Abstract
Somministrazione mirata di cellule e agenti terapeutici a favore di un'ampia gamma di applicazioni biomediche concentrando l'effetto terapeutico al sito bersaglio, riducendo al minimo gli effetti deleteri a siti fuori bersaglio. Il targeting cellule magnetica è una tecnica di consegna efficiente, sicuro, e diretto. Nanoparticelle di ossido di ferro (superparamagnetic spion) sono biodegradabili, biocompatibili, e possono essere endocitosi in cellule di renderli sensibili ai campi magnetici. Il processo di sintesi prevede la creazione di magnetite (Fe 3 O 4) nanoparticelle seguita da emulsificazione ad alta velocità per formare una poli (lattico-co-glicolico) (PLGA) rivestimento. Le SPIONs PLGA-magnetite sono circa 120 nm di diametro compreso nucleo diametro magnetite circa 10 nm. Quando posto in terreno di coltura, SPIONs sono naturalmente endocitosi dalle cellule e memorizzati come piccoli cluster all'interno di endosomi citoplasmatici. Queste particelle impartiscono massa magnetica sufficiente per le celluleper consentire il targeting entro campi magnetici. Numerosi separazione delle cellule e applicazioni destinate sono attivati per rendere vari tipi di cellule sensibili ai campi magnetici. SPIONs hanno una varietà di altre applicazioni biomediche e compreso l'uso come agente di contrasto imaging medico, farmaco o gene somministrazione mirata, saggi diagnostici, e la generazione di ipertermia locale per la terapia tumorale o saldatura del tessuto.
Protocol
1. Sintesi di magnetite Gel
- Lavare la vetreria con acido cloridrico concentrato seguita da acqua deionizzata seguita da alcool etilico. Lasciare asciugare O / N, preferibilmente in un forno di essiccazione.
ATTENZIONE! acido cloridrico è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale e lavorare in una cappa aspirante; alcol etilico è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale. - Utilizzare una bottiglia di Drechsel di de-gas 500 ml di H 2 O deionizzata facendo gorgogliare delicatamente N 2 gas per 30 minuti.
- Set-up l'apparato di sintesi di magnetite all'interno di una cappa.
- Posizionare un pallone ml a tre colli a fondo tondo da 500 all'interno di un riscaldatore cuffia riscaldante e fissare il collo centro utilizzando una pinza e stand.
- Installare un setto di gomma in uno dei colli laterali del pallone a fondo rotondo e condensatore a riflusso con un setto di gomma nel collo lato rimanente. Continuamente scorrere acqua fredda attraverso il refrigerante a ricadere.
- Puntura °e setto di gomma del pallone a fondo tondo con un ago collegato ad una linea del gas N 2 e forare il setto di gomma del condensatore a riflusso con un ago collegato ad una linea di gas in esecuzione ad un gorgogliatore (cioè, matraccio con acqua) per visualizzare efflusso del gas.
- Installare una pala lama nel centro collo del pallone a fondo tondo tramite un adattatore pagaia. Attaccare albero della pala lama a un agitatore montato su un supporto.
- Spurgare il pallone a fondo tondo con N 2 gas e lasciare N 2 gas che scorre ad una velocità bassa ma rilevabile.
- Rimuovere il condensatore a riflusso del pallone a fondo tondo ed aggiungere 1.000 g di ferro (III) cloruro, 0,6125 g di ferro (II) cloruro tetraidrato, e 50 ml di degassati H 2 O.
ATTENZIONE! di ferro (III) cloruro e ferro (II) cloruro tetraidrato sono nocivi - indossare dispositivi di protezione individuale. - Sostituire il condensatore a ricadere e mescolare a 1.000 giri, mentre il riscaldamento a 50° C. Mescolando in queste condizioni produce 10 nm nanoparticelle di magnetite diameter.
- Una volta a 50 ° C, aggiungere 10 ml di soluzione di idrossido di ammonio 28% iniettando attraverso il tappo di gomma nel pallone a fondo tondo pur agitazione.
ATTENZIONE! idrossido di ammonio è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale.
NOTA: La soluzione di idrossido di ammonio è utilizzato per precipitare magnetite e la soluzione dovrebbe diventare nero. - Rimuovere il setto di gomma e N 2 linea gas dal pallone a fondo tondo e calore a 90 ° C per evaporare l'ammoniaca gassosa mentre ancora agitazione.
NOTA: È facoltativa per mantenere il flusso di N 2 nel pallone a fondo tondo perforando setto di gomma della condensatore a riflusso, tuttavia, l'ossidazione di magnetite per maghemite è trascurabile durante questa fase. - Una volta a 90 ° C, aggiungere 1 ml di acido oleico nel pallone a fondo tondo pur agitazione. L'acido oleico è utilizzato per rivestire la magnetite nananoparticelle di per formare gel magnetite.
ATTENZIONE! acido oleico è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale. - Sostituire il setto di gomma e N 2 linea del gas sul pallone a fondo tondo e rimuovere il refrigerante a ricadere.
- Spegnere il fuoco e mescolate a 500 rpm per 2 ore.
- Rimuovere il pallone a fondo tondo dal riscaldatore cuffia riscaldante e decantare il liquido in eccesso mentre usando un magnete forte tenuto contro il fondo del pallone di trattenere il gel magnetite.
ATTENZIONE! gestire il forte magnete con estrema cura per evitare danni o lesioni. - Lasciare che il gel di magnetite asciugare O / N (facoltativo).
2. Purificazione di magnetite Gel
- Aggiungere 40 ml di esano nel pallone a fondo tondo di sciogliere il gel magnetite
ATTENZIONE! esano è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale e lavorare in una cappa aspirante. - Utilizzare un imbuto separatore con 40 ml di de-gasati H 2 O per rimuovere residui di H 2 O from la soluzione magnetite.
- Versare lentamente la soluzione di magnetite sul H 2 O nel imbuto separatore e miscelare delicatamente il liquido in due fasi per 5 minuti.
- Scolare fuori e scartare la frazione acquoso inferiore.
- Aggiungere lentamente 40 ml di degassati H 2 O a imbuto separatore tale che si deposita sotto la soluzione magnetite e miscelare delicatamente e scaricare come prima.
- Ripetere per lavare per la terza volta.
- Trasferire la soluzione di magnetite di una beuta, aggiungere un paio di spatole per un valore di solfato di sodio anidro e agitare per rimuovere ogni residuo H 2 O residua dalla soluzione di magnetite.
- Filtrare la soluzione attraverso carta da filtro magnetite 1 micron in un imbuto filtro per rimuovere il solfato di sodio e residua H 2 O.
NOTA: è consigliabile farsi accompagnare vuoto. - Trasferire la soluzione magnetite ad un pallone di evaporazione 50 ml e utilizzare un evaporatore rotante per evaporare l'esano per2 h con le seguenti condizioni: velocità di rotazione moderate, vuoto applicato, evaporando pallone in un bagno a 50 ° C di acqua, e 24 ° C l'acqua che circola attraverso il condensatore.
NOTA: In alternativa, conservare il gel di magnetite prima del rivestimento con PLGA.
3. Rivestimento di magnetite di nanoparticelle con PLGA Shell
- Sciogliere 3,60 g di PLGA (75/25 blend) in 240 ml di acetato di etile per creare un (m / v) di 1,5%. ATTENZIONE: acetato di etile è dannoso - indossare dispositivi di protezione individuale e lavorare in una cappa aspirante.
- Sciogliere 25.00 g di Pluronic F-127 in 500 ml di degassati H 2 O con un agitatore magnetico per creare un (m / v) 5,0%.
NOTA: Pluronic F-127 è un copolimero a blocchi anfifilo non ionico che agisce come un tensioattivo biocompatibile. Aiuta a stabilizzare l'emulsione olio-in-acqua nel passo 3.3.2. - Utilizzando un microspatula, raccogliere il gel di magnetite in sei 0,040 g aliquote all'interno fiale di vetro ponderati. Perform il seguente processo di rivestimento e lavaggio per ciascuna aliquota.
NOTA: Le aliquote sono necessari per garantire una gestione efficiente e decantazione magnetico, che consentirà di massimizzare purezza e resa, riducendo al minimo la degradazione prima di liofilizzazione al punto 4.- Aggiungere a 0,040 g di gel un'aliquota magnetite e 40 ml della soluzione di PLGA in un beaker di plastica e sonicare in ultrasuoni per 10 minuti.
- Aggiungere 80 ml della soluzione Pluronic nel becher di plastica ed emulsionare immediatamente con un miscelatore da laboratorio al valore massimo per 7 minuti per formare il rivestimento PLGA sulle nanoparticelle di magnetite come una emulsione olio-in-acqua.
- Diluire immediatamente la soluzione Spion in 1 L di H 2 O deionizzata e ultrasuoni per 1 h in una cappa per evaporare l'acetato di etile.
- Posizionare un forte magnete accanto alla soluzione Spion e mescolare delicatamente per raccogliere SPIONs brunastre al magnete.
NOTA: potrebbe essere necessario mescolare ad intermittenza per diverse ores prima che la soluzione diventa biancastra indicando che la maggior parte dei SPIONs sono stati raccolti. - Decantare la soluzione acquosa, pur mantenendo le SPIONs nel bicchiere con il magnete.
- Lavare i SPIONs tre volte di seguito.
- Sospendere le SPIONs in 1 L di deionizzata H 2 O.
- Sonicare la soluzione Spion per 20 minuti.
- Posizionare un forte magnete accanto alla soluzione Spion e mescolare delicatamente per raccogliere SPIONs brunastre al magnete. Potrebbe essere necessario agitare intermittenza per diverse ore prima la soluzione diventa chiara indicando che la maggior parte dei SPIONs sono stati raccolti.
- Decantare la soluzione acquosa, pur mantenendo le SPIONs nel bicchiere con il magnete.
- Raccogliere le SPIONs sintetizzati da ciascuna delle sei aliquote gel magnetite in una singola fiala di vetro ponderata in sospensione acquosa. Opzionalmente decantare l'acqua in eccesso magneticamente, se necessario.
4. Fermo-Essiccazione di SPIONs
- Congelare la soluzione spion.
- Liofilizzare la soluzione Spion O / N in un liofilizzatore.
- Pesare i SPIONs liofilizzati. SPIONs liofilizzati possono essere conservati a -20 ° C fino al momento per l'etichettatura delle cellule.
NOTA: Conservare a -20 ° C riduce drammaticamente cinetica di degradazione e aumenta la durata di conservazione.
5. Etichettatura di Celle con SPIONs
- Sospendere una aliquota di SPIONs in tampone fosfato salino (PBS) ad una concentrazione di 40 mg / ml e con ultrasuoni per 30 minuti.
- Aggiungere la soluzione in un pallone Spion quasi confluenti di cellule ad una concentrazione di 5 microlitri / ml di mezzo di coltura cellulare. Garantire una distribuzione uniforme agitandola lentamente il pallone.
- Incubare le cellule per 16 ore a 37 ° C.
- Aspirare delicatamente terreno di coltura e lavare le cellule due volte con PBS.
- Raccogliere le cellule magneticamente marcate e utilizzare per gli esperimenti.
- Soluzione spion non utilizzata può essere conservato a 4 ° C e dovrebbe essere noicato nel giro di pochi mesi. Con ultrasuoni per 30 minuti prima di ogni utilizzo.
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Representative Results
Nanoparticelle di magnetite sono circa 10 nm di diametro a seguito di agitazione una soluzione acquosa di ferro (III) cloruro e ferro (II) cloruro tetraidrato a 50 ° C e 1.000 rpm (Figura 1). Questi risultati dimostrano riuscita sintesi di nanoparticelle di magnetite. È importante verificare la dimensione e la forma delle nanoparticelle di magnetite prelevati da un piccolo campione di batch quando si tenta la sintesi per la prima volta. Microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è il metodo preferito per la visualizzazione di queste particelle. Il lotto deve essere eliminata e la sintesi dovrebbe essere tentato di nuovo se le nanoparticelle di magnetite non sono di circa 10 nm di diametro e sferica come mostrato in Figura 1.
Rivestimento nanoparticelle di magnetite con PLGA utilizzando un alta velocità risultati emulsionante in SPIONs PLGA-magnetite con un diametro di 120 nm (Figura 2). Questi risultati dimostrano successosintesi di SPIONs PLGA-magnetite. È importante verificare la dimensione e la forma di SPIONs PLGA-magnetite prelevati da un piccolo campione di batch quando si tenta la sintesi per la prima volta. Microscopia elettronica a scansione (SEM) è il metodo preferito per la visualizzazione di queste particelle. Il lotto deve essere scartato e la sintesi dovrebbe essere tentato di nuovo se i SPIONs PLGA-magnetite non sono circa 120 nm in diametro e sferica, come illustrato nella figura 2. Mentre le particelle più grandi o più piccoli possono essere desiderabili per certe applicazioni, la composizione sarà sconosciuta e quindi cella etichettatura, suscettività magnetica, e la citotossicità sarà imprevedibile.
L'incubazione delle cellule endoteliali escrescenza sangue con SPIONs per 16 hr risultati in endocitosi delle nanoparticelle (Figura 3). Questi risultati dimostrano etichettatura successo di cellule con SPIONs. È importante verificare la presenza di SPIONs entro cellule prelevate daun piccolo campione della partita quando tenta l'etichettatura per la prima volta. Microscopia elettronica a trasmissione è il metodo preferito per visualizzare queste cellule spion marcato. Le cellule devono essere scartati e le etichette dovrebbero essere di nuovo tentato se i SPIONs PLGA-mangetite non appaiono come rotondo particelle nere ammassate all'interno di endosomi citoplasma come mostrato in Figura 3. Inoltre, minori concentrazioni di SPIONs potrebbero non consentire cellulare magnetico targeting e concentrazioni elevate di SPIONs possono essere citotossici. Se necessario, la concentrazione di SPIONs utilizzati per cellule etichette può essere regolata di conseguenza.
La quantità di ferro caricati nelle celle è sufficiente per raggiungere cattura magnetica di cellule vitali ai dispositivi medici impiantabili ferromagnetici (Figura 4). Questi risultati dimostrano il successo di targeting cellule magnetico spion-mediata. Se una cella più forte effetto di mira è desiderato, la strategia preferita è quella di IncreaSE la forza o la pendenza del campo magnetico generato o applicata 8,30. L'aumento della concentrazione di SPIONs utilizzati per le celle delle etichette dovrebbe essere processato solo come ultima risorsa a causa di problemi di citotossicità. Se migliorato la vitalità cellulare è desiderato, la concentrazione di SPIONs utilizzati per cellule etichetta deve essere ridotta.
Figura 1. immagine TEM di nanoparticelle di magnetite. Magnetite nanoparticelle sono circa 10 nm di diametro visti da microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Le particelle sono sferiche e dimensioni uniformi. Barra di scala = 100 nm. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Immagine TEM di una cellula endoteliale magneticamente marcate. Una cellula endoteliale conseguenza sangue magneticamente etichettati visualizzati mediante microscopia elettronica a trasmissione (TEM). Le SPIONs sono naturalmente endocitosi dalle cellule e memorizzati in piccoli gruppi all'interno di endosomi citoplasmatici. Sinistra scala bar = 2 micron e bar proprio scale = 0.5 micron. Re-stampa con il permesso di 24./files/ftp_upload/53099/53099fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. fluorescenza immagine al microscopio di cattura delle cellule magnetiche. Cellule endoteliali magneticamente etichettati sono attratti da uno stent vascolare ferromagnetico (a destra) a un tasso significativamente più alto rispetto a stent non magnetico (a sinistra). Bar Scala = 100 micron. Ristampa con il permesso di 24. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Come con qualsiasi protocollo di sintesi di nanoparticelle, la purezza dei reagenti chimici è fondamentale per ottenere SPIONs alta qualità che avranno effetti citotossici minimi. È quindi importante per l'acquisto reagenti molto puri compreso l'acido oleico (≥99%), ferro (II) tetraidrato Cloruro (≥99.99%), ferro (III) cloruro (≥99.99%), acetato di etile (grado HPLC, ≥99.9% ), esano (grado HPLC, ≥97.0%), idrossido di ammonio (≥99.99%) e solfato di sodio (≥99.0%). È di particolare importanza per l'acquisto molto puro e di alta qualità PLGA, che può essere relativamente costoso. Inoltre, tutta la vetreria deve essere accuratamente lavato con acido cloridrico, acqua deionizzata, e alcool etilico e lasciata asciugare prima dell'uso.
Analogamente, i passaggi di purificazione e di lavaggio all'interno del protocollo sono fondamentali per garantire che i SPIONs finali saranno di alta qualità e hanno effetti citotossici minimi. Il gel di magnetite deve essere privo diidrossido di ammonio molto, acqua, ed esano possibile prima rivestimento con PLGA. Di conseguenza, gran parte del protocollo è dedicata a garantire la purezza del gel magnetite. Successivamente, i SPIONs PLGA-magnetite devono essere privi di acetato di etile, Pluronic, e l'eccesso di PLGA. Le fasi finali spion lavaggio sono più in termini di tempo parte del protocollo, ma devono essere completati per garantire elevata purezza. In particolare, la raccolta magnetica delle particelle durante ogni fase di lavaggio può richiedere molto tempo. Mescolare la soluzione può aumentare notevolmente la velocità di raccolta delle particelle, ma agitatori magnetici non può essere utilizzato. Agitatori operanti a bassa velocità sono il mezzo più efficace per una rapida raccolta delle particelle. Garantire una grande collezione di marrone SPIONs appare al magnete e la soluzione appare bianco o chiaro prima decantazione. Questo spesso può richiedere diverse ore di agitazione, ma si tradurrà in una resa finale più elevata. Le fasi di decantazione magnetici servono anche per assicurare che solo magnetic particelle vengono trattenute mentre tutti i materiali non magnetici vengono scartati.
Livelli di ferro eccessivi possono essere citotossici, quindi la quantità di massa magnetica che può essere impartita una cella utilizzando questa tecnica è limitata. La concentrazione di ferro può essere necessario diminuito per i tipi di cellule particolarmente sensibili o aumento per i campi magnetici particolarmente deboli, ma il protocollo qui descritto fornisce un punto di partenza dimostrato di bilanciare sicurezza e l'efficacia. Le SPIONs sintetizzati da questo protocollo sono costituiti da una soluzione con un rapporto 01:15 in massa di magnetite di PLGA e SPIONs vengono introdotti cellule ad una concentrazione di 200 ug / ml di mezzo di coltura cellulare. Uno di questi parametri possono essere regolati per alterare la quantità di ferro endocitosi da ciascuna cella, se necessario.
SPIONs sono sicuri per l'impianto umano e saranno biodegradabili nel tempo (emivita di circa 40-50 giorni) 31. Sia la magnetite e PLGA formano DEGRAD innocuoprodotti azioni e vengono cancellati dal corpo attraverso vie naturali 32. La natura biodegradabile dei SPIONs significa eventuali effetti citotossici diminuirà con il tempo, ma limita anche le possibili applicazioni a quelli che non necessitano di cellule per mantenere le loro proprietà magnetiche al di là di un paio di mesi. SPIONs hanno anche il vantaggio di etichettatura cellule e impartire loro effetti magnetici senza la necessità di proteine di superficie né il targeting ligandi che sono sensibili alla formazione di una corona proteine per esposizione con l'ambiente biologico 33,34.
Impartire proprietà magnetiche alle cellule è utile per una vasta gamma di applicazioni biomediche che richiedono la consegna cellula bersaglio o di smistamento 29. Una varietà di tipi di cellule hanno dimostrato la capacità di fagocitare tutta sicurezza SPIONs tra cui le cellule staminali mesenchimali 35, le cellule progenitrici endoteliali 36, cellule insulari beta 37, e le cellule staminali neurali 38. Cel magnetical Il targeting può essere preferito altra cella tecniche di targeting quando un alto grado di controllo delle condizioni di consegna è necessario.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metal basis | Sigma-Aldrich | 338818-100ML | Harmful reagent - wear personal protective equipment |
| Dreschel bottle, 500 ml | Ace Glass | 5516-16 | |
| Ethyl Acetate, CHROMASOLVR Plus, for HPLC, 99.9% | Sigma-Aldrich | 650528-1L | Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | Harmful reagent - wear personal protective equipment |
| Evaporating flask, 50 ml, 24/40 joint | Sigma-Aldrich | Z515558 | For use with rotoevaporator |
| Filter paper, 3 cm dia, grade 1 | Fisher | 09-805P | For use with glass filter funnel |
| Glass beakers, 1 L | Fisher | FB-101-1000 | For washing SPIONs |
| Glass filter funnel, vacuum hose adapter, fits 24/40, 30 mL | Fisher | K954100-0344 | |
| Glass vial caps | Fisher | 03-391-46 | For use with glass vials |
| Glass vials, 2 ml | Fisher | 03-391-44 | For collecting magnetite gel & SPIONs |
| Hexane, CHROMASOLVR, for HPLC, ≥97.0% (GC) | Sigma-Aldrich | 34859-1L | Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood |
| Iron(II) chloride tetrahydrate, ≥99.99% trace metals basis | Sigma-Aldrich | 380024-5G | Harmful reagent - wear personal protective equipment |
| Iron(III) chloride anhydrous, powder, ≥99.99% trace metals basis | Sigma-Aldrich | 451649-1G | Harmful reagent - wear personal protective equipment |
| Isomantle heater, 500 mL | Voight Global | EM0500/CEX1 | |
| Laboratory mixer | Silverson | L5M-A | |
| Lyophilizer | Labconco | 7670520 | |
| Microspatulas | Fisher | 21-401-25A | For transfering magnetite gel |
| NdFeB magnet, 1 in x 1 in x 1 in | Amazing Magnets | C1000H-M | Very strong magnet, handle with care |
| Oleic acid, ≥99% (GC) | Sigma-Aldrich | O1008-5G | Store in freezer; Harmful reagent - wear personal protective equipment |
| Overhead stirrer | IKA | 2572201 | |
| Overhead stirrer clamp | IKA | 2664000 | For use with overhead stirrer |
| Overhead stirrer H-stand | IKA | 1412000 | For use with overhead stirrer |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Plastic beakers, 250 ml | Fisher | 02-591-28 | |
| PLGA PURASORB PDLG (75/25 blend) | Purac | PDLG 7502 | PDLG 7502A may be used as well; Store in freezer |
| Pluronic F-127 powder, BioReagent, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| PTFE expandable blade paddle, 8 mm dia | SciQuip | SP4018 | |
| PTFE vessel adapter, fits 24/40, 8 mm dia paddle | Monmouth Scientific | PTFE Vessel Adaptor A480 | For use with PTFE expandable blade paddle |
| Recirculating chiller | Clarkson | 696613 | For use with rotoevaporator |
| Reflux condenser, fits 24/40, 250 mm | Ace Glass | 5997-133 | |
| Rotoevaporator | Clarkson | 216949 | |
| Rubber septa, fits 24/40 | Ace Glass | 9096-56 | |
| Separatory funnel with stopper, 250 ml | Fisher | 10-438E | |
| Sodium sulfate ACS reagent, ≥99.0%, anhydrous, granular | Sigma-Aldrich | 239313-500G | |
| Three neck round bottom flask, angled, 24/40 joints, 500 ml | Ace Glass | 6948-16 | |
| Ultrasonic cleaner perforated pan | Fisher | 15-335-20A | For use with ultrasonic cleaner |
| Ultrasonic cleaner, 2.8 L | Fisher | 15-335-20 | |
| Vacuum controller | Clarkson | 216639 | For use with rotoevaporator (optional) |
| Vacuum pump | Clarkson | 219959 | For use with rotoevaporator |
References
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