Abstract
La culture cellulaire a été traditionnellement effectuée sur bidimensionnel (2D) substrats où les cellules adhèrent utilisant des récepteurs à la surface ventrale biomatériau. Toutefois in vivo, la plupart des cellules sont complètement entourés par la matrice extracellulaire (ECM), ce qui entraîne une tridimensionnel (3D) distribution des récepteurs. Ceci peut déclencher des différences de l'extérieur, dans les voies de signalisation et donc dans le comportement des cellules.
Cet article montre que la stimulation des récepteurs dorsales de cellules déjà adhéré à un substrat 2D en superposant un film d'un nouveau matériau (une culture de sandwich) déclenche des changements importants en ce qui concerne les cultures 2D standard. En outre, l'excitation simultanée des récepteurs ventrales et dorsales décale le comportement des cellules plus proche de celle trouvée dans les environnements 3D. En outre, en raison de la nature du système, une culture en sandwich est un outil polyvalent qui permet l'étude de différents paramètres de cellule / matériau interactions, par exemple, la topographie, la raideur et différents revêtements de protéines à la fois les côtés ventrales et dorsales. Enfin, depuis les cultures sandwich-like sont basés sur des substrats 2D, plusieurs procédures d'analyse déjà développés pour des cultures 2D standard peut être utilisé normalement, surmonter des procédures plus complexes nécessaires pour les systèmes 3D.
Introduction
Traditionnellement, la culture cellulaire a été réalisée sur bidimensionnels (2D) des substrats, si la plupart des micro-environnements cellulaires in vivo ont un (3D) nature tridimensionnelle. Cet environnement 2D contre nature provoque des changements dans le comportement des cellules comme un moyen d'auto-adaptation à un monde plat, ce qui influe directement sur le destin des cellules 1,2. Par conséquent, les résultats obtenus sur les cultures de cellules 2D ne sont pas toujours reproductible in vivo. Cela a encouragé le développement de nouveaux systèmes de culture pertinentes qui cherchent à offrir des conditions plus physiologiques semblables pour obtenir de nouvelles informations sur un mécanisme biologique de dimension 3,4-dépendante.
L'une des principales différences entre la culture 2D et le 3D dans un environnement in vivo est la distribution des récepteurs de cellules ancrées sur la matrice extracellulaire (ECM): tandis que sur 2D substrats cellules adhèrent ventralement, la majorité des cellules in vivo est complètement entourée par l'ECM et donc CEll adhérence se produit à travers une distribution 3D des récepteurs. Cela déclenche différentes voies de signalisation de l'adhérence cellulaire modulant ainsi les processus importants tels que la croissance cellulaire, la différenciation cellulaire et l'expression des gènes. Durant les dernières décennies, de nombreux systèmes de culture 3D différents ont été établis 5-8, mais leur variabilité et la complexité entravent leur normalisation dans les procédures de culture cellulaire commune. En outre les systèmes 3D ne sont généralement pas faciles à manipuler et procédures expérimentales actuelles sur des substrats 2D ne peuvent être facilement établis pour les cultures 3D. En outre, la littérature compare rarement cultures 3D avec la condition de 2D équivalent ou des autres systèmes 3D, ce qui entrave la bonne compréhension du comportement des cellules dans ces modèles.
Une fois que les cellules ayant adhéré à un substrat en 2D, l'excitation des récepteurs dorsales - en superposant un film d'un nouveau matériau (culture en sandwich) - peuvent déclencher des réponses des cellules aussi bien des environnements 3D. Le reafils derrière cela est l'activation simultanée de deux récepteurs dorsale et ventrale à adhérer et la propagation dans l'environnement sandwich (Figure 1) 9,10. En conséquence, les cellules subissent des changements importants en ce qui concerne les cultures 2D 11,12. Ainsi, le devenir des cellules est déterminée lors de l'assemblage du fait de la culture en sandwich, étant donné que la stimulation dorsale déclenche les changements dans les voies cellulaires clés. Par conséquent, le destin des cellules est fortement déterminée par le moment où la culture en sandwich 11 est assemblé.
En raison de la nature du système, une culture en sandwich est un outil simple et polyvalent qui permet l'étude de différents paramètres dans les interactions cellule / matérielles telles que la chimie, de la topographie, de rigidité et de protéines revêtements à la fois les côtés ventrales et dorsales. Cela offre un degré de polyvalence plus élevé par rapport à d'autres systèmes 3D (figure 2) en raison de la dorsale indépendante et la combinaison ventrale d'un large variété des conditions de surface. En outre, différentes lignées cellulaires et à des moments différents assembler la culture en sandwich peuvent être étudiés, ce qui augmente le large spectre de possibilités.
Un protocole standard de la culture en sandwich est détaillée ci-dessous en utilisant soit de poly-L-lactique (PLLA) des fibres ou des films en tant que substrats électrofilées dorsales, lamelle de verre comme substrat ventral et de la fibronectine comme protéine de revêtement. cultures de sandwich ont été assemblés juste après l'ensemencement des cellules ou après 3 h de culture 2D. Toutefois, notez que d'autres systèmes de matériaux et des protéines pourraient être utilisés; De même, la culture en sandwich peut être assemblé à différents points dans le temps.
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Protocol
1. La production de substrats dorsales
- Production d'un film plat de PLLA par coulée au solvant.
- Travailler dans une hotte de laboratoire pour préparer une solution de 2% (p / v) dans du chloroforme PLLA (PLLA 2 g dans 100 ml de chloroforme) par agitation à la température ambiante (TA) jusqu'à dissolution complète (environ 3 heures).
- Placez les rondelles sur une boîte de Pétri en verre.
Note: utiliser des rondelles en acier inoxydable avec un diamètre intérieur de 10,5 mm (un peu plus petit que le diamètre de l'échantillon ventral) de sorte que la rondelle est placée sur le dessus du substrat ventral. D'autres matériaux tels que le polytétrafluoroéthylène (PTFE) ou des rondelles de verre peuvent être utilisés aussi bien. - Ajouter 200 ul de la solution de PLLA dans la machine à laver et à faire évaporer lentement pendant 30 min à température ambiante. Afin de permettre l'évaporation lente du solvant, fermez la boîte de Pétri avec du papier d'aluminium avec quelques trous.
- Chauffer les échantillons à 120 ° C pendant 5 minutes afin d'évaporer les traces de solvant.
- Laissez échantillons EPO neWN à la température ambiante.
- Une fois les échantillons ont refroidi (30 min environ), couvrir avec 18,2 MQ · cm d'eau dans la boîte de Pétri et incuber pendant 8 min à température ambiante.
Remarque: Si les échantillons ne sont pas complètement refroidies, elles peuvent prendre jusqu'à 18,2 MQ · cm d'eau et d'adopter un état caoutchouteux. En outre, l'incubation à 18,2 MQ · cm d'eau pendant moins de 8 min peut conduire à une mauvaise séparation, et pendant plus de 8 min dans le détachement de la laveuse. - Avec une lame de rasoir, fouiller les rondelles de les décoller de la boîte de Pétri.
- Retirez toutes les imperfections du bord de la rondelle avec des pincettes et laisser les échantillons d'air sec.
- Stocker les échantillons dans un dessiccateur sous vide (80 mbar) jusqu'à ce que le jour de l'expérience car PLLA est dégradable par hydrolyse.
- Production de fibres de PLLA par électrofilage.
- Travailler dans une hotte de laboratoire pour préparer une solution de 8% (p / v) dans l'hexafluoroisopropanol PLLA (PLLA 8 g dans 100 ml d'hexafluoroisopropanol) par stirrment à la température ambiante jusqu'à dissolution complète (3 h environ).
- Placez le polytétrafluoroéthylène (PTFE) rondelles sur une feuille d'aluminium ou sur un tambour pour le électrofilature afin d'obtenir des fibres aléatoires ou alignés respectivement.
Remarque: L'utilisation de polytétrafluoroéthylène (PTFE) un lave-linge avec un diamètre intérieur de 10,5 mm (un peu plus petit que le diamètre de l'échantillon ventral) de sorte que la rondelle est placée sur le dessus du substrat ventral. D'autres matériaux tels que l'acier inoxydable ou de verre rondelles peuvent être utilisés aussi bien. Le tambour doit tourner à une vitesse angulaire de 160,7 sec -1 (rayon = 7 cm) afin d'obtenir des fibres alignées. Une vitesse plus lente peut pas déclencher l'alignement des fibres et une plus grande vitesse se traduira par des fibres cassées. - Charger la seringue avec la solution de polymère et le placer sur la pompe à seringue.
- Electrospin la solution PLLA en utilisant un débit de 0,9 ml / h avec une tension de 30 kV et une distance de collecteur de 12 cm.
- Arrêtez l'arrière de processus de électrofilatureer 20 à 30 min, une fois une bonne densité de fibres est réalisé (car les cellules doivent interagir avec plusieurs fibres simultanément).
- Chauffer les échantillons à 120 ° C pendant 5 minutes afin d'évaporer les traces de solvant.
- Stocker les échantillons dans un dessiccateur sous vide (80 mbar) jusqu'à ce que le jour de l'expérience car PLLA est dégradable par hydrolyse.
2. Sandwich Culture
- Monter la culture en sandwich une fois que les cellules adhèrent au substrat en 2D ventral.
- Travailler dans une hotte de culture afin d'assurer des conditions stériles et stériliser tous les matériaux (lamelles de verre, les substrats dorsales, pinces, etc.) par l'exposition aux UV pendant 30 minutes.
- Enduire le substrat ventral et dorsal avec la fibronectine dans le but de diriger l'adhérence cellule-spécifique de protéines. Pour ce faire, incuber les échantillons à 20 pg / ml de fibronectine dissoute dans une solution saline tamponnée au phosphate (DPBS), contenant Ca 2+ et Mg 2+ par Dulbecco (200 pl / sample) pendant 1 heure.
Remarque: En raison du procédé de fabrication, les substrats ont une dorsales côtés supérieur et inférieur désignées parce que les solvants coulé films et fibres électrofilées attachés à l'un des côtés de la rondelle. Cette face est donc l'une en face des cellules (figure 3).- Après séchage du dépôt de protéine, laver les échantillons deux fois avec du DPBS pour éliminer les protéines en excès. Puis incuber des échantillons dans DPBS jusqu'à leur utilisation afin d'éviter des échantillons de se sécher, car cela génère protéines dénaturalisation. Utilisez DPBS contenant Ca 2+ et Mg 2+ depuis cations bivalents régulent le repliement des protéines.
- cellules de semences sur le verre des lamelles 13.
Remarque: Comme la culture en sandwich est basée sur des substrats 2D, l'ensemencement des cellules sera réalisée de façon similaire comme sur un échantillon 2D. Par exemple, C2C12 myoblastes sont ensemencées à 17 500 cellules cm -1 pour expériences de différenciation et NIH3T3 fibroblastes sont ensemencés à 7000 cElls cm -1 pour les cultures isolées pour étudier la morphologie des cellules et l'adhérence. - Placer les échantillons dans une étuve à 37 ° C avec 5% de CO 2 et permettent aux cellules d'adhérer au substrat ventral pendant 3 heures.
- Placez le substrat ensemencé ventrale dans un nouveau puits d'une plaque 12 puits multiples (où rondelles Fit).
Remarque: Montage de la culture en sandwich dans un nouveau puits est une façon de se débarrasser des cellules qui ont adhéré au fond du puits après l'ensemencement puisque ceux-ci consomment des nutriments et sécrètent des facteurs de croissance et des déchets qui influencent cellules cultivées dans le sandwich système. Ceci est également une nécessité pour des extractions cellulaires afin de lyser les cellules cultivées seulement dans le milieu de sandwich. - Et avec précaution à l'aide d'une paire de pinces, recouvrir le substrat dorsal sur les cellules. Recharge avec le milieu (1 ml) et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2.
Remarque: Le poids de la rondelle empêche le dorsal soustrer de flotter. - Changer le support deux fois par semaine que dans les cultures 2D standard. Ne pas déplacer le substrat dorsale car cela pourrait entraîner des dommages aux cellules.
- Assemblez la culture en sandwich juste après l'ensemencement des cellules.
- Travailler dans une hotte de culture afin d'assurer des conditions stériles et stériliser tous les matériaux (lamelles de verre, les substrats dorsales, pinces, etc.) par l'exposition aux UV pendant 30 minutes.
- Enduire le substrat ventral et dorsal avec la fibronectine dans le but de diriger l'adhérence cellule-spécifique de protéines. Pour ce faire, incuber les échantillons à 20 pg / ml de fibronectine dissoute dans du DPBS contenant du Ca 2+ et Mg 2+ (200 ul / échantillon) pendant 1 heure.
- Après séchage du dépôt de protéine, laver les échantillons deux fois avec du DPBS pour éliminer les protéines en excès. Puis incuber des échantillons dans DPBS jusqu'à leur utilisation afin d'éviter des échantillons de se sécher, car cela génère protéines dénaturalisation. Utilisation du DPBS contenant du Ca 2+ et Mg
- Après séchage du dépôt de protéine, laver les échantillons deux fois avec du DPBS pour éliminer les protéines en excès. Puis incuber des échantillons dans DPBS jusqu'à leur utilisation afin d'éviter des échantillons de se sécher, car cela génère protéines dénaturalisation. Utilisation du DPBS contenant du Ca 2+ et Mg
- cellules de semences sur des lamelles de verre dans un puits d'une plaque 12 puits multiples (où rondelles Fit). Pour ce faire, utilisez une suspension cellulaire très concentré pour éviter la perte de cellules après la pose du substrat dorsale.
- Et avec précaution à l'aide d'une paire de pinces, recouvrir le substrat dorsal sur les cellules. Recharge avec le milieu (1 ml) et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2.
Remarque: Le poids de la rondelle empêche le substrat dorsal de flotter. - Changer le support deux fois par semaine que dans les cultures 2D standard.
Note: Ne pas déplacer le substrat dorsale car cela pourrait entraîner des dommages aux cellules.
3. Analyse
Remarque: Les cultures de sandwich sont basés sur des substrats en 2D, et ainsi peuvent être analysées par des procédés communément déjà développés pour les cultures 2D standard. Par exemple, étant donné que le PLLA est transparent et cells sont contraints de se déplacer dans le plan xy, la microscopie est effectuée sur des substrats en 2D. La migration cellulaire peut donc être analysé comme pour les cultures 2D, sans qu'il soit nécessaire de suivre dans les cellules de l'axe z comme des cultures 3D, ce qui simplifie l'analyse de l'expérience et de l'image. Pour étudier le dosage de cicatrisation par un essai de zéro suivre ce protocole:
- Etude de la migration cellulaire (test de guérison de la plaie) dans la culture en sandwich.
- Travailler dans une hotte de culture afin d'assurer des conditions stériles et stériliser tous les matériaux (lamelles de verre, les substrats dorsales, pinces, etc.) par l'exposition aux UV pendant 30 minutes.
- Enduire le substrat ventral et dorsal avec la fibronectine dans le but de diriger l'adhérence cellule-spécifique de protéines. Pour ce faire, incuber les échantillons à 20 pg / ml de fibronectine dissoute dans une solution saline tamponnée au phosphate (DPBS), contenant Ca 2+ et Mg 2+ par Dulbecco pendant 1 heure.
- Après le revêtement de protéines, laver les échantillons deux fois avec DPBSafin d'éliminer les protéines en excès. Puis incuber des échantillons dans DPBS jusqu'à leur utilisation afin d'éviter de se sécher les échantillons car cela pourrait causer des protéines dénaturalisation. Utilisez DPBS contenant Ca 2+ et Mg 2+ depuis cations bivalents régulent le repliement des protéines.
- cellules de semences sur les lamelles de verre à haute densité 13.
- Placer les échantillons dans une étuve à 37 ° C avec 5% de CO 2 et permettent aux cellules pour atteindre la confluence.
- Utiliser un embout de pipette pour rayer la monocouche cellulaire afin d'obtenir deux populations de cellules séparées par un espace.
- Placez le substrat ensemencé ventrale dans un nouveau puits approprié pour l'acquisition time-lapse et où substrats dorsales intègrent (soit 12 plaque multi-puits).
- Avec soin et avec l'aide d'une paire de pinces, superposer le substrat dorsal sur les cellules, puis remplir avec le milieu (1 ml pour une plaque 12 multi-puits).
Remarque: Le poids de la rondelle empêchera til dorsale substrat de flotter. - Placer l'échantillon dans le microscope time-lapse (fixé à 37 ° C et 5% de CO 2) et de prendre des images de la fermeture de l'écart toutes les 20 min.
- Analyser la fermeture de l'écart à l'aide de logiciels spécifiques comme le MiToBo de plugin à partir de ImageJ. 14
Remarque: Les protéines et extraction d'acide nucléique est effectuée de manière similaire comme sur des substrats 2D. Il n'y a qu'une étape supplémentaire qui consiste à démonter la culture en sandwich d'ajouter le tampon de lyse directement sur les cellules afin d'augmenter le rendement d'extraction. Par exemple, pour l'extraction de l'ARNm:
- Extrait de l'ARNm à partir de cultures de sandwich
- Préparer tous les tampons du kit commercial selon les instructions du fabricant.
- Prendre la culture en sandwich à partir de l'incubateur.
- Retirez le support de culture à partir des échantillons.
- Laver les échantillons une fois avec DPBS contenant Ca2+ et Mg 2+ (1 ml) et enlever toute la solution.
- Avec l'aide d'une paire de pinces, enlever le substrat dorsal et ajouter le tampon de lyse (350 ul) sur le substrat ventral. Superposition de nouveau le substrat dorsal ventral sur le substrat afin de lyser les cellules qui adhèrent également au substrat dorsal.
- Enlever le substrat dorsal pour isoler la solution de lyse.
- Suivez les instructions du fabricant pour obtenir l'ARNm.
Remarque: immunodétection des protéines peut également être effectuée sur des substrats en tant que 2D. Depuis cultures sandwich-like pourraient entraver la diffusion correcte des anticorps et des tampons, des temps d'incubation devraient être augmentés. En outre, le sandwich peut être démonté avant de démarrer le protocole de coloration mais dans ce dernier cas, certaines cellules restera attaché au substrat dorsal et d'autres sur le substrat ventral.
- Protéines Immunodetect sein d'une culture de sandwich
Remarque: substrat dorsal peut être enlevé pendant le processus de fixation de sorte que les problèmes de diffusion sont évités. - Rincer avec du DPBS (1 ml), puis perméabiliser avec 0,5% de Triton X-100 dans du DPBS (1 ml) pendant 5 min à température ambiante.
- Bloquer les sites de liaison non spécifiques avec 1% d'albumine dans du DPBS (1 ml) pendant 30 min à température ambiante.
- Incuber avec l'anticorps primaire (2 ug / ml; 1 ml) dans une solution de blocage pendant 3 heures à température ambiante.
- Laver trois fois pendant 10 minutes avec du DPBS / 0,5% de Tween 20 (1 ml).
- Incuber 2 h avec des anticorps secondaires (2 ug / ml) et 1 ug / ml de DAPI dans une solution de blocage (1 ml) à température ambiante.
- Laver trois fois pendant 10 minutes dans du DPBS / 0,5% de Tween 20 (1 ml).
- Laver dans du DPBS.
Note: Les échantillons peuvent être montés sur une diapositive avec Vectashield et scellés avec du vernis à ongles quand substrats dorsales sont retirés avant l'immunodétection. - Observer sous la fluorescence de micro-champ d'application que pour des substrats 2D standard.
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Representative Results
La stimulation des récepteurs dorsales dans la culture en sandwich déclenche des changements dans la morphologie cellulaire, l'adhésion cellulaire et des voies de signalisation intracellulaires (par exemple, l'adhérence focale kinase, FAK) 12/10. A titre d'exemple, des fibroblastes en culture dans le système sandwich surexprimés la sous-unité α de l'intégrine 5 par rapport au 2D, comme on l'observe pour d'autres cultures 3D 15,16.
Cellule sort dépend fortement du moment où les récepteurs sont stimulés dorsales et par les propriétés de l'interaction dorsale, de manière similaire comme cela se produit dans d'autres systèmes tels que les hydrogels 3D. Par exemple, les hydrogels où les protéines sont étroitement liés en général montrent des cellules plus petites et arrondies avec peu développée cytosquelette d'actine et diffusent adhésions focales. Cela peut être mimée dans une culture en utilisant des substrats en forme de sandwich qui adsorbent les protéines étroitement, de sorte que les cellules ne sont pas capables de se réorganiser mécaniquement cette couche de protéines et de cellules Spreading est entravée. De même, des hydrogels où les cellules peuvent remodeler l'ECM peut être imité par le système en sandwich en utilisant des substrats qui adsorbent les protéines 10 de manière plus lâche.
La stimulation des récepteurs de la dorsale a été montré pour moduler cellule C2C12 sort. Fibres de PLLA dorsale électrofilées alignement des cellules directe lorsque revêtu de la fibronectine, mais pas lorsqu'ils sont revêtus avec de l'albumine de sérum bovin (une protéine non-adhésif). Ce résultat souligne cellules font sens biologiquement et réagissent aux entrées de dorsales (Figure 4) 9. En outre, les cultures de sandwich avec plan dorsale PLLA déclenché une augmentation du niveau de la myogenèse. Cela dépend également des stimuli biologiques dorsales depuis l'interaction avec d'autres protéines dorsales résultats des taux de différenciation distinctes (figure 5) 9.
La migration cellulaire dans la culture en sandwich est également modifiée par rapport à la culture 2D. Il a soitfr montré que dans un essai de cicatrisation, les cellules au sein de la culture en sandwich adoptent une morphologie très allongée et migrent sur des distances plus courtes que les substrats 2D (Films 1 et 2). les taux de migration cellulaire sont en outre liés à la nature de la stimulation ventral et dorsal 12.
De même que dans 3D fibronectine et de collagène gels 17,18, la culture en sandwich augmente réorganisation ECM à médiation cellulaire (à savoir la fibronectine ventrale) en ce qui concerne la condition 2D (figure 6) 12. Ce processus repose sur les dorsales stimuli mécaniques et la stabilité cytosquelette puisque l'utilisation d'inhibiteurs de la contractilité (de blebbistatin, Y27632) entravé le processus. Fait intéressant, la fibronectine ventrale a également été réorganisé en utilisant différents revêtements de protéines dorsale (c.-à-vitronectine et le sérum albumine bovine) et même si laissé non couché 12.
Figure 1:.. Croquis de la norme (2D) et des cultures en sandwich comme stimulation des récepteurs dorsales sein de la culture en sandwich déclenche supplémentaire signalisation d'adhésion cellulaire qui module les processus cellulaires importants S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: la culture en sandwich est un système polyvalent qui permet l'étude de différents paramètres bien contrôlés (entrées topographiques, rigidité, dégradés ...) sur les deux substrats ventrales et dorsales.
Figure 3:. Substrats dorsales sont esquissés à la fois en haut et en section vue afin de spectacle qui ont un haut désigné et côté inférieur (A) film plat PLLA et (B) électrofilées fibres.
Figure 4:. C2C12 morphologie sous différentes conditions de culture, y compris le plan (p) et des fibres alignées (a) de PLLA qui ont été utilisés comme ventrale (indice) ou dorsale (exposant) substrats lignes pointillées représentent les fibres orientation si nécessaire. Les cellules cultivées sur le substrat plan et superposées avec des fibres alignées de PLLA (SW p de a) Le sens des stimuli dorsales. En particulier, les cellules détectent les fibres dorsales lorsqu'il est revêtu d'fibronectine mais pas lorsqu'il est revêtu wie albumine de sérum bovin (une protéine non-adhésif). Par conséquent, les cellules adhèrent aux fibres revêtues de fibronectine et d'aligner dans le même sens. Image adapté de la référence 9. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: La différenciation cellulaire dans les cultures de sandwich après 4 jours dans les médias de différenciation. Différentes conditions de culture ont été analysés, y compris plan (P) et de fibres alignées (a) de PLLA qui ont été utilisés comme ventral (indice) ou dorsale (superscript) substrats. Des échantillons ont été revêtus avec de la fibronectine dans tous les cas. (A) la coloration par fluorescence montrant des cellules de myosine sarcomérique positifs (en vert) et les noyaux des cellules (rouge). (B) différenciéecellules orientation que calculé par transformée de Fourier rapide. (C) Myogenèse tel que déterminé par le pourcentage de cellules positives de myosine du sarcomère. Les données sont normalisées pour le contrôle étalon-or. Des différences statistiquement significatives sont indiquées par *** P <0,001. Image adapté de la référence 9. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6: Réorganisation de la fibronectine ventrale. la culture de Sandwich déclenche réorganisation FN ventrale en formant de nouvelles fibrilles de fibronectine (type brosse étiquetage; a souligné avec des flèches blanches). fibronectine ventrale est réorganisée au sein des cultures de sandwich avec différents revêtement de protéines dorsale (fibronectine, la vitronectine et la sérum albumine bovine)ou encore lorsque le substrat dorsal est laissée non revêtue. Cytosquelette d'actine (vert), les noyaux (bleu) et FN (rouge) sont présentés. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Film 1: La migration cellulaire sur 2D. L929 fibroblastes migration sur une fibronectine revêtu lamelle de verre dans une cicatrisation dosage. Les images ont été acquises pendant 16 heures (avec une trame prise toutes les 20 min). S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.
Film 2:. La migration cellulaire dans la culture en sandwich L929 fibroblastes migration dans une cicatrisation essai dans une culture en sandwich étaient le substrat ventral est une fibronectine revêtu lamelle de verre et le substrat dorsale un film de PLLA de fibronectine revêtu. Les images ont été acquises pendant 16 heures (avec une trame prise toutes les 20 min). S'il vous plaît cliquer ici pour voir cette vidéo.
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Discussion
De nos jours, la culture 3D est un sujet important pour l'industrie pharmaceutique et biotechnologique ainsi que la recherche en biologie cellulaire, y compris le cancer et les cellules souches. En conséquence, plusieurs systèmes de culture en 3D ont été développés. Malheureusement, les différences entre les systèmes 3D se traduisent habituellement par le comportement des cellules différentes, ce qui entrave la compréhension du destin cellulaire. En outre, les procédures expérimentales sont généralement pas aussi simple que pour les systèmes de culture 2D. Ainsi le développement de nouveaux systèmes de culture qui cherchent à surmonter certains de ces inconvénients est très importante.
culture en sandwich a été montré pour influencer fortement les processus cellulaires clés tels que la différenciation des cellules, la morphologie cellulaire, la signalisation cellulaire et la migration cellulaire. En outre les cellules des similitudes avec des cellules cultivées dans des systèmes 3D, appuyant la déclaration que la culture en sandwich Liens 2D avec des systèmes de culture 3D. Tissus physiologiques ont des pores dans la gamme de 3 à 14 μm cellules de cette contrainte et par conséquent influer sur les processus cellulaires tels que la migration. Ceci est récapitulé en quelque sorte à l'aide du système de sandwich comme dorsal et ventral stimuli représentent en soi un environnement contraint qui limite la morphologie des cellules et sera nécessairement influencer la migration des cellules, indépendamment des revêtements protéiques.
En raison de la stimulation simultanée de la dorsale et ventrale récepteurs, la culture en sandwich est une technologie robuste pour étudier le rôle de la dimension dans le comportement des cellules. En outre, comme il est basé sur des substrats 2D, ce système de culture est très polyvalent pour étudier différentes propriétés des matériaux et intrants ECM permettant l'étude du comportement des cellules dans différents micro-environnements. En outre, l'influence de l'heure à laquelle les récepteurs sont stimulés dorsales sur le destin des cellules peut être étudiée par recouvrant le substrat dorsal à différents points dans le temps. Par conséquent, contrairement à d'autres systèmes 3D, le système de sandwich offre un large spectrede bien-contrôlée microenvironnements cellulaires. En conséquence, le système de sandwich est une plate-forme de culture cellulaire intéressant de reproduire différents environnements physiologiques afin d'étudier la biologie cellulaire et le destin des cellules d'essai dans différentes conditions de culture.
Comme mentionné précédemment, un des avantages de ce système est que différents substrats ventrales et dorsales peuvent être étudiés en utilisant des revêtements différents de protéines. Par conséquent, les paramètres importants pour le destin des cellules telles que la densité de ligand peuvent être réglés en commandant la densité de ligand de chacun des substrats en 2D utilisés (par exemple des substrats ventrales et dorsales). Toutefois, notez que différents substrats peuvent nécessiter des modifications dans le protocole. Par exemple, en utilisant de plus grands substrats dorsales peut entraîner la nécessité de régler le temps d'incubation propre à éplucher les échantillons au large de la boîte de Pétri. De même, de plus grands substrats ventrales pourraient entraîner des régions hypoxiques au centre de l'échantillon en raison de la perméabilité à l'oxygène limitée du ventralsubstrat (due à la lamelle de verre). En outre, les procédures d'analyse dépendent des propriétés du substrat. Par exemple, en utilisant des substrats dorsales opaques gênera protocoles standards de microscopie si elle permettra toujours de protéines / extraction des acides nucléiques. Un autre facteur clé est la perméabilité du substrat dorsale puisque les cellules devraient être autorisés à obtenir les nutriments du milieu et jeter les déchets.
Pour résumer, une culture en sandwich est un système simple qui offre la possibilité de simuler différents micro-environnements 3D comme pour enquêter sur le sort de la cellule.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ploy(lactic acid) | NatureWorks | 4042D | Reagent |
| Cover glasses (12 mmØ) | Marienfeld | 631-0666 | Equipment |
| Chloroform | Scharlab | CL0200 | Reagent |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Sigma | 105228 | Reagent |
| Syringe (1 ml) | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | Equipment |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE1000 | Equipment |
| High Voltage DC Power Supply | Glassman High Voltage | Series FC | Equipment |
| Incubator | Hucoa-Herlös | 3111 | Equipment |
| Laminar flow hood | Telstar | AV30/70 | Equipment |
| Human Fibronectin | Sigma | F2006 | Reagent |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Inverted microscope | Leica Microsystems | DMI 6000 | Equipment |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Reagent |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7409 | Reagent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Reagent |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).
- Weiss, P. Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).
- Ruffner, H., Lichtenberg, J. 3D cell culture systems--towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero). Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).
- Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs. Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).
- Schor, S. L., et al. A novel 'sandwich' assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay. Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).
- Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).
- Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmerón-Sánchez, M. Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate. Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology. Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments. Nanomedicine. , (2015).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. J. Vis. Exp. , (2015).
- Glaß, M., et al. Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines. Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis. J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).
