Summary
Для того, чтобы исследовать коморбидными болезнь Альцгеймера (AD) и состояние инсульта в новой модели, три задачи поведения описаны, которые оценивают как управление двигателем и когнитивные модели поведения. Эти задачи включают в себя задачу пучка ходить, задача цилиндра и водном лабиринте Morris.
Abstract
Болезнь Альцгеймера (AD) является нейродегенеративным изнурительной болезни, что приводит к нейродегенерации и потери памяти. Хотя возраст является основным фактором риска развития БА, инсульт также вовлечен как фактор риска и фактор усугубляя. Коморбидность инсульта и АД приводит к ухудшенной инсульта, связанных с управлением двигателя и AD, связанных с когнитивными нарушениями по сравнению с только каждого условия. Для моделирования сложенном состоянии инсульта и БА, новой трансгенной модели крысы AD, с мутантной формой белка-предшественника амилоида (ключевого белка, участвующего в развитии AD), включенному в его ДНК, дается небольшой односторонний полосатой инсульт.
Для модели с комбинацией обоих инсульта и БА, поведенческие тесты, которые оценивают инсульт, связанные с управление двигателем, двигательную и AD связанных с когнитивной функции должны быть реализованы. Задача блока цилиндров включает в себя экономичный, многофункциональный аппарат, который оценивает использование двигателя спонтанное передних конечностей, В этой задаче крысу помещают в цилиндрический аппарат, где крыса будет самопроизвольно сзади и обратитесь к стенке цилиндра с его конечностями. Эти контакты считаются использование двигателя передней конечности и количественно при анализе видео после тестирования. Другой экономичный двигатель задача реализована задача луча ходьбы, которая оценивает контроль передних конечностей, контроль задних конечностей и двигательную. Эта задача включает в себя крысиный ходить по деревянным брусом, позволяющим для оценки конечностей управления двигателем на основе анализа промахов передних конечностей, задних конечностей поскользнуться и упасть. Оценка обучения и памяти завершается Морриса водный лабиринт для этой поведенческой парадигмы. Протокол начинается с пространственного обучения, в результате чего крыса локализует стационарной скрытой платформы. После того, как пространственное обучение, платформа удаляется и как краткосрочные и долгосрочные пространственной привязки памяти оценивается. Все эти три задачи чувствительны к различиям в поведении и завершены в течение 28 дней для этой модели, что делает этот пунктДИГМ времени эффективным и экономически эффективным.
Introduction
Болезнь Альцгеймера (AD) является наиболее распространенной формой деменции у пожилых людей и изнурительных нейродегенеративных заболеваний. Гистопатологически, AD представляет себя как амилоидных бляшек, нейрофибриллярных клубков и гибель нейронов. Амилоидные бляшки в основном состоят из бета-амилоидного пептида (Ар), разрабатываемой через измененное протеолитического расщепления белка - предшественника амилоида (АРР) путем бета-секретазы и гамма-секретазы ферменты 1,2,3. Продукт расщепления, A & beta;, депозиты в головном мозге создавая патологических амилоидных бляшек и оказывает токсическое воздействие на мозг, что может привести к характерным нарушениями обучаемости и потерей памяти. Все эти шаги вместе именуются как "амилоидного каскада" гипотезы 3,4. В то время как эта гипотеза имеет важное значение при исследовании AD, другие клеточные изменения были обнаружены предварить эти образования зубного налета, который отходит от первоначального амилоидного каскада пути. Эти другиеклеточные изменения , как полагают, способствуют ранней потери памяти, обучения и нарушения других когнитивных дисфункций , связанных с AD до образования бляшек 3,5,6.
С нашей эры становятся все более распространенными, факторы риска развития БА становятся чрезвычайно важным объектом исследований. Хотя возраст является основным фактором риска для спорадических форм AD, другие факторы риска были выявлены, в том числе инсульта 7,8. Инсульт является не только фактором риска, но он также может приводить к обострению уже существующих деменций. Например, клинически, прогрессирование БА было показано, что хуже , у пациентов , которые ранее испытывали инсульт 9. Кроме того, увеличение экспрессии APP и накопление A & beta были обнаружены в экспериментальных животных моделях токсичности в сочетании Ар с индуцированными инсульта 10,11. Так как это важно взаимодействие между инсультом и БА, крайне важно, чтобы эти два патологиями быть дополнительно исследованвместе в коморбидных моделей, чтобы лучше понять патофизиологию и поведение замешан в обоих условиях.
Для исследования сопутствующих патологических состояниях, соответствующая модель должна была быть разработана, в котором инсульт может взаимодействовать с A & beta; производить AD-подобные патологии. В первый раз, трансгенной крысы APP21, который имеет мутантный ген АРР человека включены в его ДНК была использована для достижения соответствующей модели AD. Мутации являются шведское двойной Миссенс и Индиана сингл миссенс мутации, которые оба были замешаны в семейных форм AD 4,8,12. При отсутствии дополнительного инсульта, эта модель крысы возрастов без разработки характерных бляшек A & beta или нейрофибриллярных клубков 12. Таким образом, в стремлении побудить AD-как поведенческое патология, небольшой инсульт вводится в правую стриатума , чтобы имитировать небольшие подкорковые инсульты часто присутствующие в слабоумием пациентов 9. Ход в трансгенной ра APP21т воплощает коморбидными состояние и позволяет исследовать различные типы поведенческих изменений, замешанных в обоих болезненных состояний. В частности, это индукция AD-подобные патологии и когнитивных нарушений у взрослых крыс позволяет исследовать самые ранние молекулярные и когнитивные изменения, предшествующие AD.
Поскольку цель состоит в том, чтобы определить первые признаки поведенческих изменений и поскольку оба инсульта и AD имеют очень четкие поведенческие патологии, при изучении коморбидными модели, задачи поведения необходимо оценить различные поведенческие фенотипы. Есть батарея относительно чувствительных тестов, которые можно сделать, чтобы проанализировать двигатель и познавательное поведение в моделях грызунов, которые включают множество парадигм и оборудования. Для того, чтобы конкретно проанализировать и передних конечностей задних конечностей моторной функции, задача цилиндра задачи и пучка ходьбы были реализованы для выявления дефицита моторных и контролировать двигательную в этой модели. Другие чувствительные задачи, разработанные специально для оценки штрафа FOrelimb двигательных навыков (т.е. задача лестницы и одной гранулы достижения задачи) требуют лишение пищи 11,13,14. Для того, чтобы избежать какой - либо из известных эффектов пищевой депривации на состояние здоровья пациента патологии 15,16,17, эти тесты были признаны непригодными для данного исследования. Задача цилиндра оценивает спонтанное использование передних конечностей у крыс во время выращивания в новой среде и может обнаружить асимметрию между конечностями у крыс с односторонним ударом 10,18. Основным преимуществом для решения этой задачи является то , что устройство может быть использовано для выполнения других задач поведения, таких как Порсолта принудительного плавания задачи 19. В отличие от задачи цилиндра, задача луч-прогулка также позволяет анализировать и задних конечностей управления двигателем передних конечностей, в дополнение к locmotion 10,14. Beam ходьба включает в себя компонент двигательную, компонент баланса и квалифицированного размещение ноги. Оба этих испытаний являются экономически эффективными, простой и эффективный по времени и поясняющие эффекты инсульта и АД на д ifferences в функционировании конечностей.
Помимо изменений в моторной функции, AD включает в себя нарушения памяти, которые могут представить на ранних стадиях развития болезни. При обращении AD-подобных патологий в модели грызуна, крайне важно , чтобы гиппокампа зависит от обучения и памяти оценивается потому , что гиппокамп является важной структурой мозга в значительной степени затронуты в AD 2. Гиппокамп является одним из важнейших область мозга для пространственного обучения и памяти и ее функции могут быть проверены с использованием различных лабиринтов парадигм у грызунов. Одним из широко используемых в основном задач для лабиринту грызунах моделей различных заболеваний является водном лабиринте Морриса 20. Водный лабиринт Морриса использует пространственные сигналы, чтобы помочь крысу в поиске стационарной скрытой платформы и тесты пространственной долговременной памяти, когда платформа будет удалена. Ценным преимуществом установки с водным лабиринтом является то , что она хорошо адаптируется в зависимости от предлагаемого вопроса исследования 20.
палатка "> Впервые методы, описанные были использованы для оценки двигателя и когнитивные функции в новой коморбидными модели инсульта у крыс и АД. с участием небольших инсультов в трансгенной модели крыс APP21. Сопутствующие заболевания было достигнуто за счет индукции вазоконстрикция кровеносных сосудов в стриатуме , чтобы произвести небольшой удар в APP21 трансгенных крыс. Эта модель инсульта была хорошо известна в качестве со-болезненное состояние в альтернативной модели крысы 11 AD. Продвижение в этом романе APP21 трансгенная модель крысы предназначалась для получения более поступательно ценную модель. в то время как поведенческие задачи описаны с использованием коморбидными инсульта и А. Д. крысиную модель, эти задачи могут быть дополнительно применены к другим моделям инсульта или моделей других неврологических заболеваний (например болезнь Паркинсона). общий описанная методология будет широко применяться к этим другим болезненных состояний, но поведение временные рамки и парадигмы могут потребовать изменения на основе предложенных Резвопрос и нить поиск модели. В дополнение к адаптации, задачи, описанные эффективны в демонстрации незначительных дефицитов, в то же время доступные по цене и времени эффективным.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Соответствующий институциональный комитет по этике животных должны одобрить все поведенческие процедуры до начала экспериментов. Все животное работа, описанная здесь, была утверждена Western University Animal подкомитетом Использования и следует Канадский совет по руководящим принципам ухода за животными. Эти эксперименты на животных проводили в течение легкой фазы.
1. Цилиндр Задача по оценке Gross Motor передней конечности
- Установка оборудования
- Приобретают цилиндр из плексигласа с перфорированной крышкой, которая скорректирует размер крысы, используемого для эксперимента. Размер цилиндра не должен позволять крысы, чтобы достигнуть вершины при выращивании и она должна позволить 2 см между стеной и носа крысы и основания хвоста крысы. Стандартный размер цилиндра составляет 23 см в диаметре и 40 см в высоту для 6-месячного (400-600 г) крыс.
- Поместите зеркало под углом 45 ° ниже устройства цилиндра с цилиндром сидит на PLExiglas стоять или какой-либо другой формой поддержки приблизительно 30 см выше верхней части таблицы.
- Настройка видеокамеры на штатив на соответствующем расстоянии, чтобы визуализировать весь диаметр цилиндра в зеркале на видеокамеру.
- Включите освещение на диммер настройки и играть белый шум в комнате (т.е. низкий объем, тонкая музыка) , чтобы уменьшить влияние резких громких звуков. Это должно помочь стимулировать движение и предотвращения замерзания из-за громких звуков.
- Экспериментальная процедура
- Перемещение крыс в экспериментальной комнате 30 минут до начала первого судебного процесса акклиматизации крыс в комнату с музыкальным воспроизведением и диммер освещения.
- Напишите соответствующее животное и пробную информацию (т.е. количество животных, изо дня в сроки и пробный номер) на небольшой белой доске. Поместите эту доску перед зеркалом.
- Нажмите запись на видеокамеру с белой доске перед зеркалом, возьмите крысу вблизи основания Oе хвост, поместите крысу в цилиндре и зафиксировать крышку. Отойди в сторону цилиндра, чтобы избежать вмешательства с возможностью записи видео.
- Удалите белую доску от перед зеркалом и пусть рекорд видео камера крысу в цилиндре в течение 5 минут (используйте таймер для записи 5 мин от момента, когда белая доска удаляется). Это одно испытание.
- Очистите цилиндр с бумажным полотенцем и водой после суда.
- Повторите шаги 1.2.2-1.2.5 еще два раза, чтобы достичь в общей сложности трех испытаний. Там должно быть 20-30 мин между пробный время, чтобы уменьшить вероятность привыкания к цилиндру. В течение этого времени запуска цилиндров испытаний для других крыс.
- Анализ видео
- Видеокамеры Импорт файлов в программе редактирования видео (т.е. IMOVIE)
- Компиляция видео на клипы для каждого испытания. Отключение звука громкость видео и уменьшить скорость видео до 25% от оригинала.
- Подсчитайте количество контактов передних конечностейсо стенкой цилиндра для левой и правой передних конечностей. Для одновременных левых и правых контактов, рассчитывать эти контакты как передних конечностей "и". Имейте в виду, что видео записывается через зеркало, то, как представляется, левая передняя конечность в видео соответствует правой передней лапы животного в реальности.
- Рассчитайте использование процентов пораженной передних конечностей (контралатеральной к обводке), используя следующее уравнение: [{(затронутый контакты + ½ двусторонние контакты) / общее количество контактов} х 100]. Производительность обеих групп мышей дикого типа и трансгенного группе без инсульта считаются группы сравнения, чтобы оценить презентацию проблем болезни, вызванной.
2. Балка прогулка Задача для оценки моторики
- Установка оборудования
- Приобретают гладкая запечатанный деревянный брус, который составляет 2 см в ширину и длину приблизительно 120 см (оптимальная ширина для 200-600 г крысы).
- Поместите две таблицы или стеллаж ипего 100 см друг от друга. Поверхности каждого блока должна быть примерно 40 см над поверхностью земли.
- Закрепите оба конца балки к столу или стеллаж поверхность с помощью липкой ленты. Приблизительно 1 м неподдерживаемого длины балки должна теперь быть поднята на 40 см над землей.
- Настройка видеокамеры на подставке, захватывая по всей длине балки. Для усиления контраста в видео, рассмотреть вопрос о введении черного фона позади луча при использовании белых крыс.
- Экспериментальная процедура
- Перемещение крыс в экспериментальной комнате 30 минут до начала первого судебного процесса акклиматизации крыс в комнату с музыкальным воспроизведением и диммер освещения.
- Поместите дом клетке или окружающей среды с обогащением трубки крысы на одном конце балки и поместите крысу на другом конце балки.
- Провести несколько незаписанный трасс за два дня до экспериментальных испытаний. Пусть крыса исследовать область и направлять крысу в направлении луча, удерживая основание крысы'Хвост.
- После того, как крыса пересечет луч, перемещать клетку или трубки к другому концу балки и повторите. Когда крыса пересекает луч свободно в любом направлении, тренировка закончилась. Держите количество тренировочных заездов согласуется среди всех животных.
- Напишите соответствующее животное и пробную информацию (т.е. количество животных, изо дня в сроки и пробный номер) на небольшой белой доске. Лента эта белая доска на стене позади луча.
- Поместите домашней клетки или среды обогащения трубки крысы на одном конце балки.
- Пресс-запись на видеокамеру и выбрать крысу вверх по основанию хвоста и место на конце балки, противоположной домашней клетки или трубки.
- Запишите полноту судебного процесса, который заканчивается, когда крыса успешно завершил обход по всей длине надземной пучка. Если крыса делает паузу на полпути поперек пучка, осторожно загривок крысы на основании хвоста или коснуться хвоста крысы нежносодействовать движению поперек пучка. Не толкайте крысу вперед каким-либо образом.
- Повторно делать испытания, когда крыса поворачивается в то время как на коромысле, неоднократно останавливается при ходьбе или ходит непоследовательно. Если крыса падает и продолжает висеть на балке, аккуратно выкопать крысу и поместить его обратно на балку в положении падения и продолжить судебный процесс.
- Перемещение дом клетке или трубки на другом конце балки, изменить пробный # на белой доске и записывают последующее исследование.
- Повторите эту процедуру до тех пор, в общей сложности 6 испытаний не были завершены, с 3-мя испытания регистрируются для каждого направления. Все 6 испытаний для крысы могут быть записаны перед началом испытания на следующей крысы.
- Анализ видео
- Импорт видео камеры файлы в программу для редактирования видео (т.е. IMOVIE).
- Компиляция видео на клипы для каждого испытания и приглушить громкость видео. Анализ каждого видеоклипа кадр за кадром.
- Подсчитайте числоот общего количества шагов крыса требуется, чтобы ходить по всей длине луча и общее количество левых и правых задних конечностей и передних конечностей промахов и общее количество падений. Производительность обеих групп мышей дикого типа и трансгенная группа без инсульта считаются по сравнению с коморбидными группе оценить появление дефицита уникальных для совместного болезненного состояния.
3. Моррис Водный лабиринт для гиппокампа-зависимой пространственного обучения и долговременной памяти
- Установка оборудования
- Закрепить видеокамеру, расположенную над центром круглого бассейна (диаметром 148 см и глубиной 58 см). Совместите четыре квадранта, обозначенные должным образом с контуром бассейна в программе слежения.
- Заполните круговой бассейн с водой около 36 см в глубину. Вода должна быть нагрета до комнатной температуры путем наполнения бассейна через несколько дней до начала экспериментального протокола.
- Добавить черный нетоксичного акриловая краска ООНсезам вода непрозрачна при использовании белых крыс. Используйте светлый цвет, например белый, для более темных цветных крыс.
- Окружите бассейн с пустыми стенных поверхностей, в том числе перегородок, если это необходимо. Когда в бассейне, крыса не должна быть в состоянии видеть экспериментаторов.
- Вырезать 4 больших различной формы пространственные сигналы из различных цветов ватмана и прикрепите одну форму на стене в назначенный север, восток, юго-восток и юго-запад местах бассейна. Эти сигналы должны быть немного выше, чем край бассейна.
- Включите радио на низком уровне громкости в северо-западном секторе, чтобы предотвратить крысу от отвлекаясь на неожиданных громких звуков во время тестирования.
- Поместите круглую платформу (диаметр 11,5 см, поверхность на 2-3 см ниже уровня воды) в центре мишени квадранте.
- Выключите основной комнате освещение и поверните на пол торшер на противоположной стороне делителя комнаты к бассейну, чтобы осветить зону.
- Конфигурация компьютера
- Установить 4 дня подряд с 4 испытаний 90 сек каждого пространственного обучения эксперимента.
- Набор 2 отдельных экспериментов зонд 30 с каждой через 24 часа после последнего пространственного обучения методом проб и через 1 неделю после первого эксперимента зонда.
- Набор учебных испытаний подают реплики на 4 испытаниях в день в течение 2 дней подряд, начиная через 24 ч после второго эксперимента зонда. Каждое испытание должно быть 60 с общей.
- Для каждого этапа, установить порядок тестирования таким образом, что существует 20 мин между пробный интервал между каждым испытанием для любого данного животного. Другие животные могут быть запущены в течение Внутриструктурные испытательного интервала, до тех пор, как каждое животное сохраняет 20 мин между пробный интервал.
- Убедитесь, что положение платформы должна быть определена экспериментатором и что все другие зоны деоштрафован назначенным положением платформы.
- Установите программу для ручного запуска и завершения каждого испытания.
- Поместите круглую платформу в юго-западном секторе. Он должен быть совмещен с круговой обозначенной "платформы" области в квадранте на компьютерной программе.
- Стартовые позиции вокруг бассейна должны быть рандомизированы для каждой крысы. Представляют все стартовые позиции в каждой группе лечения. Ни одна крыса не начинается с позиции северо-восточного для любых пространственных учебных испытаний в парадигме, представленных для обеспечения новой стартовой позиции во время тестирования зонда.
- Держите крысу у основания хвоста и аккуратно поместить его в воду вдоль стенки бассейна в указанном месте старта и быстро выйти из поля зрения крысы.
- Есть другой экспериментатор запустить программное обеспечение для отслеживания, как только крыса находится в воде. Таймер должен начать отсчет от 0 до о программе слежения. Если крыса находит платформу, имеют другой экспериментатор остановить судебный процесс на компьютере и оставить крыса на платформе, по крайней мере, 30 секунд перед извлечением его. Если крыса прыгает с платформы до суда останавливается на компьютере, судебный процесс продолжается.
- Если крыса не находит платформу в отведенное время судебного разбирательства, направлять крысу на платформу, используя ваши руки (либо делает крыса следовать за руку или направлять крысу основания хвоста). Держите крысу на платформе в течение 30 сек.
- Удалить крысу из пула с помощью основания хвоста на руку экспериментатора, которая покрыта полотенцем или пусть крыса забираются на портативном поверхности.
- Повторите шаги 3.3.3-3.3.7 в общей сложности 4 испытаний на крысу. Там должно быть между пробный интервал 20 мин для каждой крысы.
- Возвращение крыс в их родную клетку под нагревательной лампой в течение по крайней мере 10 минут после последнего пространственного обучения суда крысы.
- Продолжить EXAкт же пространственный протокол обучения для 2-й день через 4-й день пространственного обучения.
- В день 2-4, не держат крыса на платформе больше. Дайте крысе сидеть на платформе без посторонней помощи в течение 30 секунд с экспериментаторами из виду. Это может быть сделано в ходе последующих испытаний на 1-й день по случаю.
- Извлеките платформу из пула. Убедитесь, что предыдущее положение платформы по-прежнему определяется на компьютере (круг в юго-западном секторе).
- Поместите крысу в воде вдоль стенки бассейна в положении к северо-востоку и быстро выйти из поля зрения крысы. Использование романа на северо-восток начальная позиция гарантирует, что крыса напоминает позицию платформы, независимой от ранее подготовленных стартовых позиций.
- Есть другой экспериментатор запустить программное обеспечение для отслеживания, как только крыса находится в воде. Таймер должен начать отсчет от 0 до на отслеживания программного обеспечения.
- Получить крысу изк юго-западу квадранта бассейна основанием хвоста и держать на полотенце покрытой рукой или пусть крыса забираются на портативном поверхности.
- Возвращение крыс в их родную клетку под нагревательной лампой в течение по крайней мере 10 минут после суда зонда каждой крысы.
- Повторите этот эксперимент (шаги 3.4.1-3.4.5) 1 неделю спустя.
- Используйте ленту, чтобы обеспечить диаметр 4 см белый сферическую кий на подставке, которая составляет 8,5 см в высоту на платформе (общая высота кия составляет 12,5 см). В верхней части сферического реплике будет по меньшей мере 8,5 см над уровнем воды.
- Удалите пространственные сигналы от стен, окружающих бассейн.
- Перемешайте позиции платформы и начать позиции для каждой крысы в каждой группе. Все позиции платформы и начала должна быть представлена для каждой экспериментальной группы.
- Поместите платформу в обозначенном районе платформы и определить в программном обеспечении отслеживания.
- Поместите Растворим в воде вдоль стенки бассейна при Тон назначил стартовую позицию и быстро выйти из поля зрения крысы.
- Есть другой экспериментатор запустить программное обеспечение для отслеживания, как только крыса находится в воде. Таймер должен начать отсчет от 0 до на отслеживания программного обеспечения.
- После того, как крыса достигает платформы, есть другой экспериментатор остановить судебный процесс на компьютере. Если крыса прыгает с платформы, судебный процесс продолжается. Перед получением крысу, позволяют крысы сидеть на платформе в течение 15 сек.
- Получить крыса из пула с помощью основания хвоста и держать на полотенце покрытой рукой или пусть крыса забираются на портативном поверхности.
- Проверьте положение платформы для следующей крысы и перемещения платформы в соответствующей области, определенной в программе слежения.
- Повторите шаги 3.5.4-3.5.9 для следующих 3 испытаний. Там должно быть между пробный интервал 15 мин.
- Возвращение крыс в их родную клетку под нагревательной лампой в течение по крайней мере 10 минут после FINA каждой крысыл подают реплики обучения суда.
- Продолжить тот же протокол для 2-й день обучения подают реплики.
Примечание: Время, проведенное в зонах, расстояние, пройденное в зонах, средняя скорость, количество записей в зоны и время до первого въезда в зоны часто используются.
- Анализировать время и расстояние, чтобы добраться до зоны платформы и среднюю скорость в день пространственного и обучения отдельно подают реплики. Для экспериментов с зондами, анализировать латентность первой записи в целевую зону в качестве исходного времени или изменения в процентах от зонда 1 до зонд 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Поведенческие задачи, описанные были использованы для демонстрации влияния инсульта в качестве APP21 трансгенной крысиной модели болезни Альцгеймера. Сочетание инсульта и трансгена APP21, как ожидается, приведет к большему дефициту двигателя в пораженных конечностей, а также к усилению нарушения памяти.
Задача цилиндра оценивали валовой функции передней конечности двигателя и представлена как использование пораженной передней конечности. Кроме того, задача луча ходьбы была использована специально для оценки двигательной функции задних конечностей и двигательную. Так как инсульт индуцировали в правой стриатума, левая передняя конечность, как ожидается, чтобы показать моторный дефицит, если он присутствует. Данные , представленные в обоих рисунках 2 и 3a и 3b не статистически демонстрируют , что совместное болезненное крыс имеют дефицит передних конечностей или задних конечностей, соответственно. В то время как эти животные не аргруши, чтобы иметь передних конечностей или задних конечностей моторных дефицитов, они по всей видимости, имеют незначительные различия в моторной функции, относящиеся к передвижению. В задаче пучка блужданий всего шагов были значительно увеличены в коморбидных трансгенных крыс с инсультом (р <0,05, рис 3в), предполагая , что задача луч прогулка достаточно чувствителен , чтобы подобрать незначительные изменения в походке и передвижению. Небольшой полосатой модель удара используется производит небольшие штрихи, которые , вероятно , слишком малы , чтобы производить каких - либо серьезных дефицитов двигателя, но дефицит было продемонстрировано ранее в других моделях инсульта с этими двумя задачами 10,14. Вот эти задачи могут просто контролировать функцию двигателя и двигательную при исследовании параметров, представленных.
Гиппокампа зависит от пространственной памяти и обучения ссылка может быть эффективно оценены с использованием водного лабиринта Морриса. Там не было никаких очевидных различий в обучении между группами (рис 5а >, 5б), поэтому различия в обучении не может учитывать любые различия в производительности памяти. APP21 трансгенных крыс, перенесших инсульт , продемонстрировали надежный дефицит долгосрочного обращения к памяти по сравнению с трансгенными крыс без инсульта и дикого типа крыс с инсультом (р <0,05, рис 5в).
Cued обучения завершается, чтобы гарантировать, что крысы имеют одинаковую способность использовать визуальные пространственные сигналы для обнаружения платформы в водном лабиринте Морриса. Как показано на рисунке 6а и 6b рис, не наблюдалось различий в латентном или длина пути , чтобы достигнуть платформы во время обучения между подают реплики групп. Кроме того, средняя скорость плавания согласуется между группами (рис 6в) и показывает , что мотивация бежать и плавать способности была равна между группами.
1 цифра "SRC =" / файлы / ftp_upload / 53089 / 53089fig1.jpg "/>
Рисунок 1:. Временная шкала для двигателя и оценки когнитивных поведения Инсульт индуцирующего хирургии день назначается день 0 и все испытательные дни в ссылке на этот день. (A) Предварительно хирургии и послеоперационной тестирования для цилиндра задачи (C) и задачи пучка блужданий (БМ). (B) Моррис водном лабиринте пространственное обучение, тестирование зонда и Cued обучения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 2: использование Процент пораженной передней конечности цилиндра Задача была рассчитана с использованием уравнения на шаге 1.3.4 и стандартизировать день -3 базовых значений. Красная пунктирная линия помечает значение 1.0, которое представляет равное использование каждогопередней конечности в задаче цилиндра. Дикий тип сокращенно WT и трансгенными сокращенно TG. числа животных являются следующие: WT + физиологический раствор (n = 7), Bт + ход (N = 8), ТГ + физиологический раствор (N = 8), ТГ + ход (п = 6). Все значения представлены как среднее ± SEM. (Двусторонний ANOVA, Тьюки постфактум). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рис . 3: задача Луча-прогулка Сумма всех промахов производится с (А) , пострадавших и (В) не влияет задних конечностей через 5 испытаний представлен как отношение общего количества шагов , предпринятых , чтобы пересечь луч. Значения были стандартизированы к исходным значениям следующим образом: отношение послеоперационной - отношение предоперационного. (C) общие шаги , чтобы пересечь пучка O п день -7 и день 21. Дикий тип сокращенно WT и трансгенными сокращенно TG. числа животных являются следующие: WT + физиологический раствор (n = 6), Bт + ход (N = 6), ТГ + физиологический раствор (N = 6), ТГ + ход (п = 5). Все значения представлены в виде среднего значения ± SEM, и звездочки указывают статистическую значимость. (Односторонний ANOVA, Тьюки постфактум, р <0,05). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Вид программы демонстрации разделы , необходимые для установки и проведения эксперимента Некоторые выделены особенности программы слежения , используемой для Морриса водный лабиринт.. Вид аппарата с видео бассейна признакам выше будет появляться только как представлено, когда на вкладке тесты.3089fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: пространственное обучение и обращение к памяти у водном лабиринте Morris , пространственное обучение измеряли с помощью (A) инкубационный период и (б) длины пути для достижения платформы.. (C) Исходная память была измерена как процентное изменение латентности к первой записи в целевую зону на испытания зонда день 19 по сравнению с испытанием зонда день 12. Дикий тип сокращенно WT и трансгенными сокращенно TG. числа животных являются следующие: WT + физиологический раствор (n = 8), Bт + ход (п = 7), ТГ + физиологический раствор (N = 7), ТГ + ход (п = 8). Все значения представлены в виде среднего значения ± SEM, и звездочки указывают статистическую значимость. (Двусторонний ANOVA для пространственного обучения и односторонним ANOVA для тестирования зонда, Тьюки постфактум, р &# 60;. 0.05) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6:. Cued обучение в водном лабиринте Morris (A) инкубационный период и (В) длину пути , чтобы достичь платформы заявлены как среднее из всех восьми испытаний обучения. Скорость (C) Swim представлена как среднее из всех восьми испытаний обучения. Дикий тип сокращенно WT и трансгенными сокращенно TG. числа животных являются следующие: WT + физиологический раствор (n = 8), Bт + ход (п = 7), ТГ + физиологический раствор (N = 7), ТГ + ход (п = 8). Значения представлены как среднее ± SEM. (Односторонний ANOVA, Тьюки постфактум). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этогоцифра.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Сочетание инсульта и приводит к болезни Альцгеймера в очень различных поведенческих патологий, которые могут повлиять как двигатель и когнитивные функции в зависимости от тяжести состояния каждого. Таким образом, необходимо использовать разнообразные поведенческие задачи, чтобы определить отдельные вклады этих условий, а также дают некоторое представление о комбинированную и потенциально интерактивных эффектов в коморбидными состоянии. Представленные данные показывают три экономически эффективным, эффективный по времени и деликатных задач поведения для оценки двигательной функции и гиппокампа зависимую пространственное обучение и память в справочную новому коморбидными APP21 трансгенной модели крыс с инсультом. В дополнение к данным , представленным, эти задачи были проверены в более тяжелых моделях инсульта 10,14,18, а также в моделях 8,16 AD и должны быть широко применимы к различным моделям обоих заболеваний.
Это, как говорится, ни одна из задач не без Limitations. Для моторных задач В частности, некоторые устранения неполадок может потребоваться, если крысы становятся приучены к цилиндру и балкой. В задаче цилиндра, мотивация может потребоваться для обеспечения крыса достигает соответствующее количество передних конечностей контактов со стенкой цилиндра. Для достижения этого результата, применение нетоксичного запах на перфорированной крышке или стенке цилиндра может мотивировать крысу к задней части и связаться со стенкой цилиндра с его конечностями. Например, немного арахисового масла или экстракта ванили можно намазать на внутренней стенке близко к верхней части цилиндра, чтобы дополнительно стимулировать сидячий крыс, чтобы исследовать стенки цилиндра. Кольцо из цветной лентой также может быть нанесен на внутренней стороне цилиндра ¾ от нижней части цилиндра. Другой способ продвижения воспитание включает в себя удаление сидячий образ крысы и повторного введения его в цилиндр после того, как прошло некоторое время, которое было достигнуто при междугодич- следственном интервала в протоколе. МехThermore, в зависимости от высоты цилиндра по сравнению с длиной крысы, удаляя перфорированную крышку на полпути через испытание может подсказать по воспитанию и передних конечностей контакт с стенкой цилиндра. Это не должно быть сделано, если есть возможность крыса сможет выйти из цилиндра во время тестирования. Эти мотивы могут помочь увеличить количество тылам, но они не должны влиять на использование левой и правой передних лап во время контакта стенки. Если есть все еще вызывает серьезную озабоченность в связи с недостаточным количеством контактов передних конечностей после реализации этих предложений, судебный процесс может быть завершен после того, как крыса сделала в общей сложности 10 тылов, независимо от продолжительности времени. Это будет отличаться от 5-минутного испытаний, завершенных в приведенном выше протоколе, поскольку каждая крыса достигнет в общей сложности 10 тылов в разное время. С помощью модели инсульта и AD сопутствующих заболеваний, важно иметь в виду, что изменения в когнитивных уровнях производительности, тревожности и активности может развиться у этих крыс. WHile такие изменения не непосредственно влияют на первичный результат целевой цилиндра (спонтанное использование передних конечностей во время выращивания), записи и другие наблюдения могут представлять собой ценные свидетельства для немоторных связанных с поведенческими изменениями, которые могут возникнуть. В задаче цилиндра, такое поведение потенциально можно наблюдать путем анализа увеличивается или уменьшается по воспитанию поведения, так как выращивание является формой мотивированного исследовательское поведение. Кроме того, другие меры, такие как время, проведенное холить, поворачиваясь и посадки может дать представление о тревожности и других физических дефицитов, соответственно.
Что касается задачи луча ходить, используя вольере обогащения трубки, как правило, достаточно мотивации для крысы, чтобы пройти через луч. Если крыса продолжает останавливаться на полпути вдоль луча, душистый награду пищи или лечения, такие как арахисовое масло или прецизионный сахарных гранул, могут быть введены в дополнение к трубам с обогащением на противоположном конце. Если лечит приведены, убедитесь, что все крысы получали абиз того же количества лечит на день тестирования, независимо от их исполнения. Кроме того, вместо выполнения всех шести испытаний для крысы, прежде чем перейти к следующей крысы, испытания могут быть в шахматном порядке. Например, первые два испытания могут быть проведены для всех крыс перед началом следующего два. Это может предотвратить увеличение числа остановок на полпути поперек пучка, что может произойти на более поздних исследованиях, когда некоторые крысы становятся слишком комфортно с окружающей средой луча. Другим возможным решением, если частое торможение происходит, чтобы уменьшить число испытаний. Это может быть реализовано путем размещения зеркала позади луча, чтобы анализировать и левые и правые конечности в каждом испытании, таким образом, позволяя количество испытаний, чтобы уменьшить. Кроме того, привыкания к балке может произойти после нескольких сеансов тестирования и может привести к крысам, отказывающихся пересечь луч и усидеть на балке, несмотря на все усилия, чтобы мотивировать животное. Из-за этой проблемы, оценки пучка не являются идеальными для повторного тестирования в Лонг долгосрочных экспериментов. В протоколах, которые используют повторные испытания, компенсация может также стать проблемой в дополнение к мотивации. Для того, чтобы преодолеть проблемы компенсации при пересечении луча, конический луч может быть использован вместо обычного деревянного бруса 21.
Опять же, когнитивные изменения, в том числе повышенной тревожности и изменения общего уровня активности и мотивации, могут возникнуть в этой модели на животных. Поэтому, важно принять к сведению каких-либо нарушений среди экспериментальных групп в отношении мотивации животных, чтобы пересечь луч, а также их скорость и поведение не-двигательную (остановка, сидя, дрожащего, ориентация) во время прохождения луча.
исследования болезни Альцгеймера поведенческой требует тестирования памяти в краткосрочной и долгосрочной перспективе, что было достигнуто здесь с использованием водного лабиринта Морриса. Многие протоколы считают 24 ч после пространственного обучения , чтобы быть долговременной памяти 21, но с этим протоколом вImeline 24 ч после пространственного обучения считается кратковременной памяти и одна неделя считается долговременной памяти. В течение этого недельного периода времени в промежутках между зондами испытаний, крысы не должны подвергаться воздействию других поведенческих задач или ненужных стрессовых факторов, чтобы избежать помех в водном лабиринте Морриса пространственной эталонной памяти.
Что касается пространственного обучения, экспериментаторы должны быть стойкими в требовании крысы сидеть на платформе без прыжков в течение определенного промежутка времени. Если крыса успешно сидит на платформе, но спрыгивает, как экспериментаторы приходят в поле зрения, крыса должна быть помещена или направляется обратно на платформу и должны сидеть на платформе, пока экспериментатор не получает животное. Для того, чтобы следить за соблюдением обучения платформы, как единственный способ избежать воды, крысы не должна быть подобрана в то время как не плавание, если в установке зонда испытания. Если крысы удается прыгать с платформы на краю бассейна, рассмотреть вопрос о переходе на platforм далее по направлению к центру бассейна, чтобы препятствовать обучению альтернативного маршрута побега.
Для того, чтобы убедиться, нет пространственных уклоны во время пространственного и обучения подают реплики, то стартовые позиции и позиции Cued платформы для каждой крысы в группе лечения должны быть случайным образом. Каждая группа лечения должна иметь представительное число крыс, начиная с каждого исходного положения для пространственного обучения или следуя той же позиции начала и платформы парадигмы обучения подают реплики. Для присвоения стартовых позиций, Vorhees и Williams представить очень подробный набор рандомизированные стартовые позиции для пространственного обучения и рандомизированные начальной и платформы позиций для Cued обучения 20. Это может быть использован непосредственно или в качестве ориентира для назначения позиции каждой крысе до тестирования в водном лабиринте Морриса начало.
Для анализа данных водном лабиринте Морриса, предложения в протоколе выше, представляют собой, как данные, представленные здесь, были приобретены. ДАТсобранный на шаге 3.6 выше Морриса протокола водным лабиринтом может использоваться для расчета различных измерения результатов, которые могут быть полезны для описания когнитивного дефицита. Например, помимо числового набора данных, отслеживания программного обеспечения также предлагает экспериментатору возможность проанализировать отслеживать участки, которые могут дать дополнительные сведения о поисковых стратегиях животных. Кроме того, процент времени, потраченного или пройденное расстояние в пределах целевого квадранта по отношению ко всем квадранты могут быть использованы в качестве меры долговременной памяти в зондовых испытаниях. Важно иметь в виду, что эти коморбидными модели на животных могут проявлять некоторые дефициты двигателя. Сравнивая скорость плавания среди экспериментальных групп может дать указание ли потенциальный дефицит двигателя влияя на способность животных выполнять в водном лабиринте Морриса. Кроме того, чтобы исключить характеристики двигателя стать Поразительным фактором в исходе водном лабиринте, рекомендуется смотреть на длину пути, чтобы добраться до платформыв дополнение к времени запаздывания и скорость плавания , как показано на рисунке 5 и 6. Если плавание способность нарушена каким-либо образом, длина пути является наиболее точным показателем для оценки гиппокампа функции.
В то время как существуют различные временные рамки, которые могут быть применены ко всем из этих поведенческих задач, описанных, методика выполнения каждого эксперимента должна оставаться неизменной. Данные, представленные здесь, была достигнута с 21 дня после инсульта момент времени восстановления, который фиксирует ранние события после инсульта и их потенциальное взаимодействие с Ар обмена веществ в головном мозге. Хотя представленные здесь данные были в коморбидными модели инсульта и болезни Альцгеймера, эти задачи могут быть применены или адаптированы с учетом различных вопросов исследования и модели. В то время как тест цилиндра является менее модифицируемые стандартная процедура, задача луча ходьбы может быть до некоторой степени регулировать с тяжестью ожидаемого дефицита двигателя путем выбора соответствующего луча ширине,ГГ. Водный лабиринт является наиболее универсальным тестом всех парадигм, упомянутых в настоящем документе. Например, выбирая различные интервалы между окончанием фазы захвата и пространственного зонда проб ссылка памяти можно легко проверить краткосрочные и долговременной памяти. Работа-память и переключение передач, два компонента исполнительной функции, также могут быть проверены с помощью установки с водным лабиринтом. Для оценки рабочей памяти, то между пробный интервал может быть сокращен до менее 1 мин во время обучения приобретения нового местоположения платформы. Кроме того, наличие животных выучить второй, новое местоположение платформы после успешного приобретения первоначального расположения платформы может проверить гибкость ума или сдвиг стратегии. Принимая во внимание все эти потенциальные модификации, есть много гибкости с этими задачами поведения, что является еще одним важным преимуществом в дополнение ко всем вышеупомянутым преимуществ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cylinder | Western University | Plexiglas Cylinder Cylinder Diameter: 23 cm Cylinder Height: 40 cm Platform Height: 30 cm Mirror Length: 35 cm Mirror Width: 26.5 cm |
This was made specifically by Western University Machine Services for our lab. Please contact your own chosen manufacturer to design this product. |
| Handheld Video Camera | JVC | GZ-E200 | |
| Video Camera Tripod | Slik | F163 | |
| AM/FM Clock Radio | Sylvania | SCR1388 | |
| White Board | Walmart | Width: 71.12 cm Height: 55.88 cm |
These can be purchased at any store (i.e. Walmart, University bookstores) |
| Dry-erase Marker | Expo | Expo Dry-erase Original Marker | These can be purchased at any store (i.e. Walmart, University bookstores) |
| Wooden Beam | Rona | Plywood Width: 2 cm Length: 100 cm |
|
| VWR General Purpose Laboratory Tape | VWR Intl. | 89097-920 | |
| iMovie '11 | Apple Inc. | Version 9.0.9 (1795) | This is the version used in this manuscript, but any other iMovie version or video editing software could be used. |
| Morris Water Maze Pool with Platform | Stoelting Co. | 60136/60035 | These are not the exact products used in the video, but these are essentially identical. |
| Platform Cue | - | - | The platform cue used was created using a small metal stand and white spherical foam ball. These can likely be purchased at any store with home improvement materials (i.e. Walmart, Rona etc.) |
| Mainstays 71" Floor Lamp | Walmart | HW-F0377SLV | |
| ANY-Maze Behavioural Tracking Software | Stoelting Co. | 60000 | There are ANY-maze® bundles that include the camera with or without a computer and accessories. |
| Compact Video Camera | Logitech | V-U0023 | |
| Laptop | Hewlett-Packard | HP Pavilion dv6 Notebook PC | Laptop Specifics: AMD A6-3420M APU with Radeon HD Graphics 1.50 GHz, 6.00 GB RAM, 64-bit operating system. |
| Americana Non-toxic Acrylic Paint | DecoArt | DAO67-9 | This can be ordered on the DecoArt site or purchased in store at DecoArt retailers. |
| Poster Board | Walmart | PA-1961 |
References
- Auld, D., Kornecook, T., Bastianetto, S., Quirion, R. Alzheimer's disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies. Prog Neurobiol. 68 (3), 209245 (2002).
- Huang, Y., Mucke, L. Alzheimer Mechanisms and Therapeutic Strategies. Cell. 148 (6), (2012).
- Querfurth, H., LaFerla, F. Alzheimer's disease. New Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- Karran, E., Mercken, M., Strooper, B. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).
- Akiyama, H., et al. Inflammation and Alzheimer's disease. Neurobiol Aging. 21 (3), (2000).
- Butterfield, D., Drake, J., Pocernich, C., Castegna, A. Evidence of oxidative damage in Alzheimer's disease brain: central role for amyloid β-peptide. Trends Mol Med. 7 (12), 548554 (2001).
- Kalaria, R. The role of cerebral ischemia in Alzheimer's disease. Neurobiol Aging. 21 (2), 321-330 (2000).
- Selkoe, D. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
- Snowdon, D. A., et al. Brain infarction and the clinical expression of alzheimer disease: The nun study. JAMA. 277 (10), 813 (1997).
- Clarke, J., et al. Overexpression of APP provides neuroprotection in the absence of functional benefit following middle cerebral artery occlusion in rats. Eur J Neurosci. 26 (7), 1845-1852 (2007).
- Whitehead, S., Hachinski, V., Cechetto, D. Interaction Between a Rat Model of Cerebral Ischemia and β-Amyloid Toxicity Inflammatory Responses. Stroke. 36 (1), 107-112 (2005).
- Agca, C., et al. Development of transgenic rats producing human β-amyloid precursor protein as a model for Alzheimer's disease: Transgene and endogenous APP genes are regulated tissue-specifically. BMC Neuroscience. 9 (1), 28 (2008).
- Bayona, N. A., Gelb, A. W., Jiang, Z., Wilson, J. X., Urquhart, B. L., Cechetto, D. F. Propofol neuroprotection in cerebral ischemia and its effects on low-molecular-weight antioxidants and skilled motor tasks. Anesthesiology. 100 (5), 1151-1159 (2004).
- Langdon, K., Clarke, J., Corbett, D. Long-term exposure to high fat diet is bad for your brain: exacerbation of focal ischemic brain injury. Neuroscience. 182, 82-87 (2011).
- Brownlow, M., et al. Partial rescue of memory deficits induced by calorie restriction in a mouse model of tau deposition. Behav Brain Res. 271, 7988 (2014).
- Halagappa, V., et al. Intermittent fasting and caloric restriction ameliorate age-related behavioral deficits in the triple-transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol Dis. 26 (1), (2007).
- Maalouf, M., Rho, J., Mattson, M. The neuroprotective properties of calorie restriction, the ketogenic diet, and ketone bodies. Behav Brain Res. 59 (2), (2008).
- Tillerson, J. L., et al. Forced limb-use effects on the behavioral and neurochemical effects of 6-hydroxydopamine. Neuroscience. 21 (12), 4427-4435 (2001).
- Sierksma, A., et al. Improvement of spatial memory function in APPswe/PS1dE9 mice after chronic inhibition of phosphodiesterase type 4D. Neuropharmacology. 77, (2013).
- D'Hooge, R., De Deyn, P. P. Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Behav Brain Res. 36 (1), 60-90 (2001).
- Vorhees, C., Williams, M. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nat Protoc. 1 (2), 848-858 (2006).
