Abstract
세포 배양은 전통적 세포가 생체 복부 표면 수용체를 사용하여 부착 BI 차원 (2D)의 기판상에서 수행되었다. 그러나, 생체 내에서, 대부분의 셀이 완전히 수용체의 3 차원 분포의 결과로, 세포 외 기질 (ECM)에 의해 둘러싸여있다. 이 신호 전달 경로에 외부-따라서 세포 행동의 차이를 유발 할 수 있습니다.
이 문서에서는 이미 새로운 물질 (샌드위치 같은 문화)의 필름을 중첩하여 2D 기판에 부착 된 세포의 지느러미 수용체를 자극하는 표준 2D 문화에 대한 중요한 변경 사항을 트리거 보여줍니다. 또한, 복부와 지느러미 수용체의 동시 여기 가까이 3D 환경에서 발견에 셀 동작을 이동합니다. 또한 인해 시스템의 특성상, 샌드위치 형상 배양 세포 / 재료 INTE 상이한 파라미터들의 연구를 허용 다용도 공구이다ractions, 예를 들어, 지형, 강성과 모두 복부와 등의 측면에서 다른 단백질 코팅. 샌드위치 형 배양액 2D 기판에 기초하기 때문에 최종적으로, 여러 분석 절차는 이미 3D 시스템에 필요한 더 복잡한 절차를 극복 정상적으로 사용할 수있는 표준 2D 배양을 위해 개발.
Introduction
생체 세포의 미세 환경의 대부분은 3 차원 (3D) 성질을 가지고 있지만 전통적으로, 세포 배양 물은 바이 - 차원 (2D)의 기판상에서 수행되었다. 이 부 자연스러운 2D 환경은 평평한 세계에 스스로 적응하는 방법으로 세포의 행동 변화를 유발하는 직접적인 영향을 세포 운명 1,2. 따라서, 2 차원 세포 배양에서 얻어진 결과는 항상 생체 내에서 재현 할 수 없습니다. 이것은 모든 사이즈 의존성 생물학적기구 3,4-으로 더 통찰력을 얻기 위해 더 많은 생리 같은 조건을 제공하고자하는 새로운 비즈니스 배양 시스템의 개발을 장려하고있다.
2D는 세포 복부 부착 기판 상에 반해 생체 내에서 세포의 대부분이 완전히 ECM에 의해 둘러싸여있다 : 2 차원 배양 및 생체 환경에서 3D 간의 주된 차이점들 중 하나는 세포 외 기질 (ECM)에 고정 세포 수용체의 분포 따라서 CELL 밀착성이 수용체의 3 차원 분포를 통해 발생한다. 이것에 의해 이러한 세포 성장, 세포 분화 및 유전자 발현에 중요한 프로세스를 변조 다른 세포 접착 신호 전달 경로를 트리거한다. 그들의 변동 및 복잡성이 일반적인 세포 배양 과정에서의 표준화를 방해하지만 지난 수십 년 동안, 다양한 3 차원 배양 시스템은 5-8 확립되었다. 또한 3D 시스템은 일반적으로 처리 할 수 및 2D 기판에 현재의 실험 절차는 쉽게 3D 문화 확립 할 수 없습니다 쉽지 않다. 또한, 문헌은 거의 이러한 모델에서 세포 행동의 적절한 이해를 방해하고, 동등한 조건 2D 또는 3D 다른 시스템과 3 차원 배양을 비교하지 않는다.
일단 2D 기판 등의 수용체의 자극에 부착 된 세포를 가진 - 신소재 (샌드위치 같은 문화)의 필름을 중첩하여 - 셀 모두 응답 3D 환경을 트리거 할 수 있습니다. REA이 뒤에 아들은 지느러미와 복부 수용체 준수와 샌드위치 환경 내에서 확산 (그림 1) 9, 10 두의 동시 활성화입니다. 결과적으로, 세포는 배양 11,12 2D에 대해서 중요한 변화를 겪는다. 등의 자극이 키 세포 경로의 변화를 유발하기 때문에 따라서, 세포의 운명은, 때문에 샌드위치 문화의 조립시 결정됩니다. 따라서, 세포의 운명은 고도로 샌드위치 형 배양 11 조립 시간에 의해 결정된다.
인해 시스템의 특성상, 샌드위치 형상 배양 모두 복부 및 등쪽 측면에 같은 화학, 지형, 강성 및 단백질 코팅 같은 셀 / 재료 상호 상이한 파라미터들의 연구를 허용 간단하고 다양한 도구이다. 이는 넓은 V의 독립적 지느러미와 복부 조합에 다른 3D 시스템 (그림 2)에 비해 다양한 기능의 높은 수준을 제공합니다표면 상태의 ariety. 부가 적으로, 다른 세포주 및 배양 샌드위치 형 조립 상이한 시간은 가능성의 넓은 스펙트럼을 증가 연구 될 수있다.
샌드위치 같은 문화의 표준 프로토콜을 사용하여 아래에 자세히 설명되어 하나 등의 기판, 단백질 코팅으로 복부 기판과 피브로넥틴 등의 유리 커버 슬립과 같은 산 (PLLA) 전기 방사 섬유 또는 필름-L-유산 폴리. 샌드위치 같은 문화는 세포 파종 후 또는 2D 문화의 3 시간 후 조립했다. 그러나, 다른 재료 시스템 및 단백질이 사용될 수 있음에 유의 마찬가지로 샌드위치 형상의 배양은 상이한 시점에서 조립 될 수있다.
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Protocol
지느러미 기판 1. 생산
- 용매 캐스팅에 의해 PLLA의 평면 필름의 생산.
- 실온 완전히 (약 3 시간)에 용해 될 때까지 (RT)에서 교반하여 2 % 용액을 클로로포름 (w / v)의 PLLA (100 ㎖의 클로로포름에 2g의 PLLA)을 제조 흄 후드에서 작업.
- 유리 페트리 접시에 와셔를 놓습니다.
주 : (복부 샘플 직경보다 약간 작다) 10.5 mm의 내경 사용 스테인레스 와셔 와셔 복부 기판 위에 배치되도록. 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 또는 유리 와셔와 같은 다른 재료도 사용될 수있다. - 세탁기에서 PLLA 용액 200 μl를 추가하고 실온에서 30 분 동안 천천히 증발 할 수 있습니다. 용매의 느린 증발을 허용하기 위해, 몇 개의 구멍을 알루미늄 호일로 페트리 접시를 닫는다.
- 용매를 증발 추적하기 위하여 5 분 동안 120 ℃에서 샘플을 가열한다.
- 샘플 할 식지실온에서 WN.
- 샘플 (30 분 정도) 냉각 한 후, 페트리 접시 · CM 물 18.2 MΩ 커버하고 실온에서 8 분 동안 품어.
참고 : 샘플이 완전히 냉각되지 않으면, 그들이 · 최대 CM 물을 18.2 MΩ을 가지고 고무 상태를 채택 할 수있다. 또한,보다 8 분 · CM 물 18.2 MΩ에서 배양하는 것은 부적절한 분리, 그리고 세탁기에서 분리 이상 8 분 동안 발생할 수 있습니다. - 면도날로, 페트리 접시를 벗겨 와셔를 들어 올립니다.
- 핀셋 세탁기의 가장자리에서 모든 결함을 제거하고 샘플을 자연 건조 할 수 있습니다.
- PLLA는 가수 분해에 의해 분해 가능하므로 실험 일까지 진공 데시 케이 터 (80 밀리바)에서 샘플을 보관.
- 전기 방사에 의한 PLLA 섬유의 제조.
- stirr하여 헥사 플루오로 이소프로판올 용액의 8 % (w / v)의 PLLA (100 ㎖의 헥사 플루오로 이소프로판올 8g의 PLLA)을 제조 흄 후드에서 작동완전히 용해 될 때까지 실온에서 보내고 (3 시간 정도).
- 각각 랜덤 또는 정렬 된 섬유를 얻기 위해서 알루미늄 판 또는 전기 방사를위한 드럼 상에 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 와셔를 놓는다.
주 : (복부 샘플 직경보다 약간 작다) 10.5 mm의 내경 사용 폴리 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 와셔 와셔 복부 기판 위에 배치되도록. 스테인리스 강이나 유리 와셔와 같은 다른 재료도 사용될 수있다. 드럼 정렬 된 섬유를 얻기 위해서는 160.7 초 -1 (반경 = 7cm)의 각속도로 회전한다. 느린 속도는 섬유 정렬을 유발하지 않을 수 있습니다 및 빠른 속도를 절단 섬유 발생합니다. - 고분자 용액을 주사기를로드하고 주사기 펌프에 놓습니다.
- 30 kV의 전압의 12 cm의 컬렉터 거리 0.9 ㎖ / 시간의 유속을 사용 PLLA 용액 Electrospin.
- 전기 방사 공정 후방 정지ER 20-30 분, (셀이 동시에 여러 섬유와 상호 작용이 있기 때문에) 회 좋은 섬유 밀도가 달성된다.
- 용매를 증발 추적하기 위하여 5 분 동안 120 ℃에서 샘플을 가열한다.
- PLLA는 가수 분해에 의해 분해 가능하므로 실험 일까지 진공 데시 케이 터 (80 밀리바)에서 샘플을 보관.
2. 샌드위치 문화
- 세포가 복부 2D 기판에 부착되면 샌드위치와 같은 문화를 조립합니다.
- 문화 후드에서 작업은 무균 조건을 보장하고 30 분 동안 자외선 노출에 의해 모든 자료 (커버 글라스, 등의 기판, 핀셋 등)을 살균합니다.
- 순서 코트 피브로넥틴과 복부와 지느러미 기판은 특정 세포 단백질 접착을 지시합니다. 이렇게하려면, 둘 베코의 인산염 완충 식염수 (DPBS) 칼슘을 포함하는 2 + Mg를 2 + (200 μL / S에 용해 피브로넥틴의 20 μg의 / ㎖에서 샘플을 품어1 시간 동안) 충분한.
주 : 용매 캐스트 필름과 전기 방사 섬유가 세탁기의 측면 중 하나에 부착하므로 인해 제조 공정에, 등쪽 기판 지정된 상부 및 하부면을 갖는다. 이 측면 따라서 세포 (그림 3)에 직면 하나입니다.- 단백질을 코팅 한 후, 과잉의 단백질을 제거하기 위해 DPBS 두 번 샘플을 세척한다. 그런 다음이 단백질 변성의 원인부터 건조되기에서 샘플을 방지하기 위해 자신의 사용까지 DPBS에서 샘플을 품어. 가의 양이온 이후 2 + 칼슘과 마그네슘이 포함 된 사용 DPBS는 단백질 접힘을 조절한다.
- 유리에 종자 세포는 13 된 커버.
참고 : 샌드위치 같은 문화가 2D 기판을 기반으로, 휴대 시드 유사하게 2D 샘플로 수행됩니다. 예를 들어,의 C2C12 근육 모세포가 분화 cm -1 실험 및 NIH3T3 섬유 아세포에 대한 7,000 C에서 시딩 17,500 세포로 시딩ELL 학생 센티미터 -1 고립 된 문화가 세포 형태 및 접착 성을 연구하기 위해. - 5 % CO 2, 37 ℃ 인큐베이터에서 샘플을 배치 및 셀 3 시간 동안 복부 기판에 부착 할 수있다.
- (와셔 맞는 경우) 12 멀티 웰 플레이트의 새로운 우물에 복부 시드 기판을 놓습니다.
참고 : 새로운 잘 샌드위치와 같은 문화를 조립하는 것은 이러한 영양소를 소비하고 내에서 배양 된 세포에 영향을 미치는 성장 인자 및 폐기물을 분비하기 때문에 잘 파종 후 하단에 부착 한 세포를 제거하는 방법 중 하나입니다 샌드위치 같은 시스템. 이것은 또한 샌드위치 형 환경 내에서만 배양 세포를 용균시키기 위하여 세포 추출을위한 필요한 것이다. - 조심스럽게 및 핀셋의 도움으로, 세포 등의 기판을 오버레이. 매체 (1 ml)로 리필 5 % CO 2와 37 ° C에서 품어.
참고 : 세탁기의 무게는 등의 서브를 방지 할 수 있습니다부동에서 strate. - 표준 2 차원 문화로 일주일에 두 번 매체를 변경합니다. 이 세포가 손상 될 수 있기 때문에 등의 기판을 이동하지 마십시오.
- 단지 세포 파종 후 샌드위치와 같은 문화를 조립합니다.
- 문화 후드에서 작업은 무균 조건을 보장하고 30 분 동안 자외선 노출에 의해 모든 자료 (커버 글라스, 등의 기판, 핀셋 등)을 살균합니다.
- 순서 코트 피브로넥틴과 복부와 지느러미 기판은 특정 세포 단백질 접착을 지시합니다. 이렇게하려면, 칼슘 및 마그네슘 2 + 1 시간 동안 (200 μL / 샘플)를 포함 DPBS에 용해 피브로넥틴의 20 μg의 / ㎖에서 샘플을 품어.
- 단백질을 코팅 한 후, 과잉의 단백질을 제거하기 위해 DPBS 두 번 샘플을 세척한다. 그런 다음이 단백질 변성의 원인부터 건조되기에서 샘플을 방지하기 위해 자신의 사용까지 DPBS에서 샘플을 품어. 칼슘과 마그네슘이 포함 된 사용 DPBS
- 단백질을 코팅 한 후, 과잉의 단백질을 제거하기 위해 DPBS 두 번 샘플을 세척한다. 그런 다음이 단백질 변성의 원인부터 건조되기에서 샘플을 방지하기 위해 자신의 사용까지 DPBS에서 샘플을 품어. 칼슘과 마그네슘이 포함 된 사용 DPBS
- (와셔에 맞게) 12 멀티 웰 플레이트의 잘 커버 글라스에 씨앗 세포. 이를 위해, 등쪽 기판 누워 후 세포의 손실을 방지하기 위해 고농도의 세포 현탁액을 사용한다.
- 조심스럽게 및 핀셋의 도움으로, 세포 등의 기판을 오버레이. 매체 (1 ml)로 리필 5 % CO 2와 37 ° C에서 품어.
참고 : 세탁기의 무게는 부동에서 지느러미 기판을 방지 할 수 있습니다. - 표준 2 차원 문화로 일주일에 두 번 매체를 변경합니다.
참고 :이 세포 손상을 초래할 수 있기 때문에 등의 기판을 이동하지 마십시오.
3. 분석
주 : 샌드위치 형 2D 배양 기질에 기초하고 있으며, 그래서 일반적으로 이미 표준 2D 배양을 위해 개발 과정에 의해 분석 될 수있다. 예를 들어, 이후 PLLA는 투명하고 CEL입니다LS가 xy 평면 내에서 이동 제한됩니다, 현미경은 2D 기판에로 이루어집니다. 세포 이동 따라서 실험 및 이미지 분석을 단순화 3D 배양 용으로서 Z 축에서 트래킹 셀의 필요없이, 2 차원 배양 용으로 분석 될 수있다. 스크래치 분석에 의해 상처 치유 분석을 연구하려면이 프로토콜을 따르
- 샌드위치 같은 문화 내에서 연구 세포 이동 (상처 치유 분석).
- 문화 후드에서 작업은 무균 조건을 보장하고 30 분 동안 자외선 노출에 의해 모든 자료 (커버 글라스, 등의 기판, 핀셋 등)을 살균합니다.
- 순서 코트 피브로넥틴과 복부와 지느러미 기판은 특정 세포 단백질 접착을 지시합니다. 이렇게하려면 1 시간 동안 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS) 칼슘을 포함하는 2 + Mg를 2 +에 용해 피브로넥틴의 20 μg의 / ㎖에서 샘플을 품어.
- 단백질 코팅 후 DPBS 두 번 샘플을 씻어순서를 초과하는 단백질을 제거합니다. 이어서 단백질 변성을 일으킬 수이 때문에 건조 샘플을 얻는 것을 방지하기 위해, 이들의 사용까지 DPBS에서 샘플을 배양. 가의 양이온 이후 2 + 칼슘과 마그네슘이 포함 된 사용 DPBS는 단백질 접힘을 조절한다.
- 고밀도 (13)에 커버 글라스에 종자 세포.
- 5 % CO 2, 37 ℃ 인큐베이터에서 샘플을 배치 및 세포가 합류를 달성 할 수있다.
- 간격으로 구분이 세포 인구를 얻기 위해 세포 단일 층을 긁어 피펫 팁을 사용합니다.
- 시간 경과 수집을위한 새로운 잘 적합한에서 복부 시드 기판을 놓고 등의 기판 (즉, 12 멀티 웰 플레이트)을 맞게한다.
- 조심스럽게 및 핀셋의 도움으로, 세포 등의 기판을 오버레이하고 (12 멀티 웰 플레이트 1 ㎖) 매체 리필.
주 : 세탁기의 중량을 방지 할 t그는 부동에서 기판을 지느러미. - 시간 경과 현미경에서 샘플을 배치 (37 ° C로 설정하고, 5 % CO 2)와 갭 폐쇄 매 20 분의 이미지를 가져 가라.
- 같은 ImageJ에에서 플러그인 MiToBo로 특정 소프트웨어를 사용하여 갭 폐쇄를 분석한다. (14)
주 : 단백질 및 핵산 추출은 기판 상에 2 차원으로 유사하게 수행된다. 추출 효율을 증가시키기 위해 세포에 직접 용해 완충액을 추가 샌드위치 형 배양 분해로 이루어져 하나의 추가 단계가있다. 예를 들어, mRNA의 추출 :
- 샌드위치 같은 문화에서의 mRNA를 추출
- 제조업체의 지시에 따라 상업용 키트에서 모든 버퍼를 준비한다.
- 인큐베이터에서 밖으로 샌드위치와 같은 문화를 가지고.
- 샘플에서 배양 배지를 제거합니다.
- DPBS이 칼슘을 함유 한 번 샘플을 씻으십시오Mg를 2+ 2+ (1 mL) 및 모든 용액을 제거한다.
- 핀셋의 도움으로, 등의 기판을 제거하고 복부 기판에 용해 버퍼 (350 μL)를 추가합니다. 또한 지느러미 기판에 부착 세포를 용균시키기 위해 다시 복부 기판 지느러미 기판 오버레이.
- 분해 용액을 분리하는 등의 기판을 제거합니다.
- 의 mRNA를 얻기 위해 제조업체의 지침을 따르십시오.
참고 : 단백질의 면역 적 또한 2D 기판에로 수행 할 수 있습니다. 샌드위치 같은 문화가 항체와 버퍼의 올바른 확산을 방해 할 수 있기 때문에, 배양 시간이 증가한다. 또한, 샌드위치 염색 프로토콜을 시작하기 전에 분해 될 수 있지만, 후자의 경우 일부 셀은 등쪽 기판 및 기판에 대한 일부 복부에 부착 된 상태를 유지한다.
- 샌드위치 같은 문화 내에서 Immunodetect 단백질
주 : 도설 기판 확산 문제를 회피되도록 정착 과정에서 제거 될 수있다. - DPBS (1 ml)으로 헹군 후, RT에서 5 분 동안 0.5 % DPBS에서 트리톤 X-100 (1 ml)로 Permeabilize 하시려면.
- RT에서 30 분 동안 1 % DPBS 알부민 (1 mL)로 비특이적 결합 부위를 차단.
- 일차 항체와 함께 품어 (2 μg의 / ㎖ 1 ml)을 실온에서 3 시간 동안 솔루션을 차단한다.
- DPBS 10 분 / 0.5 % 트윈 20 (1 ㎖)에 대해 3 회 반복한다.
- 실온에서 용액 (1 ml)에 차단하는 이차 항체 (2 μg의 / ㎖) 및 1 μg의 / ㎖ DAPI와 2 시간을 품어.
- DPBS에서 10 분 / 0.5 % 트윈 20 (1 ㎖)에 대해 3 회 반복한다.
- DPBS에 씻으십시오.
참고 : 시료는 Vectashield와 슬라이드에 장착 등의 기판 전에 면역을 제거 할 때 매니큐어로 밀봉 할 수있다. - 형광 마이크로 하에서 관찰표준 2D 기판 용으로 범위.
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Representative Results
샌드위치 형 배양 내 등쪽 수용체의 자극은 세포 형태학, 세포 부착 및 세포 내 신호 전달 경로 (예, 국소 유착 키나제, FAK) 10-12의 변화를 트리거한다. 다른 3D 배양 15,16 관찰로서 예를 들어, 샌드위치 형 시스템 내에서의 배양 섬유 아세포는 2D에 비해 5 인테그린 α 서브 유닛을 과발현.
셀 운명은 하이드로 겔과 같은 다른 3D 시스템에서 발생하는 유사으로, 지느러미 수용체 자극 시간과 지느러미 상호 작용의 특성에 의해 크게 좌우됩니다. 예를 들어, 단백질 단단히 일반적으로 바인딩 된 하이드로 겔은 미개발 액틴 세포 골격과 작고 둥근 세포를 표시하고 초점 유착을 확산. 세포가 기계적으로 단백질과 세포 sprea의이 층을 재구성 할 수 없습니다 그래서 이것은 단단히 단백질을 흡착 샌드위치와 같은 문화를 사용하여 기판에 모방 할 수 있습니다딩이 방해된다. 유사하게, 세포는 ECM을 개조 할 수 하이드로 겔은 단백질을보다 느슨하게 10을 흡착하여 기판을 샌드위치 시스템을 모방 할 수있다.
등쪽 수용체의 자극은 C2C12 세포의 운명을 조절하는 것으로 나타났다. 피브로넥틴으로 피복하지만 소 혈청 알부민 (비 접착 단백질)로 피복하지 않을 때 전기 방사 PLLA 섬유를 직접 세포 정렬을 이룬다. 이 결과는 세포 (그림 4) 생물학적 감각을하고 등의 입력에 반응 지적 9. 또한, 평면 지느러미 PLLA와 샌드위치 같은 문화는 근육 생성의 수준의 증가를 유발. 이것은 별개의 분화 속도가 다른 등의 단백질 결과 (그림 5) (9)과의 상호 작용 때문에 등의 생물학적 자극에도 달려있다.
2 차원 배양에 비해 샌드위치 형 내 배양 세포 이동도 변경된다. 그것은 할 수있다상처 치유 검정에서 그 도시를 도중에, 샌드위치 내 배양 세포는 매우 가늘고 긴 형태를 채택 2D 기판상의보다 짧은 거리를 이동 (동영상 1, 2). 세포의 이동 속도는 또한 복부와 등쪽 자극 (12)의 특성과 관련되어있다.
마찬가지로 3 차원 피브로넥틴 콜라겐 젤 내로 17, 18는, 샌드위치와 같은 문화는 (그림 6) 12 2D 조건에 대한 세포 매개 ECM 재구성 (즉 복부 피브로넥틴)를 증가시킨다. 이 과정은 수축 억제제 (blebbistatin, Y27632) 과정을 방해의 사용 이후 등의 기계적인 자극과 세포 골격 안정성에 의존합니다. 흥미롭게도, 다른 등의 단백질 코팅 (즉 비트로 넥틴과 소 혈청 알부민)를 사용할 때 복부 피브로넥틴도 개편, 심지어 경우는 코팅 (12)을 떠났습니다.
그림 1 :.. 표준 (2D)의 스케치와 샌드위치 같은 문화 샌드위치와 같은 문화 내에서 지느러미 수용체의 자극은 중요한 세포 과정을 조절 추가 세포 부착 신호를 트리거 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 샌드위치 같은 문화가 모두 복부와 등의 기판에 다른 잘 조절 된 매개 변수 (지형 입력, 강성, 그라디언트 ...)의 연구를 수있는 다목적 시스템입니다.
도 3 :. 도설 기판 지정된 상부 및 하부 측면을 보여주기 위해 상부 및 단면도 모두 스케치된다 (A) 플랫 PLLA 필름 및 (B) 전기 방사 섬유.
그림 4 :. 필요한 경우 평면 (P) 및 정렬 된 섬유 (A) PLLA의 복부 (첨자)로 사용 된 또는 지느러미 (첨자) 기판 등 다양한 문화 조건에서 C2C12 형태 점선은 섬유에게 방향을 나타냅니다. 셀 평면 기판 상에 배양 및 PLLA의 정렬 된 섬유 (SW P는) 등의 자극을 감지으로 입혔다. 특히, 세포를 피브로넥틴으로 코팅하지만 위스콘신을 코팅하지 않을 경우 등의 섬유를 감지번째의 소 혈청 알부민 (비 접착 단백질). 따라서 세포 피브로넥틴으로 피복 섬유에 부착되어 동일한 방향으로 정렬. 참조 9에서 적응 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 차별화 미디어 4 일 후 샌드위치와 같은 문화에서 세포 분화. 다른 배양 조건은 평면 (p)과 정렬 된 섬유 (a)의 복부 PLLA (첨자) 또는 지느러미 (첨자)으로 사용 된 기판. 샘플이 모든 경우에 피브로넥틴으로 코팅 하였다 포함한 분석 하였다. (A) 형광 sarcomeric 미오신 양성 세포 (녹색)과 세포 핵 (빨간색)를 보여주는 염색. (B) 차별화고속 푸리에 변환에 의해 계산이 변형 세포의 방향입니다. (C)은 근육 생성 sarcomeric 미오신 양성 세포의 백분율에 의해 측정. 데이터는 금 표준 제어로 정규화이다. 통계적으로 유의 한 차이는 *** P <0.001로 표시됩니다. 참조 9에서 적응 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 복부 피브로넥틴의 개편. 샌드위치 문화는 새로운 피브로넥틴 원 섬유 형성하여 복부 FN 재구성을 트리거합니다. (브러시 등의 라벨을, 흰색 화살표로 지적) 복부 피브로넥틴이 다른 등의 단백질 코팅 (피브로넥틴, 비트로 넥틴과 소 혈청 알부민)와 샌드위치 같은 문화 내에서 재구성또는 지느러미 기판을 코팅 남아있는 경우에도. 액틴 세포 골격 (녹색), 핵 (파란색)과 FN (빨간색) 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 1 : 2D에 세포 이동. L929은 섬유 아세포 분석을 치유 상처에 피브로넥틴 코팅 유리 커버 슬립에 이주. 이미지 (매 20 분 촬영 프레임) 16 시간 동안 획득했다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.
영화 2 :. 샌드위치 같은 문화 내에서 세포의 이동 샌드위치 같은 문화 내에서 분석을 치유 상처에 마이그레이션 L929 섬유 아세포는 복부 기판은 피브로넥틴 코팅 유리 커버 슬립과 지느러미 기판 피브로넥틴 코팅 PLLA 필름이었다이었다. 이미지는 (매 20 분 촬영 프레임) 16 시간 동안 취득한. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
요즘, 3D 문화는 암을 포함한 세포 생물학에서 중요한 제약 및 생명 공학 산업을위한 주제뿐만 아니라 연구이고, 줄기 세포. 결과적으로 여러 3 차원 배양 시스템이 개발되어왔다. 불행히도, 3D 시스템 간의 차이는 일반적으로 세포의 운명 이해를 방해하는 다른 셀 동작이 발생할. 또한, 실험 절차는 일반적으로 2D 문화 시스템처럼 간단하지 않다. 따라서, 이들 단점 중 일부는 매우 중요하다 극복하고자하는 새로운 배양 시스템을 개발.
샌드위치 형 배양 강하게 세포 분화, 세포 형태학, 세포 신호 및 세포 이동과 같은 주요 세포 과정에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다. 샌드위치 같은 문화가 3D 문화 시스템과 2D를 연결하는 문을 지원하는 3D 시스템에서 배양 된 세포와 세포 또한 공유 유사성. 생리 조직 3-14 μ의 범위에있는 기공따라서 세포를 제약 조건 및 m은 마이그레이션과 같은 세포 과정에 영향을 미친다. 지느러미와 복부 자극이 자체 세포 형태를 제한하고 반드시 관계없이 단백질 코팅의 세포 이동에 영향을 미칠 것이다 제약 환경 대표로 이는 어떻게 든 샌드위치와 같은 시스템을 사용하여 효과적으로 요약된다.
인해 지느러미와 복부 수용체의 동시 자극, 샌드위치 형상 배양 세포 행동의 차원의 역할을 조사하기 위해 강력한 기술이다. 이 2D 기판을 기반으로 또한,이 문화 시스템은 재료의 특성과 다른 미세 환경에서 세포 행동의 연구를 허용 ECM 입력 다른 공부를 매우 다양한입니다. 게다가, 등쪽 수용체가 세포의 운명에 자극하는 시간의 영향은 서로 다른 시점에서 등쪽 기판을 중첩하여 조사 할 수있다. 따라서, 다른 3D 시스템과 달리, 샌드위치와 같은 시스템은 다양한 스펙트럼을 제공합니다의 세포 미세 환경을 잘 조절. 따라서 샌드위치 형 시스템은 상이한 배양 조건 하에서 세포 생물학 및 테스트 셀 거동을 연구하기 위해 다양한 생리 학적 환경을 모방 흥미로운 세포 배양 플랫폼이다.
전술 한 바와 같이,이 시스템의 한 가지 장점은 상이한 복부와 등쪽 기판 상이한 단백질 코팅을 이용하여 연구 될 수 있다는 것이다. 따라서, 이러한 리간드 밀도는 세포의 운명에 대한 중요한 매개 변수는 사용 된 2 차원 기판의 각 (예를 들어 복부와 등쪽 기판)의 리간드 밀도를 제어함으로써 조정될 수있다. 그러나, 다른 기판 프로토콜의 변경이 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 더 큰 지느러미 기판을 사용하여 배양 접시 오프 샘플을 박리 적절한 배양 시간을 설정해야 할 필요성이 발생할 수있다. 마찬가지로, 더 큰 기판 복부 때문에 복부의 제한된 산소 투과 샘플의 중심에서 저산소 영역을 초래할 수기판 (유리 커버 슬립으로 인해). 또한, 분석 절차는 상기 기판 특성에 의존 할 것이다. 여전히 단백질 / 핵산 추출을 허용하지만 예를 들어, 불투명 등쪽 기판을 사용하는 표준 프로토콜 현미경을 방해 할 것이다. 세포 매체로부터 영양분을 얻을 폐기물을 폐기 할 수 있어야하기 때문에 또 다른 주요 요인은 지느러미 기판의 투자율이다.
요약하면, 샌드위치 형상 배양 세포의 운명을 조사하기 위해 다른 3 차원 형상의 미세 환경을 모방 할 수있는 가능성을 제공 단순한 시스템이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ploy(lactic acid) | NatureWorks | 4042D | Reagent |
| Cover glasses (12 mmØ) | Marienfeld | 631-0666 | Equipment |
| Chloroform | Scharlab | CL0200 | Reagent |
| 1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) | Sigma | 105228 | Reagent |
| Syringe (1 ml) | Henke Sass Wolf | 4010-200V0 | Equipment |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE1000 | Equipment |
| High Voltage DC Power Supply | Glassman High Voltage | Series FC | Equipment |
| Incubator | Hucoa-Herlös | 3111 | Equipment |
| Laminar flow hood | Telstar | AV30/70 | Equipment |
| Human Fibronectin | Sigma | F2006 | Reagent |
| RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Reagent |
| Inverted microscope | Leica Microsystems | DMI 6000 | Equipment |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Reagent |
| Albumin | Sigma-Aldrich | A7409 | Reagent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Reagent |
References
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