Abstract
תרבית תאים בוצעה באופן מסורתי על מצעים דו-ממדי (2D) שבו תאים לדבוק באמצעות קולטנים הגחון אל פני השטח בחומר ביולוגי. עם זאת in vivo, רוב התאים מוקפים לחלוטין על ידי מטריקס (ECM), וכתוצאה מכך הפצה תלת ממדי (3D) של קולטנים. זה עלול לעורר הבדלים במחוץ-במסלולי איתות וכך בהתנהגות תא.
מאמר זה מראה שגירוי קולטני הגב של תאים כבר דבקו מצע 2D ידי כיסה סרט של חומר חדש (תרבות כמו כריך) מפעיל שינויים חשובים ביחס לתרבויות 2D סטנדרטיים. יתר על כן, העירור הזמני של קולטני הגחון ועל גב משמרות התנהגות תא קרוב יותר לזה שנמצא בסביבות 3D. בנוסף, בשל אופייה של המערכת, תרבות כמו כריך הוא כלי רב-תכליתי שמאפשר הלימוד של פרמטרים שונים בתא / inte חומרractions, למשל, טופוגרפיה, נוקשות וציפוי חלבון שונה בשני הצדדים הגחון ועל גב. לבסוף, מאז תרבויות כמו כריך מבוססות על מצעי 2D, מספר הליכי ניתוח כבר פיתחו לתרבויות 2D סטנדרטיים יכול לשמש בדרך כלל, להתגבר על הליכים מורכבים יותר הנדרשים למערכות 3D.
Introduction
באופן מסורתי, תרבית תאים בוצעה על מצעים דו-ממדיים (2D), שרוב microenvironments הסלולרי in vivo יש לי טבע תלת ממדי (3D). סביבת 2D לא טבעית זה גורמת לשינויים בהתנהגות תא כדרך של הסתגלות עצמית לעולם שטוח, המשפיעה ישירות על תא גורל 1,2. לפיכך, תוצאות שהתקבלו בתרביות תאי 2D לא תמיד לשחזור in vivo. זה עודד את הפיתוח של מערכות תרבות הרלוונטיות חדשות המבקשות לספק תנאים כמו-פיסיולוגיים יותר כדי לקבל תובנות נוספות כל 3,4 מנגנון ביולוגי ממד תלוי.
אחד ההבדלים העיקריים בין תרבות 2D ו3D בסביבת vivo הוא ההפצה של קולטני תא מעוגן למטריצה תאית (ECM): בעוד ב2D מצעי תאים לדבוק ventrally, רוב התאים בגוף חי מוקפות לחלוטין על ידי ECM ו כך לסה"נהידבקות ll מתרחשת באמצעות הפצת 3D של הקולטנים. זה מעורר מסלולי איתות הידבקות תאים שונים ובכך ויסות תהליכים חשובים כגון צמיחת תאים, התמיינות תאים וביטוי גנים. במהלך העשורים האחרונים, מערכות תרבות 3D שונות הוקמו 5-8, אם כי שונות והמורכבות שלהם לעכב סטנדרטיזציה שלהם בהליכי תרבות תא משותף. יתר על כן מערכות 3D הן בדרך כלל לא קלה לטפל ופרוצדורות הנוכחיות על מצעי 2D לא ניתן לקבוע בקלות לתרבויות 3D. בנוסף, רק לעתים נדירות ספרות משווה תרבויות 3D עם מצב 2D שווה הערך או מערכות אחרות 3D, פוגע ההבנה הנכונה של התנהגות תא במודלים אלה.
ברגע שיש את התאים דבקים על מצע 2D, העירור של קולטני גב - על ידי שכיסה סרט של חומר חדש (תרבות כמו כריך) - יכול לעורר תגובות תא אחד סביבות 3D. המחשבהבן מאחורי זה הוא ההפעלה בו זמנית של שני גב וגחון קולטנים לדבוק והתפשט בתוך סביבת הכריך (איור 1) 9,10. כתוצאה מכך, תאים עוברים שינויים חשובים ביחס לתרבויות 2D 11,12. כך, גורל תא נקבע במהלך עצרת בגלל תרבות הכריך, מאז גירוי הגב מפעיל שינויים במסלולים סלולריים מפתח. לכן, גורל התא נקבע מאוד על ידי הזמן שבו התרבות כמו הכריך מורכבת 11.
בשל אופייה של המערכת, תרבות כמו כריך היא כלי פשוט ורב-תכליתי שמאפשר הלימוד של פרמטרים שונים באינטראקציות תא / חומר כגון ציפויי כימיה, טופוגרפיה, נוקשות וחלבון בשני הצדדים הגחון ועל גב. זו מציעה רמה גבוהה יותר של גמישות בהשוואה למערכות אחרות 3D (איור 2) בשל הגב העצמאי ושילוב הגחון של נ 'רחבariety של תנאי שטח. בנוסף, ניתן ללמוד שורות תאים שונות ובזמנים שונים כדי להרכיב את התרבות כמו כריך, הגדלת הספקטרום הרחב של אפשרויות.
פרוטוקול סטנדרטי של התרבות כמו כריך מפורט להלן או באמצעות פולי-L-לקטית סיבי electrospun חומצה (PLLA) או סרטים כמו מצעי גב, coverslip זכוכית כמצע הגחון ופיברונקטין כציפוי חלבון. תרבויות כמו כריך נאספו רק לאחר זריעת תאים או אחרי 3 שעות של תרבות 2D. עם זאת, שימו לב שיכולים לשמש מערכות חומר אחרות וחלבונים; כמו כן התרבות כמו כריך ניתן להרכיב בנקודות זמן שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ייצור מצעים הגבי
- הפקת סרט שטוח של PLLA ידי יציקת ממס.
- לעבוד במנדף להכין פתרון של 2% (w / v) PLLA בכלורופורם (2 PLLA גרם ל -100 מיליליטר כלורופורם) על ידי ערבוב בטמפרטורת חדר (RT) עד שהיא נמסה לחלוטין (3 שעות בערך).
- מניחים את מנקי בצלחת פטרי מזכוכית.
הערה: מכונות כביסה הנירוסטה שימוש עם קוטר פנימי של 10.5 מ"מ (מעט קטן יותר מאשר קוטר מדגם הגחון), כך שמכונת הכביסה מוצבת על גבי מצע הגחון. יכולים לשמש חומרים אחרים כגון polytetrafluoroethylene (PTFE) או מכונות כביסה זכוכית גם כן. - הוסף 200 μl של פתרון PLLA במכונת הכביסה ולתת להתאדות לאט למשך 30 דקות ב RT. על מנת לאפשר אידוי איטי של הממס, לסגור את צלחת פטרי עם רדיד אלומיניום עם כמה חורים.
- מחממים את הדגימות ב 120 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להתאדות עקבות ממס.
- בואו דוגמאות מגניב לעשותwn ב RT.
- ברגע שהדגימות התקררו (30 דקות בערך), לכסות עם 18.2 MΩ · מים סנטימטר בצלחת פטרי והדגירה של 8 דקות ב RT.
הערה: אם הדגימות לא התקררו לחלוטין, ייתכן שהם תופסים 18.2 MΩ · מים סנטימטר ולאמץ מדינת גומי. בנוסף, דוגרים ב18.2 MΩ · מים סנטימטרים פחות מ -8 דקות עלול לגרום לניתוק לא תקין, ובמשך יותר מ -8 דקות בניתוק ממכונת הכביסה. - עם סכין גילוח, לחטט מנקי לקלף אותם מצלחת פטרי.
- הסר את כל פגמים מהקצה של מכונת הכביסה עם פינצטה ולתת דגימות האוויר יבשה.
- אחסן את הדגימות בייבוש ואקום (80 mbar) עד ליום של הניסוי כי PLLA הוא מתכלה על ידי הידרוליזה.
- ייצור של סיבי PLLA ידי electrospinning.
- לעבוד במנדף להכין פתרון של 8% (w / v) PLLA בhexafluoroisopropanol (PLLA 8 גרם ב 100 מיליליטר hexafluoroisopropanol) על ידי stirring ב RT עד נמס לגמרי (3 שעות בערך).
- מניחים את polytetrafluoroethylene (PTFE) מכונות כביסה בגיליון אלומיניום או בתוף לelectrospinning על מנת לקבל סיבים אקראיים או מיושר בהתאמה.
הערה: השתמש polytetrafluoroethylene (PTFE) מכונות כביסה עם קוטר פנימי של 10.5 מ"מ (מעט קטן יותר מאשר קוטר מדגם הגחון), כך שמכונת הכביסה מוצבת על גבי מצע הגחון. יכולים לשמש חומרים אחרים כגון מכונות כביסה פלדת אל-חלד או זכוכית, כמו גם. התוף צריך לסובב במהירות הזוויתית של 160.7 שניות -1 (רדיוס = 7 סנטימטרים) על מנת לקבל סיבים מיושרים. מהירות איטית יותר עשויה שלא לגרום ליישור סיבים ומהירות גבוה יותר תגרום לסיבים השבורים. - טען את המזרק עם פתרון הפולימר ולמקם אותו על משאבת המזרק.
- Electrospin פתרון PLLA באמצעות קצב זרימה 0.9 מיליליטר / שעה עם מתח של 30 וולט ומרחק אספן של 12 סנטימטר.
- לעצור את התהליך האחורי electrospinningאה 20-30 דקות, פעם בצפיפות סיבים טובה מושגת (מאז תאים צריכים אינטראקציה עם כמה סיבים בו זמנית).
- מחממים את הדגימות ב 120 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להתאדות עקבות ממס.
- אחסן את הדגימות בייבוש ואקום (80 mbar) עד ליום של הניסוי כי PLLA הוא מתכלה על ידי הידרוליזה.
תרבות 2. סנדוויץ
- להרכיב את התרבות כמו כריך פעם תאים דבקו במצע 2D הגחון.
- העבודה במנדף תרבות על מנת להבטיח תנאים סטריליים ולעקר את כל החומרים (coverslips זכוכית, מצעי גב, פינצטה, וכו ') על ידי חשיפה לקרינת UV למשך 30 דקות.
- מעיל מצע הגחון ועל גב עם פיברונקטין כדי לכוון הידבקות תא חלבון ספציפית. כדי לעשות זאת, דגירה הדגימות ב -20 / מיליליטר מיקרוגרם של פיברונקטין מומס בפוספט שנאגר מלוח של Dulbecco (DPBS) המכיל Ca 2 + וMg 2 + (200 μl / sשפע) במשך שעה 1.
הערה: בשל תהליך הייצור, יש לי מצעי גב צדדים העליונים ותחתונים מיועדים כי סיבי סרט וelectrospun ממס יציקה מצורפים לאחד הצדדים של מכונת הכביסה. הצד הזה הוא אפוא אחד מול התאים (איור 3).- לאחר ציפוי החלבון, לשטוף את הדגימות פעמיים עם DPBS כדי להסיר חלבון בעודף. אז דגירה דגימות בDPBS עד לשימוש שלהם על מנת למנוע דגימות ממקבלים יבש מאז זה גורם שלילת אזרחות חלבון. DPBS שימוש המכיל Ca 2 + וMg 2 + מאז קטיונים דו ערכיים להסדיר קיפול חלבונים.
- תאי זרע על הזכוכית coverslips 13.
הערה: כתרבות כמו כריך מבוססת על מצעי 2D, זריעת תאים תבוצע באופן דומה כמו על מדגם 2D. לדוגמא, והיצמדות למנגנון C2C12 הם זורעים ב17,500 תאי סנטימטר -1 לניסויי בידול ופיברובלסטים NIH3T3 הם זורעים ב7,000 גסנטימטר אמות -1 לתרבויות מבודדות ללמוד מורפולוגיה תא והדבקה. - מניחים את הדגימות בחממה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 ולאפשר לתאים לדבוק במצע הגחון במשך 3 שעות.
- מניחים את מצע זרע הגחון בבאר חדשה של צלחת 12 רב-היטב (שבו מנקי יתאימו).
הערה: הרכבת התרבות כמו כריך בבאר חדשה היא אחת דרכים להיפטר מהתאים שדבקו בתחתית הבאר לאחר הזריעה שכן אלה יצרכו חומרים מזינים ומפרישים גורמי גדילה ופסולת המשפיעים על תאים בתרבית בתוך מערכת כמו כריך. זוהי גם חובה לעקירות סלולריות כדי lyse רק התאים בתרבית בתוך הסביבה כמו הכריך. - בזהירות ובעזרת פינצטה, כיסוי המצע הגבי בתאים. למלא עם מדיום (1 מיליליטר) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
הערה: המשקל של מכונת הכביסה ימנע תת הגבstrate מצפה. - לשנות בינוני פעמיים בשבוע כמו בתרבויות 2D סטנדרטיים. אל תזיז את מצע הגב מאז זה עלול לגרום לניזק לתאים.
- להרכיב את התרבות כמו כריך רק לאחר זריעת תאים.
- העבודה במנדף תרבות על מנת להבטיח תנאים סטריליים ולעקר את כל החומרים (coverslips זכוכית, מצעי גב, פינצטה, וכו ') על ידי חשיפה לקרינת UV למשך 30 דקות.
- מעיל מצע הגחון ועל גב עם פיברונקטין כדי לכוון הידבקות תא חלבון ספציפית. כדי לעשות זאת, דגירה הדגימות ב -20 מיקרוגרם / מיליליטר של פיברונקטין מומס בDPBS מכיל Ca 2 + וMg 2 + (200 μl / מדגם) במשך שעה 1.
- לאחר ציפוי החלבון, לשטוף את הדגימות פעמיים עם DPBS כדי להסיר חלבון בעודף. אז דגירה דגימות בDPBS עד לשימוש שלהם על מנת למנוע דגימות ממקבלים יבש מאז זה גורם שלילת אזרחות חלבון. DPBS שימוש המכיל Ca 2 + Mg ו
- לאחר ציפוי החלבון, לשטוף את הדגימות פעמיים עם DPBS כדי להסיר חלבון בעודף. אז דגירה דגימות בDPBS עד לשימוש שלהם על מנת למנוע דגימות ממקבלים יבש מאז זה גורם שלילת אזרחות חלבון. DPBS שימוש המכיל Ca 2 + Mg ו
- תאי זרע על coverslips זכוכית בבאר של צלחת 12 רב-היטב (שבו מנקי יתאימו). כדי לעשות זאת, השתמש השעיה סלולרית מרוכזת מאוד כדי להימנע מאובדן תא לאחר הנחת המצע הגבי.
- בזהירות ובעזרת פינצטה, כיסוי המצע הגבי בתאים. למלא עם מדיום (1 מיליליטר) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
הערה: המשקל של מכונת הכביסה ימנע מצע הגבי מצף. - לשנות בינוני פעמיים בשבוע כמו בתרבויות 2D סטנדרטיים.
הערה: אל תזיז את מצע הגב מאז זה עלול לגרום לניזק לתאים.
3. ניתוח
הערה: תרבויות כמו כריך מבוססות על מצעי 2D, ולכן יכול להיות מנותחת בדרך כלל על ידי נהלים כבר פיתחו לתרבויות 2D סטנדרטיים. לדוגמא, מאז PLLA הוא שקוף וcelLS מוגבל לנוע בתוך המטוס XY, מיקרוסקופיה נעשה כעל מצעי 2D. נדידת תאים ניתן לנתח לכן כלתרבויות 2D, ללא הצורך במעקב אחר תאים בציר z כלתרבויות 3D, אשר מפשטת את ניתוח ניסוי ותמונה. כדי לחקור את assay ריפוי הפצע על ידי assay שריטה מעקב פרוטוקול זה:
- הגירת מחקר תאים (assay ריפוי פצע) בתוך התרבות כמו כריך.
- העבודה במנדף תרבות על מנת להבטיח תנאים סטריליים ולעקר את כל החומרים (coverslips זכוכית, מצעי גב, פינצטה, וכו ') על ידי חשיפה לקרינת UV למשך 30 דקות.
- מעיל מצע הגחון ועל גב עם פיברונקטין כדי לכוון הידבקות תא חלבון ספציפית. כדי לעשות זאת, דגירה הדגימות ב -20 מיקרוגרם / מיליליטר של פיברונקטין מומס בפוספט שנאגר מלוח של Dulbecco (DPBS) המכיל Ca 2 + וMg 2 + עבור שעה 1.
- לאחר ציפוי החלבון, לשטוף את הדגימות פעמיים עם DPBSכדי להסיר חלבון בעודף. אז דגירה דגימות בDPBS עד לשימוש שלהם על מנת למנוע דגימות ממקבלים יבש מאז זה יכול לגרום לשלילת אזרחות חלבון. DPBS שימוש המכיל Ca 2 + וMg 2 + מאז קטיונים דו ערכיים להסדיר קיפול חלבונים.
- תאי זרע על coverslips הזכוכית בצפיפות גבוהה 13.
- מניחים את הדגימות בחממה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 ולאפשר לתאים כדי להשיג נקודת המפגש.
- השתמש קצה פיפטה לגרד את monolayer התא על מנת לקבל 2 אוכלוסיות תאים מופרדות בפער.
- מניחים את מצע זרע הגחון בחדש גם מתאים לרכישת הזמן לשגות ובי מצעי גב יתאימו (כלומר 12 צלחת רב גם).
- בזהירות ובעזרת פינצטה, כיסוי המצע הגבי על התאים ולאחר מכן למלא עם מדיום (1 מיליליטר לצלחת 12 רב גם).
הערה: המשקל של מכונת הכביסה ימנע tהוא מגבה מצע מצף. - מניחים את המדגם במיקרוסקופ הזמן לשגות (מוגדר 37 ° C ו 5% CO 2) ולקחת תמונות של סגירת הפער בכל 20 דקות.
- נתח את סגירת הפער באמצעות תוכנה ספציפית כגון MiToBo התוסף מImageJ. 14
הערה: חלבון וחומצות גרעין חילוץ מתבצע באופן דומה כמו על מצעי 2D. יש רק צעד אחד נוסף שמורכב בפירוק התרבות כמו הכריך להוסיף למאגר תמוגה ישירות על התאים כדי להגביר את יעילות המיצוי. לדוגמא, להפקת mRNA:
- לחלץ mRNA מתרבויות כמו כריך
- הכן את כל המאגרים מהערכה המסחרית בהתאם להוראות היצרן.
- קח את התרבות כמו כריך החוצה מהחממה.
- הסר את התקשורת והתרבות מהדגימות.
- שטוף את הדגימות פעם עם DPBS מכיל Ca2 + וMg 2 + (1 מיליליטר) ולהסיר את כל הפתרון.
- בעזרת פינצטה, להסיר את מצע הגב ולהוסיף למאגר תמוגה (350 μl) למצע הגחון. כיסוי שוב מצע הגב על מצע הגחון כדי lyse גם התאים דבקו במצע הגבי.
- הסר את מצע גב לבודד את פתרון תמוגה.
- עקוב אחר ההוראות של היצרן כדי לקבל את ה- mRNA.
הערה: immunodetection של חלבונים יכול להיות גם הופיע כעל מצעי 2D. מאז תרבויות כמו כריך יכולות לעכב את דיפוזיה הנכונה של הנוגדנים ומאגרים, יש להגדיל פעמים דגירה. כמו כן, הכריך יכול להיות מפורק לפני תחילת הפרוטוקול מכתים אבל במקרה אחרון זה כמה תאים יישארו צמוד למצע הגב וחלק למצע הגחון.
- חלבוני Immunodetect בתוך תרבות כמו כריך
הערה: מצע הגבי ניתן להסיר בתהליך הקיבוע, כך שבעיות דיפוזיה נמנעות. - לשטוף עם DPBS (1 מיליליטר) ולאחר מכן permeabilize עם 0.5% Triton X-100 בDPBS (1 מיליליטר) במשך 5 דקות ב RT.
- לחסום אתרי קישור הלא ספציפי עם אלבומין 1% בDPBS (1 מיליליטר) במשך 30 דקות ב RT.
- דגירה עם נוגדן ראשוני (2 מיקרוגרם / מיליליטר; 1 מיליליטר) בחסימת פתרון לשעה 3 ב RT.
- לשטוף 3 פעמים במשך 10 דקות עם DPBS / Tween% 0.5 (20 מיליליטר 1).
- דגירה 2 שעות עם נוגדנים משני (2 מיקרוגרם / מיליליטר) ו1 מיקרוגרם / מיליליטר DAPI בפתרון חסימה (1 מיליליטר) ב RT.
- לשטוף 3 פעמים במשך 10 דקות בDPBS / Tween% 0.5 (20 מיליליטר 1).
- לשטוף בDPBS.
הערה: ניתן להרכיב דוגמאות בשקופית עם Vectashield ואטום עם לק כאשר מצעי גב יוסרו לפני immunodetection. - שים לב תחת מייקר הקרינההיקף כלמצעי 2D סטנדרטיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הגירוי של הקולטנים גב בתוך התרבות כמו הכריך מפעיל שינויים במורפולוגיה תא, הידבקות תא ומסלולי איתות תאיות (למשל קינאז מוקדי הדבקה, FAK) 10-12. כדוגמא, fibroblasts תרבית בתוך המערכת כמו כריך ביטוי יתר למקטע integrin α 5 לעומת 2D, כפי שנצפה לתרבויות אחרות 3D 15,16.
גורל תא תלוי מאוד בזמן שבו קולטני הגב מומרצים על ידי ואת המאפיינים של האינטראקציה הגב, באופן דומה כפי שקורה במערכות 3D אחרות כגון הידרוג'ל. לדוגמא, הידרוג'ל בי חלבונים הדוקים בדרך כלל להראות תאים קטנים ומעוגלים עם cytoskeleton אקטין מפותח ולפזר הידבקויות מוקד. זה יכול להיות חיקה במצעי תרבות באמצעות כמו כריך שלספוג חלבונים בחוזקה, כך שהתאים אינם מסוגלים לארגן מחדש את השכבה של חלבונים וsprea תא מכאנידינג מתעכבת. באופן דומה, ניתן חיקה הידרוג'ל שבו תאים יכולים לשפץ ECM עם מערכת הכריך באמצעות מצעים שלספוג חלבונים באופן רופף יותר 10.
הגירוי של הקולטנים הגב הוכח לווסת גורל תא C2C12. גב סיבי PLLA electrospun יישור תא ישיר כאשר מצופה פיברונקטין אבל לא כאשר מצופים באלבומין בסרום שור (חלבון הלא דביק). תוצאה זו מצביעה על תאים לעשות תחושה ביולוגית ולהגיב לתשומות הגב (איור 4) 9. בנוסף, תרבויות כמו כריך עם PLLA גב מטוס מופעלות עלייה ברמה של myogenesis. זה תלוי גם בגירויים ביולוגיים הגב מאז האינטראקציה עם תוצאות חלבוני גב שונים בשיעורי בידול ברורים (איור 5) 9.
תא הגירה בתוך התרבות כמו הכריך גם שינתה בהשוואה לתרבות 2D. יש להיות en הראה כי בassay ריפוי פצעים, תאים בתוך תרבות הכריך לאמץ מורפולוגיה מוארכת מאוד ולהעביר מרחקים קצרים יותר מאשר על מצעי 2D (סרטים 1 ו -2). שיעורי נדידת תאי יתר על כן קשורים לאופי של גירוי הגחון ועל גב 12.
באופן דומה כמו בתוך ג'לי פיברונקטין וקולגן 3D 17,18, תרבות כמו כריך מגדיל ארגון מחדש בתיווך תא ECM (כלומר פיברונקטין הגחון) ביחס למצב 2D (איור 6) 12. תהליך זה מסתמך על הגירויים מכאניים הגב ויציבות שלד תא שכן השימוש במעכבי התכווצות (blebbistatin, Y27632) הפריע לתהליך. מעניין לציין, פיברונקטין הגחון היה גם מחדש בעת שימוש בציפויים שונים חלבון גב (כלומר אלבומין vitronectin וסרום שור) וגם אם עזב 12 ללא ציפוי.
p-together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 1:.. סקיצה של סטנדרטי (2D) ותרבויות כמו כריך גירוי של הקולטנים הגב בתוך התרבות כמו הכריך מפעיל איתות הידבקות תא נוספת שמווסתת תהליכים תאיים חשובים אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: התרבות כמו כריך היא מערכת רב-תכליתית שמאפשרת הלימוד של פרמטרים שונים מבוקרות היטב (תשומות טופוגרפיות, נוקשות, שיפועים ...) בשני מצעי הגחון ועל גב.
> 
איור 3:. מצעים הגבי משורטטים עבור שני העליון וצפו בחתך כדי להראות שיש לי עליון מיועד וצד תחתון () סרט שטוח PLLA וelectrospun (ב) סיבים.
איור 4:. קווים מקווקווי מורפולוגיה C2C12 בתנאי תרבות שונים, כולל מטוס (p) וסיבים מיושרים (א) לPLLA ששמשו כגחון (תחתי) או גב (עילי) מצעים מייצגים סיבים אורינטציה במידת צורך. תאים בתרבית על מצע המטוס ועליהן סיבים מיושרים של PLLA (עמ 'SW) לחוש גירויי הגב. במיוחד, תאים לחוש את סיבי הגב כאשר מצופים פיברונקטין אבל לא כאשר מצופים wiאלבומין ה שור סרום (חלבון הלא דביק). כתוצאה מכך התאים לדבוק בסיבים מצופים פיברונקטין וליישר באותו הכיוון. תמונה המותאמת מהתייחסות 9. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: התמיינות תאים בתרבויות כמו כריך לאחר 4 ימים בתקשורת בידול. תנאי תרבות שונים נותחו כוללים מטוס (p) וסיבים מיושרים (א) לPLLA ששמשו כגחון (תחתי) או גב (עילי) מצעים. דוגמאות היו מצופות פיברונקטין בכל המקרים. (א) הקרינה מכתימה מראה תאי שרירן sarcomeric חיוביים (ירוק) וגרעינים תאים (אדום). (ב) הבדילנטייה תאים כפי שמחושבים על ידי פורייה מהיר Transform. (ג) כפי שנקבע על ידי Myogenesis אחוז תאי שרירן-חיובי sarcomeric. נתונים מנורמלים לשליטת הזהב סטנדרטית. הבדלים מובהקים סטטיסטי מצוינים עם *** P <0.001. תמונה המותאמת מהתייחסות 9. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: ארגון מחדש של פיברונקטין הגחון. תרבות כריך מפעילה ארגון מחדש FN הגחון על ידי יצירת סיבי פיברונקטין חדשים (תיוג כמו מברשת-; הצביע עם חצים לבנים). פיברונקטין הגחון הוא מחדש בתוך תרבויות כמו כריך עם ציפוי שונה חלבון הגבי (פיברונקטין, vitronectin ואלבומין בסרום שור)או אפילו כאשר מצע הגב נותר ללא ציפוי. cytoskeleton אקטין (ירוק), גרעינים (כחול) וFN (אדום) מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
סרט 1: תא הגירה על 2D. L929 פיברובלסטים נודדים על coverslip זכוכית פיברונקטין מצופה בריפוי פצע assay. תמונות נרכשו במשך 16 שעות (עם מסגרת נלקחה כל 20 דקות). אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.
סרט 2:. תא הגירה בתוך התרבות כמו כריך L929 פיברובלסטים הנודדים בריפוי פצע assay בתוך תרבות כמו כריך היו מצע הגחון היה coverslip זכוכית מצופה פיברונקטין ומצע גב סרט PLLA פיברונקטין מצופה. תמונות נרכשו במשך 16 שעות (עם מסגרת נלקחה כל 20 דקות). אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כיום, תרבות 3D הוא נושא חשוב לתעשיית התרופות ביוטכנולוגיות וכמו גם מחקר בביולוגיה של תא, כוללים סרטן ותאי גזע. כתוצאה מכך כמה מערכות תרבות 3D פותחו. למרבה הצער, הבדלים בין מערכות 3D בדרך כלל התוצאה של התנהגות תא שונה, מעכבת את ההבנה של גורל תא. חוץ מזה, הפרוצדורות הן בדרך כלל לא פשוטות כמו למערכות תרבות 2D. לפיכך פיתוח מערכות תרבות חדשות המבקשות להתגבר על חלק מהחסרונות אלה הוא חשוב ביותר.
התרבות כמו כריך הוכחה מאוד להשפיע על תהליכים תאיים מפתח כגון התמיינות תאים, מורפולוגיה תא, תא איתות ונדידת תאים. יתר על כן דמיון נתח תאים עם תאים בתרבית במערכות 3D, תמיכה בהצהרה שהתרבות כמו כריך קישורים 2D עם מערכות תרבות 3D. יש לי רקמות פיסיולוגיות הנקבוביות בטווח של 3-14 μמ 'שאילוץ תאים ולכן להשפיע על תהליכים תאיים כגון הגירה. זה איכשהו סכם שימוש במערכת כמו הכריך כגב וגחון גירויים מייצגים כשלעצמו סביבה מוגבלת שמגבילה מורפולוגיה תא ובהכרח משפיעה נדידת תאים ללא קשר לציפוי החלבון.
בשל הגירוי בו זמנית של גב וגחון קולטנים, תרבות כמו כריך היא טכנולוגיה חזקה כדי לחקור את התפקיד של ממדית בהתנהגות תא. יתר על כן, כפי שהוא מבוסס על מצעי 2D, מערכת זו התרבות היא תכליתית מאוד ללמוד שונה תכונות חומר ותשומות ECM מאפשרות המחקר של התנהגות תא במייקרו-סביבות שונות. חוץ מזה, את ההשפעה של הזמן שבו קולטני גב מומרצים על גורל תא יכולה להיחקר על ידי כיסה את המצע הגבי בנקודות זמן שונות. מכאן, בניגוד למערכות אחרות 3D, המערכת כמו הכריך מספקת קשת רחבהשל מבוקר היטב microenvironments הסלולרי. כתוצאה מכך המערכת כמו הכריך היא פלטפורמת תרבית תאים מעניינת לחקות סביבות פיסיולוגיות שונות כדי ללמוד ביולוגיה של תא ותא גורל מבחן בתנאי תרבות שונים.
כפי שהוזכר קודם, אחד יתרונות של מערכת זו הוא שמצעי הגחון ועל גב שונים ניתן ללמוד באמצעות ציפוי חלבון שונה. לכן, פרמטרים חשובים לגורל תא כגון צפיפות יגנד יכולים להיות מכוון על ידי שליטה על צפיפות יגנד של כל אחד ממצעי 2D משמשים (למשל מצעי הגחון ועל גב). עם זאת, שימו לב כי מצעים שונים עשויים להזדקק לשינויים בפרוטוקול. לדוגמא, שימוש במצעי גב גדולים יותר עלולה לגרום לצורך להגדיר את זמן הדגירה המתאים לקלף דגימות מצלחת פטרי. כמו כן, מצעי הגחון גדולים יותר עלולים לגרום לחוסר חמצן באזורים במרכז המדגם בגלל חדירות חמצן המוגבלת של הגחוןמצע (בשל coverslip הזכוכית). בנוסף, הליכי ניתוח יהיו תלויים בתכונות המצע. לדוגמא, שימוש במצעי גב אטומים יפריע פרוטוקולי מיקרוסקופיה סטנדרטיים למרות שזה עדיין מאפשר חלבון / חומצות גרעין חילוץ. גורם מרכזי נוסף הוא החדירות של המצע הגבי מאז צריכים להיות מותר תאים כדי לקבל הזנה מהבינונית ולהשליך פסולת.
לסיכום, תרבות כמו כריך היא מערכת פשוטה שמציעה את האפשרות לחקות microenvironments כמו 3D-שונה כדי לחקור את גורל תא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ploy(lactic acid) | NatureWorks | 4042D | Reagent |
| Cover glasses (12 mmØ) | Marienfeld | 631-0666 | Equipment |
| Chloroform | Scharlab | CL0200 | Reagent |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Sigma | 105228 | Reagent |
| Syringe (1 ml) | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | Equipment |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE1000 | Equipment |
| High Voltage DC Power Supply | Glassman High Voltage | Series FC | Equipment |
| Incubator | Hucoa-Herlös | 3111 | Equipment |
| Laminar flow hood | Telstar | AV30/70 | Equipment |
| Human Fibronectin | Sigma | F2006 | Reagent |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Inverted microscope | Leica Microsystems | DMI 6000 | Equipment |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Reagent |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7409 | Reagent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Reagent |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).
- Weiss, P. Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).
- Ruffner, H., Lichtenberg, J. 3D cell culture systems--towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero). Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).
- Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs. Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).
- Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).
- Schor, S. L., et al. A novel 'sandwich' assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay. Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).
- Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).
- Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmerón-Sánchez, M. Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate. Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology. Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).
- Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments. Nanomedicine. , (2015).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. J. Vis. Exp. , (2015).
- Glaß, M., et al. Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines. Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
- Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).
- Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
- Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis. J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).
