Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Motor og hippocampus Avhengig romfølelse og Reference Minne Vurdering i en transgen Rat Model of Alzheimers Disease med Stroke

doi: 10.3791/53089 Published: March 22, 2016

Summary

For å undersøke komorbide Alzheimers sykdom (AD) og hjerneslag tilstand i en roman modell, er tre atferds oppgaver beskrevet som vurderer både motorisk kontroll og kognitive atferd. Disse oppgavene inkluderer strålen-walk oppgave, sylinder oppgave og Morris vann labyrint.

Abstract

Alzheimers sykdom (AD) er en svekkende nevrodegenerativ sykdom som resulterer i neurodegenerering og hukommelsestap. Mens alder er en viktig risikofaktor for Alzheimers, har hjerneslag også vært innblandet som en risikofaktor og en forverre faktor. Den komorbiditet av hjerneslag og AD resultater i forverret slag relaterte motorisk kontroll og AD-relatert kognitiv svikt i forhold til hver tilstand alene. For å modellere den kombinerte tilstand av slag og AD, en ny transgen rottemodell av AD, med en mutert form av amyloid forløper protein (en nøkkel protein som er involvert i utviklingen av AD) innlemmet i sitt DNA, er gitt en liten ensidig striatal slag.

For en modell med en kombinasjon av både slag og AD, må atferdstester som vurderer slag relaterte motorisk kontroll, bevegelse og AD-relaterte kognitiv funksjon gjennomføres. Sylinderen oppgaven innebærer en kostnadseffektiv, flerbruksapparat som vurderer spontan forbena motor bruk. I denne oppgave blir en rotte plassert i et sylindrisk apparat, hvor rotten vil spontant bak og i kontakt med veggen i sylinderen med sine forbena. Disse kontaktene er vurdert forbena motor bruk og kvantifisert under videoanalyse etter testing. En annen kostnadseffektiv motor oppgave implementert er stråle-walk oppgave, som vurderer forbena kontroll, bakben kontroll og bevegelse. Denne oppgaven innebærer en rotte gang over en trebjelke som åpner for vurdering av lem motorisk kontroll gjennom analyse av forbena slips, bakben slips og faller. Vurdering av læring og hukommelse er ferdig med Morris vann labyrint for atferds paradigme. Protokollen starter med romlig læring, der rotte lokaliserer en stasjonær skjult plattform. Etter romfølelse, er plattformen fjernet og både kortsiktig og langsiktig romreferanse minne vurderes. Alle tre av disse oppgavene er følsomme for atferdsforskjeller og fullført innen 28 dager for denne modellen, noe som gjør dette paraparadigmetidseffektive og kostnadseffektive.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alzheimers sykdom (AD) er den mest utbredte formen for demens hos eldre befolkning og en ødeleggende nevrodegenerativ sykdom. Histopathologically, presenterer AD seg som amyloid plakk, neurofibrillary floker og nevronale tap. Amyloid plakk består hovedsakelig av beta-amyloid peptid (Ap) som har blitt produsert gjennom en endret proteolytisk spalting av amyloid forløper protein (APP) med β-sekretase og y-sekretase enzymer 1,2,3. Spalting produkt, Ap, innskudd i hjernen skape patologiske amyloid plakk og har toksiske effekter på hjernen som kan føre til de karakteristiske lærevansker og hukommelsestap. Alle disse trinnene sammen er referert til som "amyloidkaskadehypotesen" 3,4. Mens denne hypotesen er viktig når etterforsker AD, har andre celleforandringer blitt funnet å gå foran disse plakett formasjoner som avviker fra den opprinnelige amyloid kaskade veien. disse andrecelleforandringer er tenkt å bidra til tidlig hukommelsestap, læring nedskrivninger og andre kognitive dysfunksjoner som er involvert i AD før plakk dannelse 3,5,6.

Med AD stadig mer utbredt, er risikofaktorer for utvikling av AD å bli en svært viktig fokus for forskningen. Selv om alder er den viktigste risikofaktoren for sporadiske former for AD, har andre risikofaktorer er identifisert, inkludert hjerneslag 7,8. Slag er ikke bare en risikofaktor, men det kan også forverre allerede er tilstede demens. For eksempel, klinisk, progresjon av AD har vist seg å være verre hos pasienter som tidligere hadde hatt slag ni. Videre har økt ekspresjon APP og Ap akkumulering blitt funnet i eksperimentelle dyremodeller av Ap toksisitet kombinert med induserte slag 10,11. Siden det er dette viktig interaksjonen mellom slag og AD, er det vesentlig at disse to sykdommer bli ytterligere undersøktsammen i komorbide modeller for å bedre forstå patofysiologien og atferd innblandet i begge forhold.

For å undersøke komorbide tilstander, en passende modell måtte utvikles som et slag kunne samhandle med Ap for å produsere AD-lignende patologi. For første gang ble en APP21 transgen rotte som har en mutert humant APP-genet inkorporert i sitt DNA benyttes for å oppnå en passende modell for Alzheimers sykdom. Mutasjonene er den svenske dobbeltmissense og Indiana enkelt missense mutasjoner, som har både vært innblandet i familiære former av AD 4,8,12. I fravær av en ekstra fornærmelse, dette rottemodell aldre uten å utvikle den karakteristiske Ap-plaketter eller neurofibrillær fiber floker 12. Derfor, i et forsøk på å indusere AD-lignende adferds patologi, er en liten slaglengde innført i høyre striatum å etterligne de små subkortikal slag ofte er tilstede i demente 9. Slaget i APP21 transgene rat legemliggjør ko-sykelig tilstand og gjør det mulig for undersøkelse av forskjellige typer av adferdsendringer innblandet i begge sykdomstilstander. Spesielt denne induksjon av AD-lignende patologi og kognitiv svikt i voksen rotte kan vi undersøke de tidligste molekylære og kognitive endringer foregå AD.

Siden målet er å finne ut de første tegn på atferdsendringer, og siden både slag og AD har svært forskjellige atferds patologi, når studere komorbid modell, atferd oppgaver må vurdere en rekke atferdsmessige fenotyper. Det er et batteri med forholdsvis følsomme tester som kan gjøres for å analysere motor og kognitive oppførsel i gnagermodeller som involverer en rekke paradigmer og utstyr. Å spesielt analysere forbena og bakbena motorisk funksjon, har sylinderen oppgaven og stråle-walk oppgave er gjennomført for å oppdage motoriske mangler og overvåke bevegelse i denne modellen. Andre sensitive oppgaver designet for å spesifikt vurdere fint forelimb motoriske ferdigheter (dvs. trapp oppgaven og enkelt pellet nådde oppgave) krever mat deprivasjon 11,13,14. For å unngå en hvilken som helst av de kjente virkninger av mat deprivasjon på sykdoms patologier 15,16,17, har disse forsøk vært ansett uegnet for denne studien. Sylinderen oppgave vurderer spontan bruk av rotte forbein under oppdrett i en roman miljø og kan oppdage asymmetri mellom forbein i rotter med unilateral slag 10,18. En stor fordel for denne oppgave er at anordningen kan anvendes for andre atferds oppgaver, for eksempel den Porsolt tvunget svømme oppgave 19. I motsetning til sylinderen oppgave, den stråle tur oppgave tillater også analyse av bakben og forbena motorisk kontroll, i tillegg til locmotion 10,14. Beam gang inneholder en bevegelseskomponent, en balanse komponent og dyktig fot plassering. Begge disse testene er kostnadseffektiv, enkel og tidsbesparende og belyse effektene av hjerneslag og AD på d ifferences i lem funksjon.

Bortsett fra endringer i motorisk funksjon, innebærer AD hukommelsessvikt som kan presentere i tidlige stadier av sykdommen progresjon. Når adressering AD-lignende sykdommer i en gnager-modell, er det avgjørende at hippocampus avhengig læring og hukommelse vurderes fordi hippocampus er en viktig hjernestruktur i stor grad påvirkes i AD 2. Hippocampus er en viktig hjerneregion for romlig læring og hukommelse, og dens funksjon kan testes ved bruk av forskjellige labyrint paradigmer i gnagere. En av de mest brukte labyrint oppgaver for gnagermodeller av ulike sykdommer er Morris vannet labyrint 20. Morris vannlabyrint benytter romlige signaler for å hjelpe til rotte i å finne en stasjonær skjult plattform og tester romlig henvisning minne når plattformen er fjernet. En viktig fordel av vannet labyrint oppsettet er at det er svært tilpasningsdyktig, avhengig av den foreslåtte problemstilling 20.

telt "> For første gang har de teknikkene som er beskrevet blitt brukt til å vurdere motorisk og kognitiv funksjon i en roman komorbid rottemodell for hjerneslag og AD. involverer små slag i en APP21 transgen rottemodellen. Komorbiditet ble oppnådd ved å fremkalle vasokonstriksjon av blodårene i striatum å produsere et lite slag i APP21 transgene rotter. denne slag modellen har blitt godt etablert som en komorbid tilstand i en alternativ rotte modell av AD 11 Advancement. inn i denne romanen APP21 transgen rottemodellen var ment å produsere en mer translatorisk verdifull modell. Mens atferds oppgaver beskrives ved hjelp av en komorbid hjerneslag og AD rottemodellen, disse oppgavene kan bli ytterligere brukes på andre modeller av hjerneslag eller modeller av andre nevrologiske sykdommer (dvs. Parkinsons sykdom). Den generelle metodikk beskrevet vil være allment gjeldende for disse andre sykdomstilstander, men atferdstidslinjer og paradigmer kan kreve endring basert på de foreslåtte resEarch spørsmål og modell. I tillegg til å være tilpasningsdyktig, oppgavene som er beskrevet er effektive i å demonstrere mindre underskudd, og samtidig være kostnads- og tidsbesparende.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den aktuelle institusjonelle dyreetisk komité skal godkjenne alle de atferdsmessige prosedyrer før start eksperimentering. Alle dyr arbeidet som beskrives her ble godkjent av Western University Animal Bruk Subcommittee og følger den kanadiske Rådet for dyrestell retningslinjer. Disse dyreforsøk ble utført i løpet av den lette fasen.

1. Cylinder oppgave for Gross forbena Motor Assessment

  1. utstyr Setup
    1. Erverve en pleksiglass sylinder med et perforert lokk som vil imøtekomme størrelsen på rotte anvendt i eksperimentet. Størrelsen av sylinderen bør ikke tillate at rotten for å nå toppen når stell og den bør gi rom for 2 cm mellom veggen og rotte nese og bunnen av rottens hale. Standarden størrelse med en sylinder er 23 cm i diameter og 40 cm i høyde for en seks måneder gammel (400-600 g) rotte.
    2. Plasser et speil i en 45 ° vinkel under sylinderen apparat med sylinderen sitter på en Plexiglas stå eller noen annen form for støtte ca 30 cm over bordplaten.
    3. Sett opp et videokamera på et stativ på en passende avstand for å visualisere hele diameteren på sylinderen i speilet på videokameraet.
    4. Slå belysning til en dimmer innstilling og spille hvit støy i rommet (dvs. lavt volum, subtil musikk) for å redusere effekten av plutselige høye lyder. Dette bør bidra til å oppmuntre bevegelse og hindre frysing på grunn av høye lyder.
  2. Eksperimentell prosedyre
    1. Flytt rottene inn i forsøksrommet 30 min før starten av første rettssaken for å akklimatisere rotter til rommet med musikk og dimmer belysning.
    2. Skriv tilsvarende dyr og prøveinformasjon (dvs. dyr nummer, dag i tidslinjen og prøvenummer) på en liten hvit bord. Plasser denne brettet foran speilet.
    3. Trykk rekord på videokameraet med den hvite bord foran speilet, plukke opp rotte nær bunnen of halen, plassere rotten i sylinderen og feste lokket. Stå ut til siden av sylinderen for å unngå konflikt med videoopptak.
    4. Fjern den hvite bord fra foran speilet og la videokameraet posten rotte i sylinderen i 5 minutter (bruk en timer for å spille inn 5 min fra når den hvite bord er fjernet). Dette er en prøveversjon.
    5. Rengjør sylinderen med papirhåndkle og vann etter en rettssak.
    6. Gjenta trinn 1.2.2-1.2.5 to ganger til for å oppnå en totalt tre forsøk. Det bør være et 20-30 min inter-prøvetiden for å redusere sjansen for tilvenning til sylinderen. I løpet av denne tiden, kjøre sylinder prøvelser for de andre rottene.
  3. video Analysis
    1. Import videokamera filer til videoredigeringsprogram (dvs. iMovie)
    2. Kompilere videoer i klipp for hvert forsøk. Dempe lyden på videoen og redusere hastigheten på videoen til 25% av det opprinnelige.
    3. Tell antall forbena kontaktermed veggen i sylinderen til venstre og høyre forbens. For samtidige venstre og høyre kontakter, telle disse forbena kontakter som "begge". Husk at videoen er spilt inn gjennom et speil, hva synes å være venstre forbena i videoen tilsvarer dyrets høyre forbena i virkeligheten.
    4. Beregn prosent bruk av det berørte forbena (kontralateral til hjerneslag) ved hjelp av følgende ligning: [{(påvirket kontakter + ½ bilaterale kontakter) / totalt antall kontakter} x 100]. Ytelsen til både vill type grupper og den transgene gruppen uten slag anses sammenligning grupper for å vurdere presentasjon av sykdomsinduserte problemer.

2. Beam-tur oppgave for Gross Motor Assessment

  1. utstyr Setup
    1. Erverve en jevn forseglet trebjelke som er 2 cm bred og ca 120 cm lang (optimal bredde for en 200-600 g rotte).
    2. Plasser to tabeller eller hyller unsine 100 cm fra hverandre. Overflatene på hver enhet bør være ca 40 cm over bakken.
    3. Feste begge ender av bjelken til bordet eller hylle overflaten ved hjelp av tape. Omtrent 1 m støttes strålelengde skal nå være hevet 40 cm over bakken.
    4. Sett opp en video-kamera på et stativ, fange hele lengden av bjelken. For å forbedre kontrasten i videoen, vurdere å innføre en svart bakgrunn bak strålen når du bruker hvite rotter.
  2. Eksperimentell prosedyre
    1. Flytt rottene inn i forsøksrommet 30 min før starten av første rettssaken for å akklimatisere rotter til rommet med musikk og dimmer belysning.
    2. Plasser rotte hjem bur eller miljø berikelse rør i den ene enden av bjelken og plassere rotten i den andre enden av bjelken.
    3. Gjennomføre et par ikke-registrert kjører to dager før eksperimentelle studier. La rotte utforske området og lede rotte mot bjelken ved å holde foten av rotten'S halen.
    4. Når rotte har passert strålen, bevege buret eller røret til den andre ende av bjelken og gjenta. Når rotta krysser strålen fritt i begge retninger, er over treningsøkten. Hold antall trening kjører konsekvent blant alle dyrene.
    5. Skriv tilsvarende dyr og prøveinformasjon (dvs. dyr nummer, dag i tidslinjen og prøvenummer) på en liten hvit bord. Tape denne hvite bord til veggen bak bjelken.
    6. Plasser rotte hjemmeburet eller miljø anriking slangen ved den ene ende av bjelken.
    7. Trykk ta opp på videokameraet og plukke opp rotte ved haleroten og sted ved enden av bjelken motsatt til hjemmeburet eller slangen.
    8. Spill helheten av rettssaken, som ender når rotta har fullført krysser hele lengden av den forhøyede trålen. Hvis rotte pauser midtveis over strålen, forsiktig Scruff rotte ved haleroten eller berøre rotte hale forsiktigfor å fremme bevegelse på tvers av strålen. Ikke skyv rotte frem på noen måte.
    9. Re-gjøre studier der rotta slår sidelengs mens på strålen, gjentatte ganger stopper gå eller spaserturer inkonsekvent. Hvis en rotte faller og fortsetter å henge på strålen, forsiktig scoop opp rotte og sett den tilbake på bjelken ved posisjonen til høsten og fortsetter rettssaken.
    10. Flytt hjem buret eller slangen til den andre enden av bjelken, endre rettssaken # på den hvite bord og spille den påfølgende rettssaken.
    11. Gjenta denne prosedyren til totalt 6 forsøk har blitt gjennomført, med 3 forsøk blir registrert for hver retning. Alle 6 forsøk for en rotte kan registreres før forsøkene for neste rotte.
  3. video Analysis
    1. Importer video kamera filer til videoredigeringsprogram (dvs. iMovie).
    2. Kompilere videoer i klipp for hvert forsøk og dempe volumet på videoen. Analysere hvert videoklipp bilde for bilde.
    3. Tell antallav totalt antall skritt rotte tar å gå hele lengden av bjelken og det totale antall venstre og høyre bakben og forbena slips og totalt antall fall. Ytelsen til både vill type grupper og det transgene gruppen uten slag er vurdert i forhold til komorbid gruppe for å vurdere framveksten av underskudd som er unike for komorbid tilstand.

3. Morris Water Maze for hippocampus-avhengig romfølelse og Reference Minne

  1. utstyr Setup
    1. Fest et videokamera plassert over midten av et sirkulært basseng (148 cm diameter og 58 cm dybde). Juster de fire utpekte kvadranter ordentlig med omrisset av bassenget i sporing programmet.
    2. Fyll den sirkulære basseng med vann ca 36 cm dyp. Vannet bør varmes til romtemperatur ved å fylle bassenget noen dager før start av forsøksprotokoll.
    3. Legg svart giftfri akrylmaling until vannet er ugjennomsiktig ved bruk av hvite rotter. Bruk en lys farge, som hvit, for mørkere farget rotter.
    4. Omgir bassenget med tomme veggflater, inkludert romdeler hvis nødvendig. Når du er i bassenget skal rotten ikke være i stand til å se forskere.
    5. Skjær 4 store ulik form, romlig og fra forskjellige farger av plakat bord og feste en form på veggen per utpekt nord, øst, sørøst og sørvest basseng steder. Disse signaler bør være litt høyere enn kanten av bassenget.
    6. Slå på en radio på lavt volum i nordvestre delen for å forhindre rotte fra å bli distrahert av uventede høye lyder under testing.
    7. Plasser en sirkelformet plattform (11,5 cm diameter, overflate 2-3 cm under vann-nivå) i midten av målet kvadrant.
    8. Slå av hovedrommet lys og skru på en gulvstående lampe på motsatt side av romdeler til bassenget for å belyse området.
  2. Computer Configuration Bruk et sporingsprogram som er utviklet for Morris vann labyrint atferd oppgaver og sette opp protokoll før du starter eksperimenter. Et eksempel på en mulig program er gitt i figur 4.
  3. Sett 4 sammenhengende dager med 4 forsøk med 90 sek hver for romfølelse eksperiment.
  4. Satt 2 separate eksperimenter probe av 30 sek hver på 24 timer etter den siste romlig læring prøving og 1 uke etter den første proben eksperimentet.
  5. Set cued læringsforsøk på 4 forsøk per dag i 2 påfølgende dager med start 24 timer etter den andre proben forsøket. Hvert forsøk skal være 60 sekunder totalt.
  6. For hvert trinn, sett testing rekkefølge slik at det er en 20 min inter-rettssaken intervall mellom hvert forsøk for et gitt dyr. Andre dyr kan kjøres i denne inter-prøveintervall, så lenge som hvert dyr opprettholder en 20 min inter-prøveintervall.
  7. Kontroller at plattformens posisjon er å være definert av eksperimentator og at alle andre sonene er debøtelagt av den utpekte plattformposisjon.
  8. Sette programmet til å starte og avslutte hver prøve manuelt.
  • Spatial Learning Experiment
    1. Plasser den runde plattformen i sørvest kvadranten. Det bør være på linje med den sirkulære betegnelsen "plattform" område i kvadranten på dataprogrammet.
    2. Begynn posisjoner rundt bassenget skal bli randomisert for hver rotte. Representere alle startposisjoner i hver behandlingsgruppe. Ingen rotte starter fra nordøst posisjon for eventuelle romlige læringsforsøk i paradigmet som presenteres for å gi en ny start posisjon under sonde testing.
    3. Hold rotte på undersiden av halen og forsiktig plassere den i vannet langs veggen av bassenget på det angitte startposisjonen og raskt flytte ut av rotte øyne.
    4. Har den andre eksperimentator starte sporing programvare så snart rotte er i vannet. En timer bør begynne å telle opp fra 0 på sporing program. Hvis rotta lokaliserer plattformen, har den andre eksperimentator stoppe forsøket på maskinen og la rotta på plattformen i minst 30 sekunder før du hente den. Hvis rotta hopper av plattformen før rettssaken stanses på datamaskinen, fortsetter rettssaken.
    5. Hvis rotten ikke finne plattformen i den avsatte prøvetiden, veilede rotte til plattformen ved hjelp av hånden din (enten lage rotte følge hånden eller veilede rotte ved foten av halen). Hold rotte på plattformen i 30 sek.
    6. Ta rotta fra bassenget ved foten av halen på eksperimentators arm som er dekket med et håndkle eller la rotte klatre opp på en bærbar overflaten.
    7. Gjenta trinn 3.3.3-3.3.7 til sammen 4 forsøk per rotte. Det bør være en inter-prøveintervall på 20 minutter for hver rotte.
    8. Returner rottene til sine hjem bur under en varmelampe i minst 10 minutter etter rotte endelige romfølelse rettssaken.
    9. Fortsett EXAct samme romfølelse protokoll for dag 2 til dag 4 av romfølelse.
    10. På dag 2-4, ikke holde rotta på plattformen lenger. La rotte til å sitte på plattformen uten hjelp i 30 sek med forskere ute av syne. Dette kan gjøres ved senere forsøk på dag 1 på anledningen.
  • probe Experiment
    1. Fjern plattformen fra bassenget. Sørg forrige plattformens posisjon forblir definert på datamaskinen (sirkelen i sørvest kvadranten).
    2. Plasser rotte i vannet langs veggen av bassenget på den nordøstlige posisjon og raskt flytte ut av rotte øyne. Bruk av romanen nordøst startposisjon sikrer at rotta minnes plattformposisjon, uavhengig av tidligere trente startposisjoner.
    3. Har den andre eksperimentator starte sporing programvare så snart rotte er i vannet. En timer bør begynne å telle opp fra 0 på sporing av programvare.
    4. Hent rotte frasørvest kvadranten av bassenget ved foten av halen og hold på et håndkle dekket arm eller la rotte klatre opp på en bærbar overflaten.
    5. Returner rottene til sine hjem bur under en varmelampe i minst 10 minutter etter hver rotte sonde rettssaken.
    6. Gjenta dette eksperimentet (trinn 3.4.1-3.4.5) en uke senere.
  • Cued Learning Experiment
    1. Bruk tape til å sikre en 4 cm diameter hvit sfærisk kø på et stativ som er 8,5 cm høy på plattformen (total høyde kø på er 12,5 cm). Toppen av den sfæriske kø vil være minst 8,5 cm over vannivå.
    2. Fjern de forskjellige tonene fra murene som omgir bassenget.
    3. Tilfeldig plattform stillinger og begynne posisjoner for hver rotte i hver gruppe. Alle plattform og startposisjoner bør være representert for hver behandlingsgruppe.
    4. Plasser plattformen i det angitte plattformen området og definerer i sporing av programvare.
    5. Plasser rotte i vannet langs veggen av bassenget på tHan betegnet startposisjon og raskt flytte ut av rotte øyne.
    6. Har den andre eksperimentator starte sporing programvare så snart rotte er i vannet. En timer bør begynne å telle opp fra 0 på sporing av programvare.
    7. Når rotte når plattformen, har den andre eksperimentator stoppe forsøket på datamaskinen. Hvis rotta hopper av plattformen, fortsetter rettssaken. Før hente rotte, la rotta å sitte på plattformen for 15 sek.
    8. Hent rotte fra bassenget ved foten av halen og hold på et håndkle dekket arm eller la rotte klatre opp på en bærbar overflaten.
    9. Kontroller plattformens posisjon for den neste rotte og flytte plattformen til det tilsvarende område som er definert i den sporing av programvare.
    10. Gjenta trinn 3.5.4-3.5.9 for følgende 3-studier. Det bør være en inter-rettssaken intervall på 15 min.
    11. Returner rottene til sine hjem bur under en varmelampe i minst 10 minutter etter hver rotte final cued lære rettssaken.
    12. Fortsett på samme protokoll for dag 2 av spolt læring.
  • Dataanalyse
    Merk: Tid brukt i soner, distanse i soner, gjennomsnittlig hastighet, antall oppføringer i soner og tid til første inntreden i soner er ofte brukt.
    1. Analyser tid og avstand til plattformen sonen og den gjennomsnittlige hastigheten per dag av romlig og spolt lære seg. For probe eksperimenter, analysere ventetid til første inntreden i målsonen som en rå tid eller en prosent endring fra sonden en å sondere to.
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    De atferdsmessige oppgaver som er beskrevet ble anvendt for å demonstrere virkningene av slag i en APP21 transgen rotte-modell av Alzheimers sykdom. Kombinasjonen av hjerneslag og APP21 transgenet forventes å resultere i større motor underskudd i de berørte lemmer, samt økte hukommelsessvikt.

    Sylinderen oppgave bedømmes grov forbena motorisk funksjon og er representert som bruk av de berørte forbena. Videre ble den strålen-turen oppgave som brukes for spesifikt å vurdere bakben motorisk funksjon og bevegelse. Siden slag ble indusert i høyre striatum, blir den venstre forbena forventes å vise en motor underskudd dersom en er tilstede. Dataene presentert i både figur 2 og figur 3a og 3b ikke statistisk demonstrere at samtidig sykelig rotter har en forbens eller bakben underskudd, respektivt. Selv om disse dyrene ikke appære å ha forbena eller bakbena motoriske underskudd, de synes å ha mindre forskjeller i motorisk funksjon knyttet til bevegelse. I den stråle tur oppgave totale trinn ble betydelig øket i de ko-transgene sykelig rotter med slag (p <0,05, figur 3c), noe som tyder på at stråle-turen oppgave er følsom nok til å plukke opp små endringer i gangart og bevegelse. Den lille striatale slag modellen produserer små slag som er sannsynlig for liten til å produsere noen store motoriske underskudd, men underskudd har blitt vist før i andre takts modeller med disse to oppgavene 10,14. Her kan disse oppgavene rett og slett overvåke motorikk og bevegelse når undersøker parametrene som presenteres.

    Hippocampus avhengig romlig læring og referanse minne kan effektivt vurderes ved hjelp av Morris vann labyrint. Det var ingen åpenbare forskjeller i læring mellom gruppene (figur 5a > Figur 5b), derfor forskjeller i læring kan ikke ta hensyn til eventuelle forskjeller i minneytelse. APP21 transgene rotter med strek vist en robust langtids henvisning minne underskudd i forhold til transgene rotter uten slag og villtype-rotter med slag (p <0,05, figur 5c).

    Cued læring er gjennomført for å sikre at rotter har lik mulighet til å bruke visuelle romlige signaler for å lokalisere plattformen i Morris vannet labyrint. Som vist på figur 6a og figur 6b, ble ingen forskjeller observert i latens eller veilengde for å nå plattformen under spolt læring mellom gruppene. Videre gjennomsnittlig svømme kjørte jevnt mellom gruppene (figur 6c) og viser at motivasjonen for å unnslippe og svømme fotball var lik mellom gruppene.

    gur 1 "src =" / files / ftp_upload / 53089 / 53089fig1.jpg "/>
    Figur 1:. Tidslinje for motor og kognitive atferdsvurderingene Stroke-induserende kirurgi dag er tildelt dag 0 og alle testing dager er i referanse til denne dag. (A) Pre-kirurgi og post-kirurgi testing for sylinder oppgave (C) og stråle spasertur oppgave (BM). (B) Morris vannet labyrint romfølelse, probe testing og cued læring. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 2
    Figur 2:. Cylinder Task Prosent bruk av berørte forbena ble beregnet ved hjelp av ligningen i trinn 1.3.4 og standardisert til dag -3 baseline-verdier. Den røde stiplede linjen annotates 1,0 verdi som representerer lik bruk av hverforbena i sylinderen oppgave. Vill type er forkortet til WT og transgene er forkortet til TG. Dyr tall er som følger: WT + saltoppløsning (n = 7), WT + slag (n = 8), TG + saltoppløsning (n = 8), TG + slag (n = 6). Alle verdier er presentert som gjennomsnitt ± SEM. (Toveis ANOVA, Tukey innlegg hoc). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 3
    Fig. 3: Beam-tur oppgave Summen av alle kilene laget med (A) påvirkes og (B) upåvirket bakben på tvers av 5 forsøk er presentert som et forhold mellom det totale antall skritt som er tatt for å krysse bjelken. Verdier ble standardisert til utgangsverdien som følger: etter operasjonen ratio - pre-kirurgi forholdet. (C) Den totale fremgangsmåten for å krysse bjelken o n dag -7 og dag 21. Wild type er forkortet til WT og transgene er forkortet til TG. Dyr tall er som følger: WT + saltløsning (n = 6), WT + slag (n = 6), TG + saltoppløsning (n = 6), TG + slag (n = 5). Alle verdier er presentert som gjennomsnitt ± SEM og stjernetegn indikere statistisk signifikans. (Enveis ANOVA, Tukey innlegg hoc, p <0,05). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 4
    Figur 4: Program view demonstrere seksjoner som kreves for oppsett og kjører et eksperiment Noen fremhevet funksjonene i sporing program som brukes for Morris vann labyrint.. Apparatet visning med video av bassenget omtalt ovenfor vises bare som presenteres når i kategorien tester.3089fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 5
    Figur 5: Romlig læring og hukommelse i referanse Morris vannlabyrint spatial læring ble målt ved (A) latens og (B) veilengde for å nå plattformen.. (C) Annonse minne ble målt som prosentvis endring av ventetid til første inntreden i målsonen på dagen 19 sonde test i forhold til dagen 12 sonde test. Vill type er forkortet til WT og transgene er forkortet til TG. Dyr tall er som følger: WT + saltløsning (n = 8), WT + slag (n = 7), TG + saltoppløsning (n = 7), TG + slag (n = 8). Alle verdier er presentert som gjennomsnitt ± SEM og stjernetegn indikere statistisk signifikans. (Toveis ANOVA for romfølelse og enveis ANOVA for sonde testing, Tukey innlegg hoc, p &# 60;. 0,05) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figur 6
    Figur 6:. Cued læring i Morris vannet labyrint (A) Latency og (B) banelengde for å nå plattformen er oppgitt som et gjennomsnitt av alle de åtte studier av læring. (C) Swim hastighet er presentert som et gjennomsnitt av alle de åtte studier av læring. Vill type er forkortet til WT og transgene er forkortet til TG. Dyr tall er som følger: WT + saltløsning (n = 8), WT + slag (n = 7), TG + saltoppløsning (n = 7), TG + slag (n = 8). Verdier er presentert som gjennomsnitt ± SEM. (Enveis ANOVA, Tukey innlegg hoc). Klikk her for å se en større versjon av dennefigur.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

    Kombinasjonen av slag og Alzheimers sykdom resulterer i svært forskjellige adferds patologiske tilstander som kan påvirke både de motoriske og kognitive funksjon avhengig av alvorlighetsgraden av hver tilstand. Således er det nødvendig å gjøre bruk av en rekke forskjellige adferdsoppgaver for å bestemme de individuelle bidrag fra disse betingelser, såvel som å gi en viss innsikt i de kombinerte og potensielt interaktive effekter i co-sykelig tilstand. Dataene som presenteres viser tre kostnadseffektiv, tidsbesparende og sensitive atferd oppgaver å vurdere motorisk funksjon og hippocampus avhengig romlig læring og referanse minne i en roman komorbid APP21 transgen rottemodellen med hjerneslag. I tillegg til de data som er gitt, er disse oppgavene blitt bekreftet i mer alvorlige slag modeller 10,14,18, så vel som i modeller for AD 8,16 og bør være vidt anvendelig for ulike modeller av begge sykdommer.

    Når det er sagt, er ingen oppgave uten limitations. For de motoriske oppgavene Spesifikt kan noen feilsøking være nødvendig hvis rottene tilvent til sylinderen og bjelken. I sylinderen oppgaven, kan en motivasjon være nødvendig for å sikre den rotte oppnår den passende mengde av forbena kontakt med veggen av sylinderen. For å oppnå dette resultat, kan anvendelsen av en ikke-toksisk duft på den perforerte lokk eller vegg av sylinderen motivere rat til bak og i kontakt med veggen i sylinderen med sine forbena. For eksempel kan en liten bit av peanøttsmør eller vanilje ekstrakt bli utflytende på innsiden nær toppen av sylinderen for å oppmuntre stillesittende rotter for å utforske sylinderveggene. En ring av farget tape kan også brukes på innsiden av sylinderen ¾ fra bunnen av sylinderen. En annen måte å fremme merden innebærer å fjerne en stillesittende rotte og gjeninnføre den i sylinderen etter en tid har gått, som har blitt oppnådd med en inter-prøveintervall i protokollen. Pelsthermore, avhengig av høyden av sylinderen i forhold til lengden av rotte, fjerne den perforerte lokket halvveis gjennom en prøveperiode kan be oppdrett og forbena kontakt med sylinderveggen. Dette bør ikke gjøres hvis det er en mulighet for at rotte vil være i stand til å unnslippe fra sylinderen under testing. Disse motivasjon kan bidra til å øke antall steiler, men bør ikke påvirke bruken av venstre og høyre framlabbene på veggen kontakt. Hvis det fortsatt er et stort problem om et utilstrekkelig antall forbena kontakter etter implementere disse forslagene, kan en rettssak bli avsluttet etter rotten har gjort totalt 10 steiler uavhengig av lengden av tid. Dette vil være forskjellig fra de 5 minutters forsøk gjennomført i protokollen ovenfor, som hver rotte ville nå totalt 10 steiler til forskjellige tider. Med en modell for hjerneslag og AD komorbiditet, er det viktig å være oppmerksom på at endringer i kognitive prestasjoner, angst og aktivitetsnivå kan utvikle seg i disse rotter. Waler slike endringer ikke direkte påvirker den primære utfallet av sylinderen oppgave (spontan forbena bruk under oppdrett), innspilling andre observasjoner kan utgjøre verdifulle bevis for ikke-motorrelaterte atferdsendringer som kan utvikle seg. I sylinderen oppgaven, kan slik oppførsel potensielt observeres ved å analysere økt eller redusert stell oppførsel, som oppdrett er en form for motivert utforskende adferd. Videre andre tiltak som for eksempel tid brukt grooming, snu og landing kan gi innsikt på angst og andre fysiske underskudd, henholdsvis.

    I forhold til stråle spasertur oppgave, ved hjelp av hjemmeburet berikelse rør er vanligvis nok motivasjon for rotta å gå over bjelken. Hvis en rotte fortsetter å stoppe midtveis langs bjelken, en duftende mat belønning eller behandle, så som peanøttsmør eller presisjon sukker pellets, kan bli introdusert i tillegg til berikelse rørene ved den motsatte ende. Hvis godbiter er gitt, sørge for at alle rottene får abut samme mengde godbiter på testing dag, uavhengig av deres prestasjoner. I tillegg, i stedet for å kjøre alle seks forsøk for en rotte før du flytter til neste rotte, studiene kunne bli forskjøvet. For eksempel kan de to første forsøkene fylles ut for alle rottene før du starter neste to. Dette kan hindre økt antall stopp midtveis over bjelken som kan oppstå på senere studier når noen rotter blir for komfortabel med strålen miljø. En annen mulig løsning hvis hyppig stans oppstår er å redusere antall forsøk. Dette kan gjennomføres ved å plassere et speil bak strålen til å analysere både venstre og høyre lemmer i hver studie, og dermed gir det antall forsøk for å bli redusert. Videre kan tilvenning til bjelken skje etter flere testsesjoner, og kan resultere i rotter som nekter å krysse bjelken og forbli sittende på bjelken, til tross for alle anstrengelser for å motivere dyret. På grunn av dette problemet, bjelkevurderinger er ikke ideelt for gjentatt testing i long varige forsøk. I protokollene som utnytter gjentatte testing, kan erstatningen også bli et problem i tillegg til motivasjon. For å overvinne problemene for kompensasjon mens krysset strålen, kan en konisk bjelke brukes i stedet for en vanlig trebjelke 21.

    Igjen kan kognitive endringer, blant annet økt angst og endringer i generelle aktivitetsnivå og motivasjon, forekommer i denne dyremodell. Derfor er det viktig å ta oppmerksom på eventuelle uregelmessigheter blant de eksperimentelle gruppene om dyrenes motivasjon til å krysse stråle samt deres hastighet og ikke-bevegelsesatferd (stopper, sitter, skjelving, orientering) mens traversering strålen.

    Behavioral Alzheimers sykdom forskning krever kortsiktige og langsiktige minne testing, noe som er oppnådd her ved hjelp av Morris vannet labyrint. Mange protokoller vurdere 24 timer etter romfølelse å være langtidshukommelsen 21, men med denne protokollen påimeline av 24 timer etter romfølelse anses korttidshukommelse og en uke regnes som langtidshukommelsen. I løpet av denne en-ukers periode i mellom probe studier bør rottene ikke utsettes for andre atferds oppgaver eller unødvendige stressfaktorer for å unngå interferens med Morris vann labyrint romreferanse minne.

    I forhold til romlig læring, bør forskere være vedvarende i å kreve rotte å sitte på plattformen uten å hoppe etter en viss tid. Hvis rotta vellykket sitter på plattformen, men hopper av som forskere kommer til syne, skal rotten skal plasseres eller guidet tilbake til plattformen, og som kreves for å sitte på plattformen til eksperimentator henter dyret. Å håndheve læring av plattformen som den eneste måten å unnslippe vannet, bør rotter ikke bli plukket opp mens svømming, med mindre i en sonde rettssak setting. Hvis rottene klarer å hoppe fra plattform på kanten av bassenget, kan du vurdere å flytte plattform;m lenger mot midten av bassenget for å hindre læring av en alternativ rute til å unnslippe.

    For å sikre at det ikke er noen romlige skjevheter i løpet romlig og spolt læring, bør startposisjoner og cued plattform posisjoner for hver rotte i en behandlingsgruppe bli randomisert. Hver behandlingsgruppe bør ha et representativt antall rotter som starter fra hver startposisjon for romlig læring eller etter samme start og plattformposisjon paradigme for spolt læring. For tildeling av startposisjoner, Vorhees og Williams presentere en meget detaljert sett av randomiserte startposisjoner for romfølelse og randomiserte start- og plattform posisjoner for cued læring 20. Det kan benyttes direkte eller som en rettesnor for å tildele posisjoner til hver rotte før begynnelsen av Morris vannlabyrint testing.

    For analyse av Morris vann labyrint data, forslagene i protokollen ovenfor representerer hvordan dataene som presenteres her ble kjøpt. den daten samlet opp i trinn 3.6 av den ovenfor angitte Morris vannlabyrint protokoll kan benyttes for å beregne ulike effektmål som kan være nyttig for å beskrive en kognitive underskudd. For eksempel, utover den numeriske datasettet, sporing tilbyr også eksperimentator muligheten til å analysere spor tomter, som kan gi ytterligere innsikt i dyrenes søkestrategier. I tillegg er prosentandelen av tid eller distanse innenfor målet kvadrant i forhold til alle kvadranter kan brukes som et mål på henvisning minne i probe-forsøk. Det er viktig å huske på at disse komorbide dyremodeller kan utvise noen motoriske underskudd. Sammenligning svømme fart blant de eksperimentelle gruppene kan gi en indikasjon på om en potensiell motor underskudd påvirker dyrenes evne til å utføre i Morris vannet labyrint. Videre, for å utelukke motorytelse fra å bli en problemfaktor i vann labyrint resultat, er det anbefalt å se på veilengde for å nå plattformeni tillegg til ventetid og svømme hastighet som vist i figur 5 og 6. Dersom svømmeferdighet er kompromittert på noen måte, er veilengden den mest nøyaktige mål for å vurdere hippocampus funksjon.

    Mens det er ulike tidslinjer som kan brukes til alle disse atferds oppgavene som er beskrevet, bør metodikken for å kjøre hvert forsøk forbli den samme. Dataene presentert her ble oppnådd med en 21 dagers post-takts utvinning tid punkt, som fanger opp de tidlige hendelsene etter slag og deres potensielle interaksjoner med Ap metabolisme i hjernen. Mens de data som presenteres her var i en komorbid modell for hjerneslag og Alzheimers sykdom, kan disse oppgavene brukes til eller tilpasset ulike problemstillinger og modeller. Mens sylinderen testen er en lavere-modifiser standard prosedyre, kan strålen turen oppgaven bli noe justert til alvorlighetsgraden av den forventede motorisk svikt ved å velge passende bjelke widths. Vannet labyrint er den mest allsidige test av alle paradigmer som nevnes her. For eksempel velger ulike intervaller mellom slutten av innsamlingsfasen og den romlige referanse minne sonde rettssaken kan enkelt teste kortsiktige og langsiktige minne. Arbeidsminne og strategi skiftende, to komponentene i utøvende funksjon, kan også testes ved hjelp av vann labyrint oppsett. For å vurdere arbeidsminnet, kan den inter-rettssaken intervall bli redusert til under 1 min under oppkjøpet læring av en ny plattform plassering. Videre har dyr lære andre, ny plassering av plattformen etter vellykkede oppkjøpet av en innledende plattform plassering kan teste mental fleksibilitet eller strategiskifte. Tatt i betraktning alle disse mulige modifikasjoner, er det en stor fleksibilitet med disse adferdsoppgaver, som er en annen stor fordel i tillegg til alle de tidligere nevnte fordeler.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Cylinder Western University Plexiglas Cylinder
    Cylinder Diameter: 23 cm
    Cylinder Height: 40 cm
    Platform Height: 30 cm
    Mirror Length: 35 cm
    Mirror Width: 26.5 cm
    This was made specifically by Western University Machine Services for our lab. Please contact your own chosen manufacturer to design this product.
    Handheld Video Camera JVC GZ-E200
    Video Camera Tripod Slik F163
    AM/FM Clock Radio Sylvania SCR1388
    White Board Walmart Width: 71.12 cm
    Height: 55.88 cm
    These can be purchased at any store (i.e. Walmart, University bookstores)
    Dry-erase Marker Expo Expo Dry-erase Original Marker These can be purchased at any store (i.e. Walmart, University bookstores)
    Wooden Beam Rona Plywood
    Width: 2 cm
    Length: 100 cm
    VWR General Purpose Laboratory Tape VWR Intl. 89097-920
    iMovie '11 Apple Inc. Version 9.0.9 (1795) This is the version used in this manuscript, but any other iMovie version or video editing software could be used.
    Morris Water Maze Pool with Platform Stoelting Co. 60136/60035 These are not the exact products used in the video, but these are essentially identical.
    Platform Cue - - The platform cue used was created using a small metal stand and white spherical foam ball. These can likely be purchased at any store with home improvement materials (i.e. Walmart, Rona etc.)
    Mainstays 71" Floor Lamp Walmart HW-F0377SLV
    ANY-Maze Behavioural Tracking Software Stoelting Co. 60000 There are ANY-maze® bundles that include the camera with or without a computer and accessories.
    Compact Video Camera Logitech V-U0023
    Laptop Hewlett-Packard HP Pavilion dv6 Notebook PC Laptop Specifics: AMD A6-3420M APU with Radeon HD Graphics 1.50 GHz, 6.00 GB RAM, 64-bit operating system.
    Americana Non-toxic Acrylic Paint DecoArt DAO67-9 This can be ordered on the DecoArt site or purchased in store at DecoArt retailers.
    Poster Board Walmart PA-1961

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Auld, D., Kornecook, T., Bastianetto, S., Quirion, R. Alzheimer's disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies. Prog Neurobiol. 68, (3), 209245 (2002).
    2. Huang, Y., Mucke, L. Alzheimer Mechanisms and Therapeutic Strategies. Cell. 148, (6), (2012).
    3. Querfurth, H., LaFerla, F. Alzheimer's disease. New Engl J Med. 362, (4), 329-344 (2010).
    4. Karran, E., Mercken, M., Strooper, B. The amyloid cascade hypothesis for Alzheimer's disease: an appraisal for the development of therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 10, (9), 698-712 (2011).
    5. Akiyama, H., et al. Inflammation and Alzheimer's disease. Neurobiol Aging. 21, (3), (2000).
    6. Butterfield, D., Drake, J., Pocernich, C., Castegna, A. Evidence of oxidative damage in Alzheimer's disease brain: central role for amyloid β-peptide. Trends Mol Med. 7, (12), 548554 (2001).
    7. Kalaria, R. The role of cerebral ischemia in Alzheimer's disease. Neurobiol Aging. 21, (2), 321-330 (2000).
    8. Selkoe, D. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81, (2), 741-766 (2001).
    9. Snowdon, D. A., et al. Brain infarction and the clinical expression of alzheimer disease: The nun study. JAMA. 277, (10), 813 (1997).
    10. Clarke, J., et al. Overexpression of APP provides neuroprotection in the absence of functional benefit following middle cerebral artery occlusion in rats. Eur J Neurosci. 26, (7), 1845-1852 (2007).
    11. Whitehead, S., Hachinski, V., Cechetto, D. Interaction Between a Rat Model of Cerebral Ischemia and β-Amyloid Toxicity Inflammatory Responses. Stroke. 36, (1), 107-112 (2005).
    12. Agca, C., et al. Development of transgenic rats producing human β-amyloid precursor protein as a model for Alzheimer's disease: Transgene and endogenous APP genes are regulated tissue-specifically. BMC Neuroscience. 9, (1), 28 (2008).
    13. Bayona, N. A., Gelb, A. W., Jiang, Z., Wilson, J. X., Urquhart, B. L., Cechetto, D. F. Propofol neuroprotection in cerebral ischemia and its effects on low-molecular-weight antioxidants and skilled motor tasks. Anesthesiology. 100, (5), 1151-1159 (2004).
    14. Langdon, K., Clarke, J., Corbett, D. Long-term exposure to high fat diet is bad for your brain: exacerbation of focal ischemic brain injury. Neuroscience. 182, 82-87 (2011).
    15. Brownlow, M., et al. Partial rescue of memory deficits induced by calorie restriction in a mouse model of tau deposition. Behav Brain Res. 271, 7988 (2014).
    16. Halagappa, V., et al. Intermittent fasting and caloric restriction ameliorate age-related behavioral deficits in the triple-transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol Dis. 26, (1), (2007).
    17. Maalouf, M., Rho, J., Mattson, M. The neuroprotective properties of calorie restriction, the ketogenic diet, and ketone bodies. Behav Brain Res. 59, (2), (2008).
    18. Tillerson, J. L., et al. Forced limb-use effects on the behavioral and neurochemical effects of 6-hydroxydopamine. Neuroscience. 21, (12), 4427-4435 (2001).
    19. Sierksma, A., et al. Improvement of spatial memory function in APPswe/PS1dE9 mice after chronic inhibition of phosphodiesterase type 4D. Neuropharmacology. 77, (2013).
    20. D'Hooge, R., De Deyn, P. P. Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory. Behav Brain Res. 36, (1), 60-90 (2001).
    21. Vorhees, C., Williams, M. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nat Protoc. 1, (2), 848-858 (2006).
    Motor og hippocampus Avhengig romfølelse og Reference Minne Vurdering i en transgen Rat Model of Alzheimers Disease med Stroke
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Au, J. L., Weishaupt, N., Nell, H. J., Whitehead, S. N., Cechetto, D. F. Motor and Hippocampal Dependent Spatial Learning and Reference Memory Assessment in a Transgenic Rat Model of Alzheimer's Disease with Stroke. J. Vis. Exp. (109), e53089, doi:10.3791/53089 (2016).More

    Au, J. L., Weishaupt, N., Nell, H. J., Whitehead, S. N., Cechetto, D. F. Motor and Hippocampal Dependent Spatial Learning and Reference Memory Assessment in a Transgenic Rat Model of Alzheimer's Disease with Stroke. J. Vis. Exp. (109), e53089, doi:10.3791/53089 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    simple hit counter