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Medicine

Motor e hipocampo aprendizagem espacial Dependente e Avaliação de Memória de Referência em um rato transgénico modelo da doença de Alzheimer com AVC

doi: 10.3791/53089 Published: March 22, 2016

Summary

Para investigar a doença co-mórbida de Alzheimer (DA) ea condição acidente vascular cerebral em um novo modelo, três tarefas de comportamento estão descritos que avaliar tanto o controle motor e comportamentos cognitivos. Essas tarefas incluem a tarefa beam-pé, a tarefa cilindro e Morris labirinto de água.

Abstract

doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa debilitante que resulta em perda de memória e neurodegeneração. Enquanto a idade é um importante fator de risco para a DA, acidente vascular cerebral, também tem sido apontada como um fator de risco e um fator agravante. A co-morbidade do acidente vascular cerebral e AD resultados no controle motor relacionados com o acidente vascular cerebral piora e défices cognitivos relacionados com a AD quando comparado com cada condição sozinho. Para modelar a condição combinada de acidente vascular cerebral e AD, um novo modelo de rato transgénico de AD, com uma forma mutante da proteína precursora da amilóide (uma proteína chave envolvida no desenvolvimento de AD) incorporada no seu DNA, é dado um pequeno curso do estriado unilateral.

Para um modelo com a combinação de ambos acidente vascular cerebral e AD, testes comportamentais que avaliam o controle motor relacionados com o acidente vascular cerebral, locomoção e função cognitiva relacionada com a AD deve ser implementado. A tarefa cilindro envolve, um aparelho multiuso de custo eficiente que avalia o uso do motor forelimb espontânea. Nesta tarefa, um rato é colocado num dispositivo cilíndrico, onde o rato espontaneamente traseira e contacte a parede do cilindro com as suas patas dianteiras. Estes contactos são considerados de uso do motor dos membros anteriores e quantificados durante a análise de vídeo após o teste. Outra tarefa motora econômica implementada é a tarefa beam-pé, que avalia o controle do membro anterior, o controle dos membros posteriores e locomoção. Esta tarefa envolve uma caminhada de ratos através de uma viga de madeira que permite a avaliação do controle motor do membro através da análise das folhas de forelimb, deslizamentos dos membros posteriores e cai. Avaliação de aprendizagem e memória é completada com labirinto aquático de Morris para este paradigma comportamental. O protocolo começa com a aprendizagem espacial, em que o rato localiza uma plataforma escondida estacionária. Após a aprendizagem espacial, a plataforma é removida e tanto a curto prazo e da memória de referência espacial a longo prazo é avaliada. Todos os três destas tarefas são sensíveis às diferenças comportamentais e concluída no prazo de 28 dias para este modelo, tornando este parágrafotempo-eficiente digma e custo-eficiente.

Introduction

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Doença de Alzheimer (AD) é a forma mais prevalente de demência na população idosa e uma doença neurodegenerativa debilitante. Histopatologicamente, AD apresenta-se como placas amilóides, emaranhados neurofibrilares e perda neuronal. As placas amilóides consistem principalmente de péptido beta-amilóide (Ap) que tenha sido produzida por meio de uma clivagem proteolítica alterada da proteína precursora de amilóide (APP) por β-secretase e enzimas y-secretase 1,2,3. O produto de clivagem, Aâ, depósitos no cérebro criação de placas amilóides patológicas e tem efeitos tóxicos no cérebro que pode levar a dificuldades de aprendizagem característicos e a perda de memória. Todos estes passos em conjunto são referidos como o "hipótese amilóide cascata" 3,4. Embora esta hipótese é importante quando se investiga AD, outras alterações celulares foram encontrados para preceder estas formações de placa que se desvia do caminho amilóide cascata originais. esses outrosalterações celulares são pensados ​​para contribuir para a perda de memória cedo, deficiências e outras disfunções cognitivas envolvidas na AD antes da formação de placas 3,5,6 aprendizagem.

Com AD tornando cada vez mais prevalente, fatores de risco para o desenvolvimento de AD estão se tornando um foco extremamente importante da pesquisa. Embora a idade é o principal fator de risco para formas esporádicas de AD, outros fatores de risco foram identificados, incluindo acidente vascular cerebral 7,8. Acidente vascular cerebral não só é um factor de risco, mas pode também exacerbar as demências já presentes. Por exemplo, clinicamente, a progressão da doença de Alzheimer foi mostrada para ser pior nos pacientes que tinham experimentado anteriormente derrame 9. Além disso, o aumento da expressão de APP e a acumulação de Ap tem sido encontrada em modelos animais experimentais de toxicidade Ap combinado com acidente vascular cerebral induzido 10,11. Uma vez que não é importante desta interacção entre acidente vascular cerebral e AD, é essencial que estas duas patologias ser mais pesquisadojuntos em modelos de co-mórbidas para melhor compreender a fisiopatologia e comportamentos implicado em ambas as condições.

Para investigar as condições co-mórbidas, um modelo adequado tiveram de ser desenvolvidos em que um acidente vascular cerebral poderia interagir com Ab para produzir patologia AD-like. Pela primeira vez, um rato transgénico APP21 que tem um gene de APP humana mutada incorporada no seu DNA foi usado para realizar um modelo apropriado de AD. As mutações são a missense dupla sueca e Indiana mutações única missense, que ambos têm sido implicados em formas familiares de AD 4,8,12. Na ausência de um insulto adicional, este modelo de rato idades sem o desenvolvimento das placas de Ap característicos ou neurofibrilares emaranhados 12. Por conseguinte, numa tentativa de induzir a patologia comportamental AD-like, um pequeno curso é introduzido no corpo estriado direito de imitar os pequenos derrames cerebrais subcorticais muitas vezes presentes em pacientes com demência 9. O acidente vascular cerebral no ra transgênica APP21t incorpora a condição de co-mórbidas e permite a investigação de diversos tipos de alterações comportamentais implicados em ambas as condições de doença. Em particular, esta indução de déficits AD-como patologia e cognitivas no rato adulto permite-nos investigar as primeiras alterações moleculares e cognitivos anteriores AD.

Como o objetivo é determinar os primeiros sinais de mudanças comportamentais e uma vez que ambos acidente vascular cerebral e AD têm patologias comportamentais muito distintas, ao estudar o modelo de co-mórbidas, tarefas de comportamento precisa avaliar uma variedade de fenótipos comportamentais. Há uma bateria de testes relativamente sensíveis que podem ser feitas para analisar o comportamento motor e cognitivo em modelos de roedores que envolvem uma variedade de paradigmas e equipamentos. Para analisar especificamente a função forelimb e motor dos membros posteriores, a tarefa tarefa cilindro e feixe-pé foram implementadas para detectar déficits motores e monitorar a locomoção neste modelo. Outras tarefas sensíveis destinados a avaliar especificamente fina fohabilidade relimb motor (ou seja, a tarefa escadaria e única tarefa atingindo pellet) exigem privação alimentar 11,13,14. Para evitar qualquer um dos efeitos conhecidos da privação alimentar sobre patologias de doença 15,16,17, esses testes foram considerados inadequados para este estudo. A tarefa cilindro avalia o uso de membros anteriores espontânea da ratazana durante a criação de um ambiente novo e pode detectar assimetria entre os membros anteriores em ratos com AVC unilateral 10,18. Uma grande vantagem para esta tarefa é que o aparelho pode ser utilizada para outras tarefas de comportamento, tais como o Porsolt forçado tarefa mergulho 19. Ao contrário do que a tarefa de cilindro, a tarefa de feixe-pé também permite a análise de membro posterior e pata dianteira de controlo do motor, além de locmotion 10,14. Feixe de passeio inclui um componente locomotor, um componente equilíbrio e colocação dos pés qualificado. Ambos os testes são custo-eficiente, simples e tempo-eficiente e elucidar os efeitos de acidente vascular cerebral e AD em d IFERENÇAS em funcionamento do membro.

Além de mudanças na função motora, AD envolve déficits de memória que podem apresentar em estágios iniciais da progressão da doença. Ao abordar patologias AD-like em um modelo de roedor, é fundamental que a aprendizagem dependente do hipocampo e memória é avaliada porque o hipocampo é uma estrutura do cérebro importante em grande parte afetada em 2 AD. O hipocampo é uma região do cérebro essencial para a aprendizagem espacial e a memória e a sua função pode ser testado usando vários paradigmas de labirinto em roedores. Uma das tarefas de labirinto mais amplamente usados ​​para modelos de roedores de diferentes doenças é o labirinto aquático de Morris 20. O labirinto de água de Morris utiliza pistas espaciais para auxiliar o rato em localizar uma plataforma oculta estacionária e testes de memória espacial de referência quando a plataforma é removida. Uma importante vantagem da configuração do labirinto de água é que é altamente adaptável dependendo da questão de pesquisa proposta 20.

tenda "> Pela primeira vez, as técnicas descritas foram usadas para avaliar a função motora e cognitiva num modelo de rato co-mórbida romance de acidente vascular cerebral e AD. envolvendo pequenos acidentes vasculares cerebrais num modelo de rato transgénico APP21. A co-morbidade foi conseguida por indução vasoconstrição dos vasos sanguíneos no corpo estriado para produzir um pequeno acidente vascular cerebral em APP21 ratos transgênicos. este modelo acidente vascular cerebral tem sido bem estabelecida como condição co-mórbidas em um modelo de rato alternativo de 11 AD. Avanço para este romance APP21 modelo de rato transgénico foi pretendido para produzir um modelo mais translationally valioso. Enquanto as tarefas comportamentais são descritos utilizando um modelo de acidente vascular cerebral e AD rato co-mórbidas, essas tarefas podem ser ainda aplicada a outros modelos de acidente vascular cerebral ou modelos de outras doenças neurológicas (ou seja, a doença de Parkinson). O general metodologia descrita será amplamente aplicável a estes outros estados de doença, mas os prazos de comportamento e paradigmas poderá implicar a alteração com base nos res propostaspergunta earch e modelo. Além de ser adaptável, as tarefas descritas são eficazes em demonstrar déficits menores, além de ser de custo e tempo-eficiente.

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Protocol

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O comitê de ética animal institucional adequado deve aprovar todos os procedimentos comportamentais antes de iniciar a experimentação. Todo o trabalho animal descrito aqui foi aprovada pela Western University Uso de Animais Subcomissão e segue o Canadian Council on Animal Care orientações. Estas experiências com animais foram realizadas durante a fase de luz.

1. Cilindro de Trabalho para Avaliação Membro Anterior Motor Gross

  1. Configuração de equipamento
    1. Adquirir um cilindro de Plexiglas com uma tampa perfurada, que vai acomodar o tamanho do rato utilizados para a experiência. O tamanho do cilindro não deve permitir que o rato para chegar ao topo quando criada e deve permitir a 2 cm, entre a parede e o nariz do rato e a base da cauda do rato. O tamanho padrão de um cilindro é de 23 cm de diâmetro e 40 cm de altura por um de 6 meses de idade (400-600 g) de ratos.
    2. Coloque um espelho com um ângulo de 45 ° abaixo do aparelho de cilindro com o cilindro senta-se em um PLExiglas ficar de pé ou alguma outra forma de apoio cerca de 30 cm acima do topo da tabela.
    3. Defina-se uma câmara de vídeo num tripé a uma distância apropriada para visualizar todo o diâmetro do cilindro no espelho sobre a câmara de vídeo.
    4. Vire iluminação para um ambiente mais escuro e jogar ruído branco no quarto (ou seja, de baixo volume, música subtil) para reduzir o efeito de ruídos altos repentinos. Isso deve ajudar a incentivar o movimento e evitar o congelamento devido a ruídos altos.
  2. Procedimento experimental
    1. Mova os ratos na sala experimental de 30 minutos antes do início do primeiro ensaio para aclimatar os ratos para a sala com música e iluminação dimmer.
    2. Escreve a informação correspondente animais e julgamento (ou seja, número de animais, o dia no cronograma e número de teste) em uma pequena placa branca. Coloque esta placa na frente do espelho.
    3. Pressione gravar na câmara de vídeo com a placa branca na frente do espelho, pegar o rato perto da base of a cauda, ​​colocar o rato dentro do cilindro e fixar a tampa. Suporte para o lado do cilindro para evitar a interferência com a gravação de vídeo.
    4. Remova a placa branca na frente do espelho e deixar o registro da câmera de vídeo o rato dentro do cilindro por 5 minutos (use um temporizador para gravar 5 min a partir de quando o quadro branco é removido). Este é um julgamento.
    5. Limpe o cilindro com toalha de papel e água depois de um julgamento.
    6. Repita os passos 1.2.2-1.2.5 mais duas vezes para obter um total de três ensaios. Não deve haver um tempo de 20-30 min inter-ensaio para diminuir a possibilidade de habituação ao cilindro. Durante este tempo, executar ensaios de cilindros para os outros ratos.
  3. Análise de vídeo
    1. Importar arquivos de câmeras de vídeo em programa de edição de vídeo (iMovie ou seja)
    2. Compilar os vídeos em clipes para cada tentativa. Silenciar o volume do vídeo e diminuir a velocidade do vídeo para 25% do original.
    3. Contar o número de contatos forelimbcom a parede do cilindro para o membro anterior esquerdo e direito. Para contatos simultâneos esquerda e direita, contar estes contactos membros anteriores como "ambos". Tenha em atenção que o vídeo é gravada através de um espelho, o que parece ser o membro anterior esquerdo no vídeo corresponde ao membro anterior direito do animal na realidade.
    4. Calcule o uso cento do membro anterior afetada (contralateral ao acidente vascular cerebral), utilizando a seguinte equação: [{(afetada contatos + ½ contactos bilaterais) / total de contatos número} x 100]. O desempenho de ambos os grupos de tipo selvagem e o grupo transgénico sem acidente vascular cerebral são considerados grupos de comparação para avaliar a apresentação dos problemas induzida por doença.

2. Feixe-walk-Tarefa de Avaliação Motora Grossa

  1. Configuração de equipamento
    1. Adquirir uma viga de madeira lisa selado que é de 2 cm de largura e cerca de 120 cm de comprimento (largura ideal para um 200-600 g de rato).
    2. Coloque duas mesas ou prateleiras unseus 100 cm. As superfícies de cada unidade deve ser cerca de 40 cm acima do solo.
    3. Fixar ambas as extremidades do feixe para a mesa ou estante superfície usando fita. Cerca de 1 m de comprimento da viga não suportado deve agora ser elevado 40 cm acima do solo.
    4. Defina-se uma câmara de vídeo em um suporte, a captura de todo o comprimento da viga. Para melhorar o contraste no vídeo, considerar a introdução de um fundo preto atrás do feixe ao usar ratos brancos.
  2. Procedimento experimental
    1. Mova os ratos na sala experimental de 30 minutos antes do início do primeiro ensaio para aclimatar os ratos para a sala com música e iluminação dimmer.
    2. Coloque gaiola ou enriquecimento ambiental tubos do rato a uma extremidade da viga e colocar o rato na outra extremidade da viga.
    3. Realizar algumas corridas não gravou dois dias antes de ensaios experimentais. Deixe o rato explorar a área e orientar o rato para o feixe, mantendo a base do rato'S cauda.
    4. Uma vez que o rato atravessou o feixe, mover a gaiola ou tubo para a outra extremidade da viga e de repetição. Quando o rato cruza o feixe livremente em qualquer direção, o treino é longo. Manter o número de formação é executado consistente entre todos os animais.
    5. Escreve a informação correspondente animais e julgamento (ou seja, número de animais, o dia no cronograma e número de teste) em uma pequena placa branca. Fita Este quadro branco para a parede atrás da viga.
    6. Coloque tubagem enriquecimento gaiola de origem ou o ambiente do rato a uma extremidade da viga.
    7. Pressione ficha na câmara de vídeo e escolher o rato-se pela base da cauda e o local na extremidade do feixe oposto à gaiola de origem ou da tubagem.
    8. Gravar a totalidade do processo, que termina quando o rato foi concluída com êxito que atravessa o comprimento total do feixe elevados. Se as pausas de rato a meio caminho ao longo da viga, o rato pescoço suavemente pela base da cauda ou tocar cauda do rato suavementepara promover o movimento ao longo da viga. Não empurre o rato para a frente de qualquer maneira.
    9. Re-fazer ensaios em que o rato vira de lado, enquanto na trave, pára repetidamente a pé ou anda de forma inconsistente. Se um rato cai e continua a ficar com o feixe, gentilmente colher-se o rato e colocá-lo de volta na trave na posição da queda e continuar o julgamento.
    10. Mova a gaiola ou tubo para a outra extremidade da viga, mudar o julgamento # no quadro branco e registrar o posterior julgamento.
    11. Repetir este procedimento até que um total de 6 ensaios foram concluídos, com 3 ensaios a ser gravada para cada direcção. Todos os 6 ensaios para um rato pode ser gravado antes de iniciar os ensaios para a próxima rato.
  3. Análise de vídeo
    1. Importar arquivos de câmera de vídeo no programa de edição de vídeo (iMovie ou seja).
    2. Compilar os vídeos em clipes para cada tentativa e silenciar o volume do vídeo. Analise cada quadro do vídeo clipe quadro a quadro.
    3. Contar o númerodos passos totais do rato leva a percorrer o comprimento total do feixe e o número total de membros posteriores esquerda e direita e deslizamentos forelimb eo número total de quedas. O desempenho de ambos os grupos de tipo selvagem e o grupo transgénico sem acidente vascular cerebral são considerados em comparação com o grupo de co-morbilidade para avaliar aparecimento de défices únicas para a condição de co-mórbida.

3. Morris Water Maze do Ordenamento Aprendizagem e de referência de memória hipocampo-dependentes

  1. Configuração de equipamento
    1. Garantir uma câmara de video colocado acima do centro de uma piscina circular (148 cm de diâmetro e 58 cm de profundidade). Alinhe os quatro quadrantes designados corretamente com o contorno da piscina no programa de software de rastreamento.
    2. Encher a piscina circular com água de aproximadamente 36 cm de profundidade. A água deve ser aquecida até à temperatura ambiente, preenchendo a piscina alguns dias antes do início do protocolo experimental.
    3. Adicionar preto un tinta acrílica non-toxictil a água é opaca ao usar ratos brancos. Use uma cor clara, como branco, para os ratos de cores mais escuras.
    4. Rodeiam a piscina com superfícies de parede em branco, incluindo divisórias, se necessário. Quando na piscina, o rato não deve ser capaz de ver os experimentadores.
    5. Corte 4 grandes pistas espaciais diferentes em forma de diferentes cores de cartolina e anexar uma forma na parede por norte designado, leste, sudeste e locais piscina sudoeste. Estas pistas deve ser ligeiramente maior do que a borda da piscina.
    6. Ligue um rádio em volume baixo no quadrante noroeste para evitar que o rato de ser distraído por ruídos altos inesperados durante o teste.
    7. Coloque uma plataforma circular (diâmetro de 11,5 centímetros, 2-3 cm abaixo da superfície do nível da água), no centro do quadrante alvo.
    8. Desligue principais luzes da sala e acender uma lâmpada de chão no lado oposto do divisor de quarto para a piscina para iluminar a área.
  2. Configuração do computador Use um programa de rastreamento que é projetado para tarefas de comportamento labirinto aquático de Morris e configurar o protocolo antes de iniciar experimentos. Um exemplo de um possível programa é fornecida na Figura 4.
  3. Situado a 4 dias consecutivos, com 4 ensaios de 90 segundos cada para o experimento de aprendizagem espacial.
  4. Definir 2 experiências separadas sonda de 30 s cada em 24 horas após o último teste de aprendizagem espacial e 1 semana após a primeira experiência sonda.
  5. Set cued ensaios de aprendizagem em 4 ensaios por dia durante 2 dias consecutivos a partir de 24 horas após a segunda experiência sonda. Cada ensaio deve ser de 60 seg total.
  6. Para cada fase, definir a ordem de teste de modo que não é de 20 minutos de intervalo inter-ensaio entre cada ensaio para um determinado animal. Outros animais podem ser executados durante este intervalo inter-julgamento, desde que cada animal mantém a 20 min de intervalo inter-julgamento.
  7. Certifique-se de que a posição da plataforma é para ser definido pelo experimentador e que todas as outras zonas é DEmultado pela posição da plataforma designada.
  8. Configurar o programa para iniciar manualmente e terminar cada tentativa.
  • Experiência de Aprendizagem espacial
    1. Coloque a plataforma circular no quadrante sudoeste. Deve ser alinhada com a circular área designada "plataforma" no quadrante no programa de computador.
    2. Começam posições ao redor da piscina devem ser randomizados para cada rato. Representam todas as posições iniciais em cada grupo de tratamento. No rato começa a partir da posição a nordeste de todas as experiências de aprendizagem espacial no paradigma apresentados para permitir uma nova posição inicial durante o teste sonda.
    3. Segure o rato na base de sua cauda e gentilmente colocá-lo na água ao longo da parede da piscina na posição para início e se mover rapidamente fora da vista do rato.
    4. Ter o outro experimentador iniciar o software de rastreamento, logo que o rato está na água. Um temporizador deve começar a contar-se entre 0 sobre o programa de rastreamento. Se o rato localiza a plataforma, tem o outro experimentador interromper o ensaio no computador e deixar o rato na plataforma durante pelo menos 30 segundos antes de recuperá-los. Se o rato salta para fora da plataforma antes do julgamento é interrompido no computador, o julgamento continua.
    5. Se o rato não encontrar a plataforma no tempo de julgamento previsto, orientar o rato para a plataforma usando sua mão (ou fazendo com que o rato seguir sua mão ou orientar o rato pela base da cauda). Segurar o rato na plataforma durante 30 seg.
    6. Remover o rato a partir da piscina pela base da cauda no braço do experimentador que é coberta com uma toalha ou deixe o rato subir em uma superfície portátil.
    7. Repita os passos 3.3.3-3.3.7 para um total de 4 ensaios por rato. Deve haver um intervalo inter-julgamento de 20 min para cada rato.
    8. Devolver os ratos para sua gaiola sob uma lâmpada de calor para, pelo menos, 10 minutos após o julgamento do rato aprendizagem espacial final.
    9. Continue a exact mesmo protocolo de aprendizagem espacial para o dia 2 até ao dia 4 de aprendizagem espacial.
    10. No dia 04/02, não mantenha o rato sobre a plataforma por mais tempo. Permitir que o rato para sentar-se na plataforma sem assistência por 30 s com os experimentadores fora da vista. Isto pode ser feito durante os ensaios posteriores no dia 1 na ocasião.
  • Probe Experiment
    1. Remover a plataforma a partir da piscina. Assegurar a posição da plataforma anterior permanece definido no computador (círculo no quadrante sudoeste).
    2. Coloque o rato na água ao longo da parede da piscina na posição nordeste e rapidamente se mover para fora da vista do rato. Utilização do novo nordeste posição inicial assegura que o rato recorda a posição independente de plataforma de posições iniciais previamente treinados.
    3. Ter o outro experimentador iniciar o software de rastreamento, logo que o rato está na água. Um temporizador deve começar a contar-se entre 0 sobre o software de rastreamento.
    4. Recuperar o rato a partir dosudoeste quadrante da piscina pela base da cauda e mantenha em um braço coberto de toalha ou deixe o rato subir em uma superfície portátil.
    5. Devolver os ratos para sua gaiola sob uma lâmpada de calor por pelo menos 10 minutos após o julgamento sonda de cada rato.
    6. Repita este experimento (passos 3.4.1-3.4.5) 1 semana mais tarde.
  • Cued Experiência de Aprendizagem
    1. Use fita adesiva para prender a 4 cm de diâmetro sugestão esférica branca em uma posição que é de 8,5 cm de altura sobre a plataforma (altura total de cue é de 12,5 cm). A parte superior do taco esférica será de pelo menos 8,5 cm acima do nível da água.
    2. Remova as pistas espaciais das paredes ao redor da piscina.
    3. Randomizar posições da plataforma e iniciar posições para cada rato em cada grupo. Todas as posições da plataforma e de início deve ser representada para cada grupo de tratamento.
    4. Coloque plataforma na área da plataforma designada e definir no software de rastreamento.
    5. Coloque o rato na água ao longo da parede da piscina em tele designou a posição inicial e rapidamente se mover para fora da vista do rato.
    6. Ter o outro experimentador iniciar o software de rastreamento, logo que o rato está na água. Um temporizador deve começar a contar-se entre 0 sobre o software de rastreamento.
    7. Uma vez que o rato atinge a plataforma, tem o outro experimentador interromper o ensaio no computador. Se o rato salta para fora da plataforma, o julgamento continua. Antes de recuperar o rato, permitir que o rato para sentar-se na plataforma por 15 s.
    8. Recuperar o rato a partir da piscina pela base da cauda e mantenha em um braço coberto de toalha ou deixe o rato subir em uma superfície portátil.
    9. Verifique a posição da plataforma para a próxima rato e mover a plataforma para a área correspondente definido no software de rastreamento.
    10. Repita os passos 3.5.4-3.5.9 para os 3 ensaios seguintes. Deve haver um intervalo inter-julgamento de 15 min.
    11. Devolver os ratos para sua gaiola sob uma lâmpada de calor por pelo menos 10 minutos após fina de cada ratol cued julgamento de aprendizagem.
    12. Continue o mesmo protocolo para o dia 2 de aprendizagem cued.
  • Análise de dados
    Nota: O tempo gasto em zonas, a distância percorrida em zonas, velocidade média, número de entradas em zonas e o tempo para a primeira entrada na zona que são frequentemente utilizados.
    1. Analisar o tempo e distância para alcançar a zona de plataforma e a velocidade média por dia de espacial e cued aprendizagem separadamente. Para experiências de sonda, analisar a latência para a primeira entrada na zona de destino como um tempo cru ou uma mudança por cento de sonda 1 para sondar 2.
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    Representative Results

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    As tarefas comportamentais descritos foram utilizados para demonstrar os efeitos do acidente vascular cerebral em um modelo de rato transgénico APP21 de doença de Alzheimer. A combinação de acidente vascular cerebral e o transgene APP21 deverá resultar em maior déficit motor nos membros afetados, bem como o aumento déficits de memória.

    A tarefa cilindro avaliada função motora do membro anterior bruto e é representado como o uso do membro anterior afectado. Além disso, a tarefa de feixe-pé foi utilizado para avaliar especificamente a função motora do membro posterior e locomoção. Desde o acidente vascular cerebral foi induzida no striatum direito, o membro anterior esquerdo está prevista para mostrar um déficit motor se estiver presente. Os dados apresentados na Figura 2 e ambos se Figura 3a e 3b não estatisticamente demonstram que os ratos co-mórbidas tem um membro anterior do membro posterior ou défice, respectivamente. Embora estes animais não appear ter forelimb ou motoras dos membros posteriores dos défices, eles parecem ter pequenas diferenças na função motora pertencente a locomoção. Na tarefa de feixe-pé passos totais foram significativamente aumentados nos ratos transgênicos co-mórbidas com acidente vascular cerebral (p <0,05, Figura 3c), sugerindo que a tarefa beam-pé é sensível o suficiente para pegar pequenas alterações na marcha e locomoção. O modelo pequeno acidente vascular cerebral estriado usado produz pequenos acidentes vasculares cerebrais que provavelmente pequeno demais para produzir quaisquer déficits motores principais, mas os défices têm sido demonstrados antes em outros modelos tempos com estas duas tarefas 10,14. Aqui, essas tarefas pode simplesmente monitorar a função motora e locomoção durante a investigação dos parâmetros apresentados.

    Memória de aprendizagem e de referência espacial dependente do hipocampo pode ser efetivamente avaliada utilizando Morris labirinto de água. Não houve diferenças aparentes na aprendizagem entre os grupos (Figura 5a >, Figura 5b), portanto, diferenças de aprendizagem não pode ter em conta quaisquer diferenças no desempenho de memória. APP21 ratos transgênicos com acidente vascular cerebral demonstraram um déficit de memória de referência robusto de longo prazo em comparação com ratos transgênicos sem ratos com AVC e tipo selvagem com acidente vascular cerebral (p <0,05, Figura 5C).

    Cued aprendizagem é completada para assegurar que os ratos têm a mesma capacidade para utilizar pistas espaciais visuais para localizar a plataforma no labirinto de água de Morris. Como demonstrado na Figura 6a e Figura 6b, não foram observadas diferenças no comprimento de latência ou o caminho para alcançar a plataforma durante a aprendizagem cued entre os grupos. Além disso, a velocidade média de natação foi consistente entre os grupos (Figura 6c) e demonstra que a motivação para escapar e nadar habilidades foi igual entre os grupos.

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    Figura 1:. Timeline para o motor e avaliações do comportamento cognitivo-induzindo curso dia da cirurgia é atribuída dia 0 e todos os dias de teste são em referência a este dia. (A) os testes de pré-cirurgia e pós-cirurgia para a tarefa cilindro (C) e a tarefa feixe-walk (BM). Aprendizagem espacial (B) Morris labirinto de água, teste de sonda e cued aprendizagem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 2
    Figura 2:. Cylinder Task uso Percentual de membro anterior afetada foi calculada usando a equação na etapa 1.3.4 e padronizado a dia -3 valores basais. A linha pontilhada vermelha anota o valor 1.0 que representa o uso igual de cadamembro anterior na tarefa cilindro. O tipo selvagem é abreviado como WT e transgénico é abreviado como TG. O número de animais são os seguintes: WT + soro fisiológico (n = 7), WT + acidente vascular cerebral (n = 8), TG + soro fisiológico (n = 8), TG + acidente vascular cerebral (n = 6). Todos os valores são apresentados como média ± SEM. (Two-way ANOVA, Tukey post hoc). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 3
    Figura 3:. Tarefa Feixe-pé A soma de todas as fichas feitas com o (A) afetados e (B) hindlimb afetada por 5 ensaios é apresentada como uma proporção do número total de passos dados para cruzar a viga. Os valores foram normalizados aos valores basais da seguinte forma: relação pós-cirurgia - relação de pré-cirurgia. (C) Os passos totais para atravessar o feixe o N dia -7 e dia 21. O tipo selvagem é abreviado como WT e transgénico é abreviado como TG. O número de animais são os seguintes: WT + soro fisiológico (n = 6), WT + acidente vascular cerebral (n = 6), TG + soro fisiológico (n = 6), TG + acidente vascular cerebral (n = 5). Todos os valores são apresentados como média ± EPM e os asteriscos indicam significância estatística. (One-way ANOVA, post hoc de Tukey, p <0,05). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 4
    Figura 4: Vista Programa demonstrando seções necessário para a configuração e execução de um experimento Algumas funcionalidades destacadas do programa de rastreamento usado para Morris labirinto de água.. A visão aparelho com o vídeo da piscina caracterizado acima só aparecerá como apresentado quando na aba testes.3089fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 5
    Figura 5: a aprendizagem espacial e a memória de referência no labirinto aquático de Morris aprendizagem espacial foi medida por (a) a latência e (B) comprimento do caminho para alcançar a plataforma.. (C) de memória de referência foi medida como percentagem de alteração da latência para a primeira entrada na zona-alvo no teste sonda dia 19 em comparação com o teste sonda dia 12. O tipo selvagem é abreviado como WT e transgénico é abreviado como TG. O número de animais são os seguintes: WT + soro fisiológico (n = 8), WT + acidente vascular cerebral (n = 7), TG + soro fisiológico (n = 7), TG + acidente vascular cerebral (n = 8). Todos os valores são apresentados como média ± EPM e os asteriscos indicam significância estatística. (Two-way ANOVA para a aprendizagem espacial e one-way ANOVA para testes de sonda, de Tukey post hoc, p &# 60;. 0,05) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 6
    Figura 6:. Cued aprendizagem no labirinto aquático de Morris (A) Latência e (B) comprimento do caminho para chegar a plataforma são apresentados como uma média de todos os oito ensaios de aprendizagem. Velocidade (C) Swim é apresentado como uma média de todos os oito ensaios de aprendizagem. O tipo selvagem é abreviado como WT e transgénico é abreviado como TG. O número de animais são os seguintes: WT + soro fisiológico (n = 8), WT + acidente vascular cerebral (n = 7), TG + soro fisiológico (n = 7), TG + acidente vascular cerebral (n = 8). Os valores são apresentados como a média ± SEM. (One-way ANOVA, Tukey post hoc). Por favor clique aqui para ver uma versão maior destafigura.

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    Discussion

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    A combinação de acidente vascular cerebral e doença de Alzheimer resultados em patologias de comportamento muito distintos que podem afectar tanto a função motora e cognitiva, dependendo da gravidade de cada doença. Assim, é necessário fazer uso de uma variedade de tarefas comportamentais para determinar as contribuições individuais destas condições, bem como oferecer algumas informações sobre os efeitos combinados e potencialmente interactivos na condição de co-mórbida. Os dados apresentados demonstram três rentável, as tarefas de comportamento sensíveis tempo-eficiente e para avaliar a função motora e memória de aprendizagem e de referência espacial dependente do hipocampo em um modelo de rato romance co-mórbidas APP21 transgénicos com acidente vascular cerebral. Para além dos dados apresentados, estas tarefas tem sido verificada em modelos de acidente vascular cerebral mais graves 10,14,18, bem como em modelos de 8,16 AD e deve ser amplamente aplicáveis ​​a vários modelos de ambas as doenças.

    Dito isto, não é tarefa é sem limitations. Para as tarefas motoras especificamente, alguns solução de problemas pode ser necessária se os ratos tornam-se habituados ao cilindro e a viga. Na tarefa de cilindro, uma motivação pode ser necessário para assegurar o rato atinge a quantidade apropriada de contactos membros anteriores com a parede do cilindro. Para alcançar este resultado, a aplicação de um perfume não-tóxicos na tampa perfurada ou à parede do cilindro pode motivar o rato para a retaguarda e contacte a parede do cilindro com as suas patas dianteiras. Por exemplo, um pouco de manteiga de amendoim ou extrato de baunilha pode ser manchada na parede interna perto do topo do cilindro de incentivar ainda mais ratos sedentários para explorar as paredes do cilindro. Um anel de fita colorida pode também ser aplicado no interior do cilindro de ¾ da parte inferior do cilindro. Outra forma de promover a criação envolve a remoção de um rato sedentários e re introduzindo-lo para o cilindro depois de algum tempo passou, o que foi conseguido com um intervalo inter-julgamento no protocolo. PeleThermore, dependendo da altura do cilindro em comparação com o comprimento do rato, a remoção da tampa perfurada no meio de um ensaio pode pedir a criação e o contacto do membro anterior com a parede do cilindro. Isto não deve ser feito se existe uma possibilidade de o rato irá ser capaz de escapar do cilindro durante o teste. Estes motivos podem ajudar a aumentar o número de partes traseiras, mas não deve influenciar a utilização das patas dianteiras esquerda e direita durante o contacto da parede. Se ainda existir uma grande preocupação sobre um número inadequado de contactos membros anteriores após a aplicação destas sugestões, um ensaio pode ser terminado após o rato tenha feito um total de 10 partes traseiras, independentemente da duração do tempo. Este seria diferente dos ensaios de 5 minutos cumpridos no protocolo anteriormente referido, tal como cada rato iria chegar a um total de 10 partes traseiras em momentos diferentes. Com um modelo de acidente vascular cerebral e co-morbidade AD, é importante estar ciente de que mudanças nos níveis de desempenho, ansiedade e atividade cognitiva pode desenvolver nestes ratos. WHile tais mudanças não afetam diretamente o resultado primário da tarefa cilindro (uso forelimb espontânea durante a criação), a gravação de outras observações podem constituir indícios valiosos para mudanças de comportamento não-motorizados relacionados que podem se desenvolver. Na tarefa cilindro, tais comportamentos podem potencialmente ser observado analisando aumentada ou diminuída comportamento de dependência, como é criação de uma forma de comportamento exploratório motivado. Além disso, outras medidas, como o tempo gasto limpeza, transformando e aterragem pode fornecer informações sobre a ansiedade e outros déficits físicos, respectivamente.

    Em relação à tarefa beam-pé, utilizando o tubo de enriquecimento de casa gaiola é geralmente motivação suficiente para o rato a caminhar ao longo da viga. Se um rato continua a parar a meio caminho ao longo da viga, uma recompensa alimentar perfumado ou tratar, tal como manteiga de amendoim ou açúcar precisão pelotas, pode ser introduzida para além dos tubos de enriquecimento na extremidade oposta. Se trata são dadas, garantir que todos os ratos recebem aba mesma quantidade de mimos no dia de teste, independentes do seu desempenho. Além disso, em vez de correr todos os seis ensaios para um rato antes de passar para o próximo rato, ensaios poderiam ser escalonados. Por exemplo, os dois primeiros ensaios pôde ser concluída para todos os ratos antes de iniciar os dois seguintes. Isto poderá impedir o aumento do número de paragens a meio caminho ao longo da viga, que pode ocorrer em ensaios posteriores quando alguns ratos tornam-se muito confortável com o meio do feixe. Outra solução possível, se ocorre paragem frequente é o de diminuir o número de ensaios. Isto poderia ser implementado pela colocação de um espelho atrás do feixe para analisar membros, tanto de esquerda e direita em cada julgamento, permitindo assim que o número de tentativas de ser diminuída. Além disso, a habituação ao feixe pode ocorrer após várias sessões de testes e pode resultar em ratos que se recusam a atravessar o feixe e permaneça sentado na trave, apesar de todos os esforços para motivar o animal. Devido a este problema, as avaliações de feixe não são ideais para testes repetidos em Loexperimentos ng prazo. Em protocolos que utilizam repetidos testes, compensação também pode se tornar uma preocupação, além de motivação. Para superar as questões de compensação durante a travessia do feixe, um feixe cônico pode ser usado em vez de uma viga de madeira regulares 21.

    Mais uma vez, as alterações cognitivas, incluindo aumento da ansiedade e alterações nos níveis de atividade em geral e motivação, pode ocorrer neste modelo animal. Portanto, é importante tomar nota de qualquer irregularidade entre os grupos experimentais sobre a motivação dos animais para atravessar o feixe, bem como a sua velocidade e comportamento não-locomotor (parando, sentado, tremendo, orientação) ao atravessar a trave.

    investigação da doença de Alzheimer comportamental requer testes de memória de curto prazo e de longo prazo, o que foi conseguido aqui usando o labirinto aquático de Morris. Muitos protocolos de considerar 24 horas após a aprendizagem espacial a ser memória de longo prazo 21, mas com este protocolo emimeline de 24 h depois da aprendizagem espacial é considerado memória de curto prazo e uma semana é considerada a memória de longo prazo. Durante este período de tempo de uma semana no meio de ensaios de sondas, os ratos não devem ser expostas a outros factores de stress tarefas comportamentais ou desnecessárias para evitar interferência com a memória de referência espacial labirinto aquático de Morris.

    No que diz respeito à aprendizagem espacial, os experimentadores deve ser persistente em exigir o rato para sentar-se na plataforma sem saltar para um determinado período de tempo. Se o rato senta-se com sucesso na plataforma, mas pula como os experimentadores entrar em vista, o rato deve ser colocado ou guiados de volta para a plataforma e obrigados a sentar-se na plataforma até que o experimentador recupera o animal. Para reforçar a aprendizagem da plataforma como a única maneira de escapar a água, os ratos não deve ser pego enquanto nadava, a não ser em um ambiente de teste sonda. Se os ratos conseguem saltar da plataforma na borda da piscina, considere mover o Platform mais para o centro da piscina para desencorajar a aprendizagem de uma rota alternativa de fuga.

    Para garantir que não haja desvios espaciais durante a aprendizagem espacial e cued, as posições de início e posições da plataforma cued para cada rato em um grupo de tratamento devem ser randomizados. Cada grupo de tratamento deve ter um número representativo de ratos a partir de cada posição de partida para a aprendizagem espacial ou seguir o mesmo paradigma de início e posição plataforma de aprendizagem cued. Para atribuir posições de início, Vorhees e Williams apresentam um conjunto muito detalhada de posições de início randomizados para a aprendizagem espacial e posições de início e de plataforma randomizados para Cued aprendizagem 20. Isso pode ser usado diretamente ou como um guia para atribuir posições para cada rato antes do início Morris teste do labirinto de água.

    Para a análise dos dados labirinto aquático de Morris, as sugestões do protocolo acima representam a forma como os dados aqui apresentados foi adquirida. o datum recolhidas no passo 3.6 do protocolo acima do labirinto de água de Morris pode ser usado para calcular várias medidas de resultados que podem ser úteis para descrever um deficit cognitivo. Por exemplo, além do conjunto de dados numéricos, software de monitoramento também oferece o experimentador a oportunidade de analisar parcelas de trilha, que podem dar insights adicionais em estratégias de busca dos animais. Além disso, a percentagem de tempo gasto ou distância percorrida no quadrante alvo em relação a todos os quadrantes pode ser utilizado como uma medida da memória de referência nos ensaios de sonda. É importante ter em mente que esses modelos animais co-mórbidas pode apresentar algumas deficiências motoras. Comparando-se a velocidade de natação entre os grupos experimentais podem dar uma indicação se um potencial de déficit motor está afetando a capacidade dos animais para realizar no labirinto aquático de Morris. Além disso, para excluir o desempenho motor de tornar-se um factor de confusão em resultado do labirinto de água, recomenda-se a olhar para comprimento do caminho para chegar plataformaAlém de latência e nadar velocidade, como demonstrado na Figura 5 e 6. Se capacidade de natação está comprometida de alguma forma, comprimento do caminho é a medida mais precisa para avaliar a função do hipocampo.

    Embora existam diversas linhas de tempo diferentes, que podem ser aplicadas a todas estas tarefas comportamentais descritos, o método de execução de cada ensaio, devem continuar a ser a mesma. Os dados aqui apresentados foram obtidos com um pós-AVC ponto de tempo de recuperação de 21 dias, que captura os eventos iniciais após acidente vascular cerebral e a sua interacção potencial com o metabolismo de Ap no cérebro. Apesar de os dados aqui apresentados foi em um modelo de co-mórbida de acidente vascular cerebral e doença de Alzheimer, estas tarefas podem ser aplicados ou adaptados a diversas questões de investigação e modelos. Enquanto o cilindro de teste é um procedimento padrão menos modificáveis, a tarefa feixe de pé pode ser um pouco ajustada à gravidade do déficit motor esperado pela escolha apropriada Widt feixehs. O labirinto de água é o teste mais versátil de todos os paradigmas aqui mencionados. Por exemplo, a escolha de vários intervalos entre o fim da fase de aquisição e o julgamento sonda de memória de referência espacial pode facilmente testar a curto prazo e memória de longo prazo. memória e mudança de estratégia de trabalho, dois componentes da função executiva, também pode ser testado utilizando a configuração do labirinto de água. Para avaliar a memória de trabalho, o intervalo inter-ensaio pode ser reduzida para menos de 1 min, durante a aprendizagem aquisição de um novo local plataforma. Além disso, tendo os animais aprendem uma segunda nova localização da plataforma, após a aquisição bem sucedida de uma localização inicial da plataforma pode testar a flexibilidade mental ou mudança de estratégia. Considerando todos esses potenciais modificações, existe uma grande quantidade de flexibilidade com essas tarefas de comportamento, o que é outro grande benefício, além de todos os benefícios acima mencionados.

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    Disclosures

    Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Cylinder Western University Plexiglas Cylinder
    Cylinder Diameter: 23 cm
    Cylinder Height: 40 cm
    Platform Height: 30 cm
    Mirror Length: 35 cm
    Mirror Width: 26.5 cm
    This was made specifically by Western University Machine Services for our lab. Please contact your own chosen manufacturer to design this product.
    Handheld Video Camera JVC GZ-E200
    Video Camera Tripod Slik F163
    AM/FM Clock Radio Sylvania SCR1388
    White Board Walmart Width: 71.12 cm
    Height: 55.88 cm
    These can be purchased at any store (i.e. Walmart, University bookstores)
    Dry-erase Marker Expo Expo Dry-erase Original Marker These can be purchased at any store (i.e. Walmart, University bookstores)
    Wooden Beam Rona Plywood
    Width: 2 cm
    Length: 100 cm
    VWR General Purpose Laboratory Tape VWR Intl. 89097-920
    iMovie '11 Apple Inc. Version 9.0.9 (1795) This is the version used in this manuscript, but any other iMovie version or video editing software could be used.
    Morris Water Maze Pool with Platform Stoelting Co. 60136/60035 These are not the exact products used in the video, but these are essentially identical.
    Platform Cue - - The platform cue used was created using a small metal stand and white spherical foam ball. These can likely be purchased at any store with home improvement materials (i.e. Walmart, Rona etc.)
    Mainstays 71" Floor Lamp Walmart HW-F0377SLV
    ANY-Maze Behavioural Tracking Software Stoelting Co. 60000 There are ANY-maze® bundles that include the camera with or without a computer and accessories.
    Compact Video Camera Logitech V-U0023
    Laptop Hewlett-Packard HP Pavilion dv6 Notebook PC Laptop Specifics: AMD A6-3420M APU with Radeon HD Graphics 1.50 GHz, 6.00 GB RAM, 64-bit operating system.
    Americana Non-toxic Acrylic Paint DecoArt DAO67-9 This can be ordered on the DecoArt site or purchased in store at DecoArt retailers.
    Poster Board Walmart PA-1961

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    References

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    Motor e hipocampo aprendizagem espacial Dependente e Avaliação de Memória de Referência em um rato transgénico modelo da doença de Alzheimer com AVC
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    Au, J. L., Weishaupt, N., Nell, H. J., Whitehead, S. N., Cechetto, D. F. Motor and Hippocampal Dependent Spatial Learning and Reference Memory Assessment in a Transgenic Rat Model of Alzheimer's Disease with Stroke. J. Vis. Exp. (109), e53089, doi:10.3791/53089 (2016).More

    Au, J. L., Weishaupt, N., Nell, H. J., Whitehead, S. N., Cechetto, D. F. Motor and Hippocampal Dependent Spatial Learning and Reference Memory Assessment in a Transgenic Rat Model of Alzheimer's Disease with Stroke. J. Vis. Exp. (109), e53089, doi:10.3791/53089 (2016).

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