Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Сэндвич-как микросреды, чтобы использовать Cell / Материал взаимодействий

Published: August 4, 2015 doi: 10.3791/53090
Automatic Translation
1,2, 1,3, 2
1Center for Biomaterials and Tissue Engineering, Universitat Politècnica de València, 2Division of Biomedical Engineering, School of Engineering, University of Glasgow, 3Biomedical Research Networking Center in Bioengineering, Biomaterials and Nanomedicine (CIBER-BBN)

Abstract

Клеточные культуры традиционно проводится на двумерная (2D) подложки, где клетки придерживаются помощью брюшной рецепторы поверхности биоматериала. Однако в естественных условиях, большинство клеток полностью окружены внеклеточного матрикса (ЕСМ), в результате трехмерного (3D) распределения рецепторов. Это может вызвать различия в за-в сигнальных путей и, таким образом, в поведении клеток.

Эта статья показывает, что стимулирование спинной рецепторы клеток уже придерживались в 2D подложки путем накладывания пленки нового материала (сэндвич-как культура) вызывает значительные изменения в отношении стандартных 2D культур. Кроме того, одновременное возбуждение брюшной и спинной рецепторов сдвигает поведение клеток ближе к найденному в 3D среде. Кроме того, из-за природы системы, сэндвич-культура, как это универсальный инструмент, который позволяет изучение различных параметров в ячейке / материала интеractions, например, топография, жесткость и различные белковые покрытия как на брюшной и спинной сторон. Наконец, так как сэндвич-как культуры на основе 2D субстратах, несколько процедур анализа уже разработаны для стандартных 2D культур можно использовать как обычно, преодолевая более сложные процедуры, необходимые для 3D систем.

Introduction

Традиционно, культуры клеток была проведена на би-мерных (2D) подложки, хотя большинство из естественных клеточных в микросреды имеют трехмерную (3D) характер. Это неестественное 2D среда вызывает изменения в поведении клеток как способ самонастройки в плоском мире, которые непосредственно влияет сотовый судьба 1,2. Следовательно, результаты, полученные на культурах клеток 2D не всегда воспроизводимы в естественных условиях. Это способствовало развитию новых соответствующих систем культивирования, стремящихся обеспечить более физиолого-как условия, чтобы получить более полное представление о любой размерности зависит от биологического механизма 3,4.

Одним из основных различий между 2D культуры и 3D в естественных условиях окружающей среды распределение клеточных рецепторов на якоре в внеклеточного матрикса (ЕСМ): в то время как на 2D субстраты клетки придерживаться снизу, большинство клеток в естественных условиях полностью окружен ECM и Таким образом, сеLL адгезия происходит через распределение 3D рецепторов. Это вызывает различные пути клеточной адгезии сигнализации, таким образом, модулирующих важные процессы, такие как рост клеток, дифференциации клеток и экспрессии генов. В течение последних десятилетий, много различных систем 3D культуры были созданы 5-8, хотя их изменчивость и сложность препятствуют их стандартизации в общих процедур клеточных культур. Кроме того 3D системы, как правило, не так легко обрабатывать, и в настоящее время экспериментальные процедуры по 2D субстратам не может быть легко установлено на 3D культур. Кроме того, литература редко сравнивает 3D культур с эквивалентным условием 2D или других 3D систем, препятствующих правильному пониманию поведения клеток в этих моделях.

После того, как имеющие клетки, прилипшие на 2D подложки, возбуждением рецепторов спинных - путем наложения пленки нового материала (сэндвич-как культура) - может вызвать клеточные ответы, так 3D сред. REAсын за это одновременное срабатывание обоих спинных и брюшных рецепторов придерживаться и распространения в окружающей среде сэндвич (рис 1) 9,10. Как следствие, клетки претерпевают существенных изменений по отношению к 2D культур 11,12. Таким образом, судьба клеток определяется во время сборки из-за сэндвич культуры, так как спинной стимуляция вызывает изменения в ключевых клеточных путей. Поэтому судьба клеток высоко определяется временем, когда сэндвич-культура, как собранном 11.

Из-за природы системы, сэндвич-как культура простой и универсальный инструмент, который позволяет изучение различных параметров в ячейки / материальных взаимодействий, таких как химия, топографии, жесткости и белковых покрытий как на брюшной и спинной сторон. Это обеспечивает более высокую степень универсальности по сравнению с другими 3D систем (рисунок 2) в связи с независимой спинной и брюшной сочетания широкого противАриети поверхностных условий. Кроме того, различные клеточные линии и различные времена, чтобы собрать бутерброд, как культура может быть изучена, увеличивая широкий спектр возможностей.

Стандартный протокол сэндвич-как культуры подробно ниже, используя либо поли-L-молочной кислоты (ПЛМК) electrospun волокна или пленки, как спинной субстратов, покровного стекла в качестве подложки брюшной и фибронектина как белка покрытием. Сэндвич-как культуры были собраны сразу после посева клеток или после 3 часов в 2D культуре. Тем не менее, обратите внимание, что могут быть использованы другие материальные системы и белки; Точно так же, как сэндвич-культура может быть собран в различные моменты времени.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Производство Спинной субстратов

  1. Производство плоской пленки ПЛМК литьем с растворителем.
    1. Работа в вытяжном шкафу с получением раствора 2% (вес / объем) ПЛМК в хлороформе (2 г ПЛМК в 100 мл хлороформа) с перемешиванием при комнатной температуре (RT) до полного растворения (приблизительно 3 ч).
    2. Поместите шайбы на стеклянной чашке Петри.
      Примечание: Используйте шайбы из нержавеющей стали с внутренним диаметром 10,5 мм (немного меньше, чем диаметр брюшной образец) так, чтобы машина установлена ​​на верхней части брюшной подложки. Другие материалы, такие как политетрафторэтилен (ПТФЭ) или стеклянными шайбами ​​можно использовать также.
    3. Добавить 200 мкл раствора в PLLA шайбы и пусть медленно испаряться в течение 30 мин при комнатной температуре. Для того чтобы обеспечить медленное испарение растворителя, закрыть чашку Петри с алюминиевой фольгой с несколькими отверстиями.
    4. Тепло образцов при 120 ° С в течение 5 мин, чтобы испарить растворитель следы.
    5. Пусть образцы прохладно делатьWn при комнатной температуре.
    6. После образцы охладились (примерно 30 мин), накрыть 18,2 мОм · см воды в чашку Петри и инкубировали в течение 8 минут при комнатной температуре.
      Примечание: Если образцы не полностью остынет, они могут принять до 18,2 МОм · см воды и принять резиновой состояние. Кроме того, инкубирование в 18,2 МОм · см воды менее чем за 8 мин может привести к неправильной отряда, и за более чем 8 мин в отрешенности от шайбы.
    7. С бритвой, вырвать шайбы, чтобы очистить их от чашку Петри.
    8. Удалите все недостатки от края шайбы с помощью пинцета и пусть образцы воздушно-сухой.
    9. Хранить образцы в вакуумном эксикаторе (80 мбар) до дня эксперимента, поскольку ПЛМК является разложению в результате гидролиза.
  2. Производство PLLA волокон электропрядения.
    1. Работа в вытяжном шкафу, чтобы приготовить раствор 8% (вес / объем) ПЛМК в гексафторизопропаноле (8 г ПЛМК в 100 мл гексафторизопропаноле) по stirrING в РТ до полного растворения (3 ч приблизительно).
    2. Поместите политетрафторэтилен (ПТФЭ) шайбы на алюминиевом листе или на барабане для электропрядения, чтобы получить случайные или выровненные волокна соответственно.
      Примечание: Использование политетрафторэтилена (ПТФЭ) шайбы с внутренним диаметром 10,5 мм (немного меньше, чем диаметр брюшной образец) так, чтобы машина установлена ​​на верхней части брюшной подложки. Другие материалы, такие как шайбы из нержавеющей стали или стекла могут быть использованы также. Барабан должен вращаться с угловой скоростью 160,7 с -1 (радиус = 7 см), чтобы получить выровненные волокна. Медленнее скорость не может вызвать выравнивание волокна и быстрее скорости приведет к сломанной волокон.
    3. Загрузите шприц с раствором полимера и поместить его на шприцевой насос.
    4. Electrospin решение ПЛМК использованием скорости 0,9 мл / ч потока с напряжением 30 кВ и коллектора расстоянии 12 см.
    5. Остановить процесс электропрядения кормеER 20-30 мин, когда хороший плотность волокон достигается (с клетки должны взаимодействовать с несколькими волокон одновременно).
    6. Тепло образцов при 120 ° С в течение 5 мин, чтобы испарить растворитель следы.
    7. Хранить образцы в вакуумном эксикаторе (80 мбар) до дня эксперимента, поскольку ПЛМК является разложению в результате гидролиза.

2. Сэндвич Культура

  1. Соберите бутерброд, как когда-то культуру клетки придерживался брюшной 2D подложки.
    1. Работа в капот культуры, чтобы обеспечить стерильные условия и стерилизовать все материалы (покровные стекла, спинной субстраты, пинцет и т.д.) с помощью УФ-облучения в течение 30 мин.
    2. Пальто в брюшной и спинной подложки с фибронектина, чтобы направить конкретный адгезии клеток белка. Чтобы сделать это, инкубировать образцов в 20 мкг / мл фибронектина, растворенных в Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором (DPBS), содержащем Са 2+ и Mg 2+ (200 мкл / секобильным) в течение 1 ч.
      Примечание: Из-за процесса изготовления, спинной подложки имеют назначенного верхней и нижней стороны, так как растворитель литой пленки и волокна electrospun прикреплен к одной из сторон шайбы. Эта сторона Поэтому одним лицом клетки (рисунок 3).
      1. После белка покрытием, мыть образцы дважды DPBS, чтобы удалить белок в избытке. Тогда не инкубировать образцов в DPBS до их использования в целях предотвращения образцы от попадания сухой, так как это вызывает белка Денатурализация. Используйте DPBS, содержащие Са 2+ и Mg 2+, так как двухвалентных катионов регулируют сворачивание белков.
    3. Семенной клеток на покровные стекла 13.
      Примечание: В сэндвич-подобный культура основана на 2D субстратах, посева клеток будет выполняться аналогично тому, как на 2D образца. Например, C2C12 миобластов высевают 17500 клеток см -1 для дифференциации экспериментов и NIH3T3 фибробластов высевают в 7000 CELLS см -1 для изолированных культур для изучения морфологии клеток и адгезии.
    4. Поместите образцы в инкубаторе при 37 ° С с 5% СО 2 и позволяют клеткам прилипать к брюшной подложки в течение 3 ч.
    5. Поместите брюшной семенами подложки в новой скважины 12 мульти-луночного планшета в (где шайбы подходят).
      Примечание: Сборка сэндвич-как культуру в новой скважины является одним из способов, чтобы избавиться от клеток, которые придерживались на дно и после посева, так как они будут потреблять питательные вещества и выделяют факторы роста и отходов, которые оказывают влияние клетки культивировали в течение сэндвич-подобная система. Это также необходимо для клеточных экстрактов, чтобы лизировать только клетки, культивируемые в сэндвич-среде.
    6. Тщательно и с помощью пинцета, наложение спинной подложку на клетки. Пополнение с среды (1 мл) и инкубируют при 37 ° С с 5% СО 2.
      Примечание: вес шайбы предотвращает спинной субСтрейт из плавающей.
    7. Изменение среды два раза в неделю, как в стандартных 2D культур. Не перемещайте спинной субстрат, так как это может привести к повреждению клеток.
  2. Соберите бутерброд, как культуру только после посева клеток.
    1. Работа в капот культуры, чтобы обеспечить стерильные условия и стерилизовать все материалы (покровные стекла, спинной субстраты, пинцет и т.д.) с помощью УФ-облучения в течение 30 мин.
    2. Пальто в брюшной и спинной подложки с фибронектина, чтобы направить конкретный адгезии клеток белка. Чтобы сделать это, инкубировать образцов в 20 мкг / мл фибронектина, растворенных в DPBS, содержащих Ca 2+ и Mg 2+ (200 мкл / образец) в течение 1 ч.
      1. После белка покрытием, мыть образцы дважды DPBS, чтобы удалить белок в избытке. Тогда не инкубировать образцов в DPBS до их использования в целях предотвращения образцы от попадания сухой, так как это вызывает белка Денатурализация. Используйте DPBS, содержащие Са 2+ и Mg
    3. Семенной клеток на покровных стеклах в лунку 12-луночного нескольких планшеты (где шайбы подходят). Чтобы сделать это, используйте высококонцентрированные суспензии клеток, чтобы избежать потери клеток после укладки спинной подложку.
    4. Тщательно и с помощью пинцета, наложение спинной подложку на клетки. Пополнение с среды (1 мл) и инкубируют при 37 ° С с 5% СО 2.
      Примечание: масса шайбы предотвращает спинной подложку из плавающей.
    5. Изменение среды два раза в неделю, как в стандартных 2D культур.
      Примечание: Не перемещайте спинной субстрат, так как это может привести к повреждению клеток.

3. Анализ

Примечание: Сэндвич-подобный культуры на основе 2D субстратах, и поэтому может быть широко анализировали с помощью процедур, уже разработанных для стандартных 2D культур. Например, с ПЛМК прозрачна и селLs ограничены для перемещения в плоскости ху, микроскопия сделано как на 2D субстратах. Миграция клеток может быть поэтому анализировали, как для 2D культур, без необходимости отслеживания клетки в оси как для 3D-культур, которые упрощает эксперимент и анализ изображения. Для изучения заживления ран анализа к царапинам анализе читать этот протокол:

  1. Исследование миграции клеток (заживление ран анализ) в сэндвич-как и культура.
    1. Работа в капот культуры, чтобы обеспечить стерильные условия и стерилизовать все материалы (покровные стекла, спинной субстраты, пинцет и т.д.) с помощью УФ-облучения в течение 30 мин.
    2. Пальто в брюшной и спинной подложки с фибронектина, чтобы направить конкретный адгезии клеток белка. Чтобы сделать это, инкубировать образцов в 20 мкг / мл фибронектина, растворенных в Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором (DPBS), содержащем Са 2+ и Mg 2+ в течение 1 часа.
      1. После белка покрытия, мыть образцы дважды DPBSдля того, чтобы удалить белок в избытке. Затем образцы инкубируют не в DPBS до их использования в целях предотвращения попадания образцы сухой, так как это может привести к белка Денатурализация. Используйте DPBS, содержащие Са 2+ и Mg 2+, так как двухвалентных катионов регулируют сворачивание белков.
    3. Семенной клеток на покровные стекла при высокой плотности 13.
    4. Поместите образцы в инкубаторе при 37 ° С с 5% CO 2 клетки и позволит достичь слияния.
    5. Используйте пипетки, чтобы не поцарапать клеточный монослой для того, чтобы получить 2 клеточных популяций, разделенных зазором.
    6. Поместите брюшной семенами субстрата в новый хорошо подходит для приобретения покадровой и где спинной субстраты подходят (т.е. 12 мульти-луночного планшета).
    7. Тщательно и с помощью пинцета, наложение спинной подложку на клетки, а затем залить среды (1 мл в течение 12 мульти-луночного планшета).
      Примечание: масса шайбы предотвращает тон спинной подложку из плавающей.
    8. Поместите образец в покадровой микроскоп (задать до 37 ° С и 5% СО 2) и получать изображения закрытия зазора каждые 20 мин.
    9. Анализ закрытия зазора с помощью специального программного обеспечения, такие как плагин MiToBo от ImageJ. 14

Примечание: Белок и экстракции нуклеиновой кислоты выполняется аналогично тому, как на 2D субстратов. Существует только один дополнительный шаг, который заключается в разборке сэндвич-культуры, как добавить лизирующего буфера непосредственно на клетках с целью повышения эффективности извлечения. Например, для извлечения мРНК:

  1. Выписка мРНК из сэндвич-как культур
    1. Подготовьте все буферы из коммерческого набора в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.
    2. Возьмите сэндвич-как культуру из инкубатора.
    3. Извлеките культуральной среды из образцов.
    4. Вымойте образцы один раз DPBS содержащий Ca2+ и Mg 2+ (1 мл) и снимите весь раствор.
    5. С помощью пинцета, удалить спинной подложку и добавить лизирующего буфера (350 мкл) в брюшной подложки. Перекрытие снова спинной подложки, на вентральной подложки для того, чтобы лизировать клетки и прилипшие к спинной подложки.
    6. Удалить спинной подложку, чтобы изолировать лизиса решение.
    7. Следуйте инструкциям производителя, чтобы получить мРНК.

Примечание: Иммунологический белков также может быть выполнена также на 2D субстратах. Так сэндвич-культуры, как может помешать правильной диффузии антител и буферы, времени инкубации должна быть увеличена. Кроме того, сэндвич может быть разобран перед началом протокола окрашивания, но в этом последнем случае некоторые клетки остаются прикрепленными к спинной подложки и некоторые брюшной подложки.

  1. Immunodetect белки внутри сэндвич-как и культура Промыть образец один раз DPBS и исправить с помощью 4% формальдегида в PBS в течение 20 мин при 4 ° С.
    Примечание: Спинной подложка может быть удалена в процессе фиксации, так что можно избежать проблемы диффузии.
  2. Промыть DPBS (1 мл), а затем проницаемыми с 0,5% Triton X-100 в DPBS (1 мл) в течение 5 мин при комнатной температуре.
  3. Блок неспецифические сайты связывания с 1% альбумина в DPBS (1 мл) в течение 30 мин при комнатной температуре.
  4. Инкубируйте с первичным антителом (2 мкг / мл; 1 мл) в блокирующем растворе в течение 3 ч при комнатной температуре.
  5. Промыть 3 раза в течение 10 мин с DPBS / 0,5% Tween 20 (1 мл).
  6. Инкубируют 2 ч с вторичными антителами (2 мкг / мл) и 1 мкг / мл DAPI в блокирующем растворе (1 мл) при комнатной температуре.
  7. Промыть 3 раза в течение 10 мин в DPBS / 0,5% Tween 20 (1 мл).
  8. Стирать в DPBS.
    Примечание: Образцы могут быть установлены на слайде с Vectashield и запечатаны с лаком для ногтей, когда спинной субстраты удалены перед на иммунологического.
  9. Соблюдайте под флуоресцентным микроСфера, как для стандартных 2D субстратах.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Стимулирование рецепторов спинных в сэндвич-как и культура вызывает изменения в морфологии клеток, клеточной адгезии и внутриклеточных сигнальных путей (например, фокальные контакты киназы, ФСП) 10-12. В качестве примера, фибробласты культивировали в сэндвич-подобные системы избыточно экспрессируется в α 5 субъединицы интегрина по сравнению с 2D, как это наблюдалось для других 3D культур 15,16.

Судьба клеток в значительной степени зависит от времени, когда спинной рецепторы стимулируются и свойствами взаимодействия спинного, так же как это происходит в других 3D систем, таких как гидрогели. Например, гидрогели, где белки тесно связаны, как правило, показывают меньшие и округлые клетки с неразвитой цитоскелета и диффузных координационные спайки. Это можно имитировать в сэндвич-культуры, как с помощью подложек, которые адсорбируют белки плотно, так что клетки не способны к механическим реорганизовать этот слой белков и клеток spreaДин затруднено. Точно так же, гидрогели, где клетки могут перестроить ECM можно имитировать с сэндвич системы с помощью субстраты, которые адсорбируют белки более свободно 10.

Стимуляция рецепторов спинных было показано, модулирует судьбу С2С12 клеток. Спинной electrospun ПЛМК волокнам выравнивание прямой клеток при покрытии фибронектина, но не тогда, когда покрытые бычьего сывороточного альбумина (без клея белка). Этот результат указывает клетки делать биологически смысл и реагировать на входы спинных (Рисунок 4) 9. Кроме того, сэндвич-как культуры с плоской спинной PLLA вызвало повышение уровня миогенеза. Это также зависит от спинных биологических раздражителей, так как при взаимодействии с различными белками спинной результатов в различных дифференциации тарифов (рисунок 5) 9.

Миграция клеток в сэндвич-культуры, как также изменяется по сравнению с 2D культуре. Он имеет бытьан показали, что в заживления ран анализа, клетки в культуре сэндвич принять весьма вытянутую морфологию и миграцию на короткие расстояния, чем на 2D субстратах (Кино 1 и 2). Уровень миграции клеток которые, кроме того, относится к природе брюшной и спинной стимуляции 12.

Подобно тому, как в 3D фибронектина и коллагена гелей 17,18, сэндвич-как культура повышает клеточный ECM реорганизации (т.е. вентральной фибронектина) в отношении 2D состоянии (Рисунок 6) 12. Этот процесс основан на спинной механических стимулов и цитоскелета стабильности, так как использование ингибиторов сократимости (blebbistatin, Y27632) затрудненных процесс. Интересно, что брюшной фибронектин и преобразован при использовании различных покрытий спинной белка (т.е. витронектина и бычий сывороточный альбумин), и даже если оставить без покрытия 12.


Рисунок 1:.. Эскиз стандартной (2D) и сэндвич-как культуры Стимуляция рецепторов спинных внутри сэндвич-как и культура вызывает дополнительную сигнализацию клеточной адгезии, который модулирует важные клеточные процессы Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2: Сэндвич-как культура универсальная система, которая позволяет изучение различных контролируемых параметров (топографических входов, жесткость, градиенты ...) на обоих вентральных и дорсальных поверхностей.


Рисунок 3:. Спинной субстраты набросал для верхней и поперечного сечения для того, чтобы показать, что есть назначенный верхнюю и нижнюю сторону () Квартира ПЛМК кино и (Б) electrospun волокна.

Рисунок 4
Фигура 4:. ​​C2C12 морфология при различных условиях культивирования в том числе плоскости (Р) и выровненных волокон (а) ПЛМК, что были использованы в качестве вентральной (индекс) или спинной (надстрочные) субстратов Пунктирные линии представляют волокнам ориентацию, где это необходимо. Клетки, культивированные на плоскости подложки и обложил унифицированных волокон PLLA (SW р а) ощущение спинной стимулы. В частности, клетки чувствуют спинной волокна, когда покрытые фибронектина, но не тогда, когда покрытые Wiго бычий сывороточный альбумин (неадгезивная белка). Следовательно клетки придерживаться волокон, покрытых фибронектином и выровнять в том же направлении. Адаптировано из ссылки 9 Изображение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рисунок 5: Дифференциация клеток в сэндвич-как культур после 4 дней в среде для дифференцировки. Различные условия культивирования были проанализированы в том числе плоскости (Р) и выровненных волокон (а) ПЛМК, что были использованы в качестве вентральной (индекс) или спинной (верхний индекс) подложки. Образцы покрытых фибронектином во всех случаях. () Флуоресценции окрашивания показывает саркомерный миозина положительных клеток (зеленый) и ядра клеток (красные). (Б) ДифференцированныйКлетки ориентация по подсчетам быстрого преобразования Фурье. (С) Миогенез как определено в процентах от саркомерных миозина-позитивных клеток. Данные нормированы на стандартную контроля золота. Статистически значимые различия указаны с *** P <0,001. Адаптировано из ссылки 9 Изображение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6: Реорганизация брюшной фибронектина. Сэндвич культура вызывает перестройку вентральной FN путем формирования новых фибронектина фибриллы (Brush, как маркировка; указывал с белыми стрелками). Брюшные фибронектин будет преобразован в сэндвич-типа с различным культурам покрытия спинной белка (фибронектина, витронектина и бычий сывороточный альбумин)или даже тогда, когда спинной субстрат остается без покрытия. Цитоскелета (зеленый), ядра (синий) и Fn (красный) показаны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Фильм 1: Миграция клеток на 2D. L929 фибробластов мигрируют на фибронектина покрытием покровного стекла в заживления раны анализа. Изображения были получены в течение 16 часов (с рамой каждые 20 мин). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы смотреть это видео.

Фильм 2:. Миграция клеток в сэндвич-как культуры фибробластов L929 миграции в заживления раны анализа в сэндвич-как культуры были вентральной субстрат был фибронектин покрытием стекло покровное и спинной субстрат фибронектин покрытием ПЛМК фильм. Изображения были получены в течение 16 часов (с рамой принимать каждые 20 мин). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы смотреть это видео.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В настоящее время, 3D культура важная тема для фармацевтической и биотехнологической промышленности, а также исследования в области клеточной биологии, в том числе рака и стволовых клеток. Как следствие, были разработаны несколько 3D системы культуры. К сожалению, различия между 3D систем обычно приводит к различным поведением клеток, препятствуя понимание судьбы клеток. Кроме того, экспериментальные процедуры, как правило, не так просто, как для систем 2D культуры. Отсюда развивается новая культура системы, стремящихся преодолеть некоторые из этих недостатков является чрезвычайно важным.

Сэндвич-культура, как было показано, сильно влияют основные клеточные процессы, такие как дифференциации клеток, морфологии клеток, клеточной сигнализации и миграции клеток. Более того клетки имеют сходство с клетками, культивируемыми в 3D систем, поддерживающих заявление, что сэндвич-как культура связывает 2D с культурой систем 3D. Физиологические ткани имеют поры в диапазоне от 3 до 14 μм, что тягот клетки и, следовательно, влиять на клеточные процессы, такие, как миграция. Это каким-то образом воспроизводятся с помощью сэндвич-как систему, как спинной и брюшные стимулы представляют таковой в условиях ограниченности, которая ограничивает морфологии клеток и неизбежно влияют на миграцию клеток, независимо от белковых покрытий.

В связи с одновременной стимуляции спинного и брюшных рецепторов, сэндвич-как культура надежная технология, чтобы исследовать роль размерности в поведении клеток. Кроме того, так как он основан на 2D субстратах, эта система культура является весьма универсальной, чтобы изучить разные свойства материала и ECM входов позволяет изучение поведения клеток при различных микросреды. Кроме того, влияние времени, в который спинные рецепторы стимулируются от судьбы клеток может быть исследована путем наложения спинной подложку в различные моменты времени. Следовательно, в отличие от других 3D систем, сэндвич-подобная система обеспечивает широкий спектрхорошо управляется сотовой микросреды. Следовательно, сэндвич-система, как интересный для культивирования клеток платформой, чтобы имитировать различные физиологические среды с целью изучения клеточной биологии и судьбу испытательной камере при различных условиях культивирования.

Как упоминалось ранее, одним преимуществом этой системы является то, что различные брюшной и спинной субстраты могут быть изучены с использованием различных белковых покрытий. Таким образом, важными параметрами для судьбы клеток, такие как плотность лиганда может быть настроена путем регулирования плотности лиганда из каждого из 2D подложек, используемых (например, брюшной и спинной субстратов). Тем не менее, обратите внимание, что различные субстраты, возможно, потребуется изменения в протокол. Например, с помощью большие спинные подложек может привести к необходимости создания надлежащего времени инкубации, чтобы очистить образцы от чашки Петри. Кроме того, крупные брюшные субстраты может привести к гипоксии областей в центре образца из-за ограниченной проницаемостью кислорода вентральногоПодложка (из-за покровным стеклом). Кроме того, процедуры анализа будет зависеть от свойств подложки. Например, с помощью непрозрачных спинной субстраты будет препятствовать стандартные протоколы микроскопии, хотя это будет по-прежнему позволяют белок / нуклеиновые кислоты экстракции. Еще одним ключевым фактором является проницаемость спинной подложки с клетки должны иметь возможность получить питательные вещества из среды и выбросить отходы.

Подводя итог, сэндвич-как культура простая система, которая дает возможность имитировать различные 3D-как микросреды, чтобы исследовать судьбу клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ploy(lactic acid) NatureWorks 4042D Reagent
Cover glasses (12 mmØ) Marienfeld 631-0666 Equipment
Chloroform Scharlab CL0200 Reagent
1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol (HFIP) Sigma 105228 Reagent
Syringe (1 ml) Henke Sass Wolf 4010-200V0 Equipment
Syringe pump New Era Pump Systems NE1000 Equipment
High Voltage DC Power Supply Glassman High Voltage Series FC Equipment
Incubator Hucoa-Herlös 3111 Equipment
Laminar flow  hood Telstar AV30/70 Equipment
Human Fibronectin Sigma F2006 Reagent
RNeasy Micro Kit Qiagen 74004 Reagent
Inverted microscope Leica Microsystems DMI 6000 Equipment
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Reagent
Albumin Sigma-Aldrich A7409 Reagent
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287 Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J Cell Sci. 125 (Pt 13), 3015-3024 (2012).
  2. Weiss, P. Rev. Mod. Phys. 31 (1), 11-20 (1959).
  3. Ruffner, H., Lichtenberg, J. 3D cell culture systems--towards primary drug discovery platforms: an interview with Heinz Ruffner (Novartis) and Jan Lichtenberg (InSphero). Biotechnol J. 7 (7), 833-834 (2012).
  4. Horning, J. L., et al. 3-D tumor model for in vitro evaluation of anticancer drugs. Mol Pharm. 5 (5), 849-862 (2008).
  5. Wolf, K., et al. Compensation mechanism in tumor cell migration: mesenchymal-amoeboid transition after blocking of pericellular proteolysis. J Cell Biol. 160 (2), 267-277 (2003).
  6. Schor, S. L., et al. A novel 'sandwich' assay for quantifying chemo-regulated cell migration within 3-dimensional matrices: wound healing cytokines exhibit distinct motogenic activities compared to the transmembrane assay. Cell Motil Cytoskeleton. 63 (5), 287-300 (2006).
  7. Lee, E. J., Hwang, C. M., Baek, D. H., Lee, S. H. Fabrication of microfluidic system for the assessment of cell migration on 3D micropatterned substrates. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2009 (2009), 6034-6037 (2009).
  8. Zaman, M. H., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
  9. Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in sandwich-like microenvironments. Effect on cell differentiation. Biotechnol Bioeng. 110 (11), 3048-3058 (2013).
  10. Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Moratal, D., Salmerón-Sánchez, M. Fibronectin-matrix sandwich-like microenvironments to manipulate cell fate. Biomater. Sci. 2 (3), 381-389 (2014).
  11. Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Dorsal and ventral stimuli in cell-material interactions: effect on cell morphology. Biointerphases. 7 (1-4), 39 (2012).
  12. Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Rico, P., Salmerón-Sánchez, M. Cell migration within confined sandwich-like nanoenvironments. Nanomedicine. , (2015).
  13. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. J. Vis. Exp. , (2015).
  14. Glaß, M., et al. Cell Migration Analysis: Segmenting Scratch Assay Images with Level Sets and Support Vector Machines. Pattern Recogn. 45 (9), 3154-3165 (2012).
  15. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  16. Huebsch, N., Arany, P. R., Mao, A. S., et al. Harnessing traction-mediated manipulation of the cell/matrix interface to control stem-cell fate. Nat. Mater. 9 (6), 518-526 (2010).
  17. Petrie, R. J., Gavara, N., Chadwick, R. S., Yamada, K. M. Nonpolarized signaling reveals two distinct modes of 3D cell migration. J Cell Biol. 197 (3), 439-455 (2012).
  18. Mao, Y., Schwarzbauer, J. E. Stimulatory effects of a three-dimensional microenvironment on cell-mediated fibronectin fibrillogenesis. J Cell Sci. 118 (Pt 19), 4427-4436 (2005).

Tags

Биоинженерия выпуск 102 сэндвич культура 3D культура культура клеток физиологических сотовые окружающей среды биоинженерии
Сэндвич-как микросреды, чтобы использовать Cell / Материал взаимодействий
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ballester-Beltrán, J., Lebourg, … More

Ballester-Beltrán, J., Lebourg, M., Salmerón-Sánchez, M. Sandwich-like Microenvironments to Harness Cell/Material Interactions. J. Vis. Exp. (102), e53090, doi:10.3791/53090 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter