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Bioengineering

सैंडविच की तरह microenvironments सेल / सामग्री सहभागिता के दोहन के लिए

Published: August 4, 2015 doi: 10.3791/53090
Automatic Translation
1,2, 1,3, 2
1Center for Biomaterials and Tissue Engineering, Universitat Politècnica de València, 2Division of Biomedical Engineering, School of Engineering, University of Glasgow, 3Biomedical Research Networking Center in Bioengineering, Biomaterials and Nanomedicine (CIBER-BBN)

Abstract

सेल संस्कृति पारंपरिक रूप से कोशिकाओं biomaterial सतह के लिए उदर रिसेप्टर्स का उपयोग कर पालन जहां द्वि-आयामी (2 डी) substrates पर बाहर किया गया है। हालांकि इन विवो में, कोशिकाओं के सबसे पूरी तरह से रिसेप्टर्स की एक तीन आयामी (3 डी) के वितरण में जिसके परिणामस्वरूप, बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) से घिरे हैं। इस रास्ते संकेतन में बाहर-और इस तरह सेल व्यवहार में में मतभेद को गति प्रदान कर सकते हैं।

यह लेख पहले से ही एक नई सामग्री (एक सैंडविच की तरह संस्कृति) की एक फिल्म overlaying से एक 2 डी सब्सट्रेट का पालन कोशिकाओं के पृष्ठीय रिसेप्टर्स उत्तेजक मानक 2D संस्कृतियों के संबंध में महत्वपूर्ण परिवर्तन से चलाता है कि पता चलता है। इसके अलावा, उदर और पृष्ठीय रिसेप्टर्स की एक साथ उत्तेजना करीब 3 डी वातावरण में पाया है कि करने के लिए सेल व्यवहार परिवर्तन। इसके अतिरिक्त, के कारण प्रणाली की प्रकृति के कारण, एक सैंडविच की तरह संस्कृति सेल / सामग्री inte में विभिन्न मापदंडों के अध्ययन की अनुमति देता है कि एक बहुमुखी उपकरण हैractions, जैसे, स्थलाकृति, जकड़न और दोनों उदर और पृष्ठीय पक्ष में विभिन्न प्रोटीन कोटिंग्स। सैंडविच की तरह संस्कृतियों 2 डी substrates पर आधारित होते हैं, क्योंकि अंत में, कई विश्लेषण प्रक्रियाओं पहले से ही 3 डी सिस्टम के लिए आवश्यक और अधिक जटिल प्रक्रियाओं पर काबू पाने, आम तौर पर इस्तेमाल किया जा सकता मानक 2D संस्कृतियों के लिए विकसित की है।

Introduction

इन विवो सेलुलर microenvironments में से अधिकांश एक तीन आयामी (3 डी) प्रकृति है, हालांकि परंपरागत रूप से, सेल संस्कृति, द्वि-आयामी (2 डी) substrates पर बाहर किया गया है। इस अप्राकृतिक 2 डी वातावरण में एक फ्लैट दुनिया के लिए स्वयं अनुकूलन के एक तरीके के रूप में सेल व्यवहार में परिवर्तन, चलाता है, जो सीधे तौर पर प्रभावित सेल भाग्य 1,2। इसलिए, 2 डी सेल संस्कृतियों पर प्राप्त परिणामों हमेशा विवो में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य नहीं हैं। यह किसी भी आयाम पर निर्भर जैविक तंत्र 3,4 में आगे अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए अधिक शारीरिक-तरह की स्थिति प्रदान करने की मांग नई प्रासंगिक संस्कृति प्रणालियों के विकास के लिए प्रोत्साहित किया है।

2 डी कोशिकाओं औदरीयता पालन substrates पर है, जबकि vivo में कोशिकाओं के बहुमत पूरी तरह से ईसीएम और से घिरे रहे हैं: 2 डी संस्कृति और vivo वातावरण में 3 डी के बीच मुख्य अंतर यह है कि बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के लिए लंगर सेल रिसेप्टर्स के वितरण है इस प्रकार सीईडालूँगा आसंजन रिसेप्टर्स की एक 3 डी वितरण के माध्यम से होता है। इस जिससे इस तरह की कोशिकाओं की वृद्धि, सेल भेदभाव और जीन की अभिव्यक्ति के रूप में महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं modulating अलग सेल आसंजन संकेत दे रास्ते से चलाता है। उनके परिवर्तनशीलता और जटिलता आम सेल संस्कृति प्रक्रियाओं में उनके मानकीकरण में बाधा हालांकि पिछले दशकों के दौरान, कई अलग अलग 3 डी संस्कृति प्रणाली, 5-8 स्थापित किया गया है। इसके अलावा 3 डी सिस्टम आम तौर पर संभाल करने के लिए और 2 डी substrates पर वर्तमान प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं आसानी से 3 डी संस्कृतियों के लिए स्थापित नहीं किया जा सकता है आसान नहीं हैं। इसके अलावा, साहित्य शायद ही कभी इन मॉडलों में सेल व्यवहार की उचित समझ निरोधक समकक्ष 2D हालत या अन्य 3 डी सिस्टम के साथ 3 डी संस्कृतियों तुलना करती है।

एक बार एक 2 डी सब्सट्रेट, पृष्ठीय रिसेप्टर्स की उत्तेजना पर पालन कोशिकाओं होने - एक नई सामग्री (सैंडविच की तरह संस्कृति) की एक फिल्म overlaying द्वारा - सेल एक जैसे प्रतिक्रियाओं 3 डी वातावरण को गति प्रदान कर सकते हैं। इसकी वजहइसके पीछे पुत्र पृष्ठीय और उदर रिसेप्टर्स पालन करना और सैंडविच वातावरण में प्रसार करने के लिए (चित्रा 1) 9,10 दोनों के एक साथ सक्रियण है। एक परिणाम के रूप में, कोशिकाओं 2D संस्कृतियों 11,12 के संबंध में महत्वपूर्ण परिवर्तन से गुजरना। पृष्ठीय उत्तेजना कुंजी सेलुलर रास्ते में परिवर्तन से चलाता है के बाद से इस प्रकार, सेल भाग्य, क्योंकि सैंडविच संस्कृति की सभा के दौरान निर्धारित किया जाता है। इसलिए, सेल भाग्य अत्यधिक सैंडविच की तरह संस्कृति 11 इकट्ठा होता है जब समय से निर्धारित होता है।

कारण प्रणाली की प्रकृति के कारण, एक सैंडविच की तरह संस्कृति दोनों उदर और पृष्ठीय पक्ष में इस तरह के रसायन शास्त्र, स्थलाकृति, जकड़न और प्रोटीन कोटिंग्स के रूप में सेल / सामग्री बातचीत में विभिन्न मापदंडों के अध्ययन की अनुमति देता है कि एक सरल और बहुमुखी उपकरण है। इस कारण एक विस्तृत वी के स्वतंत्र पृष्ठीय और उदर संयोजन करने के लिए अन्य 3 डी सिस्टम (चित्रा 2) की तुलना में बहुमुखी प्रतिभा के एक उच्च डिग्री प्रदान करता हैसतह शर्तों के ariety। साथ ही, विभिन्न सेल लाइनों और सैंडविच की तरह संस्कृति को इकट्ठा करने के लिए अलग-अलग समय संभावनाओं की विस्तृत स्पेक्ट्रा बढ़ रही है, का अध्ययन किया जा सकता है।

सैंडविच की तरह संस्कृति का एक मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर नीचे विस्तृत है या तो पृष्ठीय substrates, प्रोटीन कोटिंग के रूप में उदर सब्सट्रेट और फ़ाइब्रोनेक्टिन के रूप में कांच coverslip के रूप में एसिड (PLLA) electrospun फाइबर या फिल्मों-एल लैक्टिक पाली। सैंडविच की तरह संस्कृतियों सिर्फ सेल बोने के बाद या 2D संस्कृति के 3 घंटे के बाद इकट्ठे हुए थे। हालांकि, अन्य सामग्री सिस्टम और प्रोटीन का इस्तेमाल किया जा सकता है कि ध्यान दें; इसी तरह सैंडविच की तरह संस्कृति अलग समय बिंदुओं पर इकट्ठा किया जा सकता है।

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Protocol

पृष्ठीय Substrates के 1. उत्पादन

  1. विलायक कास्टिंग द्वारा PLLA के एक फ्लैट फिल्म के उत्पादन।
    1. कमरे के तापमान पूरी तरह से (लगभग 3 घंटा) जब तक भंग (आरटी) में सरगर्मी से 2% की एक समाधान क्लोरोफॉर्म में (डब्ल्यू / वी) PLLA (100 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म में 2 जी PLLA) तैयार करने के लिए एक धूआं हुड में कार्य करें।
    2. एक गिलास पेट्री डिश वाशर पर रखें।
      नोट: (उदर नमूना व्यास से थोड़ा छोटा) 10.5 मिमी की एक भीतरी व्यास के साथ प्रयोग स्टेनलेस स्टील वाशर वॉशर उदर सब्सट्रेट के शीर्ष पर रखा गया है कि इतनी। ऐसे polytetrafluoroethylene (PTFE) या कांच वाशर के रूप में अन्य सामग्री के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है।
    3. वॉशर में PLLA समाधान के 200 μl जोड़ें और आरटी पर 30 मिनट के लिए धीरे-धीरे लुप्त हो जाना। विलायक की धीमी वाष्पीकरण की अनुमति देने के लिए, कुछ छेद के साथ एल्यूमीनियम पन्नी के साथ पेट्री डिश को बंद करें।
    4. विलायक निशान लुप्त हो जाना करने के क्रम में 5 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर नमूने हीट।
    5. नमूने कर शांत करते हैंआरटी पर WN।
    6. नमूने (30 मिनट के लगभग) नीचे ठंडा है, पेट्री डिश में · सेमी पानी 18.2 MΩ के साथ कवर और आरटी पर 8 मिनट के लिए सेते हैं।
      नोट: नमूने पूरी तरह से ठंडा नहीं कर रहे हैं, वे · अप सेमी पानी 18.2 MΩ लेने के लिए और एक रबड़ राज्य गोद ले सकते हैं। साथ ही, कम से कम 8 मिनट के लिए · सेमी पानी 18.2 MΩ में incubating अनुचित टुकड़ी में, और वॉशर से सेना की टुकड़ी में अधिक से अधिक 8 मिनट के लिए हो सकता है।
    7. एक धार के साथ, पेट्री डिश उन्हें दूर छील करने के लिए वाशर जिज्ञासा।
    8. चिमटी के साथ वॉशर के किनारे से किसी भी खामियों को दूर करने और नमूने हवा शुष्क करते हैं।
    9. PLLA हाइड्रोलिसिस से सड़ सकने है क्योंकि प्रयोग के दिन तक एक निर्वात desiccator (80 मिलीबार) में नमूनों की दुकान।
  2. Electrospinning द्वारा PLLA फाइबर के उत्पादन।
    1. Stirr द्वारा hexafluoroisopropanol में एक 8% का समाधान (डब्ल्यू / वी) PLLA (100 मिलीलीटर hexafluoroisopropanol में जी 8 PLLA) तैयार करने के लिए एक धूआं हुड में कामपूरी तरह भंग तक आरटी पर आईएनजी (3 घंटा लगभग)।
    2. क्रमशः यादृच्छिक या गठबंधन तंतुओं पाने के लिए एक एल्यूमीनियम शीट पर या electrospinning के लिए एक ड्रम पर polytetrafluoroethylene (PTFE) वाशर रखें।
      नोट: (उदर नमूना व्यास से थोड़ा छोटा) 10.5 मिमी की एक भीतरी व्यास के साथ प्रयोग polytetrafluoroethylene (PTFE) वाशर वॉशर उदर सब्सट्रेट के शीर्ष पर रखा गया है कि इतनी। ऐसे स्टेनलेस स्टील या कांच वाशर के रूप में अन्य सामग्री के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है। ड्रम गठबंधन तंतुओं को प्राप्त करने के क्रम में 160.7 सेकंड -1 (त्रिज्या = 7 सेमी) के एक कोणीय वेग में बारी बारी से करना चाहिए। एक धीमी गति फाइबर संरेखण ट्रिगर नहीं हो सकता है और एक तेज गति टूटी हुई फाइबर में परिणाम होगा।
    3. बहुलक समाधान के साथ सिरिंज लोड और सिरिंज पंप पर जगह है।
    4. 30 केवी के एक वोल्टेज और 12 सेमी की एक कलेक्टर दूरी के साथ एक 0.9 मिलीलीटर / घंटा प्रवाह की दर का उपयोग कर PLLA समाधान Electrospin।
    5. Electrospinning प्रक्रिया पिछाड़ी बंद करोएर 20-30 मिनट, (कोशिकाओं एक साथ कई तंतुओं के साथ बातचीत करने के लिए है के बाद से) एक बार एक अच्छा फाइबर घनत्व हासिल की है।
    6. विलायक निशान लुप्त हो जाना करने के क्रम में 5 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस पर नमूने हीट।
    7. PLLA हाइड्रोलिसिस से सड़ सकने है क्योंकि प्रयोग के दिन तक एक निर्वात desiccator (80 मिलीबार) में नमूनों की दुकान।

2. सैंडविच संस्कृति

  1. कोशिकाओं उदर 2 डी सब्सट्रेट करने के लिए पालन कर रहे हैं एक बार सैंडविच की तरह संस्कृति इकट्ठे।
    1. एक संस्कृति हुड में कार्य बाँझ शर्तों को सुनिश्चित करने और 30 मिनट के लिए यूवी जोखिम से सभी सामग्री (कांच coverslips, पृष्ठीय substrates, चिमटी, आदि) बाँझ।
    2. क्रम में कोट फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ उदर और पृष्ठीय सब्सट्रेट विशेष सेल प्रोटीन आसंजन निर्देशित करने के लिए। ऐसा करने के लिए है Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (DPBS) सीए युक्त 2 + और ​​2 मिलीग्राम + (200 μl / एस में भंग फ़ाइब्रोनेक्टिन 20 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में नमूने सेते1 घंटे के लिए) पर्याप्त।
      नोट: विलायक casted फिल्म और electrospun तंतुओं वॉशर के पक्षों में से एक के साथ संलग्न की वजह से होने के कारण निर्माण की प्रक्रिया करने के लिए, पृष्ठीय substrates के एक नामित ऊपर और नीचे पक्षों है। इस तरफ इसलिए कोशिकाओं (चित्रा 3) का सामना करना पड़ रहा है।
      1. प्रोटीन कोटिंग के बाद, अधिक में प्रोटीन को हटाने के क्रम में DPBS के साथ दो बार के नमूने धो लें। तो फिर इस प्रोटीन denaturalization का कारण बनता है के बाद से शुष्क हो रहा से नमूने को रोकने के क्रम में उनके उपयोग करें जब तक DPBS में नमूने सेते हैं। द्विसंयोजक फैटायनों के बाद से 2 + 2 Ca और मिलीग्राम से युक्त प्रयोग DPBS के प्रोटीन तह विनियमित।
    3. कांच पर बीज कोशिकाओं 13 coverslips।
      नोट: सैंडविच की तरह संस्कृति 2D substrates पर आधारित है, सेल बोने इसी प्रकार एक 2 डी नमूना पर के रूप में प्रदर्शन किया जाएगा। उदाहरण के लिए, C2C12 myoblast सेमी -1 भेदभाव प्रयोगों और NIH3T3 तंतुप्रसू के लिए 7,000 सेल्सियस पर वरीयता प्राप्त कर रहे 17,500 कोशिकाओं पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैंएल सेमी -1 अलग संस्कृतियों सेल आकृति विज्ञान और आसंजन का अध्ययन करने के लिए।
    4. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में नमूने प्लेस और कोशिकाओं को 3 घंटे के लिए उदर सब्सट्रेट का पालन करने की अनुमति देते हैं।
    5. (वाशर फिट है) एक 12 बहु अच्छी तरह से थाली के एक नए कुएं में उदर वरीयता प्राप्त सब्सट्रेट रखें।
      ध्यान दें: एक नए कुएं में सैंडविच की तरह संस्कृति कोडांतरण इन पोषक तत्वों की खपत और भीतर संवर्धित कोशिकाओं को प्रभावित करती है कि वृद्धि कारक है और अपशिष्ट का स्राव के बाद से अच्छी तरह से बोने के बाद के नीचे का पालन किया है कि कोशिकाओं से छुटकारा पाने के लिए एक रास्ता है सैंडविच की तरह प्रणाली। यह भी सैंडविच की तरह पर्यावरण के भीतर सुसंस्कृत केवल कोशिकाओं lyse के क्रम में सेलुलर एक्सट्रेक्शन के लिए बहुत जरूरी है।
    6. ध्यान और चिमटी की एक जोड़ी की मदद से, कोशिकाओं पर पृष्ठीय सब्सट्रेट उपरिशायी। मध्यम (1 मिलीलीटर) के साथ फिर से भरना और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      नोट: वॉशर के वजन पृष्ठीय उप रोकने जाएगाफ्लोटिंग से रणनीतियां।
    7. मानक 2D संस्कृतियों में के रूप में एक सप्ताह में दो बार मध्यम बदलें। इस सेल क्षति हो सकती थी क्योंकि पृष्ठीय सब्सट्रेट कदम नहीं है।
  2. सिर्फ सेल बोने के बाद सैंडविच की तरह संस्कृति इकट्ठे।
    1. एक संस्कृति हुड में कार्य बाँझ शर्तों को सुनिश्चित करने और 30 मिनट के लिए यूवी जोखिम से सभी सामग्री (कांच coverslips, पृष्ठीय substrates, चिमटी, आदि) बाँझ।
    2. क्रम में कोट फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ उदर और पृष्ठीय सब्सट्रेट विशेष सेल प्रोटीन आसंजन निर्देशित करने के लिए। ऐसा करने के लिए, सीए 2 + मिलीग्राम और 2 + 1 घंटे के लिए (200 μl / नमूना) युक्त DPBS में भंग फ़ाइब्रोनेक्टिन 20 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में नमूने सेते हैं।
      1. प्रोटीन कोटिंग के बाद, अधिक में प्रोटीन को हटाने के क्रम में DPBS के साथ दो बार के नमूने धो लें। तो फिर इस प्रोटीन denaturalization का कारण बनता है के बाद से शुष्क हो रहा से नमूने को रोकने के क्रम में उनके उपयोग करें जब तक DPBS में नमूने सेते हैं। सीए 2 + और ​​मिलीग्राम से युक्त प्रयोग DPBS
    3. (वाशर फिट है) एक 12 बहु अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में कांच coverslips पर बीज कोशिकाओं। ऐसा करने के लिए, पृष्ठीय सब्सट्रेट बिछाने के बाद सेल नुकसान से बचने के लिए एक अत्यधिक ध्यान केंद्रित सेलुलर निलंबन का उपयोग करें।
    4. ध्यान और चिमटी की एक जोड़ी की मदद से, कोशिकाओं पर पृष्ठीय सब्सट्रेट उपरिशायी। मध्यम (1 मिलीलीटर) के साथ फिर से भरना और 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      नोट: वॉशर के वजन फ्लोटिंग से पृष्ठीय सब्सट्रेट कर पाएगा।
    5. मानक 2D संस्कृतियों में के रूप में एक सप्ताह में दो बार मध्यम बदलें।
      नोट: इस सेल क्षति हो सकती थी क्योंकि पृष्ठीय सब्सट्रेट कदम नहीं है।

3. विश्लेषण

नोट: सैंडविच की तरह संस्कृतियों 2 डी substrates पर आधारित हैं, और इसलिए आमतौर पर पहले से ही मानक 2D संस्कृतियों के लिए विकसित की प्रक्रियाओं से विश्लेषण किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, के बाद से PLLA पारदर्शी और सेल हैरास XY विमान के भीतर ले जाने के लिए विवश कर रहे हैं, माइक्रोस्कोपी 2 डी substrates पर के रूप में किया जाता है। सेल प्रवास इसलिए प्रयोग और छवि विश्लेषण जो सरल 3 डी संस्कृतियों के लिए के रूप में जेड अक्ष में कोशिकाओं पर नज़र रखने की आवश्यकता के बिना, 2 डी संस्कृतियों के लिए के रूप में विश्लेषण किया जा सकता है। एक खरोंच परख से घाव भरने परख का अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल का पालन करें:

  1. सैंडविच की तरह संस्कृति के भीतर अध्ययन सेल माइग्रेशन (घाव भरने परख)।
    1. एक संस्कृति हुड में कार्य बाँझ शर्तों को सुनिश्चित करने और 30 मिनट के लिए यूवी जोखिम से सभी सामग्री (कांच coverslips, पृष्ठीय substrates, चिमटी, आदि) बाँझ।
    2. क्रम में कोट फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ उदर और पृष्ठीय सब्सट्रेट विशेष सेल प्रोटीन आसंजन निर्देशित करने के लिए। ऐसा करने के लिए, 1 घंटे के लिए है Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (DPBS) सीए युक्त 2 + और ​​2 मिलीग्राम + में भंग फ़ाइब्रोनेक्टिन 20 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर में नमूने सेते हैं।
      1. प्रोटीन कोटिंग के बाद, DPBS के साथ दो बार के नमूने धोनेआदेश में अतिरिक्त प्रोटीन को हटाने के लिए। तब प्रोटीन denaturalization कारण बन सकता है इस के बाद से शुष्क हो रहा से नमूने को रोकने के क्रम में उनके उपयोग करें जब तक DPBS में नमूने सेते हैं। द्विसंयोजक फैटायनों के बाद से 2 + 2 Ca और मिलीग्राम से युक्त प्रयोग DPBS के प्रोटीन तह विनियमित।
    3. एक उच्च घनत्व 13 पर कांच coverslips पर बीज कोशिकाओं।
    4. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में नमूने प्लेस और कोशिकाओं संगम प्राप्त करने के लिए अनुमति देते हैं।
    5. एक अंतराल के द्वारा अलग 2 सेल आबादी पाने के लिए सेल monolayer खरोंच करने के लिए एक विंदुक टिप का उपयोग करें।
    6. समय चूक अधिग्रहण के लिए एक नया अच्छी तरह से उपयुक्त में उदर वरीयता प्राप्त सब्सट्रेट प्लेस और पृष्ठीय substrates के (यानी 12 बहु अच्छी तरह से थाली) फिट हैं।
    7. ध्यान और चिमटी की एक जोड़ी की मदद से, कोशिकाओं पर पृष्ठीय सब्सट्रेट ओवरले और फिर (एक 12 बहु अच्छी तरह से थाली के लिए 1 एमएल) के माध्यम से फिर से भरना।
      नोट: वॉशर के वजन को रोकने जाएगा टीवह फ्लोटिंग से सब्सट्रेट पृष्ठीय।
    8. समय चूक माइक्रोस्कोप में नमूना प्लेस (37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट और 5% सीओ 2) और अंतर को बंद करने के लिए हर 20 मिनट की छवियों को ले लो।
    9. ऐसे ImageJ से प्लगइन MiToBo के रूप में विशिष्ट सॉफ्टवेयर का उपयोग कर खाई को बंद करने का विश्लेषण करें। 14

नोट: प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड निकासी 2D substrates पर के रूप में इसी तरह से किया जाता है। निष्कर्षण दक्षता बढ़ाने के लिए कोशिकाओं पर सीधे lysis बफर जोड़ने के लिए सैंडविच की तरह संस्कृति disassembling में होते हैं कि केवल एक अतिरिक्त कदम है। उदाहरण के लिए, mRNA के निकासी के लिए:

  1. सैंडविच की तरह संस्कृतियों से mRNA के निकालें
    1. निर्माता के निर्देशों के अनुसार वाणिज्यिक किट से सभी buffers तैयार करें।
    2. इनक्यूबेटर से बाहर सैंडविच की तरह संस्कृति ले लो।
    3. नमूनों से संस्कृति मीडिया निकालें।
    4. DPBS के सीए को रोकने के साथ एक बार नमूने धो लें2 + और ​​2 मिलीग्राम + (1 मिलीलीटर) और सभी समाधान निकालें।
    5. चिमटी की एक जोड़ी की मदद से, पृष्ठीय सब्सट्रेट हटाने और उदर सब्सट्रेट करने के लिए lysis बफर (350 μl) जोड़ें। यह भी पृष्ठीय सब्सट्रेट का पालन कोशिकाओं lyse के क्रम में फिर से उदर सब्सट्रेट पर पृष्ठीय सब्सट्रेट ओवरले।
    6. Lysis समाधान अलग करने के लिए पृष्ठीय सब्सट्रेट निकालें।
    7. MRNA के प्राप्त करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।

नोट: प्रोटीन की immunodetection भी 2 डी substrates पर के रूप में किया जा सकता है। सैंडविच की तरह संस्कृतियों एंटीबॉडी और buffers का सही प्रसार में बाधा सकता है के बाद से, ऊष्मायन बार वृद्धि की जानी चाहिए। इसके अलावा, सैंडविच धुंधला प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले disassembled किया जा सकता है, लेकिन इस बाद के मामले में कुछ कोशिकाओं पृष्ठीय सब्सट्रेट और उदर सब्सट्रेट करने के लिए कुछ करने के लिए संलग्न रहेगा।

  1. एक सैंडविच की तरह संस्कृति के भीतर Immunodetect प्रोटीन DPBS के साथ एक बार नमूना धो लें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए पीबीएस में 4% formaldehyde के साथ तय कर लो।
    नोट: पृष्ठीय सब्सट्रेट प्रसार की समस्याओं से बचा रहे हैं कि इतना निर्धारण की प्रक्रिया के दौरान हटाया जा सकता है।
  2. DPBS (1 मिलीलीटर) के साथ कुल्ला और फिर आरटी पर 5 मिनट के लिए DPBS में 0.5% ट्राइटन X-100 (1 मिलीलीटर) के साथ permeabilize।
  3. आरटी पर 30 मिनट के लिए DPBS में 1% एल्बुमिन (1 मिलीलीटर) के साथ गैर विशिष्ट बंधन साइटों को ब्लॉक।
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ सेते (2 माइक्रोग्राम / एमएल, 1 मिलीलीटर) आरटी पर 3 घंटे के लिए अवरुद्ध समाधान में।
  5. DPBS के साथ 10 मिनट / 0.5% बीच 20 (1 मिलीलीटर) के लिए 3 बार धोएं।
  6. आरटी पर समाधान (1 मिलीलीटर) अवरुद्ध में माध्यमिक एंटीबॉडी (2 माइक्रोग्राम / एमएल) और 1 माइक्रोग्राम / एमएल DAPI के साथ 2 घंटा सेते हैं।
  7. DPBS में 10 मिनट / 0.5% बीच 20 (1 मिलीलीटर) के लिए 3 बार धोएं।
  8. DPBS में धो लें।
    नोट: नमूने Vectashield के साथ एक स्लाइड पर मुहिम शुरू की और पृष्ठीय substrates के पूर्व immunodetection हटा रहे हैं जब नेल पॉलिश के साथ सील किया जा सकता है।
  9. प्रतिदीप्ति सूक्ष्म तहत निरीक्षण करेंमानक 2 डी substrates के लिए के रूप में गुंजाइश।

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Representative Results

सैंडविच की तरह संस्कृति के भीतर पृष्ठीय रिसेप्टर्स की उत्तेजना सेल आकृति विज्ञान, कोशिका आसंजन और intracellular संकेत दे रास्ते (जैसे फोकल आसंजन काइनेज, FAK) 10-12 में परिवर्तन हो सके। अन्य 3 डी संस्कृतियों 15,16 के लिए मनाया के रूप में एक उदाहरण के रूप में, सैंडविच की तरह व्यवस्था के भीतर सुसंस्कृत fibroblasts, 2 डी की तुलना में α 5 Integrin सबयूनिट overexpressed।

सेल भाग्य ऐसे हाइड्रोजेल के रूप में अन्य 3 डी सिस्टम में होता है इसी प्रकार, के रूप में पृष्ठीय रिसेप्टर्स प्रेरित कर रहे हैं जब समय पर और पृष्ठीय बातचीत के गुण के आधार पर अत्यधिक निर्भर है। उदाहरण के लिए, प्रोटीन कसकर आम तौर पर बाध्य कर रहे हैं, जहां हाइड्रोजेल अविकसित actin cytoskeleton के साथ छोटे और गोल कोशिकाओं को दिखाने और फोकल adhesions फैलाना। कोशिकाओं यंत्रवत् प्रोटीन और सेल sprea के इस परत पुनर्निर्माण करने में सक्षम नहीं हैं तो यह है कि यह कसकर प्रोटीन सोखना कि एक सैंडविच की तरह संस्कृति का उपयोग करने के substrates में मजाक उड़ाया जा सकता हैडिंग रुकावट है। इसी तरह, कोशिकाओं ईसीएम फिर से तैयार कर सकते हैं जहां हाइड्रोजेल प्रोटीन अधिक शिथिल 10 सोखना कि substrates के उपयोग करके सैंडविच प्रणाली के साथ मजाक उड़ाया जा सकता है।

पृष्ठीय रिसेप्टर्स की उत्तेजना C2C12 सेल भाग्य व्यवस्थित करना दिखाया गया है। फ़ाइब्रोनेक्टिन के साथ लेपित लेकिन जब गोजातीय सीरम albumin (एक गैर चिपकने वाला प्रोटीन) के साथ लेपित नहीं जब electrospun PLLA तंतुओं प्रत्यक्ष सेल संरेखण पृष्ठीय। इस परिणाम कोशिकाओं (चित्रा 4) जैविक रूप से भावना से करते हैं और पृष्ठीय आदानों पर प्रतिक्रिया बताते हैं 9। साथ ही, विमान पृष्ठीय PLLA साथ सैंडविच की तरह संस्कृतियों myogenesis के स्तर में वृद्धि शुरू हो गया। यह अलग भेदभाव दरों में अलग पृष्ठीय प्रोटीन परिणाम (चित्रा 5) 9 के साथ बातचीत के बाद पृष्ठीय जैविक उत्तेजनाओं पर भी निर्भर करता है।

2 डी संस्कृति की तुलना में जब सैंडविच की तरह संस्कृति के भीतर सेल प्रवास भी बदल दिया है। यह हो गया हैएक घाव चिकित्सा परख में पता चला है कि एन, सैंडविच संस्कृति के भीतर कोशिकाओं को एक अत्यधिक लम्बी आकृति विज्ञान अपनाने के लिए और 2 डी substrates पर की तुलना में कम दूरी में पलायन (सिनेमा 1 और 2)। सेल प्रवास दरों इसके अलावा उदर और पृष्ठीय उत्तेजना 12 की प्रकृति से संबंधित हैं।

इसी तरह 3 डी फ़ाइब्रोनेक्टिन और कोलेजन जैल के भीतर के रूप में 17,18, सैंडविच की तरह संस्कृति (चित्रा 6) 12 2 डी हालत के संबंध में सेल की मध्यस्थता ईसीएम पुनर्गठन (यानी उदर फ़ाइब्रोनेक्टिन) बढ़ जाती है। इस प्रक्रिया को सिकुड़ना अवरोधक (blebbistatin, Y27632) प्रक्रिया रुकावट के उपयोग के बाद से पृष्ठीय यांत्रिक उत्तेजनाओं cytoskeleton है और स्थिरता पर निर्भर करता है। दिलचस्प है, अलग पृष्ठीय प्रोटीन कोटिंग्स (यानी vitronectin और गोजातीय सीरम albumin) का उपयोग करते समय उदर फ़ाइब्रोनेक्टिन भी पुनर्गठित किया गया था और यहां तक कि अगर uncoated 12 छोड़ दिया है।


चित्रा 1:।। मानक (2 डी) के स्केच और सैंडविच की तरह संस्कृतियों सैंडविच की तरह संस्कृति के भीतर पृष्ठीय रिसेप्टर्स की उत्तेजना महत्वपूर्ण सेलुलर प्रक्रियाओं modulates कि अतिरिक्त कोशिका आसंजन संकेतन चलाता है यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: सैंडविच की तरह संस्कृति दोनों उदर और पृष्ठीय substrates पर विभिन्न अच्छी तरह से नियंत्रित मानकों (स्थलाकृतिक आदानों, कठोरता, ढ़ाल ...) के अध्ययन की अनुमति देता है कि एक बहुमुखी प्रणाली है।


चित्रा 3:। पृष्ठीय substrates के एक नामित ऊपर और नीचे की ओर है कि शो के क्रम में ऊपर और पार अनुभाग देखें दोनों के लिए sketched रहे हैं (ए) के फ्लैट PLLA फिल्म और (बी) electrospun फाइबर।

चित्रा 4
चित्रा 4:। जहां आवश्यक विमान (पी) और गठबंधन फाइबर (क) PLLA के उदर (सबस्क्रिप्ट) के रूप में इस्तेमाल किया गया है कि या पृष्ठीय (अभिलेख) के substrates सहित विभिन्न संस्कृति की शर्तों के तहत C2C12 आकृति विज्ञान बिंदीदार रेखा तंतुओं अभिविन्यास का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रकोष्ठों विमान सब्सट्रेट पर सुसंस्कृत और PLLA के निरपेक्ष फाइबर (दप पी क) पृष्ठीय उत्तेजनाओं भावना के साथ मढ़ा। विशेष रूप से, कोशिकाओं फ़ाइब्रोनेक्टिन के साथ लेपित लेकिन वाई लेपित नहीं जब जब पृष्ठीय तंतुओं भावनावें गोजातीय सीरम albumin (एक गैर चिपकने वाला प्रोटीन)। नतीजतन कोशिकाओं फ़ाइब्रोनेक्टिन के साथ लेपित तंतुओं का पालन करना और एक ही दिशा में संरेखित करें। संदर्भ 9 से अनुकूलित छवि। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: भेदभाव मीडिया में 4 दिनों के बाद सैंडविच की तरह संस्कृतियों में सेल भेदभाव। अलग संस्कृति शर्तों विमान (पी) और गठबंधन फाइबर (क) PLLA के उदर (सबस्क्रिप्ट) या पृष्ठीय (अभिलेख) के रूप में इस्तेमाल किया गया है कि substrates। सैम्पल सभी मामलों में फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ लेपित रहे थे सहित विश्लेषण किया गया। (ए) प्रतिदीप्ति sarcomeric मायोसिन सकारात्मक कोशिकाओं (हरा) और सेल नाभिक (लाल) दिखा धुंधला हो जाना। (बी) विभेदितफास्ट फूरियर द्वारा गणना के रूप में परिणत कोशिकाओं अभिविन्यास। (सी) Myogenesis sarcomeric मायोसिन पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत द्वारा निर्धारित की। डाटा सोने के मानक नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत है। सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद *** पी <0.001 के साथ संकेत कर रहे हैं। संदर्भ 9 से अनुकूलित छवि। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: उदर फ़ाइब्रोनेक्टिन का पुनर्गठन। सैंडविच संस्कृति नए फ़ाइब्रोनेक्टिन तंतुओं के गठन से उदर एफ एन पुनर्गठन हो सके। (ब्रश की तरह लेबलिंग, सफेद तीर के साथ बाहर की ओर इशारा) वेंट्रल फ़ाइब्रोनेक्टिन अलग पृष्ठीय प्रोटीन कोटिंग (फ़ाइब्रोनेक्टिन, vitronectin और गोजातीय सीरम albumin) के साथ सैंडविच की तरह संस्कृतियों के भीतर पुनर्गठित किया हैया पृष्ठीय सब्सट्रेट uncoated छोड़ दिया जाता है, तब भी जब। Actin cytoskeleton (हरा), नाभिक (नीला) और एफ एन (लाल) दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 1: 2 डी पर सेल प्रवास। L929 तंतुप्रसू परख चिकित्सा एक घाव में एक फ़ाइब्रोनेक्टिन लेपित गिलास coverslip पर पलायन। छवियां (हर 20 मिनट के लिए गए एक फ्रेम के साथ) 16 घंटा के लिए हासिल किया गया। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

मूवी 2:। सैंडविच की तरह संस्कृति के भीतर सेल प्रवास एक सैंडविच की तरह संस्कृति के भीतर परख चिकित्सा एक घाव में पलायन L929 तंतुप्रसू उदर सब्सट्रेट एक फ़ाइब्रोनेक्टिन लेपित गिलास coverslip और पृष्ठीय सब्सट्रेट एक फ़ाइब्रोनेक्टिन लेपित PLLA फिल्म थी थे। छवियाँ (हर 20 मिनट के लिए गए एक फ्रेम के साथ) 16 घंटा के लिए हासिल किया गया। इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

आजकल, 3 डी संस्कृति कैंसर सहित कोशिका जीव विज्ञान में एक महत्वपूर्ण दवा और जैव प्रौद्योगिकी उद्योग के लिए विषय के रूप में अच्छी तरह से अनुसंधान, और स्टेम सेल। एक परिणाम के रूप में कई 3 डी संस्कृति सिस्टम विकसित किया गया है। दुर्भाग्य से, 3 डी सिस्टम के बीच मतभेद आम तौर पर सेल भाग्य की समझ निरोधक अलग सेल व्यवहार में परिणाम। इसके अलावा, प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं आमतौर पर 2 डी संस्कृति प्रणालियों के लिए के रूप में के रूप में सरल नहीं हैं। इसलिए इन कमियों के कुछ अत्यधिक महत्वपूर्ण है पर काबू पाने के लिए की मांग नई संस्कृति प्रणाली विकसित करने।

सैंडविच की तरह संस्कृति दृढ़ता से इस तरह के सेल भेदभाव, सेल आकृति विज्ञान, कोशिका संकेतन और सेल प्रवास के रूप में प्रमुख सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है। सैंडविच की तरह संस्कृति 3 डी संस्कृति सिस्टम के साथ 2 डी लिंक उस बयान का समर्थन 3 डी सिस्टम में संवर्धित कोशिकाओं के साथ इसके अलावा कोशिकाओं शेयर समानताएँ। शारीरिक ऊतकों 3 से 14 μ की रेंज में है poresइसलिए कोशिकाओं की कमी और उस मी ऐसे प्रवास के रूप में सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित करती है। पृष्ठीय और उदर उत्तेजनाओं से प्रति सेल आकृति विज्ञान की सीमा और जरूरी परवाह किए बिना प्रोटीन कोटिंग्स के सेल प्रवास को प्रभावित करती है कि एक विवश वातावरण का प्रतिनिधित्व के रूप में यह किसी भी तरह सैंडविच की तरह इस प्रणाली का उपयोग recapitulated है।

कारण पृष्ठीय और उदर रिसेप्टर्स की एक साथ उत्तेजना के लिए, सैंडविच की तरह संस्कृति सेल व्यवहार में dimensionality की भूमिका की जांच करने के लिए एक मजबूत तकनीक है। यह 2 डी substrates पर आधारित है के रूप में इसके अलावा, इस संस्कृति प्रणाली गुण सामग्री और विभिन्न microenvironments के तहत सेल व्यवहार के अध्ययन की अनुमति ईसीएम आदानों अलग अध्ययन करने के लिए बहुत बहुमुखी है। इसके अलावा, पृष्ठीय रिसेप्टर्स सेल भाग्य पर प्रेरित कर रहे हैं, जिस पर समय का प्रभाव अलग-अलग समय बिंदुओं पर पृष्ठीय सब्सट्रेट overlaying द्वारा जांच की जा सकती है। इसलिए, अन्य 3 डी प्रणालियों के विपरीत, सैंडविच की तरह प्रणाली एक व्यापक स्पेक्ट्रम प्रदान करता हैके सेलुलर microenvironments अच्छी तरह से नियंत्रित। नतीजतन सैंडविच की तरह सिस्टम अलग संस्कृति की शर्तों के तहत कोशिका जीव विज्ञान और परीक्षण सेल भाग्य का अध्ययन करने के क्रम में विभिन्न शारीरिक वातावरण की नकल के लिए एक दिलचस्प सेल संस्कृति मंच है।

पहले उल्लेख किया है, इस प्रणाली का एक लाभ यह अलग उदर और पृष्ठीय substrates के विभिन्न प्रोटीन कोटिंग्स का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है। इसलिए, इस तरह ligand के घनत्व के रूप में सेल भाग्य के लिए महत्वपूर्ण पैरामीटर का उपयोग किया 2D substrates के हर एक (जैसे उदर और पृष्ठीय substrates के) के ligand के घनत्व को नियंत्रित करने से देखते जा सकता है। हालांकि, विभिन्न substrates प्रोटोकॉल में परिवर्तन की आवश्यकता हो सकती है कि ध्यान दें। उदाहरण के लिए, बड़ा पृष्ठीय substrates के उपयोग करते हुए पेट्री डिश बंद नमूने छील करने के लिए उचित ऊष्मायन समय निर्धारित करने की आवश्यकता हो सकती है। इसी तरह, बड़ा उदर substrates के वजह से उदर की सीमित ऑक्सीजन पारगम्यता का नमूना के केंद्र में hypoxic क्षेत्रों में हो सकता हैसब्सट्रेट (कांच coverslip के कारण)। इसके अतिरिक्त, विश्लेषण प्रक्रियाओं सब्सट्रेट गुणों पर निर्भर करेगा। यह अभी भी प्रोटीन / न्यूक्लिक एसिड निकासी की अनुमति होगी, हालांकि उदाहरण के लिए, अपारदर्शी पृष्ठीय substrates के का उपयोग कर मानक माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल में बाधा है। कोशिकाओं को मध्यम से पोषक तत्वों को पाने के लिए और अपशिष्ट त्यागने के लिए अनुमति दी जानी चाहिए, क्योंकि एक और महत्वपूर्ण कारक पृष्ठीय सब्सट्रेट की पारगम्यता है।

योग करने के लिए, एक सैंडविच की तरह संस्कृति सेल भाग्य की जांच के लिए अलग 3 डी की तरह microenvironments की नकल करने की संभावना प्रदान करता है कि एक सरल प्रणाली है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ploy(lactic acid) NatureWorks 4042D Reagent
Cover glasses (12 mmØ) Marienfeld 631-0666 Equipment
Chloroform Scharlab CL0200 Reagent
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) Sigma 105228 Reagent
Syringe (1 ml) Henke Sass Wolf 4010-200V0 Equipment
Syringe pump New Era Pump Systems NE1000 Equipment
High Voltage DC Power Supply Glassman High Voltage Series FC Equipment
Incubator Hucoa-Herlös 3111 Equipment
Laminar flow  hood Telstar AV30/70 Equipment
Human Fibronectin Sigma F2006 Reagent
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 Reagent
Inverted microscope Leica Microsystems DMI 6000 Equipment
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Reagent
Albumin Sigma-Aldrich A7409 Reagent
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287 Reagent

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References

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बायोइन्जिनियरिंग अंक 102 सैंडविच संस्कृति 3 डी संस्कृति सेल संस्कृति शारीरिक सेलुलर पर्यावरण जैव अभियांत्रिकी
सैंडविच की तरह microenvironments सेल / सामग्री सहभागिता के दोहन के लिए
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Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions. J. Vis. Exp. (102), e53090, doi:10.3791/53090 (2015).

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