린더 벽. 동시에 왼쪽과 오른쪽 접점은 "모두"이러한 앞다리 연락처를 계산합니다. 비디오가 비디오의 왼쪽 앞다리가 실제로 동물의 오른쪽 앞다리에 해당로 보이는 거울을 통해 기록되어 있음을 알아 두셔야합니다.
- 다음 식을 이용하여 (스트로크에 반대측) 영향을받는 앞다리의 비율 사용을 계산 : [{/ 총 연락처 (주소록 + ½ 양자 접촉에 영향을)} × 100]. 야생형 그룹과 뇌졸중없이 형질 전환 그룹 모두의 성능은 질병에 의한 문제의 프레젠테이션을 평가하는 비교 그룹으로 간주됩니다.
2. 빔 도보 작업 총 모터 평가를위한
- 장비 설치
- 2cm 폭 약 120cm 길이의 (a 200-600g 쥐를위한 최적의 폭)입니다 부드러운 밀봉 나무 빔을 획득.
- 이 테이블이나 선반 취소를 배치간격은 100cm. 각 유닛의 표면은 지상 약 40cm이어야한다.
- 표에 나 테이프를 사용하여 표면을 선반 빔의 양쪽 끝을 고정합니다. 약 1m 지원되지 않는 빔의 길이는 이제 지상 40cm 상승한다.
- 빔의 전체 길이를 캡처, 스탠드에 비디오 카메라를 설정합니다. 비디오의 대비를 강화하기 위해 흰쥐를 사용하는 경우 빔 뒤에 검은 배경을 소개하는 것이 좋습니다.
- 실험 절차
- 첫 번째 재판의 시작은 음악 재생 및 조광기 조명 방에 쥐 순응하기 전에 실험 방 30 분에 쥐를 이동합니다.
- 빔의 일단 쥐의 홈 케이지 또는 환경 농축 튜브를 삽입하고, 빔의 다른 끝에서 쥐를 놓는다.
- 실험 시험 이틀 전에 약간의 비 기록 실행을 실시한다. 쥐가 지역을 탐험하자 쥐의 기반을 잡고 빔을 향해 쥐를 안내의 꼬리.
- 쥐가 빔을 교차되면, 빔과 반복의 다른 쪽 끝 케이지 또는 튜브를 이동합니다. 쥐가 어느 방향으로 자유롭게 빔을 교차 할 때, 훈련이 끝났습니다. 훈련의 수는 모든 동물 중에서 일관된 실행하십시오.
- 작은 화이트 보드에 (타임 라인 및 시험 번호, 즉 동물의 수, 일) 해당 동물 및 시험 정보를 작성합니다. 빔 뒤에 벽이 화이트 보드를 테이프.
- 빔의 한쪽 끝에서 쥐의 홈 케이지 또는 환경 농축 튜브를 놓습니다.
- 눌러 비디오 카메라에 기록 홈 케이지 또는 튜브에 상기 빔의 반대측의 단부에서의 꼬리와 장소의 기지국에 의해 래트를 픽업.
- 쥐가 성공적으로 높은 빔의 전체 길이를 가로 지르는 완료되면 종료 재판, 전체를 기록합니다. 쥐의 일시 정지는 꼬리의 기지에 의해 부드럽게 쥐 목덜미, 빔을 가로 질러 중간에 또는 부드럽게 쥐의 꼬리를 터치하면빔을 가로 질러 이동을 촉진한다. 어떤 방식으로 앞으로 쥐를 누르지 마십시오.
- 다시 할 빔에 반복적으로 걸어 중지하거나 일관성 산책하는 동안 쥐가 옆으로 회전 시험을. 쥐 폭포 부드럽게, 빔에 꽉 쥐를 특종과 가을의 위치에 빔을 다시 배치하고 시험을 계속 계속됩니다.
- 빔의 타단에 상기 홈 케이지 또는 튜브를 이동 화이트 보드 시험 번호를 변경하고 다음 시험을 기록한다.
- (6) 시험의 총 완료 될 때까지 3 시험은 각 방향에 대해 기록되면서,이 절차를 반복합니다. 쥐 실험을위한 모든 6 다음 래트에 대한 실험을 시작하기 전에 기록 될 수있다.
- 영상 분석
- 비디오 편집 프로그램 (예 : iMovie를)로 가져 오기 비디오 카메라 파일.
- 각 시험에 대한 클립에 비디오를 컴파일하고 비디오의 볼륨을 음소거. 프레임에 의해 각 비디오 클립 프레임을 분석합니다.
- 수를 계산총 단계의 쥐 빔의 전체 길이와 좌우 뒷다리와 앞다리 미끄러 져 떨어지는 건수의 총 수를 걸어 걸린다. 모두 야생형 그룹의 실적 스트로크없이 트랜스 제닉 그룹은 병적 상태 고유 적자 출현을 평가하는 병적 군에 비해 여겨진다.
해마에 의존하는 공간 학습 및 참조 메모리 3. 모리스 물 미로
- 장비 설치
- 원형 풀 (148cm 직경 58cm 깊이)의 중앙 위에 위치 된 비디오 카메라를 고정. 추적 소프트웨어 프로그램 풀의 윤곽 제대로 네 개의 지정된 사분면을 맞 춥니 다.
- 약 36cm 깊은 물과 원형 풀을 입력합니다. 물은 몇 일 전에 실험 프로토콜을 시작하기에 풀 충전하여 실온으로 가온한다.
- 검은 비 독성 아크릴 페인트 않은 추가흰쥐를 사용하는 경우 물 때까지 불투명하다. 어두운 색의 쥐를 들면, 흰색 등의 밝은 색상을 사용합니다.
- 필요한 경우 실내 칸막이를 포함한 빈 벽 표면과 수영장을 둘러싸고 있습니다. 때 수영장에서, 쥐가 실험자를 볼 수 없습니다해야합니다.
- 포스터 보드의 다른 색상에서 4 큰 다른 모양의 공간 큐를 잘라 지정된 북쪽, 동쪽, 남동 및 남서 풀 위치에 따라 벽에 하나의 형상을 연결합니다. 이 큐는 풀의 가장자리보다 약간 높아야한다.
- 테스트하는 동안 예기치 않은 시끄러운 소리에 정신이되는 쥐를 방지하기 위해 북서 사분면에 낮은 볼륨에서 라디오를 켭니다.
- 대상 사분면의 중앙에 원형의 플랫폼 (11.5 cm 직경, 표면 수위 아래 2-3cm)을 놓습니다.
- 메인 룸의 조명을 끄고 영역을 조명하기 위해 풀에 방 분배기의 반대편에 바닥 서 램프를 켭니다.
- 컴퓨터 구성
- 공간 학습 실험 90 초마다 4 시험으로 4 일 연속을 설정합니다.
- 첫 번째 프로브 실험 후 마지막 공간 학습 재판 후 24 시간 및 1 주 30 초 각각 2 개의 별도 프로브 실험을 설정합니다.
- 세트는 두 번째 프로브 실험 후 24 시간부터 2 일 연속 하루 4 실험에서 학습 실험을 큐. 각 시험은 60 초 총 있어야합니다.
- 특정 동물에 대한 각각의 시험 사이에 20 분 간 시험 간격이되도록, 각 단계의 경우, 시험 순서를 설정한다. 다른 동물들은 한 모든 동물은 20 분 간 시험 간격을 유지하고,이 간 재판 간격 동안 실행할 수 있습니다.
- 플랫폼의 위치는 실험자에 의해 정의된다는 것을 확인하고 다른 지역은 해제됩니다지정된 플랫폼의 위치에 의해 벌금을 부과.
- 수동으로 시작하고 각 시험을 종료 할 프로그램을 설정합니다.
- 남서부 사분면에있는 원형의 플랫폼을 놓습니다. 그것은 컴퓨터 프로그램의 사분면에있는 원형 지정 "플랫폼"지역과 일치해야합니다.
- 수영장 주변의 시작 위치는 각각의 쥐에 대한 무작위 배정해야한다. 각 처리 군 내의 모든 시작 위치를 나타낸다. 어떤 쥐 프로브 테스트 동안 새로운 시작 위치를 허용하기 위해 제시 패러다임의 모든 공간 학습 시험의 북동쪽 위치에서 시작합니다.
- 꼬리의 기지에서 쥐를 잡고 조심스럽게 지정된 시작 위치에서 풀의 벽을 따라 물에 배치하고 신속하게 쥐의 시야 밖으로 이동합니다.
- 다른 실험 빨리 래트가 물에서와 같이 트랙킹 소프트웨어를 시작하게한다. 타이머는 추적 프로그램에 0부터 카운트 업을 시작한다. 쥐가 플랫폼을 찾으면, 다른 실험은 컴퓨터의 재판을 중지하고 검색하기 전에 적어도 30 초 동안 플랫폼에 쥐를두고있다. 재판이 컴퓨터에 중지되기 전에 쥐가 플랫폼을 이동하는 경우, 재판이 계속됩니다.
- 쥐가 할당 된 시험 시간에 플랫폼을 찾지 못하면, 당신의 손 (중 쥐가 손을 따르거나 꼬리의 기지에 의해 쥐를 안내하기)를 사용하여 플랫폼에 쥐를 안내합니다. 30 초 동안 플랫폼에서 쥐를 잡으십시오.
- 수건으로 덮여 또는 쥐 휴대용 표면에 오를 수 있도록하는 실험자의 팔 위에 꼬리의 기지에 의해 풀에서 쥐를 제거합니다.
- 쥐 당 4 임상 시험의 총 단계를 반복 3.3.3-3.3.7. 각 쥐 20 분 간 시험 간격이 있어야합니다.
- 쥐의 마지막 공간 학습 재판 다음 적어도 10 분 동안 가열 램프 아래에 자신의 홈 케이지에 쥐를 돌려줍니다.
- 엑사 계속공간 학습 일 ~ 4 일 2 캐럿 동일한 공간 학습 프로토콜입니다.
- 하루 2-4에서 더 이상 플랫폼에서 쥐를 보유하지 않습니다. 쥐가 시야 밖으로 실험자 30 초 동안 도움없이 플랫폼에 앉아 할 수 있습니다. 이를 계기로 1 일에 나중에 시험 중에 수행 할 수 있습니다.
- 풀에서 플랫폼을 제거합니다. (남서 사분면 원) 컴퓨터에 정의 된 이전 플랫폼의 위치를 유지해야합니다.
- 동북 위치에 풀의 벽을 따라 물 속에서 쥐를 놓고 신속하게 쥐의 시야 밖으로 이동합니다. 소설의 사용은 북동 위치가 쥐가 이전에 훈련을 시작 위치에서 독립적 인 플랫폼의 위치를 회상 보장 시작합니다.
- 다른 실험 빨리 래트가 물에서와 같이 트랙킹 소프트웨어를 시작하게한다. 타이머는 추적 소프트웨어에 0부터 카운트 업을 시작한다.
- 로부터 쥐 검색남서 꼬리의 기지에 의해 풀의 사분면과 수건 덮인 팔을 잡거나 쥐 휴대용 표면에 오를 수 있습니다.
- 각 쥐의 프로브 시험 다음 적어도 10 분 동안 가열 램프 아래에 자신의 홈 케이지에 쥐를 돌려줍니다.
- 일주 이번 실험 (단계를 3.4.1-3.4.5)을 반복합니다.
- 플랫폼에 8.5 cm 높이 스탠드에 4 cm 직경 흰색 구형 큐를 확보하기 위해 테이프를 사용 (큐의 전체 높이 12.5 cm)입니다. 구형 큐의 상단 수위보다 최소 8.5 cm 것입니다.
- 수영장 주변 벽에서 공간 단서를 제거합니다.
- 플랫폼의 위치를 무작위로 각 그룹의 각 쥐에 대한 위치를 시작합니다. 모든 플랫폼 및 시작 위치는 각 치료 그룹에 대한 표현되어야한다.
- 지정된 플랫폼 영역에서 플랫폼을 놓고 추적 소프트웨어에 정의합니다.
- t에서 풀의 벽을 따라 물에 쥐를 놓고그는 쥐의 시야 밖으로 이동 신속하게 위치를 시작하고 지정된.
- 다른 실험 빨리 래트가 물에서와 같이 트랙킹 소프트웨어를 시작하게한다. 타이머는 추적 소프트웨어에 0부터 카운트 업을 시작한다.
- 쥐가 플랫폼에 도달하면, 다른 실험은 컴퓨터의 재판을 중지해야합니다. 쥐가 플랫폼을 이동하는 경우, 재판이 계속됩니다. 쥐를 검색하기 전에 쥐 15 초 동안 플랫폼에 앉아 할 수 있습니다.
- 꼬리의 기지에 의해 풀에서 쥐를 검색하고 수건 덮인 팔을 잡거나 쥐 휴대용 표면에 오를 수 있습니다.
- 다음 쥐의 플랫폼의 위치를 확인하고 추적 소프트웨어에 정의 된 해당 영역으로 플랫폼을 이동합니다.
- 다음 3 시험에 대한 단계를 반복 3.5.4-3.5.9. 15 분 간 시험 간격이 있어야합니다.
- 각 쥐의 FINA 다음 적어도 10 분 동안 가열 램프 아래에 자신의 홈 케이지에 쥐를 돌려줍니다난 시험 학습 큐.
- 큐 학습의 날 2에 대해 동일한 프로토콜을 계속합니다.
참고 : 영역에서 소요 시간, 거리 영역으로 항목과 영역으로 첫 번째 항목에 대한 시간의 수는 자주 사용되는 영역, 평균 속도에 여행했다.
- 플랫폼 영역 및 공간의 하루 평균 속도에 도달하는 시간 간격을 분석하여 개별적으로 학습 큐. 프로브 실험을 위해, (2)를 조사하는 원료 시간 또는 프로브 1 퍼센트 변화에 따라 대상 지역에 첫 번째 항목에 대한 대기 시간을 분석 할 수 있습니다.
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Representative Results
설명 된 행동 작업은 알츠하이머 병의 APP21 형질 전환 생쥐 모델에서 스트로크의 효과를 입증하기 위해 사용되었다. 뇌졸중과 APP21 형질 전환 유전자의 조합은 영향을받는 사지에 더 큰 모터 적자뿐만 아니라, 증가 된 메모리 적자가 발생할 것으로 예상된다.
실린더 작업은 총 앞다리 운동 기능을 평가하고, 해당 앞다리의 사용과 같이 표현된다. 또한, 빔 - 거리 태스크 구체적 뒷다리 운동 기능과 운동을 평가하기 위해 사용되었다. 스트로크 적절한 선조체에서 유도 된 이후 좌측 앞다리 하나가 존재하면, 모터 적자 것으로 예상된다. 통계적으로 그 공동 병적 쥐를 보여주지 않는 그림 2와 그림 3a 및도 3b 모두에 제시된 데이터는 각각 앞다리 나 뒷다리 적자가 있습니다. 이 동물은 AP 통신을하지 않는 동안배는 앞다리 나 뒷다리 모터 적자를 가지고, 그들은 운동에 관한 운동 기능에 약간의 차이가 나타나지 않습니다. 빔 도보 작업에서는 전체 단계는 크게 빔 도보 작업이 보행 및 운동의 사소한 변경 사항을 충분히 민감하다는 것을 시사 스트로크 (P <0.05,도 3c)와 공동 병적 유전자 변형 쥐에서 증가 하였다. 사용되는 작은 선조체 스트로크 모델은 가능성이 주요 모터 적자를 생산하기에 너무 작은 작은 스트로크를 생산하고 있지만, 적자는이 두 가지 작업 10, 14와 다른 뇌졸중 모델에서 이전에 입증되었다. 제시된 매개 변수를 조사 할 때 여기, 이러한 작업은 단순히 운동 기능과 운동을 모니터링 할 수 있습니다.
해마 따라 공간 학습 및 참조 메모리가 효과적으로 모리스 물 미로을 사용하여 평가 될 수있다. 그룹 간 학습에 명백한 차이 (그림 5a는 없었다 >도 5b), 따라서 학습 차이 메모리 성능의 차이를 설명 할 수 없습니다. 스트로크 APP21 유전자 변형 쥐 유전자 변형 스트로크 스트로크와 야생형 쥐없이 쥐 (P <0.05,도 5c)에 비해 강력한 장기 기준 메모리 적자를 보여 주었다.
큐 학습은 쥐 모리스 물 미로 플랫폼의 위치를 시각적 공간 큐를 사용하는 동일한 능력을 가지고 있는지 확인 완료된다. 도 6a 및도 6b에서 알 수 있듯이, 차이는 군간 큐 학습 동안, 플랫폼에 도달하는 지연 또는 경로의 길이가 관찰되지 않았다. 또한, 평균 수영 속도는 그룹 (도 6c) 사이의 일치이고 동기 부여가 탈출 능력 그룹 사이 동등했다 수영하는 것을 보여줍니다.
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그림 1 :. 모터와인지 행동 평가에 대한 타임 라인 스트로크 유도 수술 하루가 할당되는 일 0 모든 테스트 일이 일을 참조하고 있습니다. (A) 실린더 작업 (C) 및 빔 도보 작업 (BM)에 대한 사전 수술과 수술 후 테스트. (B) 모리스 물 미로 공간 학습, 프로브 테스트 및 학습 큐. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 영향 앞다리의 실린더 작업 백분율 사용 단계 1.3.4의 식을 이용하여 계산 일 -3 기준 값으로 표준화 하였다. 빨간색 점선은 각각의 동일한 사용을 나타내는 1.0 값을 주석을실린더 작업에 앞다리. 야생 유형 (WT)로 축약되어 형질 전환은 TG로 축약된다. 동물 번호는 다음과 같다 : WT + 생리 식염수 (N = 7), WT + 행정 (N = 8), TG + 생리 식염수 (N = 8), TG + 행정 (N = 6). 모든 값은 SEM ± 평균으로 표시하고 있습니다. (양방향 ANOVA, Tukey에의 포스트 특별). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3. 빔 거리 태스크 5 실험 걸쳐 제 (A)로 이루어진 모든 슬립 합 영향 (B)의 영향을받지 뒷다리 빔을 통과하는 데 걸리는 총 단계 수의 비율로 표시된다. - 사전 수술 비율 수술 후 비율 : 값은 다음과 같이 기본 값으로 표준화되었다. (C) 빔 O를 통과하는 전체 단계 N 일 -7 일 (21) 야생 유형 (WT)로 축약되어 형질 전환은 TG로 축약된다. 동물 번호는 다음과 같다 : WT + 생리 식염수 (N = 6)에서, WT + 행정 (N = 6), TG + 생리 식염수 (N = 6), TG + 행정 (N = 5). SEM 및 별표는 통계적 유의성을 나타내는 ± 모든 값은 평균으로 표시하고 있습니다. (편도 ANOVA, Tukey에의 포스트 혹은, P <0.05). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 프로그램보기 보여주는 섹션 설치 및 실험을 실행하는 데 필요한 몇 모리스 물 미로에 사용되는 추적 프로그램의 기능을 강조했다.. 테스트 탭에 때 제시된 풀의 비디오 장치보기에만 나타납니다 위의 기능.3089fig4large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5 : 공간 학습 및 모리스 물 미로 레퍼런스 메모리 공간 학습이 플랫폼에 도달하기 위해 (A) 대기 및 (B)의 경로 길이에 의해 측정 하였다.. (C) 레퍼런스 메모리는 12 일 프로브 테스트에 비해 19 일 프로브 시험의 대상 영역에 처음 진입 대기 시간의 퍼센트 변화로서 측정 하였다. 야생 유형 (WT)로 축약되어 형질 전환은 TG로 축약된다. 동물 번호는 다음과 같은 : WT + 식염수 (N = 8), WT + 스트로크 (N = 7), TG + 식염수 (N = 7), TG + 스트로크 (N = 8). SEM 및 별표는 통계적 유의성을 나타내는 ± 모든 값은 평균으로 표시하고 있습니다. (공간 학습과 일원 분산 분석 프로브 테스트, Tukey에의 포스트 혹, P &에 대한 양방향 ANOVA# 60;. 0.05) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6 :. 모리스 물 미로 학습 큐 (A) 대기 시간 및 (B)의 경로 길이가 플랫폼에 도달하는 학습 여덟 실험의 평균으로 기재되어있다. (C) 수영 속도는 학습의 모든 팔 시험의 평균으로 표시됩니다. 야생 유형 (WT)로 축약되어 형질 전환은 TG로 축약된다. 동물 번호는 다음과 같은 : WT + 식염수 (N = 8), WT + 스트로크 (N = 7), TG + 식염수 (N = 7), TG + 스트로크 (N = 8). 값은 SEM ± 평균으로 표시하고 있습니다. (편도 ANOVA, Tukey에의 포스트 특별). 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림.
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Discussion
모터와 각각의 증상의 중증도에 따라인지 기능 모두에 영향을 미칠 수있는 뚜렷한 행동 병리 뇌졸중 및 치매 결과의 조합. 따라서, 이러한 조건의 개별 기여도를 결정할뿐만 아니라, 병적 상태에서 결합 잠재적 상호 작용 효과에 대한 통찰력을 제공 할 행동의 다양한 작업을 활용하는 것이 필요하다. 제시된 데이터는 3 개의 비용 효율적인 스트로크 새로운 공동 병적 APP21 형질 전환 쥐 모델에서 운동 기능과 해마 따라 공간 학습 및 참조 메모리를 평가하는 시간을 절약하고 민감한 행동 작업을 보여줍니다. 제시된 데이터 외에, 이러한 태스크뿐만 아니라 AD 8,16의 모델 모두 다양한 질환 모델 널리 적용되어야 더 심한 뇌졸중 모델 10,14,18에서 확인되었다.
상기되는 것을, 어떤 작업은 리없이 없다mitations. 쥐 실린더와 빔 순응 될 경우 특히 모터 작업에 어떤 문제가 요구 될 수있다. 실린더 작업에있어서, 동기가 쥐 실린더 벽 앞다리 콘택트의 적당량을 달성 할 수 있도록 요구 될 수있다. 이 결과를 달성하기 위하여, 실린더의 뚜껑 또는 관통 벽 무독성 향기의인가 뒤쪽 래트 동기 및 앞다리와 실린더의 벽을 접촉 할 수있다. 예를 들어 땅콩 버터, 바닐라 추출액 조금 더 실린더 벽을 둘러 좌상 래트 격려 실린더의 상단에 가까운 안쪽 벽에 도말된다. 컬러 테이프 링은 실린더의 바닥으로부터 실린더 ¾의 내측에 적용될 수있다. 사육을 촉진하는 또 다른 방법은 좌상 쥐를 제거하고 프로토콜 간 시험 간격으로 이루어졌다 일정 시간이 경과 한 후 실린더에 재 도입하는 것을 포함한다. 모피thermore, 시험을 통해 반 천공 뚜껑을 제거한 쥐의 길이에 비해 실린더의 높이에 따라서 양육 및 실린더 벽 앞다리 접촉 프롬프트 할 수있다. 쥐가 테스트 중에 실린더에서 탈출 할 수있을 것입니다 가능성이있는 경우에 할 수 없습니다. 이 동기는 후방의 수를 증가시킬 수 있지만, 벽에 접촉시 좌측 및 우측 앞발의 사용에 영향을주지해야한다. 이러한 제안을 구현 한 후 앞다리 컨택 부적절한 수에 대한 주요 관심사가 여전히 존재하는 경우 래트 상관없이 시간의 길이 (10) 후방의 합계를 제작 한 후, 시험이 종료 될 수있다. 각 래트는 다른 시간에 10 개의 후방 도달 하듯이, 상기 프로토콜 완료 5 분 시험 상이하다. 뇌졸중 및 AD 공동 이환율의 모델로,인지 성능, 불안 및 활동 수준의 변화가 이러한 쥐에서 개발 수 있다는 것을 인식하는 것이 중요하다. W하일 이러한 변화를 직접 개발할 수있는 비 모터 관련 행동 변화에 대한 중요한 증거를 구성 할 수있다 다른 관측 기록 (양육하는 동안 자연 앞다리 사용) 실린더 작업의 일차 결과에 영향을주지 않습니다. 사육 동기를 탐색 동작의 한 형태로서, 실린더 작업에서, 이러한 동작은 잠재적으로 증가 또는 감소 동작이 양육 분석하여 관찰 할 수있다. 또한, 같은 시간 같은 다른 조치는 각각 불안과 다른 물리적 적자에 대한 통찰력을 제공 할 수있는 터닝 및 방문, 손질 보냈다.
홈 케이지 농축 튜브를 사용하여 빔 도보 작업에 관해서는, 보통 쥐가 빔을 가로 질러 걸을 수있는 충분한 동기 부여이다. 쥐은 땅콩 버터 또는 정밀 설탕 알갱이로, 빔을 따라 중간 향기로운 음식 보상을 중지하거나 치료하기 위해 계속되면 반대쪽에서 농축 관에 추가로 도입 될 수있다. 취급이 주어지면, 모든 쥐 AB를받을 수 있도록성능의 독립적 인 시험을 하루에 취급, 같은 양의 아웃. 또한, 오히려 다음 쥐에 이동하기 전에 쥐에 대한 모든 여섯 시험을 실행하는 것보다, 시험은 엇갈리게 될 수있다. 예를 들어, 첫 번째 두 실험은 다음의 두 가지를 시작하기 전에 모든 래트에 대해 완료 될 수있다. 이 중간에 일부 쥐 빔 환경에 너무 익숙해 질 때 나중에 시험에 발생할 수있는 빔을 가로 질러 정지의 수가 증가되지 않을 수 있습니다. 빈번한 정지가 발생하는 경우 다른 가능한 솔루션은 실험의 수를 감소시키는 것이다. 이는 따라서, 각각의 시험에 좌우 양쪽 사지 분석 빔 미러 뒤에 배치 시도 횟수가 감소 될 수있게함으로써 구현 될 수있다. 또한, 빔 요법 이니 여러 테스트 세션 후 발생할 수와 동물 동기를 부여하기 위해 모든 노력에도 불구하고, 빔을 통과하고 빔에 앉아 남아 거부 쥐가 발생할 수 있습니다. 이 때문에 문제, 빔 평가는 보라의 반복 테스트에 적합하지 않습니다NG 장기 실험. 테스트를 반복 이용 프로토콜에서, 보상은 동기 외에 우려가있다. 상기 빔을 횡단하는 동안 보상의 문제를 극복하기 위해, 테이퍼 빔은 일정한 나무 빔 (21) 대신 사용될 수있다.
다시 증가 불안과 전반적인 활동 수준과 동기 부여의 변화를 포함하는인지 적 변화는이 동물 모델에서 발생할 수 있습니다. 따라서, 빔을 순회하면서 빔뿐만 아니라 속도와 비 전위의 행동 (정지 앉아, 떨림, 방향)을 교차하는 동물들의 동기 부여에 관한 실험 그룹 중 어떤 부정의 주를 가지고하는 것이 중요합니다.
행동 알츠하이머 질환 연구 모리스 물 미로를 사용하여 여기를 달성 한 단기 및 장기 기억 테스트를 필요로한다. 대부분의 프로토콜은 공간 학습 후 24 시간이 장기 기억 (21)로 간주하지만,이 프로토콜에서와공간 학습 후 24 시간의 imeline은 단기 기억 간주 1 주일 장기 메모리로 간주된다. 프로브 시험 사이-이 일주일 동안의 기간 동안, 래트 모리스 물 미로 공간 참조 메모리와의 간섭을 피하기 위해 다른 행동 작업이나 불필요한 스트레스에 노출되지 않아야한다.
공간 학습에 관해서는 실험자는 일정 시간 동안 점프없이 플랫폼에 앉아 쥐를 요구에서 지속해야한다. 쥐가 성공적으로 플랫폼에 앉아 있지만, 실험자 시력에 와서에서 이동하는 경우, 쥐 배치 또는 다시 플랫폼에 대한 안내와 실험이 동물을 검색 할 때까지 플랫폼에 앉아해야합니다. 물을 탈출 할 수있는 유일한 방법으로 플랫폼의 학습을 적용하려면, 쥐 프로브 시험 설정에서 제외하고, 수영하는 동안 포착 할 수 없습니다. 쥐가 풀의 가장자리에 플랫폼에서 뛰어 관리하는 경우, 플랫폼, 이동 고려탈출의 대체 경로의 학습을 방해하는 풀의 중심을 향해 더 해요.
공간 및 큐 학습시에는 공간 편견이 없는지 확인하기 위해, 치료 그룹의 각 쥐의 시작 위치와 큐 플랫폼의 위치를 무작위되어야한다. 각 치료 그룹은 공간 학습에 대한 각각의 시작 위치에서 시작하거나 큐 학습을위한 동일한 시작과 플랫폼의 위치 패러다임을 다음 쥐의 대표 번호가 있어야합니다. 시작 위치를 지정하는 경우, Vorhees와 윌리엄스는 공간 학습과 (20)를 학습 큐에 대한 무작위 시작 및 플랫폼 위치에 대한 무작위 시작 위치의 매우 상세한 세트를 제시한다. 이것은 처음 모리스 물 미로 시험 전에 각 래트에 위치를 할당하기 위해 직접 또는 가이드 라인으로 이용 될 수있다.
모리스 물 미로 데이터의 분석을위한 프로토콜에서 제안 상기에 제시된 데이터 취득 상황을 나타낸다. 날엔A가 상술 모리스 물 미로 프로토콜의 단계 3.6에서 수집은인지 결핍을 설명하는 것이 유용 할 수있는 다양한 결과 측정을 계산하기 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 수치 데이터 집합을 넘어, 추적 소프트웨어는 실험자에게 동물의 검색 전략에 추가 통찰력을 줄 수있는 트랙 플롯을 분석 할 수있는 기회를 제공합니다. 또한, 시간 비율 지출 또는 모든 사분면에 대하여 목표 사분면 내의 이동 거리 프로브 시험에서 기준 메모리의 척도로서 사용될 수있다. 이들 공동 병적 동물 모델은 일부 모터 적자를 나타낼 수 있음을 염두에 두어야하는 것이 중요하다. 실험 그룹 중 수영 속도를 비교하는 것은 잠재적 인 모터 적자가 모리스 물 미로에서 수행 할 수있는 동물의 능력에 영향을 미치는 여부를 표시를 제공 할 수 있습니다. 또한, 물 미로 결과에 교란 요인이되는 것을 모터 성능을 제외, 플랫폼에 도달하는 경로 길이 볼 것을 권장합니다뿐만 아니라 대기 시간도 5 및 6에서 입증 된 바와 같이 속도를 수영. 수영 기능이 어떠한 방식으로 손상되면, 경로 길이 해마 기능을 평가하는 가장 정확한 측정이다.
이러한 행동 기재된 모든 작업에 적용 할 수있는 다양한 다른 타임 라인이 있지만, 각각의 실험을 실행하는 방법은 동일하게 유지한다. 여기에 제시된 데이터는 뇌졸중과 뇌의 Aβ 대사와의 잠재적 인 상호 작용 후 초기 이벤트를 캡처하는 이십일일 뇌졸중 후 회복 시점으로 달성되었다. 여기에 제시된 데이터는 뇌졸중, 알츠하이머 병의 공동 병적 모델에있는 동안, 이러한 작업에 적용되는 각종 연구 질문 및 모델에 맞게 적용 할 수 있습니다. 실린더 테스트 덜 수정 표준 절차 동안, 상기 빔 워크 작업은 다소 적절한 빔 widt 선택하여 예상 운동 부족의 정도를 조정할 수있다HS. 물 미로는이 문서에서 언급 된 모든 패러다임의 가장 다재 다능 한 테스트입니다. 예를 들어, 상기 취득 단계의 끝 쉽게 단기 및 장기 메모리를 테스트 할 수있는 공간 레퍼런스 메모리 프로브 시험간에 다양한 간격으로 선택. 메모리 및 전략 변속 작동, 집행 기능의 두 성분은 또한 물 미로 설정을 이용하여 테스트 할 수있다. 작업 메모리를 평가하기 위해, 간 시험 구간은 새 플랫폼 위치 취득 학습 중에 1 분 이하로 감소 될 수있다. 또한, 동물은 초기 플랫폼 위치의 성공적인 인수 후 플랫폼의 제 2의 새 위치를 배울 수있는 것은 정신적 유연성이나 전략의 변화를 테스트 할 수 있습니다. 이러한 잠재적 인 변형을 모두 고려하여, 모든 전술 한 이점에 더하여 또 다른 주요 이점은 이러한 동작 과제와 많은 유연성이있다.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cylinder | Western University | Plexiglas Cylinder Cylinder Diameter: 23 cm Cylinder Height: 40 cm Platform Height: 30 cm Mirror Length: 35 cm Mirror Width: 26.5 cm |
This was made specifically by Western University Machine Services for our lab. Please contact your own chosen manufacturer to design this product. |
| Handheld Video Camera | JVC | GZ-E200 | |
| Video Camera Tripod | Slik | F163 | |
| AM/FM Clock Radio | Sylvania | SCR1388 | |
| White Board | Walmart | Width: 71.12 cm Height: 55.88 cm |
These can be purchased at any store (i.e. Walmart, University bookstores) |
| Dry-erase Marker | Expo | Expo Dry-erase Original Marker | These can be purchased at any store (i.e. Walmart, University bookstores) |
| Wooden Beam | Rona | Plywood Width: 2 cm Length: 100 cm |
|
| VWR General Purpose Laboratory Tape | VWR Intl. | 89097-920 | |
| iMovie '11 | Apple Inc. | Version 9.0.9 (1795) | This is the version used in this manuscript, but any other iMovie version or video editing software could be used. |
| Morris Water Maze Pool with Platform | Stoelting Co. | 60136/60035 | These are not the exact products used in the video, but these are essentially identical. |
| Platform Cue | - | - | The platform cue used was created using a small metal stand and white spherical foam ball. These can likely be purchased at any store with home improvement materials (i.e. Walmart, Rona etc.) |
| Mainstays 71" Floor Lamp | Walmart | HW-F0377SLV | |
| ANY-Maze Behavioural Tracking Software | Stoelting Co. | 60000 | There are ANY-maze® bundles that include the camera with or without a computer and accessories. |
| Compact Video Camera | Logitech | V-U0023 | |
| Laptop | Hewlett-Packard | HP Pavilion dv6 Notebook PC | Laptop Specifics: AMD A6-3420M APU with Radeon HD Graphics 1.50 GHz, 6.00 GB RAM, 64-bit operating system. |
| Americana Non-toxic Acrylic Paint | DecoArt | DAO67-9 | This can be ordered on the DecoArt site or purchased in store at DecoArt retailers. |
| Poster Board | Walmart | PA-1961 |
References
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