Introduction
표준 2D 배양과는 달리, 3 차원 세포 배양 대리 모델 생리 관련 컨텍스트 번 유사한 조직에서 상피 세포 행동 연구 허용한다. 유선의 3D 문화는 유선 개발 및 신 생물의 여러 측면을 명료하게 도왔다. 그러나, 현재 3D 배양 모델의 대부분은 작업에 사용되는 인간 상피 세포주 호르몬 수용체 발현 6,7,9 부족하기 때문에 호르몬 작용을 연구하는 것이 적합하다.
여기서, 우리는 호르몬 작용 (12) 연구에 적합 인간의 유방 상피 세포의 3 차원 문화 모델을 설명합니다. 이 모델은 원래 유방 침투 유관 암종 54 세의 여성 환자로부터 얻은 흉수에서 파생 된 시판 호르몬 응답 인간 유방 상피 세포주 T47D 3,11,13을 사용한다. 우리는 매트릭스 쥐 꼬리 콜라겐 타입 1을 사용합니다. 이 3D 숭배URE 모델은 인간 유방 상피 세포에 대한 세 가지 mammotropic 호르몬 (에스트라 디올, promegestone (황체 호르몬의 유사체) 및 프로락틴)의 작용의 연구에 적합하다. 호르몬에 의한 상피의 형태는 형태 계측 학적 분석 (12)에 의해 시간이 지남에 따라 정량적으로 평가 될 수있다.
적절한 파종 밀도는 이러한 3D 문화 2 주 동안 유지 될 수 있습니다. 현재까지 구조물의 발달은 상피 형태에서 호르몬 작용 강력한 정량 평가 충분하다. 겔은 세포 증식에 대해 이전 시점에서 수확 될 수 있고, 유전자 발현 분석. 또한,이 모델은 순차 호르몬 치료의 효과를 시험하기에 적합하다; 예를 들어, 다음 주 중에 호르몬의 다른 호르몬 / 조합으로 첫 주 동안 에스트라 디올 치료 및 교체 후. 예컨대 ICI 182,780 같은 항 에스트로겐 화합물 및 에스트로겐의 효과도 STU 수이 3D 문화 모델 (12)를 사용하여 죽었다.
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Protocol
시약 1. 준비
- 10-3 M의 재고 솔루션을 만들 수있는 합성 progestagen의 promegestone (R5020) 및 에탄올 17-β-에스트라 디올 (E2)를 녹인다. 1 ㎎ / ㎖ 모액을 증류하여 탈 이온수 프로락틴을 녹인다. 10 -2 M 주식 솔루션을 만들기 위해 DMSO에 항 에스트로겐 ICI 182,780을 녹인다. 최대 6 개월 동안 -20 ° C에서 이러한 솔루션을 저장합니다.
- 숯불 덱스 트란 (CD)의 혈청 및 CDFBS 매체를 제거 :
- 30 분 동안 57 ° C의 물 중탕에 소 태아 혈청 (FBS)을 열 - 불 활성화.
참고 : 사용이 프로토콜의 나머지 부분에 대해서만 산 세척 유리합니다. - 필요한 숯의 양을 계산한다. 상기 활성탄에 의한 변위를 보상 5 % 중량 / 부피의은 분말 활성탄 무게 혈청 량보다 10 % 더 많은 양을 사용.
- 혈청 양과 동일한 양을 사용하여 차가운 탈 증류수로 두 번 세척 숯. 각 세척 C에 대한숯 펠렛 2 분 50 XG에 entrifuge. 세척 사이에 물을 제거합니다. 마지막 숯 펠렛 0.5 % 중량 / 부피의 덱스 트란 T-70을 추가합니다. 5 분 100 XG에 증류수, 탈 이온수와 원심 분리기에 다시 일시 중지합니다. 물을 대기음.
- 펠렛에 혈청의 적절한 볼륨을 추가하고 혈청에 숯 덱스 트란 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 60 분 37 ºC에서, (6 RPM) 압연 동안 품어. 20 분 동안 2,000 XG에 원심 분리기. 상층 액이 흐린 나타나는 경우, 원심 분리를 반복; 그러나, 혈청은 현재 완전히 명확하지 않을 수 있지만, 여과시 삭제됩니다.
- 큰 입자상 물질을 제거하기 위해 0.45 미크론 필터를 통해 다시 0.80 미크론 필터를 통해 여과하고. 마지막으로, 0.20 미크론 필터로 멸균 필터. 스토어는 -20 ºC에서 유리 튜브 또는 T-25 배양 플라스크에 CDFBS 필터링.
- 숯 덱스 트란은 태아 미디어 (CDFBS 미디어) 소 함유 박탈 : 페놀 레드가없는 DMEM의 375 ml의 DMEM의 125 ㎖의 혼합/ F-12. 37.5 ml의를 제거하고 숯 덱스 트란 박탈 소 태아 혈청의 동일한 볼륨으로 교체. 2 mM의 최종 농도 106 U / ㎖ 페니실린 및 L- 글루타민을 추가합니다. 그 결과 매체는 75 % DMEM, 25 % DMEM / F-12, 7.5 %의 숯불 덱스 트란 제거-FBS, 2mM의 L 글루타민, 10 (6) U / ㎖ 페니실린이다.
- 30 분 동안 57 ° C의 물 중탕에 소 태아 혈청 (FBS)을 열 - 불 활성화.
- 10X PBS, 1N의 NaOH와 증류수 탈 이온수를 준비합니다. 필요한 콜라겐 용액의 부피에 따라 각각의 충분한 양을 준비한다. 필터링 모든 솔루션을 소독. 최대 1 개월 4 ° C에서 10 배 PBS와 멸균 증류수 탈 이온수를 저장합니다. 1N NaOH 용액을 보관하지 마십시오.
- 제조업체에서 제공하는 "콜라겐 I, 쥐 꼬리의 대체 겔화 절차"에 대한 프로토콜에 따라 1 ㎎ / ㎖ 최종 농도 콜라겐 솔루션을 준비합니다. 각 겔 콜라겐 용액 1.5 ㎖로한다. 예를 들어, 제조 콜라겐 용액 (피펫 동안 손실을 고려하여 0.5 mL)을 18.5 mL의 제조12 젤. 바로 콜라겐 솔루션을 사용하거나 최대 2 ~ 3 시간 동안 얼음에 개최.
- 카마 졸업생 염료 :
- 증류수 500 ㎖에 1g 카민 2.5 g 알루미늄 칼륨 설페이트 결합. 20 분 동안 교반하는 동안 끓인다. 이상 끓는 않도록주의하세요. 추가 증류수로 다시 500 ml의에 최종 볼륨을 조정합니다.
- 항균 활성에 대한 티몰의 결정을 추가하고 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 병을 커버합니다. 각 사용하기 전에 실험실 등급의 종이 필터를 통해 필터링합니다. 최대 3 개월 카민 용액을 다시 사용합니다. 실온에서 저장, 빛으로부터 보호.
- 콜라게나 제 용액 / V w 0.125 %의 농도로 DMEM / F12 배지에서 콜라겐을 분해. 이 솔루션을 보관하지 마십시오.
쥐의 꼬리 콜라겐 타입 1 젤과 호르몬 치료 2. 3D 문화 T47D의 세포
참고 : 4 ° C에서 멸균 혈청 피펫과 피펫 팁을 유지합니다.
- 처리장단일 세포 현탁액을 Re 및 세포 수를 수행한다. 분할 T47D 세포 배양은 70 %의 합류에 도달하기 전에. 필요한 셀의 양을 포함하는 양을 원심 분리기. 한 젤은 약 75,000 T47D 세포를 포함하는 것을 고려하십시오.
- 초기 피펫을 사용하여 콜라겐의 적절한 부피 세포 펠렛을 다시 일시. 각 겔은 콜라겐의 1.5 ml의로 구성되어 있음을 고려한다. 거품을 도입 피하기 위해 조심스럽게 세포와 콜라겐을 섞는다.
- 세포의 분포에 정전기의 영향을 방지 판을 풀기 후 정전기 감소 브러시로 12 웰 플레이트의 경계, 상단과 하단 브러시합니다. 후드의 작업 표면과 접촉시 정전기의 발생을 방지하기 위해, 또한 정전기 감소 brush.Gently로 닦았 된 다른 12 웰 플레이트 (빈 접시)의 상단에이 판을 배치 믹스의 1.5 ml에 부어 12 웰 플레이트의 각 웰에.
- 30 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 일을 제거전자 인큐베이터에서 플레이트와 후드에 다시 배치합니다.
- P200 멸균 팁을 사용하여 조심스럽게 잘 국경에서 부드럽게 원을 그리 젤을 분리합니다. 겔은 웰의 바닥으로부터 분리한다.
- CDFBS 배지에서 희석 호르몬 웰에 첨가한다. 10 -7 M 최종 농도에서 10 -10 M 최종 농도와 프로락틴에서 E2 및 R5020을 사용합니다. 대조군으로 추가 호르몬하지만 여전히 사용되는 호르몬 주식과 동일한 DMSO의 높은 볼륨을 포함하지 않고 CDFBS 미디어를 사용합니다. 각 잘 미디어 1.5 ml에 포함되어 있는지 확인합니다. 37 ° C, 5 % CO 2, 100 % 내부의 3D 문화를 배치 습도 조직 문화 인큐베이터. 2 일마다 미디어를 변경, 1 ~ 2 주 동안 문화를 유지한다.
전체 마운트 3. 젤 처리
- 문화 미디어를 제거하고 각 웰에 PBS 1.5 ml에 추가 할 수 있습니다.
- 슬라이드에 젤을 전송합니다. 곡선을 사용하여 반 겔을 잘라D 수술 블레이드. 절반으로 처리를 계속 조직 학적 분석을 위해 나머지 절반을 저장합니다.
- 전체 슬라이드에 마운트의 절반 젤을 전송합니다. 5 분 동안 젤 건조하자 다음 10 % 포르말린을 포함하는 코 플린 항아리에 슬라이드를 전송합니다.
참고 : 모든 배양은 실온에서 수행해야합니다. - 통 O의 /의 N에 코 플린 항아리에 젤을 수정합니다.
- 세척 통에 10 분마다 두 번 PBS와 슬라이드. 전송은 70 %의 EtOH에 슬라이드; 통에 1 시간 동안 품어. 카마 졸업생 O / N로 전송 슬라이드.
- 다음 날, 1 시간마다 70 % EtOH로 95 % EtOH로 100 %의 EtOH에 통에 슬라이드를 탈수. 이전 두 번 1 시간마다 자일 렌 통에 유지하는 슬라이드. 젤 1.5 mm 두께 된 커버를 탑재 톨루엔 기반 장착 매체를 사용합니다.
- 일반 빛 (현미경 입체경)에서 전체 마운트를 검사합니다. 형상 및 루멘의 자세한 분석을 위해 공 초점 현미경을 사용하여 633 nm의 오펜 레이저와 카민 염료를 시각화.
조직학 분석 처리 4. 젤 처리
- 10 % 포르말린을 함유하는 20 mL 유리 바이알에 겔의 나머지 절반을 전송하고 진탕 O / N에 고정한다.
- 통에 10 분마다 PBS로 두 번 젤을 씻으십시오. 파라핀 삽입에 대한 처리 카세트에 배치 젤.
- 70 %의 EtOH로 전송 겔은, 1 시간 동안 배양하고 1 시간 동안 95 % EtOH로 다음 1 시간 동안 신선한 95 % EtOH로 변경, 100 %의 EtOH를 1 시간, 1 시간 동안 신선한 100 %의 EtOH로 변경합니다. 1 시간 동안 신선한 크실렌 다시 이때 겔은 실온에서 100 % EtOH로 O / N에 저장 될 수 있거나, 1 시간 동안 배양하고, 크실렌.
- 전사 카세트 회 이상 신선한 파라핀 반복 진공 배양기에서 60 ℃에서 1 시간 동안 파라핀.
- 깨끗한 파라핀 플라스틱 금형을 입력합니다. 카세트를 열고 젤을 제거하고 플라스틱 금형 포함 된 파라핀에 넣습니다. 파라핀과 함께 작성하고 상단에 라벨을 포함하는 카세트의 상단을 추가하고 블록이 식지.
- 비접촉식를 제거IC에서 금형 및 섹션 마이크로톰을 사용하여 블록. 그는 염색 및 면역 세포 5 음 두꺼운 부분을 얻습니다.
콜라게나 치료를 사용하여 젤의 세포에서 세포의 5. 추출
- 웰에서 겔을 제거하고 PBS를 함유하는 페트리 접시로 옮긴다. 린스 젤 잠시.
- 0.125 % 콜라게나 제 2 ㎖를 함유하는 15 ㎖의 튜브 겔을 전송. 작은 조각으로 젤을 파괴하기 위해 최대 피펫 아래로 4-5 시간.
- 25 분 동안 37 ° C에서 품어 (겔 용해 세포 현탁액에 때까지)
- 혈청 보충 배지 2 ㎖를 추가합니다. 원심 분리 (1,000 XG, 5 분), 폐기 뜨는하여 세포를 수집, 세포를 다시 일시 중지하고 계산합니다.
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Representative Results
도 1은 호르몬 성 3 차원 배양 물을 제조하는 절차를 요약 한 것이다. 상피 구조 단독 E2의 존재하에 2 주 동안 배양 및 다른 호르몬과 조합하여 겔 마운트 전체에서 관찰된다. 어떤 호르몬은 배양 배지 (CDFBS 매체) (그림 2)에 추가되지 않은 경우에만 단일 세포 또는 2-3 셀 그룹이 존재한다. 이 상태는 음성 대조군으로 작용한다.
모양, 크기, 루멘 존재 다를 3D 문화 양식 구조에서 셀. 겔 구조의 분포는 일반적으로 불균일하다. 이전에 나타낸 바와 같이, 중앙 4에서 볼보다 겔의 경계를 따라 일반적으로보다 구조가있다. 이 때문에 공간 이질의, 표본 간의 비교는 샘플에 걸쳐 지역 대응으로 제한되어야한다.
콜라겐 타입 1이 영향을 표현형을 유도하는 종결과 상피 구조 5 차 품질. 여기에 사용 된 쥐의 꼬리 콜라겐 타입 1은 조직을 파괴 셀 그룹 (그림 3)의 형성 결과 소 콜라겐 타입 1에 파종하기 때문에 선택되었다.
상피 구조의 상세한 분석은 공 촛점 현미경 (도 4)을 사용하여 달성 될 수있다. 둥근 긴 구조 (그림 4A)에서 E2 처리 결과. E2 더 많은 신진 구조 (그림 4B)에서 프로락틴 결과의 존재, 동안 측의 연상 세포 돌기 (그림 4C)을 분기와 불규칙한 구조에서 E2 및 promegestone 결과의 존재. Z 방향의 성장에 의해 측정했을 때, 및 E2 플러스 promegestone 관측과 비교할 때, E2 단독 및 E2 플러스 프로락틴 조직 구조를 두껍게.
호르몬 치료 후 세포 수를 정량하기 위하여, 세포는 아르 extracte콜라게나 제 처리를 사용하여 겔로부터 D. 예를 들어,이 방법을 이용하여, 우리는 항 에스트로겐 ICI 182780은 3D 배양에서 세포의 증식에 대한 E2의 효과 (도 5)를 억제하는 방법을 연구 할 수있다.
도 호르몬 성 차원 배양의 제조 절차 1.이. 간략하게, T47D 세포의 단일 세포 현탁액을 래트 꼬리 콜라겐 타입 1로 혼합하여 12 웰 플레이트의 웰에 주입된다. 겔은 37 ℃ / 5 % CO2 배양기에서 30 분 동안 응결 수있다. 배양 배지를 첨가하고, 겔은 잘로부터 분리된다. 문화는 엔드 포인트에 따라 1 ~ 2 주 후에 수확 할 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
. 카마 졸업생 염료로 염색 한 후 3D 문화의 그림 2. 전체 마운트 상피 구조, 형태 분석을위한 ROI의 예를 시각화하는 카민 명반으로 염색 반 겔 (A) 전체 마운트는 상자로 표시됩니다; 3D 문화의 WM은 2 주 (B)에 대한 성장은 E2 및 프로락틴 보충 미디어 (추가 더 호르몬)와 (C) CDFBS 미디어를 CDFBS 없습니다. 스케일 바는 5,000 μm의 (A) 500 μm의 (B & C). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3D 배양에 사용되는 행렬 그림 3. 비교. (A) BOVI. 100 μm의 : 쥐의 꼬리 콜라겐 유형 1. 스케일 막대를 사용하는 경우 북동 콜라겐 유형은 조직 구조 (B)에 반대 세포 조직을 파괴 클러스터, 1 결과는 관찰 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
(A) E2, (B) 및 프로락틴 E2 + (C) + E2 R5020과 이주. 처리 후 3-D 콜라겐 겔에서 관찰 T47D 구조도 4 공 촛점 이미지. 화살표는 세포질 돌기를 가리 킵니다. 상피 구조의 두께는 각각 24, 40 및 20 μm의했다. 스케일 바 :. 40 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5 3D 배양 E2 단독으로 처리하거나 또는 E2 플러스 ICI 182,780 일주. 세포 수를 콜라게나 제 처리를 사용하여 세포의 추출 후. (A)는 매체 CDFBS, (B)는 -10 M, 10-7 M 1X 플러스 E2에서 1 × -10 M 및 (D)에 1 × ICI 182,780 -8 M 플러스 E2의 (C)에 1 × ICI 182,780 매체 플러스 E2를 CDFBS 1 × -10 M.에서 바 :. SEM 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Acknowledgments
우리는 크게 셰릴 Schaeberle에 의해 편집 기여를 주셔서 감사합니다. 이 연구는 에이 보조금 # 02-2009-093과 02-2011-095, 및 AMS에 NIEHS / NIH ES 08314에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 환경 보건 과학 연구소 또는 국립 보건원의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well Tissue Culture Plates (Falcon) | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15 ml polystyrene conical Tubes | Fisher Scientific | 14-959-49D | |
| Activated Charcoal | Sigma | C-5510 | |
| Carmine Alum | Sigma | C1022-100G | |
| Collagenase, Type 3 | Worthington | S0C11784 | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM510 | Equiped with HeNe 633nm laser |
| Dextran T-70 | Abersham/Pharmacia | 17-0280-01 | |
| DMEM/F-12, HEPES, no phenol red | Life Technologies | 11339-021 | Phenol red-free media for hormone use |
| DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Life Technologies | 11054-020 | Phenol red-free media for hormone use |
| 17-β-Estradiol | EMD Millipore | 3301 | Dissolved in Ethanol |
| Ethanol | Koptec | V1001 | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30070.03 | For use with hormones, must be Charcoal Dextran stripped |
| Filters (115 ml) | Nalgene | 380-0080, 245-0045, 120-0020 | 0.88, 0.45, 0.20 micron, respectively |
| Formalin, 10% | Fisher Scientific | SF93-20 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030-081 | |
| ICI 182,780 (fulvestrant) | Sigma Aldrich | I4409-25MG | Dissolved in DMSO |
| Microtome | Leica | RM2155 | |
| Tissue embedding media | McCormick Scientific | 39502004 | |
| Penicillin | Sigma | 7794-10MU | Dissolved in 10 ml of distilled deionized water |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | |
| Phosphate Buffered Saline pH 7.4 | Sigma Aldrich | P3813-10PAK | |
| Prolactin | Sigma Aldrich | L4021-50UG | Dissolved in distilled deionized water |
| Promegestone | Perkin Elmer | NLP004005MG | Dissolved in Ethanol |
| Rat-Tail Collagen | Corning | 354236 | Lots may contain varying concentrations, note accordingly |
| Scalpel | Miltex | 4311 | |
| Semi-enclosed Benchtop Tissue Processor | Leica | TP1020 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich | S5881 | Prepare 1N NaOH stock |
| StaticMaster Anti-static brush | Amstat | C3500 | |
| Stripette Serological Pipettes | Corning | 4101 | |
| T-25 flasks | Corning | 430168 | |
| Tissue Cassettes | Fisher Scientific | 15-200-403E | |
| Wheaton Vials, Glass, 20 ml | Fisher Scientific | 03-341-25D | |
| Xylene | VWR | 95057-822 |
References
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