Summary
For at undersøge komorbide Alzheimers sygdom (AD) og slagtilfælde tilstand i et hidtil ukendt model, er tre opførsel opgaver beskrevet, at vurdere både motorstyring og kognitive adfærd. Disse opgaver omfatter strålen-walk opgave, cylinder opgave og Morris water maze.
Abstract
Alzheimers sygdom (AD) er en svækkende neurodegenerativ sygdom, der resulterer i neurodegeneration og hukommelsestab. Mens alder er en stor risikofaktor for AD, er slagtilfælde også været impliceret som en risikofaktor og en forværrer faktor. Den co-morbiditet af slagtilfælde og AD resultater i forværret slagtilfælde-relaterede motorstyring og AD-relaterede kognitive mangler i forhold til hver enkelt tilstand alene. At modellere den kombinerede tilstand for slagtilfælde og AD, en hidtil ukendt transgen rottemodel med AD, med en muteret form af amyloid precursor protein (et centralt protein involveret i udviklingen af AD) inkorporeret i sit DNA, er givet en lille ensidig striatale slagtilfælde.
For en model med kombinationen af både slagtilfælde og AD, skal adfærdstests der vurderer slagtilfælde-relateret motorstyring, bevægelse og AD-relateret kognitiv funktion implementeres. Cylinderen Opgaven indebærer en omkostningseffektiv, MP apparat, der vurderer spontan forben motor brug. I denne opgave er en rotte anbragt i et cylindrisk apparat, hvor rotten vil spontant bageste og kontakte cylindervæggen med sine forben. Disse kontakter betragtes forben motor brug og kvantificeres under video analyse efter test. En anden omkostningseffektiv motor opgave gennemført, er strålen-walk opgave, som vurderer forben kontrol, bagben kontrol og bevægelse. Denne opgave indebærer en rotte gå på tværs af en træbjælke giver mulighed for vurdering af lemmer motor kontrol gennem analyse af forben underkjoler, bagbenenes glider og falder. Vurdering af indlæring og hukommelse er afsluttet med Morris water maze for denne adfærdsmæssige paradigme. Protokollen begynder med rumlig indlæring, hvorved rotten lokaliserer en stationær skjult platform. Efter rumlig indlæring, er platformen fjernet og både kortsigtede og langsigtede rumlig henvisning hukommelse vurderes. Alle tre af disse opgaver er følsomme over for adfærdsmæssige forskelle og afsluttet inden for 28 dage for denne model, hvilket gør denne paraparadigme tid-effektiv og omkostningseffektiv.
Introduction
Alzheimers sygdom (AD) er den mest udbredte form for demens hos ældre befolkning og en svækkende neurodegenerativ sygdom. Histopatologisk, AD præsenterer sig selv som amyloide plaques, neurofibrillære sammenfiltringer og neuronalt tab. Amyloide plaques består primært af beta-amyloidpeptid (Ap), som er fremstillet gennem en ændret proteolytisk spaltning af amyloid precursor protein (APP) ved β-sekretase og y-sekretase enzymer 1,2,3. Spaltningsproduktet, Ap, aflejringer i hjernen skaber patologiske amyloide plaques og har toksiske virkninger på hjernen, der kan føre til de karakteristiske læring svækkelser og hukommelsestab. Alle disse trin tilsammen benævnt "amyloid kaskade hypotese" 3,4. Mens denne hypotese er vigtigt, når undersøger AD, er der fundet andre cellulære ændringer for at gå forud for disse plaquedannelser der strejfer fra den oprindelige amyloid cascade pathway. disse andrecellulære ændringer menes at bidrage til hurtig hukommelsestab, læring svækkelser og andre kognitive dysfunktioner involveret i AD før plaquedannelse 3,5,6.
Med AD bliver mere og mere udbredt, er risikofaktorer for udvikling af AD blive en meget vigtig fokus for forskningen. Selvom alder er den vigtigste risikofaktor for sporadiske former for AD, har andre risikofaktorer er blevet identificeret, herunder slagtilfælde 7,8. Slagtilfælde er ikke kun en risikofaktor, men det kan også forværre allerede tilstedeværende demenssygdomme. For eksempel klinisk, progressionen af AD er blevet vist at være værre i patienter, som tidligere havde haft flere slagtilfælde 9. Desuden har forøget APP-ekspression og Ap akkumulering blevet fundet i eksperimentelle dyremodeller for Ap toksicitet kombineret med induceret slagtilfælde 10,11. Da der er dette vigtigt samspil mellem slagtilfælde og AD, er det vigtigt, at disse to patologier yderligere forsketsammen i co-morbide modeller for bedre at forstå patofysiologi og adfærd impliceret i begge forhold.
For at undersøge følgesygdomme, en passende model måtte udvikles, hvor et slag kunne interagere med Ap at producere AD-lignende patologi. For første gang blev en APP21 transgene rotte, der har en muteret humant APP-gen inkorporeret i sit DNA anvendes til at opnå en passende model for AD. Mutationerne er det svenske dobbelt missense og Indiana enkelt missense-mutationer, som begge er blevet impliceret i familiær former af AD 4,8,12. I mangel af en yderligere fornærmelse, denne rotte model aldre uden at udvikle de karakteristiske Ap plaques eller neurofibrillære tråde 12. Derfor, i et forsøg på at inducere AD-lignende adfærdsmæssige patologi, er en lille streg indført i den højre striatum at efterligne de små subkortikale streger ofte til stede i demenspatienter 9. Den slagtilfælde i APP21 transgene rat er indbegrebet af co-morbid tilstand og tillader undersøgelse af forskellige typer af adfærdsændringer impliceret i begge sygdomstilstande. Især denne induktion af AD-lignende patologi og kognitive mangler i voksne rotter giver os undersøge de tidligste molekylære og kognitive ændringer forud AD.
Da målet er at bestemme de første tegn på adfærdsændringer og da både slagtilfælde og AD har meget forskellige adfærdsmæssige patologier, når man studerer co-morbide model, adfærd opgaver nødt til at vurdere en række adfærdsmæssige fænotyper. Der er et batteri af relativt følsomme tests, der kan gøres for at analysere motor og kognitiv adfærd i gnaver modeller, der involverer en række forskellige paradigmer og udstyr. For specifikt analysere forben og bagben motorisk funktion, har cylinder opgave og stråle-walk opgave blevet gennemført for at opdage motoriske underskud og overvåge bevægelse i denne model. Andre følsomme opgaver designet til specifikt at vurdere fint forelimb motorik (dvs. trappen opgaven og enkelt pille nå opgave) kræver mad afsavn 11,13,14. For at undgå enhver af de kendte virkninger af underernæring på sygdoms patologier 15,16,17, har disse tests er fundet uegnet til denne undersøgelse. Cylinderen opgave vurderer den spontane brug af rottens forbenene under opdræt i en roman miljø og kan afsløre asymmetri mellem forbenene i rotter med ensidig slagtilfælde 10,18. En stor fordel for denne opgave er, at apparatet kan anvendes til andre adfærdsmæssige opgaver, såsom Porsolt tvunget svømme opgave 19. I modsætning til cylinderen opgave, strålen-walk opgave tillader også analyse af bagben og forben motorstyring, foruden locmotion 10,14. Beam gå inkluderer en bevægeapparatet komponent, en balance komponent og dygtige fod placering. Begge disse tests er omkostningseffektive, ligetil, og tid-effektive og belyse effekten af slagtilfælde og AD på d ifferences i lemmer funktion.
Bortset fra ændringer i motorisk funktion, AD involverer hukommelse underskud, der kan præsentere i tidlige stadier af sygdommen progression. Når adressering AD-lignende patologier i en gnaver-model, er det afgørende, at hippocampus afhængig indlæring og hukommelse vurderes, fordi hippocampus er et vigtigt hjernens struktur stort set påvirket i AD 2. Hippocampus er et vigtigt område af hjernen for rumlig indlæring og hukommelse og dens funktion kan testes under anvendelse af forskellige labyrint paradigmer hos gnavere. En af de mest udbredte labyrint opgaver for gnavermodeller for forskellige sygdomme er Morris water maze 20. Morris water maze udnytter rumlige informationer til at bistå rotten med at finde en stationær skjult platform og tester rumlig henvisning hukommelse, når platformen er fjernet. En værdifuld fordel af vandet labyrint setup er, at det er meget fleksibel, afhængigt af den foreslåede forskning spørgsmål 20.
telt "> For første gang har de beskrevne teknikker blevet anvendt til at vurdere motorisk og kognitiv funktion hos en hidtil ukendt co-morbid rottemodel for slagtilfælde og AD. involvere små streger i en APP21 transgen rottemodel. Co-morbiditet blev opnået ved at inducere vasokonstriktion af blodkarrene i striatum at frembringe en lille streg i APP21 transgene rotter. denne slagtilfælde model er blevet veletableret som en co-morbid tilstand i en alternativ rottemodel for AD 11. Advancement i denne roman APP21 transgen rottemodel blev bestemt at producere en mere translationelt værdifuld model. Mens de adfærdsmæssige opgaver er beskrevet ved anvendelse af et co-morbid slagtilfælde og AD rottemodel, disse opgaver kan yderligere anvendes på andre modeller af slagtilfælde eller modeller af andre neurologiske sygdomme (dvs. Parkinsons sygdom). Den generelle metoden vil være bredt anvendelig til disse andre sygdomstilstande, men adfærd tidslinjer og paradigmer kan kræve ændringer baseret på de foreslåede research spørgsmål og model. Ud over at være tilpasningsdygtige, de opgaver, der er beskrevet er effektive i at påvise mindre underskud, mens også omkostninger og tid-effektive.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den passende institutionelle dyreetik udvalg skal godkende alle de adfærdsmæssige procedurer før start eksperimenter. Alt dyr arbejde beskrives her blev godkendt af Western University Animal Brug underudvalg og følger den canadiske Rådet om Animal Care retningslinjer. Disse dyreforsøg blev udført i den lette fase.
1. Cylinder opgave for Gross forben Motor Assessment
- Opsætning af udstyr
- Erhverve en plexiglas cylinder med en perforeret låg, der vil rumme størrelsen af rotte anvendes til eksperimentet. Størrelsen af cylinderen bør ikke tillade rotten at nå toppen når opdræt og det bør give mulighed for 2 cm mellem væggen og rottens næse og bunden af rottens hale. Standardstørrelsen af en cylinder er 23 cm i diameter og 40 cm i højden for en 6-måneder gammel (400-600 g) rotte.
- Placer et spejl i en 45 ° vinkel under cylinderapparat med cylinderen sidder på en Plexiglas stå eller en anden form for støtte ca. 30 cm over bordpladen.
- Opsæt et videokamera på et stativ i en passende afstand til visualisere hele diameter af cylinderen i spejlet på videokameraet.
- Drej belysning til en lysdæmper indstilling og spille hvid støj i lokalet (dvs. lav volumen, subtile musik) for at reducere effekten af pludselige høje lyde. Dette bør bidrage til at fremme bevægelse og forhindre frysning grundet høje lyde.
- Forsøgsprocedure
- Flyt rotterne i den eksperimentelle rum 30 min før starten af første retssag at akklimatisere rotter til rummet med musik spiller og svagere belysning.
- Skriv de tilsvarende oplysninger dyr og forsøg (dvs. dyr nummer, dag i tidslinjen og forsøg nummer) på et lille hvidt bord. Placer dette board foran spejlet.
- Tryk optage på videokameraet med det hvide bord foran spejlet, afhente rotten nær bunden of halen, placere rotten i cylinderen og fastgør låget. Stå ud til siden af cylinderen for at undgå at forstyrre videooptagelse.
- Fjern den hvide bord fra foran spejlet og lade videokameraet optage rotten i cylinderen i 5 minutter (brug en timer til registrering 5 min fra når det hvide bord er fjernet). Dette er en retssag.
- Rens cylinder med et stykke køkkenrulle og vand efter en retssag.
- Gentag trin 1.2.2-1.2.5 to gange for at opnå i alt tre forsøg. Der bør være en 20-30 min inter-trial tid at mindske risikoen for tilvænning til cylinderen. I løbet af denne tid, kør cylinder forsøg for de andre rotter.
- Video Analyse
- Import videokamera filer til videoredigeringsprogram (dvs. iMovie)
- Udfyld de videoer i klip for hvert forsøg. Slå lyden af videoen og nedsætte hastigheden af videoen til 25% af det oprindelige.
- Tæl antallet af forben kontaktermed væggen af cylinderen for venstre og højre forben. For samtidige venstre og højre kontakter, tæller disse forben kontakter som "både". Husk på, at videoen er optaget gennem et spejl, hvad der synes at være den venstre forben i videoen svarer til dyrets højre forben i virkeligheden.
- Beregn procent brug af den berørte forben (kontralateral til slagtilfælde) ved hjælp af følgende ligning: [{(påvirket kontakter + ½ bilaterale kontakter) / samlede antal kontakter} x 100]. Udførelsen af både vildtype grupper og den transgene gruppe uden slagtilfælde betragtes sammenligningsgrupper for at vurdere præsentation af sygdom-induceret problemer.
2. Beam-walk Opgave for Gross Motor Assessment
- Opsætning af udstyr
- Anskaf en glat forseglet træbjælke, der er 2 cm bred og ca. 120 cm lang (optimal bredde for en 200-600 g rotte).
- Placer to tabeller eller reoler unsine 100 cm fra hinanden. Overfladen på hver enhed skal være ca. 40 cm over jorden.
- Fastgør begge ender af bjælken til tabellen eller reoler overflade ved anvendelse tape. Ca. 1 m af ikke-understøttet bjælke længde bør nu være forhøjet 40 cm over jorden.
- Opsæt et videokamera på et stativ, erobre hele længden af bjælken. For at øge kontrasten i videoen, overveje at indføre en sort baggrund bag strålen, når du bruger hvide rotter.
- Forsøgsprocedure
- Flyt rotterne i den eksperimentelle rum 30 min før starten af første retssag at akklimatisere rotter til rummet med musik spiller og svagere belysning.
- Placer rotte hjem bur- eller miljøberigelse rør i den ene ende af bjælken og placere rotten i den anden ende af bjælken.
- Gennemføre et par ikke-registrerede kørsler to dage før eksperimentelle forsøg. Lad rotten udforske området og lede rotten mod bjælken ved at holde bunden af rotte'S hale.
- Når rotten har krydset strålen, flytte buret eller røret til den anden ende af bjælken og gentag. Når rotten krydser strålen frit i begge retninger, træningen er overstået. Hold antallet af uddannelsen kører konsekvent blandt alle dyr.
- Skriv de tilsvarende oplysninger dyr og forsøg (dvs. dyr nummer, dag i tidslinjen og forsøg nummer) på et lille hvidt bord. Tape denne hvide bord til væggen bag bjælken.
- Placer rottens hjem bur eller miljø berigelse slange i den ene ende af bjælken.
- Tryk optage på videokamera og samle rotten op ved haleroden og sted for enden af bjælken modsat hjemmet bur eller slange.
- Optage hele det forsøg, som slutter, når rotten resultat har gennemgået gennemkører den fulde længde af den forhøjede stråle. Hvis rotten pauser midtvejs tværs strålen, forsigtigt harmoniske rotten ved haleroden eller røre rottens hale forsigtigtat fremme bevægelse på tværs af strålen. Skub ikke rotten frem på nogen måde.
- Re-do forsøg, hvor rotten vender sidelæns under på bjælken, gentagne gange stopper går eller går inkonsekvent. Hvis en rotte falder og fortsætter med at hænge på bjælken, forsigtigt øse op rotten og læg den tilbage på bjælken ved positionen af efteråret og fortsætte forsøget.
- Flyt hjem bur eller slange til den anden ende af bjælken, ændre retssagen # på den hvide bord og optage den efterfølgende retssag.
- Gentag denne procedure, indtil alt 6 forsøg er afsluttet, med 3 forsøg bliver registreret for hver retning. Alle 6 forsøg for en rotte kan optages, før du starter forsøgene til næste rotte.
- Video Analyse
- Import videokamera filer til videoredigeringsprogram (dvs. iMovie).
- Udfyld de videoer i klip for hver prøve og slå lyden af videoen. Analysere hvert videoklip billede for billede.
- Tæl antalletaf de samlede trin rotten tager at gå den fulde længde af bjælken og det samlede antal af venstre og højre bagben og forben glider og det samlede antal af fald. Udførelsen af begge vildtype grupper og den transgene gruppe uden slagtilfælde anses i sammenligning med co-morbid gruppe at evaluere fremkomsten af underskud unikke for co-morbid tilstand.
3. Morris Water Maze for Hippocampal-afhængig rumlig indlæring og reference Hukommelse
- Opsætning af udstyr
- Skaf et videokamera anbragt over midten af en rund pool (148 cm diameter og 58 cm dybde). Flugt de fire udpegede kvadranter ordentligt med omridset af bassinet i tracking software program.
- Fyld den cirkulære pool med vand ca. 36 cm dyb. Vandet bør opvarmes til stuetemperatur ved at fylde poolen et par dage før påbegyndelse af forsøgsprotokollen.
- Tilføj sort giftfri akrylmaling uninto vandet er uigennemsigtig, når du bruger hvide rotter. Brug en lys farve, såsom hvid, for mørkere farvede rotter.
- Surround poolen med tomme vægflader, herunder rumdelere, hvis nødvendigt. Når i puljen, skal rotten ikke kunne se eksperimentatorer.
- Skær 4 store forskellige formede rumvirkning fra forskellige farver af plakat bord og vedhæfte en form på væggen pr udpegede nord, øst, sydøst og sydvest pool steder. Disse signaler skal være en anelse højere end kanten af poolen.
- Tænd en radio ved lav lydstyrke i det nordvestlige kvadrant at forhindre rotten bliver distraheret af uventede høje lyde under testen.
- Placer en cirkulær platform (11,5 cm diameter, flade 2-3 cm under vandniveau) i midten af målet kvadrant.
- Sluk vigtigste værelse lys og slå på et gulv stående lampe på den modsatte side af lokalet divider til puljen til at belyse området.
- Computer Configuration
- Set 4 dage i træk med 4 forsøg med 90 sek hver for den rumlige læring eksperimentet.
- Set 2 separate probe eksperimenter af 30 sek hver ved 24 timer efter den sidste rumlig indlæring forsøg og 1 uge efter den første probe eksperiment.
- Set cued forsøg læring på 4 forsøg pr dag for 2 på hinanden følgende dage begyndende 24 timer efter den anden probe eksperiment. Hvert forsøg skal være 60 sek total.
- For hvert trin, indstille test rækkefølge, så at der er en 20 min inter-trial intervallet mellem hvert forsøg for en given dyr. Andre dyr kan køres i løbet af denne inter-retssagen interval, så længe hvert dyr opretholder en 20 min inter-retssagen interval.
- Sørg for, at platformen position skal defineres af forsøgslederen, og at alle andre zoner er DEbøde af den udpegede platform position.
- Indstil programmet manuelt starte og slutte hvert forsøg.
- Placer den cirkulære platform i sydvest kvadrant. Det bør på linje med den cirkulære betegnet "platform" område i kvadrant på computerprogrammet.
- Start positioner omkring poolen skal randomiseret for hver rotte. Repræsenterer alle start-positioner i hver behandlingsgruppe. Ingen rotte starter fra nordøst position for eventuelle rumlige læring forsøg i paradigme præsenteres at give mulighed for en ny startposition under sonde test.
- Hold rotten i bunden af halen og forsigtigt placere den i vandet langs væggen af puljen på det angivne startposition og hurtigt flytte ud af rottens syn.
- Har den anden forsøgslederen starte tracking software så snart rotten er i vandet. En timer skal begynde at tælle op fra 0 på sporing program. Hvis rotten lokaliserer platformen, har den anden forsøgslederen stoppe forsøget på computeren og forlade rotte på platformen i mindst 30 sek, før at hente den. Hvis rotten hopper fra platform før retssagen er stoppet på computeren, retssagen fortsætter.
- Hvis rotten ikke finder platformen i den tildelte retssagen tid, guide rotten til platformen ved hjælp af din hånd (enten gøre rotten følge din hånd eller guide rotten ved bunden af halen). Hold rotten på platformen i 30 sekunder.
- Fjern rotten fra puljen ved bunden af halen på eksperimentatorens arm, der er dækket med et håndklæde eller lad rotten klatre på en bærbar overflade.
- Gentag trin 3.3.3-3.3.7 for i alt 4 forsøg pr rotte. Der bør være en inter-retssagen interval på 20 min for hver rotte.
- Retur rotterne til deres hjem bur under en varmelampe i mindst 10 min efter rottens endelige rumlig indlæring forsøg.
- Fortsæt EXAct samme rumlige læring protokol for dag 2 til dag 4 i rumlig indlæring.
- På dag 2-4, må du ikke holde rotten på platformen længere. Lad rotten til at sidde på platformen uden hjælp i 30 sek med eksperimentatorer ud af syne. Dette kan gøres under senere forsøg på dag 1 på lejlighed.
- Fjern platformen fra puljen. Sørg for forrige platform position forbliver defineret på computeren (cirkel i sydvest kvadrant).
- Placer rotte i vandet langs væggen af poolen på nordøst position og hurtigt flytte ud af rottens syn. Anvendelse af den hidtil ukendte nordøst startposition sikrer, at rotten minder platformspositionen uafhængig af tidligere uddannet startpositioner.
- Har den anden forsøgslederen starte tracking software så snart rotten er i vandet. En timer skal begynde at tælle op fra 0 på tracking software.
- Hent rotten frasydvest kvadrant af pool ved basen af halen og holde på et håndklæde-dækket arm eller lade rotten klatre på en bærbar overflade.
- Retur rotterne til deres hjem bur under en varmelampe i mindst 10 min efter hver rottes sonde retssag.
- Gentag dette eksperiment (trin 3.4.1-3.4.5) en uge senere.
- Brug tape til at sikre en 4 cm i diameter hvid sfærisk cue på et stativ, der er 8,5 cm høj på platformen (totalhøjde på cue er 12,5 cm). Toppen af den sfæriske cue vil være mindst 8,5 cm over vandoverfladen.
- Fjern de rumlige signaler fra væggene omkring poolen.
- Tilfældig platform positioner og begynde positioner for hver rotte i hver gruppe. Alle platform og start-positioner bør være repræsenteret for hver behandlingsgruppe.
- Placer platform i det udpegede platform område og definere i tracking software.
- Placer rotte i vandet langs væggen af puljen ved than udpegede startposition og hurtigt flytte ud af rottens syn.
- Har den anden forsøgslederen starte tracking software så snart rotten er i vandet. En timer skal begynde at tælle op fra 0 på tracking software.
- Når rotten når platformen, har den anden forsøgslederen stoppe forsøget på computeren. Hvis rotten hopper fra platform, retssagen fortsætter. Før hentning rotten, tillader rotten til at sidde på platformen i 15 sek.
- Hent rotten fra puljen ved bunden af halen og holde på et håndklæde-dækket arm eller lade rotten klatre på en bærbar overflade.
- Kontroller platform for den næste rotte og flytte platformen til det tilsvarende område som defineret i tracking software.
- Gentag trin 3.5.4-3.5.9 for følgende 3 forsøg. Der bør være en inter-retssagen interval på 15 min.
- Retur rotterne til deres hjem bur under en varmelampe i mindst 10 min efter hver rottes final cued lære retssag.
- Fortsæt den samme protokol til dag 2 af cued læring.
Bemærk: Tid brugt i zoner, distance i zoner, gennemsnitshastighed, antal poster i zoner og tid til første indrejse i zoner ofte anvendes.
- Analyser tid og afstand til at nå platformen zone og den gennemsnitlige hastighed for hver dag, rumlig og cued læring separat. For probe eksperimenter, analysere latenstiden til første indrejse i den pulszone, en rå tid eller en procent ændring fra sonde 1 til sonde 2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De adfærdsmæssige beskrevne opgaver blev anvendt til at demonstrere effekterne af slagtilfælde i en APP21 transgen rottemodel med Alzheimers sygdom. Kombinationen af slagtilfælde og APP21 transgen forventes at resultere i større motor underskud i de angrebne lemmer, samt øgede hukommelse underskud.
Cylinderen opgave vurderede brutto forben motorisk funktion og er repræsenteret som anvendelse af den påvirkede forben. Endvidere blev bjælkelignende gåtur opgave anvendes til specifikt at vurdere bagben motorik og bevægelse. Da slagtilfælde blev induceret i den højre striatum, forventes venstre forben for at vise en motor underskud, hvis man er til stede. De data, der præsenteres i både figur 2 og figur 3a og 3b ikke statistisk påvise, at co-morbide rotter har en forben eller bagben underskud hhv. Mens disse dyr ikke appære til at have forben eller bagben motoriske underskud, de synes at have mindre forskelle i motorisk funktion vedrørende bevægelse. I bjælken-walk opgave samlede skridt blev forøget betydeligt i de co-morbide transgene rotter med slagtilfælde (p <0,05, figur 3c), hvilket tyder på, at strålen-walk opgave er følsom nok til at opfange mindre ændringer i gangart og bevægelse. Den lille striatale slagtilfælde model, der anvendes producerer små streger, der sandsynligvis for lille til at producere større motoriske underskud, men underskuddet er blevet påvist før i andre slagtilfælde modeller med disse to opgaver 10,14. Her kan disse opgaver blot overvåge motorik og bevægelse, når de efterforsker parametrene præsenteret.
Hippocampal afhængig rumlig indlæring og reference hukommelse kan effektivt vurderes ved anvendelse Morris water maze. Der var ingen synlige forskelle i læring mellem grupper (figur 5a >, Figur 5b), derfor forskelle i læring kan ikke redegøre for eventuelle forskelle i hukommelsen ydeevne. APP21 transgene rotter med hjerneblødning robust langsigtet henvisning hukommelsessvigt sammenlignet med transgene rotter uden rotter slagtilfælde og vildtype med slagtilfælde (p <0,05, figur 5C).
Cued læring er fuldført for at sikre, at rotter har samme evne til at bruge visuelle rumlige informationer til at lokalisere platformen i Morris water maze. Som vist i figur 6a og figur 6b, blev der ikke observeret forskelle i ventetid eller banelængde for at nå platformen under cued læring mellem grupper. Desuden er den gennemsnitlige svømme hastighed var konsistent mellem grupperne (figur 6c) og viser, at motivationen til at flygte og svømme evner var lig mellem grupperne.
gur 1 "src =" / files / ftp_upload / 53089 / 53089fig1.jpg "/>
Figur 1:. Tidslinje for motoriske og kognitive adfærd vurderinger Slagtilfælde-inducerende operationsdagen er tildelt dag 0, og alle test dage er med henvisning til denne dag. (A) før kirurgi og post-kirurgi test for cylinder opgave (C) og stråle-walk opgave (BM). (B) Morris water maze rumlig indlæring, sonde test og cued læring. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Cylinder Task Procent brug af angrebne forben blev beregnet ved hjælp af ligningen i trin 1.3.4 og standardiseret til dag -3 baseline værdier. Den røde stiplede linie annotates den 1.0 værdi, der repræsenterer ens brug af hverforben i cylinderen opgave. Vildtype forkortes WT og transgene forkortes TG. Antallet af dyr er som følger: WT + saltvand (n = 7), WT + slagtilfælde (n = 8), TG + saltvand (n = 8), TG + slagtilfælde (n = 6). Alle værdier er vist som middelværdi ± SEM. (To ANOVA, Tukey indlæg hoc). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Beam-walk opgave Summen af alle følgesedler lavet med (A), der berøres, og (B) upåvirket bagben på 5 undersøgelser er vist i forhold til det samlede antal skridt til at krydse strålen. Værdier blev standardiseret til baselineværdierne som følger: post-kirurgi forholdet - pre-kirurgi ratio. (C) De samlede skridt til at krydse strålen o n dag -7 og dag 21. Vildtype forkortes WT og transgene forkortes TG. Antallet af dyr er som følger: WT + saltvand (n = 6), WT + slagtilfælde (n = 6), TG + saltvand (n = 6), TG + slagtilfælde (n = 5). Alle værdier er vist som middelværdi ± SEM og stjerner angiver statistisk signifikans. (En-vejs ANOVA, Tukey indlæg hoc, p <0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Program view viser sektioner kræves til opsætning og kører et eksperiment Et par fremhævet funktioner i sporing program, der bruges til Morris water maze.. Apparatet visning med videoen af puljen featured ovenfor vises kun som præsenteres når i fanen Tests.3089fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: rumlig indlæring og reference hukommelse i Morris water maze rumlig indlæring blev målt ved (A) latens og (B) vejlængden at nå platformen.. (C) Reference hukommelse blev målt som procent ændring i ventetid til første indrejse i målzonen på dagen 19 sonde test i forhold til dag 12 sonde test. Vildtype forkortes WT og transgene forkortes TG. Antallet af dyr er som følger: WT + saltvand (n = 8), WT + slagtilfælde (n = 7), TG + saltvand (n = 7), TG + slagtilfælde (n = 8). Alle værdier er vist som middelværdi ± SEM og stjerner angiver statistisk signifikans. (To ANOVA for geografisk læring og envejs ANOVA for sonde test, Tukey indlæg hoc, s &# 60;. 0,05) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6:. Cued læring i Morris water maze (A) Latency og (B) vejlængden at nå platform opgøres som et gennemsnit af alle otte forsøg med læring. (C) Swim hastighed præsenteres som et gennemsnit af alle otte forsøg med læring. Vildtype forkortes WT og transgene forkortes TG. Antallet af dyr er som følger: WT + saltvand (n = 8), WT + slagtilfælde (n = 7), TG + saltvand (n = 7), TG + slagtilfælde (n = 8). Værdier er præsenteret som middelværdi ± SEM. (En-vejs ANOVA, Tukey indlæg hoc). Klik her for at se en større version af dennefigur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kombinationen af slagtilfælde og Alzheimers sygdom resulterer i meget forskellige adfærdsmæssige patologier som kan påvirke både motoriske og kognitive funktion afhængigt af sværhedsgraden af hver betingelse. Det er således nødvendigt at gøre brug af en række adfærdsmæssige opgaver at bestemme de individuelle bidrag af disse tilstande, samt give et indblik i de kombinerede og potentielt interaktive effekter i co-morbid tilstand. De præsenterede data demonstrerer tre omkostningseffektiv, tidsbesparende og følsomme adfærd opgaver at vurdere motorik og hippocampus afhængig rumlig indlæring og reference hukommelse i en roman co-morbid APP21 transgen rotte model med slagtilfælde. Udover de præsenterede data, er disse opgaver blevet verificeret i mere alvorlige slagtilfælde modeller 10,14,18, samt i modeller for AD 8,16 og bør være bredt anvendelig til forskellige modeller af begge sygdomme.
Det er sagt, ingen opgave er uden limitations. For motoriske opgaver specifikt kan nogle fejlmelding være påkrævet, hvis rotter bliver vænnet til cylinderen og bjælken. I cylinderen opgave, kan en motivation være forpligtet til at sikre rotten opnår den passende mængde forben kontakter med væggen af cylinderen. For at opnå dette resultat, kan anvendelsen af en ikke-toksisk duft på den perforerede låg eller cylindervæggen motivere rotte til bageste og kontakte cylindervæggen med sine forben. For eksempel kan en lille smule jordnøddesmør eller vanille ekstrakt smøres på indervæggen tæt på toppen af cylinderen til yderligere at fremme stillesiddende rotter for at udforske cylindervæggene. En ring af farvet tape kan også anvendes på indersiden af cylinderen ¾ fra bunden af cylinderen. En anden måde at fremme opdræt indebærer at fjerne en stillesiddende rotte og genindføre den til cylinderen efter nogen tid er gået, som er opnået med en inter-retssagen interval i protokollen. Pelsdere, afhængigt af højden af cylinderen i forhold til længden af rotte, fjerne den perforerede låg halvvejs gennem et forsøg kan foranledige opdræt og forben kontakt med cylindervæggen. Dette bør ikke ske, hvis der er en mulighed rotten vil kunne undslippe fra cylinderen under testen. Disse motivationer kan bidrage til at øge antallet af stejler, men bør ikke påvirke brugen af de venstre og højre forpoter under væg kontakt. Hvis der stadig er et stort problem om et utilstrækkeligt antal forben kontakter efter gennemførelsen af disse forslag, kan en retssag være sluttede efter rotten har lavet i alt 10 stejler uanset længden af tid. Dette vil være anderledes end de 5 minutters forsøg tilbagelagt i protokollen ovenfor, som hver rotte ville nå i alt 10 stejler på forskellige tidspunkter. Med en model for slagtilfælde og AD co-morbiditet, er det vigtigt at være opmærksom på, at ændringer i kognitive præstationer, angst og aktivitetsniveau kan udvikle sig i disse rotter. While sådanne ændringer ikke direkte påvirke primære resultat af cylinderen opgave (spontan forben brug under opdræt), optagelse andre observationer kan udgøre værdifulde beviser for ikke-motoriske-relaterede adfærdsændringer, der kan udvikle. I cylinderen opgave, kan sådan adfærd potentielt observeres ved at analysere øget eller nedsat opdræt adfærd, som opdræt er en form for motiveret udforskende adfærd. Desuden andre foranstaltninger såsom tidsforbrug grooming, drejning og landing kan give indsigt på angst og andre fysiske underskud henholdsvis.
I forhold til strålen-walk opgave, ved hjælp af hjemmet bur berigelse slange er normalt nok motivation for rotten at gå på tværs af strålen. Hvis en rotte fortsat stoppe midtvejs langs bjælken, et duftende foderbelønning eller behandle, såsom jordnøddesmør eller præcisionen sukkeropløsninger pellets, kunne indføres i tillæg til de berigelse rør i den modsatte ende. Hvis der gives godbidder, sikre, at alle rotter får abud den samme mængde behandler på test dag, uafhængigt af deres præstationer. Derudover, i stedet for at køre alle seks forsøg for en rotte, før du flytter til den næste rotte, forsøg kunne være forskudt. For eksempel kunne de to første forsøg skal udfyldes for alle rotter før du starter den næste to. Dette kan forhindre det øgede antal stop midtvejs over stråle, der kan opstå på senere forsøg, når nogle rotter bliver for komfortabel med bjælken miljø. En anden mulig løsning, hvis hyppige stop opstår, er at reducere antallet af forsøg. Dette kunne gennemføres ved at placere et spejl bag strålen til at analysere både venstre og højre ben i hvert forsøg, således at antallet af forsøg, der skal reduceres. Endvidere kan tilvænning til bjælken forekomme efter flere test sessioner og kan resultere i rotter nægter at krydse strålen og blive siddende på bjælken, trods alle bestræbelser på at motivere dyret. På grund af dette problem, vurderinger stråle er ikke egnede til gentagen afprøvning i long sigt eksperimenter. I protokoller, som udnytter gentagne test, kan erstatningen også blive et problem i tillæg til motivation. For at overvinde spørgsmål om erstatning, mens krydse strålen, kan en tilspidset stråle bruges i stedet for en almindelig træbjælke 21.
Igen kan forekomme kognitive ændringer, herunder øget angst og ændringer i de generelle aktivitetsniveau og motivation, i denne dyremodel. Derfor er det vigtigt at notere eventuelle uregelmæssigheder blandt de eksperimentelle grupper vedrørende dyrenes motivation til at krydse strålen samt deres hastighed og ikke-bevægeapparatet adfærd (standsning, siddende, rysten, orientering), mens gennemkører strålen.
Behavioral Alzheimers sygdom forskning kræver kortsigtede og lang sigt hukommelse test, der er opnået her ved hjælp af Morris water maze. Mange protokoller overveje 24 timer efter rumlig indlæring at være langtidshukommelsen 21, men med denne protokol påimeline af 24 timer efter rumlig indlæring anses korttidshukommelse og en uge anses langtidshukommelse. I løbet af denne uges periode i-mellem probe test skal rotterne ikke udsættes for andre adfærdsmæssige opgaver eller unødvendige stressfaktorer for at undgå interferens med Morris water maze rumlig henvisning hukommelse.
I forhold til rumlig indlæring bør eksperimentatorer være vedholdende i at kræve rotten til at sidde på platformen uden at hoppe i en vis mængde tid. Hvis rotten held sidder på platformen, men springer sig og eksperimentatorer kommer til syne, bør rotten anbringes eller ledes tilbage til platformen og skal sidde på platformen, indtil forsøgslederen henter dyret. For at håndhæve indlæring af platformen som den eneste måde at undslippe vandet, bør rotterne ikke afhentes mens svømning, medmindre i en sonde prøveperiode indstilling. Hvis rotter formår at springe fra platform på kanten af poolen, overveje at flytte platform;m længere mod midten af poolen at modvirke indlæring af en alternativ rute for flugt.
For at sikre, at der ikke er nogen rumlige fordomme under rumlig og cued læring, bør start positioner og cued platform positioner for hver rotte i en behandlingsgruppe blive randomiseret. Hver behandlingsgruppe bør have et repræsentativt antal rotter startende fra hver udgangsposition for geografisk læring eller efter den samme start og platform position paradigme for cued læring. For at tildele startpositioner, Vorhees og Williams præsentere et meget detaljeret sæt af randomiserede startpositioner for geografisk læring og randomiserede start- og platform positioner for cued læring 20. Dette kan bruges direkte eller som en retningslinje for at tildele positioner til hver rotte før begyndelsen Morris water maze test.
Til analysen af Morris water maze data, forslagene i protokollen ovenfor repræsenterer hvordan data præsenteres her blev erhvervet. Den datet samlet i trin 3.6 i ovennævnte Morris water maze protokol kan bruges til at beregne forskellige effektmål, der kan være nyttige til at beskrive en kognitiv underskud. For eksempel, ud over den numeriske datasæt, tracking software giver også forsøgslederen mulighed for at analysere spor plots, som kan give yderligere indsigt i dyrenes søgestrategier. Derudover er procentdelen af tid eller distance inden for det ønskede kvadrant i forhold til alle kvadranter kan anvendes som et mål for henvisning hukommelse i probe forsøg. Det er vigtigt at huske på, at disse co-morbide dyremodeller kan udvise nogle motoriske underskud. Sammenligning svømme hastighed blandt de eksperimentelle grupper kan give en indikation om, hvorvidt en potentiel motor underskud påvirker dyrenes evne til at udføre i Morris vand labyrint. Endvidere at udelukke motorydelsen bliver forstyrrende element i vand labyrint resultat, anbefales det, at se på vejlængde at nå platformenforuden ventetid og svømme hastighed som vist i figur 5 og 6. Hvis svømning evne er kompromitteret på nogen måde, vejlængde er den mest nøjagtige foranstaltning til at vurdere hippocampus funktion.
Mens der er forskellige tidslinjer, som kan anvendes til alle disse adfærdsmæssige opgaver, der er beskrevet, bør metoden for at køre hvert forsøg forblive den samme. De data, der præsenteres her blev opnået med en 21 dages efter slagtilfælde restitutionstid punkt, som indfanger de tidlige begivenheder efter slagtilfælde og deres potentielle samspil med Ap metabolisme i hjernen. Mens data præsenteret her var i en co-morbid model for slagtilfælde og Alzheimers sygdom, kan disse opgaver anvendes på eller tilpasset forskellige forskningsspørgsmål og modeller. Mens cylinderen test er en mindre-modificerbare standardprocedure, kan strålen gåtur opgave få justeret til sværhedsgraden af den forventede motor underskud ved at vælge passende stråle widths. Vandet labyrint er den mest alsidige test af alle paradigmer nævnt heri. For eksempel, at vælge forskellige intervaller mellem afslutningen af købet fase og den rumlige henvisning hukommelse sonde retssag kan nemt teste kort- og langtidshukommelse. Arbejde hukommelse og strategi gearskift, to komponenter af udøvende funktion, kan også testes ved hjælp af vand labyrint setup. For at vurdere arbejdshukommelsen, kan den inter-retssagen interval reduceres til under 1 min under erhvervelse indlæring af en ny platform placering. Endvidere kan der dyr lære en anden, ny placering af platformen efter vellykket overtagelse af en indledende platform placering teste mental fleksibilitet eller strategi skift. I betragtning af alle disse potentielle ændringer, der er en stor fleksibilitet med disse adfærdsmønstre opgaver, som er en anden stor fordel udover alle de ovennævnte fordele.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cylinder | Western University | Plexiglas Cylinder Cylinder Diameter: 23 cm Cylinder Height: 40 cm Platform Height: 30 cm Mirror Length: 35 cm Mirror Width: 26.5 cm |
This was made specifically by Western University Machine Services for our lab. Please contact your own chosen manufacturer to design this product. |
| Handheld Video Camera | JVC | GZ-E200 | |
| Video Camera Tripod | Slik | F163 | |
| AM/FM Clock Radio | Sylvania | SCR1388 | |
| White Board | Walmart | Width: 71.12 cm Height: 55.88 cm |
These can be purchased at any store (i.e. Walmart, University bookstores) |
| Dry-erase Marker | Expo | Expo Dry-erase Original Marker | These can be purchased at any store (i.e. Walmart, University bookstores) |
| Wooden Beam | Rona | Plywood Width: 2 cm Length: 100 cm |
|
| VWR General Purpose Laboratory Tape | VWR Intl. | 89097-920 | |
| iMovie '11 | Apple Inc. | Version 9.0.9 (1795) | This is the version used in this manuscript, but any other iMovie version or video editing software could be used. |
| Morris Water Maze Pool with Platform | Stoelting Co. | 60136/60035 | These are not the exact products used in the video, but these are essentially identical. |
| Platform Cue | - | - | The platform cue used was created using a small metal stand and white spherical foam ball. These can likely be purchased at any store with home improvement materials (i.e. Walmart, Rona etc.) |
| Mainstays 71" Floor Lamp | Walmart | HW-F0377SLV | |
| ANY-Maze Behavioural Tracking Software | Stoelting Co. | 60000 | There are ANY-maze® bundles that include the camera with or without a computer and accessories. |
| Compact Video Camera | Logitech | V-U0023 | |
| Laptop | Hewlett-Packard | HP Pavilion dv6 Notebook PC | Laptop Specifics: AMD A6-3420M APU with Radeon HD Graphics 1.50 GHz, 6.00 GB RAM, 64-bit operating system. |
| Americana Non-toxic Acrylic Paint | DecoArt | DAO67-9 | This can be ordered on the DecoArt site or purchased in store at DecoArt retailers. |
| Poster Board | Walmart | PA-1961 |
References
- Auld, D., Kornecook, T., Bastianetto, S., Quirion, R. Alzheimer's disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies. Prog Neurobiol. 68 (3), 209245 (2002).
- Huang, Y., Mucke, L. Alzheimer Mechanisms and Therapeutic Strategies. Cell. 148 (6), (2012).
- Querfurth, H., LaFerla, F. Alzheimer's disease. New Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- Karran, E., Mercken, M., Strooper, B. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 10 (9), 698-712 (2011).
- Akiyama, H., et al. Inflammation and Alzheimer's disease. Neurobiol Aging. 21 (3), (2000).
- Butterfield, D., Drake, J., Pocernich, C., Castegna, A. Evidence of oxidative damage in Alzheimer's disease brain: central role for amyloid β-peptide. Trends Mol Med. 7 (12), 548554 (2001).
- Kalaria, R. The role of cerebral ischemia in Alzheimer's disease. Neurobiol Aging. 21 (2), 321-330 (2000).
- Selkoe, D. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
- Snowdon, D. A., et al. Brain infarction and the clinical expression of alzheimer disease: The nun study. JAMA. 277 (10), 813 (1997).
- Clarke, J., et al. Overexpression of APP provides neuroprotection in the absence of functional benefit following middle cerebral artery occlusion in rats. Eur J Neurosci. 26 (7), 1845-1852 (2007).
- Whitehead, S., Hachinski, V., Cechetto, D. Interaction Between a Rat Model of Cerebral Ischemia and β-Amyloid Toxicity Inflammatory Responses. Stroke. 36 (1), 107-112 (2005).
- Agca, C., et al. Development of transgenic rats producing human β-amyloid precursor protein as a model for Alzheimer's disease: Transgene and endogenous APP genes are regulated tissue-specifically. BMC Neuroscience. 9 (1), 28 (2008).
- Bayona, N. A., Gelb, A. W., Jiang, Z., Wilson, J. X., Urquhart, B. L., Cechetto, D. F. Propofol neuroprotection in cerebral ischemia and its effects on low-molecular-weight antioxidants and skilled motor tasks. Anesthesiology. 100 (5), 1151-1159 (2004).
- Langdon, K., Clarke, J., Corbett, D. Long-term exposure to high fat diet is bad for your brain: exacerbation of focal ischemic brain injury. Neuroscience. 182, 82-87 (2011).
- Brownlow, M., et al. Partial rescue of memory deficits induced by calorie restriction in a mouse model of tau deposition. Behav Brain Res. 271, 7988 (2014).
- Halagappa, V., et al. Intermittent fasting and caloric restriction ameliorate age-related behavioral deficits in the triple-transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol Dis. 26 (1), (2007).
- Maalouf, M., Rho, J., Mattson, M. The neuroprotective properties of calorie restriction, the ketogenic diet, and ketone bodies. Behav Brain Res. 59 (2), (2008).
- Tillerson, J. L., et al. Forced limb-use effects on the behavioral and neurochemical effects of 6-hydroxydopamine. Neuroscience. 21 (12), 4427-4435 (2001).
- Sierksma, A., et al. Improvement of spatial memory function in APPswe/PS1dE9 mice after chronic inhibition of phosphodiesterase type 4D. Neuropharmacology. 77, (2013).
- D'Hooge, R., De Deyn, P. P. Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Behav Brain Res. 36 (1), 60-90 (2001).
- Vorhees, C., Williams, M. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nat Protoc. 1 (2), 848-858 (2006).
