Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Sandwich-lignende microenvironments å utnytte Cell / Material Interactions

Published: August 4, 2015 doi: 10.3791/53090
Automatic Translation
1,2, 1,3, 2
1Center for Biomaterials and Tissue Engineering, Universitat Politècnica de València, 2Division of Biomedical Engineering, School of Engineering, University of Glasgow, 3Biomedical Research Networking Center in Bioengineering, Biomaterials and Nanomedicine (CIBER-BBN)

Abstract

Cellekultur har tradisjonelt blitt utført på bi-dimensjonale (2D) substrater hvor cellene fester seg ved hjelp av ventral reseptorer til biomaterialet overflaten. Imidlertid in vivo, de fleste av cellene er fullstendig omgitt av den ekstracellulære matriks (ECM), som resulterer i en tre-dimensjonal (3D) fordeling av reseptorer. Dette kan utløse forskjeller i utsiden-i signalveier og dermed i celle atferd.

Denne artikkelen viser at stimulerende dorsal-reseptorene til celler som allerede er festet til en 2D-substrat ved overlegging av en film av et nytt materiale (en sandwich-lignende kultur) utløser viktige endringer med hensyn til standard 2D-kulturer. Videre er den samtidige magnetisering av ventrale og dorsale reseptorer forskyver celle atferd nærmere den som finnes i 3D-miljøer. I tillegg, på grunn av beskaffenheten av systemet, er en sandwich-lignende kultur en allsidig verktøy som gjør det mulig å studere forskjellige parametre i celle / materiale interactions, for eksempel topografi, stivhet og ulike proteinbelegg på begge ventrale og dorsale sider. Til slutt, siden Sandwich-lignende kulturer er basert på 2D underlag, flere analyseprosedyrer som allerede er utviklet for standard 2D kulturer kan brukes som normalt, vinne mer komplekse prosedyrer som trengs for 3D-systemer.

Introduction

Tradisjonelt har cellekultur blitt utført på bi-dimensjonale (2D) substrater, selv om de fleste av de in vivo cellulære mikromiljøer har en tre-dimensjonal (3D) natur. Dette unaturlig 2D miljø utløser endringer i celle atferd som en måte selv tilpasning til en flat verden, som direkte påvirker celle skjebne 1,2. Derfor resultater oppnådd på 2D-cellekulturer er ikke alltid reproduserbare in vivo. Dette har oppmuntret til utvikling av nye relevante kultursystemer som søker å gi flere fysiologiske lignende forhold for å få ytterligere innsikt i noen dimensjon avhengig biologisk mekanisme 3,4.

En av de viktigste forskjellene mellom 2D og 3D-kultur in vivo miljøet er fordelingen av cellereseptorer forankret til den ekstracellulære matriks (ECM), mens på 2D substrates celler holder seg ventralt, er de fleste av cellene in vivo fullstendig omgitt av ECM og dermed cell vedheft skjer gjennom en 3D-distribusjon av reseptorer. Dette utløser forskjellige celleadhesjon signalbaner som derved modulerer viktige prosesser så som cellevekst, celledifferensiering og genekspresjon. I løpet av de siste tiårene har mange forskjellige 3D kultursystemer er etablert 5-8, selv om deres variasjon og kompleksitet hindre deres standardisering felles cellekultur prosedyrer. Videre 3D-systemer er vanligvis ikke lett å håndtere og dagens eksperimentelle prosedyrer på 2D underlag kan ikke være lett etablert for 3D kulturer. I tillegg, litteratur sjelden sammen 3D kulturer med tilsvarende 2D tilstand eller andre 3D-systemer, hindrer riktig forståelse av celle atferd i disse modellene.

En gang å ha cellene som festet seg på et 2D-substrat, eksitasjon av dorsal reseptorene - ved å legge over en film av et nytt materiale (-sandwich-lignende kultur) - kan føre til celle-responser både 3D-miljøer. Reason bak dette er den samtidige aktivering av både dorsale og ventrale reseptorer for å overholde og spre seg i sandwich-miljø (figur 1) 9,10. Som en konsekvens av dette, gjennomgår celler viktige endringer med hensyn til 2D kulturer 11,12. Således blir celle skjebne bestemmes ved montering på grunn av sandwich-kultur, ettersom den dorsale stimulering utløser endringer i viktige cellulære veier. Derfor blir celle skjebnen høyt bestemt av den tiden da sandwich-lignende kultur er satt sammen 11.

På grunn av beskaffenheten av systemet, er en sandwich-lignende kultur en enkel og allsidig verktøy som gjør det mulig å studere forskjellige parametre i celle / material interaksjoner som kjemi, topografi, stivhet og proteinbelegg på både ventrale og dorsale sider. Dette gir en høyere grad av fleksibilitet i forhold til andre 3D-systemer (figur 2) på grunn av den uavhengige dorsal og ventrale kombinasjon av et bredt variety av overflateforhold. I tillegg kan ulike cellelinjer og forskjellige tider for å montere sandwich-lignende kultur undersøkes, øker det brede spektrum av muligheter.

En standardprotokoll av sandwich-lignende kulturen er beskrevet nedenfor ved anvendelse av enten poly-L-melkesyre (PLLA) elektrospunnede fibre eller filmer som rygg substrater, glass dekkglass som ventral substrat og fibronektin som proteinbelegg. Sandwich-lignende kulturer ble montert like etter celle seeding eller etter tre timer av 2D kultur. Vær imidlertid oppmerksom på at andre vesentlige systemer og proteiner kan brukes; Likeledes sandwich-lignende kultur kan bli satt sammen på forskjellige tidspunkter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Produksjon av Rygg Underlag

  1. Fremstilling av en flat film av PLLA ved oppløsningsmiddelstøping.
    1. Arbeid i et avtrekk for å fremstille en oppløsning av 2% (w / v) PLLA i kloroform (2 g PLLA i 100 ml kloroform) ved omrøring ved romtemperatur (RT) til det er helt oppløst (ca. 3 timer).
    2. Plasser skivene på et glass petriskål.
      Merk: Bruk av rustfritt stål skiver med en indre diameter på 10,5 mm (litt mindre enn den ventrale prøven diameter), slik at skiven er plassert på toppen av den ventrale substratet. Andre materialer slik som polytetrafluoretylen (PTFE) eller glassskiver kan brukes i tillegg.
    3. Tilsett 200 ul av den PLLA løsning i vaskemaskinen og la fordampe langsomt i 30 minutter ved RT. For å tillate langsom fordamping av oppløsningsmidlet, lukker petriskål med aluminiumsfolie med noen hull.
    4. Varm prøvene ved 120 ° C i 5 minutter for å fordampe løsningsmiddel traser.
    5. La prøvene coolwn ved RT.
    6. Når prøvene er avkjølt (ca. 30 min), dekk med 18,2 Megohm · cm vann i petriskålen og inkuberes i 8 minutter ved romtemperatur.
      Merk: Hvis prøvene ikke er helt avkjølt, kan de ta opp 18,2 Megohm · cm vann og vedta en gummiaktig tilstand. I tillegg kan ruger på 18,2 Megohm · cm vann for mindre enn 8 min resultere i urettmessig løsrivelse, og for mer enn 8 min i løsrivelse fra vaskemaskinen.
    7. Med et barberblad, lirke skivene å skrelle dem av petriskål.
    8. Fjern eventuelle feil fra kanten av skiven med pinsett og la prøvene lufttørke.
    9. Oppbevar prøvene i en vakuumeksikator (80 mbar) inntil dagen for forsøket fordi PLLA er nedbrytbar ved hydrolyse.
  2. Produksjon av PLLA fibre av electro.
    1. Arbeid i et avtrekk for å fremstille en oppløsning av 8% (w / v) PLLA i heksafluorisopropanol (8 g PLLA i 100 ml hexafluorisopropanol) ved stirring på RT till helt oppløst (3 timer ca.).
    2. Plasser polytetrafluoretylen (PTFE) skivene på en aluminiumplate eller på en trommel for elektrospinning for å få tilfeldige eller orienterte fibre respektivt.
      Merk: Bruk polytetrafluoretylen (PTFE) skiver med en indre diameter på 10,5 mm (litt mindre enn den ventrale prøven diameter), slik at skiven er plassert på toppen av den ventrale substratet. Andre materialer som rustfritt stål eller glass skiver kan brukes i tillegg. Trommelen skal rotere med en rotasjonshastighet på 160,7 sek -1 (radius = 7 cm) for å få orienterte fibre. En lavere hastighet kan ikke utløse fiber justering og en raskere hastighet vil resultere i ødelagte fibre.
    3. Laste sprøyten med polymerløsningen og plasser den på sprøytepumpe.
    4. Electrospin den PLLA løsning ved hjelp av en 0,9 ml / time strømningshastighet med en spenning på 30 kV og en kollektor avstand på 12 cm.
    5. Stopp electro prosessen akteruter 20-30 minutter, når en god fibertetthet oppnås (siden cellene har til å interagere med flere fibre samtidig).
    6. Varm prøvene ved 120 ° C i 5 minutter for å fordampe løsningsmiddel traser.
    7. Oppbevar prøvene i en vakuumeksikator (80 mbar) inntil dagen for forsøket fordi PLLA er nedbrytbar ved hydrolyse.

2. Sandwich Culture

  1. Monter sandwich-lignende kultur når cellene blir overholdt ventral 2D underlaget.
    1. Arbeid i en kultur hette for å sikre sterile forhold og sterilisere alle materialer (dekkglass, rygg underlag, pinsett, etc.) ved UV-eksponering i 30 min.
    2. Smør ventral og dorsal underlaget med fibronektin for å dirigere bestemt celle-protein heft. For å gjøre dette, inkuber prøvene i 20 ng / ml fibronektin oppløst i Dulbeccos Fosfat saltvann (DPBS) som inneholder Ca 2+ og Mg 2+ (200 mL / srikelig) i 1 time.
      Bemerk: På grunn av fremstillingsprosessen, dorsale substrater har en utpekt topp- og bunnsidene, fordi oppløsningsmidlet støpt film og elektrospunnede fibre festet til en av sidene av skiven. Denne siden er derfor en vender cellene (figur 3).
      1. Etter at proteinbelegg, vaskes prøvene to ganger med DPBS for å fjerne protein i overskudd. Deretter inkubere prøvene i DPBS til deres bruk for å hindre at prøvene fra å bli tørr, siden dette fører til protein denaturalization. Bruk DPBS inneholder Ca 2+ og Mg 2+ siden toverdige kationer regulere proteinfolding.
    3. Seed celler på dekkglass 13.
      Merk: Som sandwich-lignende kultur er basert på 2D underlag, vil celle seeding utføres på samme måte som på en 2D-prøven. For eksempel er C2C12 myoblast sådd på 17 500 celler cm -1 differensierings eksperimenter og NIH3T3 fibroblaster utsåes med 7000 cells cm -1 for isolerte kulturer å studere cellemorfologi og heft.
    4. Plassere prøvene i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO 2 og la cellene å følge den ventral underlaget i 3 timer.
    5. Plasser den ventrale seeded substratet i en ny brønn i en 12 multi-brønn plate (hvor skivene passer).
      Merk: Montering sandwich-lignende kultur i en ny brønn er en måte å kvitte seg med de celler som har festet til bunnen av brønnen etter såing siden disse vil forbruke næringsstoffer og utskiller vekstfaktorer og avfall som påvirker celler dyrket innen smørbrød-lignende system. Dette er også en nødvendighet for cellulære ekstraksjoner for å lysere bare de celler dyrket i sandwich-lignende miljø.
    6. Nøye og med hjelp av en pinsett, overlappe rygg underlaget på cellene. Fyll på medium (1 ml) og inkuber ved 37 ° C med 5% CO2.
      Merk: Vekten av skiven vil hindre den dorsale subStrate fra flytende.
    7. Endre medium to ganger i uken som i standard 2D kulturer. Ikke flytt rygg underlaget da dette kan føre til celleskade.
  2. Monter sandwich-lignende kulturen like etter celle seeding.
    1. Arbeid i en kultur hette for å sikre sterile forhold og sterilisere alle materialer (dekkglass, rygg underlag, pinsett, etc.) ved UV-eksponering i 30 min.
    2. Smør ventral og dorsal underlaget med fibronektin for å dirigere bestemt celle-protein heft. For å gjøre dette, inkuber prøvene i 20 ng / ml fibronektin oppløst i DPBS inneholder Ca 2+ og Mg 2+ (200 mL / prøve) for 1 time.
      1. Etter at proteinbelegg, vaskes prøvene to ganger med DPBS for å fjerne protein i overskudd. Deretter inkubere prøvene i DPBS til deres bruk for å hindre at prøvene fra å bli tørr, siden dette fører til protein denaturalization. Bruk DPBS inneholder Ca 2+ og Mg
    3. Seed cellene på dekkglass i en brønn med en 12 multi-brønn plate (der skivene passer). For å gjøre dette, brukes sterkt konsentrert cellular suspensjon for å unngå celletap etter legging rygg underlaget.
    4. Nøye og med hjelp av en pinsett, overlappe rygg underlaget på cellene. Fyll på medium (1 ml) og inkuber ved 37 ° C med 5% CO2.
      Merk: Vekten av skiven vil hindre den dorsale substratet fra flytende.
    5. Endre medium to ganger i uken som i standard 2D kulturer.
      Merk: Ikke flytt rygg underlaget da dette kan føre til celleskade.

3. Analyse

Merk: Sandwich-lignende kulturer er basert på 2D underlag, og så kan ofte analysert av prosedyrer som allerede er utviklet for standard 2D kulturer. For eksempel, siden PLLA er gjennomsiktig og cells er begrenset til å bevege seg i xy-planet, er mikroskopi gjort som på 2D underlag. Cellemigrasjon kan derfor analyseres som for 2D-kulturer, uten behov for sporing av celler i z-aksen som for 3D-kulturer, noe som forenkler analysen eksperiment og bilde. Å studere sårtilheling analysen av en ripe analyse følge denne protokollen:

  1. Studien celle migrasjon (sårheling assay) innen sandwich-lignende kultur.
    1. Arbeid i en kultur hette for å sikre sterile forhold og sterilisere alle materialer (dekkglass, rygg underlag, pinsett, etc.) ved UV-eksponering i 30 min.
    2. Smør ventral og dorsal underlaget med fibronektin for å dirigere bestemt celle-protein heft. For å gjøre dette, inkuber prøvene i 20 ng / ml fibronektin oppløst i Dulbeccos Fosfat saltvann (DPBS) som inneholder Ca 2+ og Mg 2+ i 1 time.
      1. Etter protein belegg, vaske prøvene to ganger med DPBSfor å fjerne protein i overskudd. Deretter inkubere prøvene i DPBS til deres bruk for å hindre at prøvene fra å bli tørr, siden dette kan føre til proteinet denaturalization. Bruk DPBS inneholder Ca 2+ og Mg 2+ siden toverdige kationer regulere proteinfolding.
    3. Seed cellene på dekkglass ved en høy tetthet 13.
    4. Plassere prøvene i en inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 og tillate cellene å oppnå konfluens.
    5. Bruk en pipette tips å skrape i cellemonolag for å få to celle populasjoner adskilt av et gap.
    6. Plasser ventral seeded underlaget i en ny brønn egnet for time-lapse erverv og hvor rygg underlag passe (dvs. 12 multi-brønn plate).
    7. Nøye og med hjelp av en pinsett, overlappe rygg underlaget på cellene og deretter fylle på med medium (1 ml for en 12 multi-brønn plate).
      Merk: Vekten av skiven vil hindre tHan dorsal substrat fra flytende.
    8. Plasser prøven i intervall mikroskop (satt til 37 ° C og 5% CO2), og å ta bilder av spalten lukke hver 20 min.
    9. Analysere gapet nedleggelse bruker spesifikk programvare som plugin MiToBo fra ImageJ. 14

Merknad: protein og nukleinsyre ekstraksjon blir utført på samme måte som på 2D-substrater. Det er bare ett ekstra trinn som består i å demontere sandwich-lignende kultur for å legge til lysis buffer direkte på cellene for å øke utvinningseffektiviteten. For eksempel, for mRNA utvinning:

  1. Utdrag mRNA fra Sandwich-lignende kulturer
    1. Forberede alle buffere fra kommersielle kit i henhold til produsentens anvisninger.
    2. Ta sandwich-lignende kultur ut fra inkubatoren.
    3. Fjern kulturmedier fra prøvene.
    4. Vask prøvene gang med DPBS inneholder Ca2+ og Mg 2+ (1 ml) og fjerne all løsningen.
    5. Ved hjelp av en pinsett, fjerner rygg substratet og tilsett lysis buffer (350 pl) til den ventrale substratet. Overlappe igjen dorsal substratet på den ventrale substratet for å lysere cellene også festet til rygg substratet.
    6. Fjern den dorsale substratet for å isolere lysis løsningen.
    7. Følg produsentens instruksjoner for å få mRNA.

Merk: immundeteksjon av proteiner kan også utføres som på 2D underlag. Siden sandwich-lignende kulturer kunne hindre korrekt spredning av antistoffene og buffere, bør inkubasjonstidene økes. Dessuten kan sandwich demonteres før fargingen protokoll, men i dette sistnevnte tilfelle noen celler vil forbli festet til rygg substratet og noe til den ventrale substratet.

  1. Immunodetect proteiner i en sandwich-lignende kultur Vask prøven en gang med DPBS og fest med 4% formaldehyd i PBS i 20 minutter ved 4 ° C.
    Merk: Dorsal substratet kan fjernes i løpet av fikseringen prosessen, slik at diffusjon problemer unngås.
  2. Skyll med DPBS (1 ml) og deretter permeabilize med 0,5% Triton X-100 i DPBS (1 ml) i 5 min ved RT.
  3. Blokkere ikke-spesifikke bindingsseter med 1% albumin i DPBS (1 ml) i 30 minutter ved RT.
  4. Inkuber med primært antistoff (2 mg / ml, 1 ml) i blokkeringsløsning i 3 timer ved RT.
  5. Vask tre ganger i 10 minutter med DPBS / 0,5% Tween 20 (1 ml).
  6. Inkuber i 2 timer med sekundære antistoffer (2 ug / ml) og 1 ug / ml DAPI i blokkeringsoppløsning (1 ml) ved romtemperatur.
  7. Vask tre ganger i 10 minutter i DPBS / 0,5% Tween 20 (1 ml).
  8. Vask i DPBS.
    Merk: Prøver kan monteres på et lysbilde med Vectashield og forseglet med neglelakk når rygg underlag blir fjernet før den immundeteksjon.
  9. Observere under fluorescens microomfang som for standard 2D underlag.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Stimulering av reseptorer i rygg sandwich-lignende kultur utløser endringer i cellemorfologi, celleadhesjon og intracellulære signalveier (som fokal adhesjonskinase, FAK) 10-12. Som et eksempel, fibroblaster dyrket i sandwich-lignende system overuttrykt i α 5 integrinet subenheten i forhold til 2D, som observert for andre 3D kulturer 15,16.

Cell skjebne er svært avhengig av den tid da dorsal-reseptorer stimuleres og av egenskapene til den dorsale interaksjon, på samme måte som skjer i andre 3D-systemer så som hydrogeler. For eksempel hydrogelene hvor proteiner er tett bundet vanligvis viser mindre og avrundede celler med uutviklet aktin cytoskjelettet og diffus fokale adhesjon. Dette kan bli etterlignet i en sandwich-lignende kultur ved hjelp av substrater som adsorberer proteiner tett, slik at cellene ikke er i stand til mekanisk å reorganisere dette lag av proteiner og celle spredd,ding er hindret. På samme måte kan hydrogelene der cellene kan renovere ECM bli etterlignet med sandwich-systemet ved hjelp av substrater som adsorberer proteiner mer løst 10.

Stimulering av dorsal-reseptorer er blitt vist å modulere C2C12 celle skjebne. Dorsal elektrospunnede fibre PLLA direkte celle innretting når belagt med fibronektin, men ikke når det er belagt med bovint serumalbumin (en ikke-klebende protein). Dette resultatet peker på celler gjør biologisk forstand, og reagerer på rygg innganger (figur 4) 9. I tillegg sandwich-lignende kulturer med plane rygg PLLA utløst en økning i nivået av myogenese. Dette er også avhengig av rygg biologiske stimuli siden samspillet med ulike rygg proteiner resultater i forskjellige differensierings priser (figur 5) 9.

Cellemigrering i sandwich-lignende kultur er også endres i forhold til 2D-kulturen. Det har væreno vist at i en sårhelende assay, celler i kultur-sandwich innta en meget langstrakt morfologi og migrere kortere avstander enn på 2D-substrater (film 1 og 2). Cellemigrering prisene er videre relatert til naturen av den ventrale og dorsale stimulering 12.

På samme måte som i 3D fibronektin og kollagen geler 17,18, øker-sandwich-lignende kultur celle-mediert ECM omorganisering (dvs. den ventrale fibronektin) i forhold til 2D tilstand (figur 6) 12. Denne prosessen er avhengig av rygg mekaniske stimuli og cytoskeleton stabilitet siden bruk av kontraktilitet hemmere (Blebbistatin, Y27632) hindret prosessen. Interessant, ventral fibronektinet ble også omorganisert ved bruk av forskjellige ryggproteinbelegg (dvs. vitronektin og kvegserumalbumin) og selv om igjen ubestrøket 12.


Figur 1:.. Skisse av standard (2D) og sandwich-lignende kulturer Stimulering av rygg reseptorer i sandwich-lignende kultur utløser ekstra celleadhesjonen signale som modulerer viktige cellulære prosesser Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Sandwich-lignende kultur er et allsidig system som gjør det mulig å studere ulike velkontrollerte parametre (topografiske innganger, stivhet, graderinger ...) på begge de ventrale og dorsale underlag.


Figur 3:. Rygg substrater skissert for både toppen og tverrsnitt for å vise at en utpekt over- og undersiden (A) Flat PLLA film og (B) elektrospunnede fiber.

Figur 4
Figur 4:. C2C12 morfologi under forskjellige dyrkningsbetingelser inkludert planet (p), og orienterte fibre (A) av PLLA som ble brukt som ventrale (indeks) eller dorsal (Superscript) substrater Stiplede linjer representerer fibre orientering der det er nødvendig. Celler dyrket på flyet underlaget og kledde med innrettede fibre av PLLA (SW p a) Sense dorsal stimuli. Spesielt celler fornemme ryggfibrene når belagt med fibronektin, men ikke når belagt with bovint serumalbumin (en ikke-klebende protein). Følgelig celler kleber seg til fibrene belagt med fibronektin, og justere i samme retning. Bilde tilpasset fra Nummer 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Cell differensiering i Sandwich-lignende kulturer etter 4 dager i differensiering media. Forskjellige kulturbetingelser ble analysert inkludert planet (p), og orienterte fibre (a) av PLLA som ble brukt som ventrale (indeks) eller dorsal (superscript) substrater. Prøver ble belagt med fibronektin i alle tilfeller. (A) Fluorescens farging viser sarcomeric myosin positive celler (grønn) og cellekjerner (rød). (B) Differensiertceller orientering som beregnes ved Fast Fourier Transform. (C) myogenese som bestemt av prosentandelen av sarcomeric myosin-positive celler. Data er normalisert til gullstandarden kontroll. Statistisk signifikante forskjeller er angitt med *** p <0,001. Bilde tilpasset fra Nummer 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6
Figur 6: Omorganisering av ventral fibronektin. Sandwich kultur utløser ventral FN omorganisering ved å danne nye fibronectin fibriller (pensel-lignende merking, påpekte med hvite piler). Ventral fibronektinet omorganiseres innen sandwich-lignende kulturer med forskjellige rygg protein belegg (fibronectin, vitronektin og kvegserumalbumin)eller selv når rygg substratet er igjen ubelagt. Aktin cytoskjelettet (grønn), kjerner (blå) og FN (rød) vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Film 1: Cell migrasjon på 2D. L929 fibroblast migrerer på en fibronektin belagt glass dekkglass i en sårtilheling analysen. Bilder ble kjøpt for 16 timer (med en ramme tas hvert 20 min). Klikk her for å se denne videoen.

Movie 2:. Cell migrasjon innen sandwich-lignende kultur L929 fibroblast migrere i en sårtilheling analysen innen en sandwich-lignende kulturen var ventral underlaget var en fibronektin belagt glass dekkglass og rygg underlaget en fibronektin belagt PLLA film. Bilder ble kjøpt for 16 timer (med en ramme tas hvert 20 min). Klikk her for å se denne videoen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dag er 3D kultur et viktig tema for farmasøytisk og bioteknologisk industri samt forskning innen cellebiologi, inkludert kreft og stamceller. Som en følge av flere 3D-kultursystemer har blitt utviklet. Dessverre er forskjeller mellom 3D-systemer vanligvis resultere i forskjellige celle atferd, hindrer forståelse av cellen skjebne. Dessuten eksperimentelle prosedyrer er vanligvis ikke så enkelt som for 2D kultursystemer. Derav utvikle nye kultursystemer som søker å overvinne noen av disse ulempene er meget viktig.

Sandwich-lignende kultur er blitt vist å sterkt påvirke viktige cellulære prosesser som celledifferensiering, cellemorfologi, cellesignalisering og cellemigrasjon. Videre celler deler likheter med celler dyrket i 3D-systemer, som støtter påstanden om at sandwich-lignende kultur knytter 2D med 3D-kultur-systemer. Fysiologiske vev har porer i området fra 3 til 14 μm at begrensningen celler og derfor påvirke cellulære prosesser som migrasjon. Dette er en eller annen måte ved hjelp rekapitulert sandwich-lignende system som dorsale og ventrale stimuli representerer i seg selv et begrenset miljø som begrenser cellemorfologi og vil nødvendigvis påvirke cellemigrering uavhengig av proteinbelegg.

På grunn av den samtidig stimulering av dorsale og ventrale reseptorer, er sandwich-lignende kultur en robust teknologi for å undersøke rollen til dimensionality i celle-adferd. Videre, ettersom det er basert på 2D-underlag, er denne kulturen systemet svært allsidig for å studere forskjellige materialegenskaper og ECM innganger tillater studiet av cellen oppførsel under forskjellige mikromiljøer. Dessuten kan påvirkning av det tidspunkt ved hvilket rygg reseptorer stimuleres av celle skjebne bli undersøkt ved overliggende dorsal substratet ved forskjellige tidspunkter. Derfor, i motsetning til andre 3D-systemer, gir sandwich-lignende system et vidt spektrumav godt kontrollert cellulære microenvironments. Følgelig sandwich-lignende system er et interessant cellekultur plattformen for å etterligne forskjellige fysiologiske miljøer for å undersøke cellebiologi og testcellen skjebne under forskjellige dyrkningsbetingelser.

Som nevnt før, er en fordel med dette systemet at ulike ventral og rygg substrater kan studeres ved hjelp av ulike proteinbelegg. Derfor kan viktige parametere for celle skjebne som ligand densitet være innstilt ved regulering av liganden tettheten av hver enkelt av de 2D underlag som brukes (f.eks ventrale og dorsale substrater). Vær imidlertid oppmerksom på at ulike substrater kan trenge endringer i protokollen. For eksempel kan du bruker større rygg underlag resultere i behov for å sette riktig inkubasjonstid å skrelle prøvene av petriskål. Likeledes kan større ventral substrater resultere i hypoksiske områder i sentrum av prøven på grunn av den begrensede oksygen permeabiliteten av ventralsubstrat (på grunn av dekkglass). I tillegg vil analyseprosedyrer avhenge av substratet egenskaper. For eksempel vil ved hjelp av opake rygg substrater hindre standard mikrosprotokoller men det vil fortsatt tillate protein / nukleinsyre-ekstraksjon. En annen viktig faktor er permeabiliteten av dorsal substratet ettersom celler bør få lov til å komme næringsstoffer fra mediet og kast avfall.

For å oppsummere, er en sandwich-lignende kultur et enkelt system som gir mulighet for å etterligne ulike 3D-aktig microenvironments å undersøke celle skjebne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ploy(lactic acid) NatureWorks 4042D Reagent
Cover glasses (12 mmØ) Marienfeld 631-0666 Equipment
Chloroform Scharlab CL0200 Reagent
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) Sigma 105228 Reagent
Syringe (1 ml) Henke Sass Wolf 4010-200V0 Equipment
Syringe pump New Era Pump Systems NE1000 Equipment
High Voltage DC Power Supply Glassman High Voltage Series FC Equipment
Incubator Hucoa-Herlös 3111 Equipment
Laminar flow  hood Telstar AV30/70 Equipment
Human Fibronectin Sigma F2006 Reagent
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 Reagent
Inverted microscope Leica Microsystems DMI 6000 Equipment
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Reagent
Albumin Sigma-Aldrich A7409 Reagent
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287 Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).
  2. Weiss, P. Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).
  3. Ruffner, H., Lichtenberg, J. 3D cell culture systems--towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero). Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).
  4. Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs. Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).
  5. Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).
  6. Schor, S. L., et al. A novel 'sandwich' assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay. Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).
  7. Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).
  8. Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
  9. Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).
  10. Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmerón-Sánchez, M. Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate. Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).
  11. Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology. Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).
  12. Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments. Nanomedicine. , (2015).
  13. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. J. Vis. Exp. , (2015).
  14. Glaß, M., et al. Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines. Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).
  15. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  16. Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).
  17. Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
  18. Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis. J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).

Tags

Bioteknologi Sandwich kultur 3D kultur cellekultur fysiologiske cellular miljø bioteknologi
Sandwich-lignende microenvironments å utnytte Cell / Material Interactions
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ballester-Beltrán, J., Lebourg, … More

Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions. J. Vis. Exp. (102), e53090, doi:10.3791/53090 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter