Introduction
標準的な2Dの文化とは異なり、3次元細胞培養サロゲートモデルは、生理学的に関連するコンテキスト、1組織に似における上皮細胞の挙動の研究を可能にします。乳腺の3D培養物は、乳腺の発達と腫瘍の多くの側面を解明に役立ちました。しかし、現在入手可能な三次元培養モデルのほとんどは、タスクに使用したヒト上皮細胞株は、ホルモン受容体の発現6,7,9を欠いているので、ホルモン作用を研究するためには不適当です。
ここで、我々はホルモン作用12を研究するのに適しているヒト乳房上皮の三次元培養モデルについて説明します。このモデルは、もともと乳房の浸潤性乳管癌で54歳の女性患者から得られた胸水から由来した市販のホルモン応答ヒト乳房上皮細胞株、T47D 3,11,13を 、使用しています。私たちは、マトリックスとしてラット尾コラーゲンタイプ1を使用します。この3DカルトUREモデルは、ヒト乳房上皮細胞上の3つの主要なmammotropicホルモン（エストラジオール、プロメゲストン（プロゲステロンの類似体）、およびプロラクチン）の作用の研究に適しています。ホルモン誘導性の上皮形態は、形態学的分析12時間にわたって定量的に評価することができます。
適切な播種密度は、これらの3D培養物は2週間保持することができます。この時点で、構造物の開発は、上皮形態に対するホルモン作用の堅牢な定量的評価のために十分です。ゲルは、細胞増殖のための以前の時点で回収してもよいし、遺伝子発現解析します。さらに、このモデルは、連続ホルモン療法の効果を試験するのに適しています。例えば、次の週の間のホルモンの他のホルモン/組み合わせで最初の週と交換時のエストラジオールで処理した後。このようなICI 182,780などのエストロゲン様化合物および抗エストロゲンの効果は、また、STUすることができますこの三次元培養モデル12を使用して死亡しました。
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Protocol
試薬の調製
- 10 -3 Mストック溶液を作るために、エタノール中で合成黄体ホルモンのプロメゲストン（R5020）および17-βエストラジオール（E2）を溶解します。 1mg / mlのストック溶液を作製するために蒸留脱イオン水にプロラクチンを溶解します。 10 -2 Mの原液を作るためにDMSOに抗エストロゲンICI 182,780を溶解します。最大6ヶ月間-20℃でこれらのソリューションを保管してください。
- チャコールデキストラン（CD）は、血清およびCDFBS媒体を剥奪しました：
- 30分間57℃の水浴中でウシ胎児血清（FBS）を熱不活性化します。
注：このプロトコルの残りの部分のみを使用して酸洗浄ガラス製品を。 - 必要な炭の量を計算します。粉末活性炭は、炭による変位を補償するために、血清の量よりも10％以上のボリュームを5％重量/体積を計量使用します。
- 血清の量と同じ量を使用して、冷脱イオン蒸留水で2回木炭を洗ってください。各洗浄cの木炭をペレット化するために2分間50×gでentrifuge。洗浄の間に水を除去します。最後の炭ペレットに0.5％重量/体積デキストランT-70を追加します。 5分間100×gで蒸留、脱イオン水および遠心分離機で再懸濁します。水を吸引。
- ペレットに血清の適切な量を追加し、血清中に木炭デキストランペレットを再懸濁。 60分間37ºCで、（6 RPM）転動しながら、インキュベートします。 20分間、2000×gで遠心分離します。上清が濁って表示された場合は、遠心分離を繰り返します。しかし、血清は、現時点では完全には明らかではないかもしれないが、濾過中にクリアされます。
- より大きな粒子状物質を除去するために0.45ミクロンフィルターを通して再び0.80ミクロンフィルターを通して濾過し、。最後に、0.20ミクロンフィルターで濾過滅菌します。ストアは、-20ºCでガラス管またはT-25培養フラスコ内CDFBSを濾過しました。
- チャコールデキストランウシ胎児含有培地（CDFBSメディア）：フェノールレッドを含まないDMEMの375ミリリットルとDMEMの125ミリリットルを混ぜます/ F-12。 37.5ミリリットルを取り外し、チャコールデキストランウシ胎児血清の同じボリュームに置き換えます。 2 mMの最終濃度に10 6 U / mlのペニシリンおよびL-グルタミンを追加します。得られた培地は、75％のDMEM、25％DMEM / F-12、2mMのL-グルタミン、及び10 6 U / mlのペニシリン、FBS剥離7.5％チャコールデキストランです。
- 30分間57℃の水浴中でウシ胎児血清（FBS）を熱不活性化します。
- 10X PBS、1N NaOH及び蒸留脱イオン水を準備します。必要とされるコラーゲン溶液の量に応じて各の十分なボリュームを準備します。フィルタリングによって、すべてのソリューションを滅菌します。 1ヶ月まで4℃で10×PBSと滅菌蒸留脱イオン水を保管してください。 1N NaOH溶液を保管しないでください。
- 製造元によって提供される「コラーゲンI、ラットの尾の代替ゲル化手順」のプロトコルに従って、1mg / mlの最終濃度でコラーゲン溶液を準備します。各ゲルは、コラーゲン溶液1.5mlで作られています。例えば、準備するコラーゲン溶液18.5ミリリットル（ピペット操作の間の損失を考慮して0.5ml）で調製12ゲル。すぐにコラーゲン溶液を使用するか、最大2-3時間、氷上で保持します。
- カーマインミョウバン染料：
- 蒸留水500ミリリットルで1グラムカーマインと2.5グラム硫酸アルミニウムカリウムを兼ね備えています。 20分間撹拌しながら沸騰。吹きこぼれを避けるために注意して観察してください。バック追加の蒸留水で500ミリリットルへの最終的な音量を調整します。
- 抗菌活性のためのチモールの結晶を追加し、光から保護するためにアルミホイルで瓶をカバーしています。各使用前に実験室グレードの濾紙を通して濾過します。までの3ヶ月間のカルミンソリューションを再利用します。光から保護し、室温で保存し、。
- コラゲナーゼ溶液：w / vの0.125％の濃度でDMEM / F12培地中でコラゲナーゼを溶解します。このソリューションを保管しないでください。
ラットテールコラーゲンタイプでT47D細胞の2次元文化1ゲルおよびホルモン治療
注：4℃で滅菌した血清学的ピペットとピペットチップを保持します。
- Prepa単一細胞懸濁液を再度、細胞カウントを行います。分割T47D細胞培養物は、それらが70％コンフルエンスに到達する前に。必要な細胞の量を含むボリュームを遠心。 1つのゲルは、約75,000 T47D細胞を含むべきであることを考えてみましょう。
- コールド・ピペットを使用して、コラーゲンの適切な量で細胞ペレットを再懸濁します。各ゲルはコラーゲン1.5mlので構成されていることを考えます。気泡を導入することを避けるために穏やかに細胞とコラーゲンを混ぜます。
- 細胞分布上の静電気の影響を防止するために、プレートを開梱した後、静的低減ブラシで12ウェルプレートの境界、上部と底部を磨きます。また、静的低減brush.Gentlyでブラッシングされた別の12ウェルプレート（ブランクプレート）の上に、このプレートを置き、フードの作業面との接触時の静電荷の蓄積を回避するために、ミックスの1.5ミリリットルを注ぎます12ウェルプレートの各ウェルに。
- 30分間、37℃のインキュベーターでプレートを置きます。目を削除しますインキュベーターからの電子プレートとフードの中に戻って置きます。
- P200の滅菌チップを用いて、慎重に井戸の国境から緩やかな円を描くようにゲルを切り離します。ゲルはまた、井戸の底から切り離す必要があります。
- CDFBS培地で希釈したホルモンをウェルに添加します。 10 -7 Mの最終濃度で、10 -10 Mの最終濃度およびプロラクチンでE2とR5020を使用してください。対照として、追加されたホルモンなしCDFBSメディアを使用していますが、まだ使用ホルモン株式に等しいDMSOの最高のボリュームを含みます。各ウェルは、メディアの1.5ミリリットルが含まれていることを確認してください。 37℃、5％CO 2、100％の内部3D培養物を置き 加湿組織培養インキュベーター。 2日おきにメディアを変更し、1または2週間の培養を維持します。
全体のマウント3.ゲル法
- 培養培地を除去し、各ウェルにPBSの1.5ミリリットルを追加します。
- スライドにゲルを転送します。曲線を用いて半分にゲルをカットD手術用ブレード。半分で処理を継続し、組織学的分析のために残りの半分を保存します。
- 全体スライドにマウントするための半ゲルを転送します。 5分間ゲル乾かした後、10％ホルマリンを含むコプリンジャーにスライドを転送します。
注：すべてのインキュベーションは室温で行われるべきです。 - シェーカーO / N上のコプリンジャー中でゲルを修正しました。
- ウォッシュは、シェーカー上で10分間ずつ2回PBSでスライドします。転送が70％エタノールにスライドします。シェーカーで1時間インキュベートします。カーマインミョウバンO / Nへの転送スライド。
- 次の日は、1時間ごとに70％エタノール、95％エタノールおよび100％EtOH中でシェーカー上でスライドを脱水。転送は1時間ごとに二回キシレン、シェーカー上で維持するためにスライドします。ゲルおよび厚さ1.5mmのカバースリップをマウントするために、トルエンベースの封入剤を使用してください。
- 定期的な光（顕微鏡やステレオスコープ）の下で全体のマウントを調べます。形状および内腔のより詳細な分析のために、共焦点顕微鏡を使用し、ヘリウムネオン633nmのレーザーでカーマイン色素を可視化。
組織学分析のための処理4.ゲル法
- 10％ホルマリンを含む20ミリリットルのガラスバイアルにゲルの残りの半分を転送し、シェーカーO / Nで固定します。
- シェーカー上で10分間ずつ2回PBSでゲルを洗浄してください。パラフィン包埋のために処理カセットに置きゲル。
- 70％エタノールに移しゲルは、1時間インキュベートし、1時間95％EtOHで、次の1時間の新鮮な95％エタノールに変更し、100％エタノールを1時間、および1時間の新鮮な100％エタノールに変更します。 1時間の新鮮なキシレンで再びこの時点では、ゲルは、室温での100％EtOH O / Nに格納されてもよいし、1時間キシレンでインキュベートし。
- 転写カセットをさらに2回、新鮮なパラフィンで繰り返し、真空インキュベーター中で60℃で1時間パラフィンします。
- きれいなパラフィンでプラスチック金型を埋めます。 、カセットを開き、ゲルを除去し、パラフィンを含むプラスチック金型に入れてください。パラフィンでいっぱいにし、上部にあるラベルを含むカセットの上部を追加し、ブロック冷まします。
- プラストを削除しますICカビやセクションミクロトームを使用してブロック。 HE染色および免疫細胞化学のために5μmの厚さの切片を取得します。
コラゲナーゼ処理を用いてゲルからの細胞からの細胞の5抽出
- 井戸からゲルを外し、PBSを含むペトリ皿に移します。簡単にゲルをすすぎます。
- 0.125％コラゲナーゼの2ミリリットルを含む15ミリリットルチューブにゲルを転送します。小片にゲルを破壊するために、アップピペットダウン4-5回。
- 25分間37℃でインキュベートする（ゲルは溶解し、細胞が懸濁液中にあるまで）
- 血清添加した培養培地2mlを追加します。遠心分離（千×gで、5分）、上清を捨てて細胞を収集し、細胞を再懸濁し、カウントされます。
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Representative Results
図1は、ホルモン感受性3D培養液を調製するための手順をまとめたものです。上皮構造は、単独E2の存在下および他のホルモンとの組み合わせで2週間培養ゲルの全マウントに観察されます。何のホルモンを培地（CDFBS培地）（ 図2）に追加されていない場合にのみ、単一の細胞または2-3細胞のグループが存在しています。この状態は、陰性対照としての役割を果たす。
形状、サイズ、及び管腔の存在下で変化する3D培養状構造のセル。ゲル中の構造物の分布は、典型的には不均一です。先に示したように、中央部4に見られるよりも、ゲルの境界に沿って一般的な構造があります。このため、空間的不均一で、標本間の比較は、サンプル全体に対応する領域に制限する必要があります。
コラーゲン1型は、影響を表現型Aの由来する種その結果、上皮構造5の目の品質。ラット尾コラーゲン1型ウシコラーゲンタイプ1で播種は、無秩序な細胞群（ 図3）が形成されたので、ここで使用されるように、選択されました。
上皮構造の詳細な分析は、共焦点顕微鏡（ 図4）を使用して達成することができます。丸みを帯びた細長い構造でE2処理結果（ 図4A）。 E2とより出芽構造（ 図4B）におけるプロラクチンの存在は、一方の側を彷彿とさせる携帯の突起（ 図4C）の分岐を有する不規則な構造でE2とプロメゲストン結果の存在。 z方向に成長することによって測定した場合、及びE2プラスプロメゲストンにおいて観察されたものと比較した場合、E2単独およびE2プラスプロラクチンは、組織構造を厚く。
ホルモン処理後の細胞数を定量するために、細胞はextracteありますコラゲナーゼ処理を用いてゲルからD。たとえば、この方法を使用して、我々は、抗エストロゲンICI 182,780は、3D培養（ 図5）における細胞増殖に対するE2の影響を抑制する方法を学ぶことができます。
ホルモン感受性3D培養物を調製するための図1の手順を簡潔に 、T47D細胞の単一細胞懸濁液を、ラット尾コラーゲン1型と混合し、12ウェルプレートのウェルに注入します。ゲルは、37℃/ 5％CO 2インキュベーター内で30分間、凝結させました。培養培地を添加し、ゲルをウェルから分離されます。培養物は、エンドポイントに応じて1または2週間後に収穫することができる。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
。カルミンミョウバン色素で染色した後、3D培養の図2.全マウント上皮構造、形態解析のためのROIの例を可視化するためのカルミンのミョウバンで染色した半ゲルの（A）ホールマウントはボックスで示されます。 （B）で2週間増殖させた3次元培養のWMは、メディア（何のホルモンを添加しない）とE2とプロラクチンを補充した（C）CDFBSメディアをCDFBS。スケールバーは、5000ミクロン（A）と500ミクロン（B＆C）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
3D培養に使用されるマトリックスの図3の比較。（A）Boviラット尾コラーゲンタイプ1スケールバー使用するときに組織化された構造（B）とは対照的に、細胞の無秩序なクラスタ内の1の結果は、観測されねコラーゲンタイプ：100μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
（A）E2、（B）E2 +プロラクチン及び（C）E2 + R5020で2週間処置後3次元コラーゲンゲル中で観察されたT47D構造の図4の共焦点画像 。矢印は細胞質の突起を指します。上皮構造の厚さはそれぞれ24、40および20μmでした。スケールバー：40μmで、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図1週間E2単独またはE2プラスICI 182,780のいずれかで処理5. 3D培養。細胞数コラゲナーゼ処理を用いて細胞抽出後。 （A）を培地 、（B）は 1×10 -10 Mおよび（D）で1×10 -8 MプラスE2で（C）ICI 182,780、培地プラス1×10 -10 MでのE2 CDFBS ICI 182780 1×10-7 MでプラスE2をCDFBS 1×10 -10 Mでバー：SEM この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Acknowledgments
私たちはシェリルSchaeberleによって社説貢献を大幅に感謝しています。この研究は、エイボン補助金＃02-2009-093と02-2011-095、およびAMSへNIEHS / NIH ES 08314によってサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも環境健康科学研究所や国立衛生研究所の公式見解を示すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well Tissue Culture Plates (Falcon) | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml polystyrene conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Activated Charcoal | Sigma | C-5510 | |
| Carmine Alum | Sigma | C1022-100G | |
| Collagenase, Type 3 | Worthington | S0C11784 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 | Equiped with HeNe 633nm laser |
| Dextran T-70 | Abersham/Pharmacia | 17-0280-01 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Life Technologies | 11339-021 | Phenol red-free media for hormone use |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Life Technologies | 11054-020 | Phenol red-free media for hormone use |
| 17-β-Estradiol | EMD Millipore | 3301 | Dissolved in Ethanol |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30070.03 | For use with hormones, must be Charcoal Dextran stripped |
| Filters (115 ml) | Nalgene | 380-0080, 245-0045, 120-0020 | 0.88, 0.45, 0.20 micron, respectively |
| Formalin, 10% | Fisher Scientific | SF93-20 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | |
| ICI 182,780 (fulvestrant) | Sigma Aldrich | I4409-25MG | Dissolved in DMSO |
| Microtome | Leica | RM2155 | |
| Tissue embedding media | McCormick Scientific | 39502004 | |
| Penicillin | Sigma | 7794-10MU | Dissolved in 10 ml of distilled deionized water |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | |
| Prolactin | Sigma Aldrich | L4021-50UG | Dissolved in distilled deionized water |
| Promegestone | Perkin Elmer | NLP004005MG | Dissolved in Ethanol |
| Rat-Tail Collagen | Corning | 354236 | Lots may contain varying concentrations, note accordingly |
| Scalpel | Miltex | 4311 | |
| Semi-enclosed Benchtop Tissue Processor | Leica | TP1020 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Prepare 1N NaOH stock |
| StaticMaster Anti-static brush | Amstat | C3500 | |
| Stripette Serological Pipettes | Corning | 4101 | |
| T-25 flasks | Corning | 430168 | |
| Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 15-200-403E | |
| Wheaton Vials, Glass, 20 ml | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| Xylene | VWR | 95057-822 |
References
- Barnes, C., et al. From single cells to tissues: interactions between the matrix and human breast cells in real time. PLoS ONE. 9, e93325 (2014).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen responsive cells in culture. Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 83, 2496-2500 (1986).
- Chalbos, D., Vignon, F., Keydar, I., Rochefort, H. Estrogens stimulate cell proliferation and induce secretory proteins in a human breast cancer cell line (T47D). J.Clin.Endocrinol.Metab. 55, 276-283 (1982).
- Dhimolea, E., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The role of collagen reorganization on mammary epithelial morphogenesis in a 3D culture model. Biomaterials. 31, 3622-3630 (2010).
- Dhimolea, E., Soto, A. M., Sonnenschein, C. Breast epithelial tissue morphology is affected in 3D cultures by species-specific collagen-based extracellular matrix. J.Biomed.Mat.Res.A. 100, 2905-2912 (2012).
- Krause, S., et al. Dual regulation of breast tubulogenesis using extracellular matrix composition and stromal cells. Tissue Eng Part A. 18, 520-532 (2012).
- Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. A novel 3D in vitro. culture model to study stromal-epithelial interactions in the mammary gland. Tissue Eng.Part C Methods. 14, 261-271 (2008).
- Krause, S., Maffini, M. V., Soto, A. M., Sonnenschein, C. The microenvironment determines the breast cancer cells' phenotype: organization of MCF7 cells in 3D cultures. BMC Cancer. 10, 263-275 (2010).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat.Methods. 4, 359-365 (2007).
- Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int.J.Cancer. , (2014).
- Soto, A. M., Murai, J. T., Siiteri, P. K., Sonnenschein, C. Control of cell proliferation: evidence for negative control on estrogen-sensitive T47D human breast cancer cells. Cancer Res. 46, 2271-2275 (1986).
- Speroni, L., et al. Hormonal regulation of epithelial organization in a 3D breast tissue culture model. Tissue Eng.Part C Methods. 20, 42-51 (2014).
- Vignon, F., Bardon, S., Chalbos, D., Rochefort, H. Antiestrogenic effect of R5020, a synthetic progestin in human breast cancer cells in culture. J.Clin.Endocrinol.Metab. 56, 1124-1130 (1983).
