Abstract
Entrega direccionada de células e agentes terapêuticos beneficiaria uma vasta gama de aplicações biomédicas, concentrando-se o efeito terapêutico no sítio alvo, enquanto minimizam os efeitos deletérios para locais fora do alvo. Segmentação célula magnética é uma técnica de entrega eficiente, segura e simples. Nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético (spion) são biodegradáveis, biocompatíveis, e pode ser sujeita a endocitose nas células para as tornar sensível aos campos magnéticos. O processo de síntese envolve a criação de magnetite (Fe 3 O 4) nanopartículas seguido por emulsificação a alta velocidade para formar uma poli (ácido láctico-co-glicólico) revestimento (PLGA). Os SPIONs PLGA-magnetita são aproximadamente 120 nm de diâmetro incluindo a cerca de 10 nm núcleo de magnetita diâmetro. Quando colocado em meio de cultura, são naturalmente SPIONs endocitose pelas células e armazenadas como pequenos aglomerados dentro de endossomas citoplasmáticos. Estas partículas conferem massa magnético suficiente para as célulaspara permitir o direccionamento para dentro de campos magnéticos. Numerosos separação de células e aplicações de segmentação são ativadas por prestar diversos tipos de células que respondem a campos magnéticos. SPIONs ter uma variedade de outras aplicações biomédicas, incluindo também o uso como um agente de contraste para imagiologia médica, a entrega de drogas ou gene alvo, ensaios de diagnóstico e geração de hipertermia local para terapia de tumor ou tecido de solda.
Protocol
1. Síntese de magnetita Gel
- Lave todos os vidros por meio de ácido clorídrico concentrado seguido por água desionizada seguido de álcool etílico. Deixar secar S / N, de preferência num forno de secagem.
CUIDADO! ácido clorídrico é prejudicial - usar equipamento de protecção pessoal e trabalho em um exaustor; álcool etílico é prejudicial - usar equipamento de protecção pessoal. - Utilize uma garrafa Dreschel para de-gás 500 ml de H2O desionizada fazendo borbulhar suavemente N2 gasoso durante 30 minutos.
- Set-up do aparelho síntese magnetita dentro de um exaustor química.
- Coloque um frasco de fundo redondo ml com três gargalo de 500 dentro de um aquecedor de manta de aquecimento e garantir o centro pescoço usando uma pinça e stand.
- Instalar um septo de borracha em uma das gargantas laterais do balão de fundo redondo e condensador de refluxo com um septo de borracha para dentro do gargalo lado restante. Continuamente correr água fria através do condensador de refluxo.
- Punção the septo de borracha do balão de fundo redondo com uma agulha conectada a uma linha de gás N2 e punção septo de borracha do condensador de refluxo com uma agulha conectada a uma linha de gás que funciona a um borbulhador (isto é, a garrafa com água) para visualizar saída de gás.
- Instalar uma pá lâmina no centro do pescoço do frasco de fundo redondo através de um adaptador de remo. Encaixar o eixo da pá de lâmina para um agitador de topo montado sobre um suporte.
- Purgar o balão de fundo redondo com gás N2 e deixar N 2 gás que flui a uma taxa baixa mas detectável.
- Remover o condensador de refluxo a partir do balão de fundo redondo e adicionar 1,000 g de ferro (III), cloreto de 0,6125 g de ferro (II) tetra-hidrato de cloreto, e 50 ml de desgaseificado H2O
CUIDADO! de ferro (III) e ferro (II) tetra-cloreto são prejudiciais - usar equipamento de protecção pessoal. - Substituir o condensador de refluxo e agita-se a 1.000 rpm, enquanto se aquecia a 50° C. A agitação sob estas condições produz nanopartículas de magnetite 10 nm de diâmetro.
- Uma vez a 50 ° C, adiciona-se 10 ml de solução de hidróxido de amónio a 28% por injecção através do septo de borracha no frasco de fundo redondo, enquanto ainda se agitava.
CUIDADO! hidróxido de amônio é nocivo - usar equipamento de protecção pessoal.
NOTA: A solução de hidróxido de amónio é usado para precipitar a magnetite e a solução deve ficar preto. - Remover o septo de borracha e N2 linha de gás a partir do balão de calor e de fundo redondo a 90 ° C para evaporar o amoníaco gasoso, enquanto ainda se agitava.
NOTA: É opcional para manter o fluxo de N 2 para o balão de fundo redondo através da perfuração do septo de borracha do condensador de refluxo, no entanto, a oxidação da magnetite de maghemite é insignificante durante este passo. - Uma vez a 90 ° C, adiciona-se 1 ml de ácido oleico para o balão de fundo redondo, enquanto ainda se agitava. O ácido oleico é utilizado para revestir a magnetita ndnoparticles para formar gel de magnetite.
CUIDADO! ácido oleico é prejudicial - usar equipamento de protecção pessoal. - Substituir o septo de borracha e N2 linha de gás para o balão de fundo redondo e remover o condensador de refluxo.
- Desligue o fogo e mexa a 500 rpm durante 2 horas.
- Retirar o frasco de fundo redondo a partir da manta de aquecimento do aquecedor e decanta-se o líquido restante, enquanto utilizando um íman forte realizada contra o fundo do frasco para reter o gel de magnetite.
CUIDADO! lidar com a forte ímã com extremo cuidado para evitar danos ou ferimentos. - Permitir que a O gel de magnetite seco ao ar / N (opcional).
2. Purificação de magnetita Gel
- Adicionar 40 ml de hexano para o balão de fundo redondo para dissolver o gel de magnetite
CUIDADO! hexano é prejudicial - usar equipamento de protecção pessoal e trabalho em um exaustor. - Utilizar um funil separador com 40 ml de desgaseificado H2O residual para remover H 2 O frosou a solução magnetite.
- Lentamente, deitar a solução de magnetite na H2O no funil de separação e agitar suavemente o líquido de duas fases, durante 5 minutos.
- Escorra e descarte a fração aquosa inferior.
- Adiciona-se lentamente 40 ml de desgaseificado H2O ao funil de separação de tal modo que se estabelece em baixo da solução de magnetite e agitar suavemente e drenar como antes.
- Repetir a lavagem para uma terceira vez.
- Transferir solução magnetita para um Erlenmeyer, adicione algumas espátulas no valor de sulfato de sódio anidro, e agite para remover qualquer remanescente residual H 2 O a partir da solução de magnetita.
- Filtrar a solução através de papel de filtro de magnetite 1 uM num funil de filtro para remover o sulfato de sódio residual e H 2 O.
NOTA: É recomendável assistência de vácuo. - Transferir a solução para um balão de magnetite evaporação de 50 ml e usar um evaporador rotativo, para evaporar o hexano durante2 h, com as seguintes condições: velocidade de rotação moderado, vácuo aplicado, evaporando balão num banho de água a 50 C ° e 24 ° C de circulação de água através do condensador.
NOTA: Opcionalmente, armazenar o gel magnetite antes do revestimento com PLGA.
3. Revestimento de magnetita com nanopartículas PLGA Shell
- Dissolve-se 3,60 g de PLGA (75/25 mistura) em 240 ml de acetato de etilo, para se criar uma (m / v) de solução de 1,5%. CUIDADO: acetato de etilo é prejudicial - usar equipamento de protecção pessoal e trabalho em um exaustor.
- Dissolve-se 25,00 g de Pluronic F-127 em 500 ml de-gaseados de H2O utilizando um agitador magnético para criar um (m / v) de solução de 5.0%.
NOTA: o Pluronic F-127 é um copolímero em bloco anfifílico não iónico que actua como um tensioactivo biocompatível. Ele ajuda a estabilizar a emulsão de óleo-em-água no passo 3.3.2. - Usando um microspatula, recolher o gel de magnetita em seis 0,040 g alíquotas dentro de frascos de vidro ponderadas. Perform o seguinte processo de revestimento e de lavagem para cada alíquota.
NOTA: As alíquotas são necessárias para garantir uma gestão eficiente e decantação magnética, que irá maximizar a pureza e rendimento, minimizando a degradação antes da liofilização na etapa 4.- Adicionar uma alíquota de 0,040 g de gel de magnetite e 40 ml da solução de PLGA a um copo de plástico e sonicado num aparelho de limpeza de ultra-sons durante 10 minutos.
- Adicionar 80 ml da solução de Pluronic para o copo de plástico e emulsionar imediatamente com um misturador de laboratório para o nível mais alto durante 7 minutos para formar o revestimento de PLGA em que as nanopartículas de magnetite preparada como uma emulsão de óleo-em-água.
- Imediatamente diluir a solução spion em 1 L de H2O desionizada e sonicado durante 1 h numa hote química para evaporar o acetato de etilo.
- Coloque um ímã forte ao lado da solução spion e mexa delicadamente para coletar SPIONs acastanhadas no ímã.
NOTA: Pode ser necessário agitar de forma intermitente durante várias horass antes de a solução torna-se esbranquiçada indicando que a maioria das SPIONs foram recolhidos. - Decantar a solução aquosa, mantendo as SPIONs no copo com o ímã.
- Lavar as SPIONs três vezes como se segue.
- Suspender os SPIONs em 1 L de H 2 O. desionizada
- Sonicar a solução spion por 20 minutos.
- Coloque um ímã forte ao lado da solução spion e mexa delicadamente para coletar SPIONs acastanhadas no ímã. Pode ser necessário agitar intermitentemente durante várias horas antes de a solução se tornar clara, indicando que a maioria das SPIONs foram recolhidos.
- Decantar a solução aquosa, mantendo as SPIONs no copo com o ímã.
- Recolher os SPIONs sintetizados a partir de cada um dos seis alíquotas de gel de magnetite em um único frasco de vidro ponderado, tal como uma suspensão aquosa. Opcionalmente decantar o excesso de água magneticamente, conforme necessário.
4. Congelamento-drying de SPIONs
- Congelar a solução spion.
- Liofilizar a solução spion O / N em um liofilizador.
- Pesar os SPIONs liofilizados. SPIONs liofilizados podem ser armazenados à temperatura de -20 ° C até ser usado para a marcação de células.
NOTA: O armazenamento a -20 ° C, reduz drasticamente cinética de degradação e aumenta a vida de prateleira.
5. Rotulagem de células com SPIONs
- Suspende-se uma alíquota de SPIONs em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a uma concentração de 40 mg / ml e sonicar durante 30 min.
- Adicionar a solução para um balão spion quase confluente de células a uma concentração de 5 ul / ml de meio de cultura celular. Assegurar uma distribuição uniforme por balançando suavemente o frasco.
- Incubam-se as células durante 16 horas a 37 ° C.
- Suavemente aspirar meio de cultura e lavar as células duas vezes com PBS.
- Coletar células magneticamente marcadas e usar para experimentos.
- Solução spion não utilizados podem ser armazenados a 4 ° C e deve ser nósed dentro de alguns meses. Sonicar durante 30 minutos antes de cada utilização.
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Representative Results
Nanopartículas de magnetite são de aproximadamente 10 nm de diâmetro, como resultado da agitação de uma solução aquosa de ferro (III) e cloreto de ferro (II), cloreto de tetra-hidrato a 50 ° C e 1000 rpm (Figura 1). Estes resultados demonstram a síntese bem sucedida de nanopartículas de magnetite. É importante para verificar o tamanho e a forma de nanopartículas de magnetite tomadas a partir de uma pequena amostra do lote durante a tentativa para a síntese da primeira vez. A microscopia electrónica de transmissão (MET) é o método preferido para a visualização destes partículas. O lote deve ser descartado e a síntese deve ser tentada novamente se as nanopartículas de magnetite não são de aproximadamente 10 nm de diâmetro e esférico como mostrado na Figura 1.
O revestimento das nanopartículas de magnetite com PLGA utilizando a alta velocidade resultados emulsionantes em SPIONs PLGA-magnetite com um diâmetro de 120 nm (Figura 2). Estes resultados demonstram bem sucedidaSPIONs síntese de PALG-magnetite. É importante para verificar o tamanho e a forma de SPIONs PLGA-magnetite tomadas a partir de uma pequena amostra do lote durante a tentativa para a síntese da primeira vez. A microscopia electrónica de varrimento (SEM) é o método preferido para a visualização destes partículas. O lote deve ser descartado e a síntese deve ser tentada novamente se os SPIONs PLGA-magnetite não são de aproximadamente 120 nm de diâmetro e esférico como mostrado na Figura 2. Embora as partículas maiores ou menores, pode ser desejável para certas aplicações, a composição irá ser desconhecido e, portanto, a célula rotulagem, suscetibilidade magnética, e citotoxicidade será imprevisível.
A incubação de células endoteliais com excrescência sangue SPIONs resultados para 16 hr em endocitose das nanopartículas (Figura 3). Estes resultados demonstram rotulagem bem sucedida de células com SPIONs. É importante para verificar a presença de SPIONs dentro de células retiradas deuma pequena amostra do lote ao tentar a rotulagem para a primeira vez. Microscopia electrónica de transmissão é o método preferido para a visualização de células marcadas com estes spion. As células devem ser descartado e com o rótulo deve ser tentada novamente se os SPIONs PLGA-mangetite não aparecem como redonda partículas pretas agrupados dentro de endossomas citoplasmáticos, como mostrado na Figura 3. Além disso, as concentrações mais baixas de SPIONs pode falhar para permitir magnética de células alvo e concentrações mais elevadas de SPIONs pode ser citotóxica. Se necessário, a concentração de células utilizadas para SPIONs etiqueta pode ser ajustada em conformidade.
A quantidade de ferro carregados nas células é suficiente para atingir captação magnética de células viáveis para dispositivos médicos implantáveis ferromagnéticos (Figura 4). Estes resultados demonstram direccionamento celular mediada magnética-spion bem sucedida. Se uma célula mais forte efeito de direccionamento é desejada, a estratégia preferida é a aumenSE, o gradiente de força ou o campo magnético gerado ou aplicada 8,30. O aumento da concentração de SPIONs usados para células rótulo só deve ser julgado como um último recurso, devido a preocupações de citotoxicidade. Se melhorou a viabilidade celular é desejada, a concentração de células utilizadas para SPIONs etiqueta deve ser diminuída.
Figura 1. Imagem TEM de nanopartículas de magnetita. Nanopartículas de magnetita são aproximadamente 10 nm de diâmetro, como visto por microscopia eletrônica de transmissão (TEM). As partículas são esféricas e de tamanho uniforme. Barra de escala = 100 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. imagem TEM de uma célula endotelial magneticamente marcada. Uma célula endotelial excrescência sangue magneticamente marcada visualizado por microscopia electrónica de transmissão (TEM). Os SPIONs são naturalmente endocitose pelas células e armazenadas em pequenos aglomerados dentro de endossomas citoplasmáticos. Esquerda escala bar = 2 um e barra de escala direita = 0,5 m. Re-imprimir com a permissão de 24."target =" _ blank /files/ftp_upload/53099/53099fig3large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura imagem de microscopia de fluorescência de captação 4. magnética de células. As células endoteliais magneticamente marcadas são atraídas para um stent vascular ferromagnético (à direita), a uma taxa significativamente mais elevada do que um stent não magnético (esquerda). Barras de escala = 100 pm. Re-print com a permissão de 24. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Tal como acontece com qualquer protocolo de síntese de nanopartículas, a pureza dos produtos químicos reagentes é crítico para a consecução SPIONs de alta qualidade que terão efeitos citotóxicos mínimas. É, portanto, importante para adquirir reagentes muito puros, incluindo o ácido oleico (≥99%), ferro (II) tetra-hidrato de cloreto de (≥99.99%), ferro (III), cloreto de (≥99.99%), acetato de etilo (qualidade para HPLC, ≥99.9% ), hexano (grau HPLC, ≥97.0%), hidróxido de amónio (≥99.99%), e sulfato de sódio (≥99.0%). É de particular importância para adquirir muito puro e de alta qualidade de PLGA, que pode ser relativamente caro. Além disso, todos os artigos de vidro devem ser cuidadosamente lavado com ácido clorídrico, água desionizada, e álcool etílico e deixou-se secar antes de usar.
Da mesma forma, os passos de purificação e de lavagem dentro do protocolo são críticas para assegurar as SPIONs finais serão de alta qualidade e tem efeitos citotóxicos mínimas. O gel magnetite deve estar livre dehidróxido de amónio como muito, água, hexano e quanto possível antes do revestimento com PLGA. Por conseguinte, grande parte do protocolo é dedicada para assegurar a pureza do gel de magnetite. Subsequentemente, os SPIONs PLGA-magnetite deve estar livre de acetato de etilo, o Pluronic, e o excesso de PLGA. As etapas finais de lavagem spion são as mais demorado parte do protocolo, mas deve ser concluído para garantir a alta pureza. Especificamente, recolha magnética das partículas durante cada passo de lavagem pode ser muito demorado. Agitar a solução pode aumentar grandemente a velocidade de recolha de partículas, mas barras de agitação magnéticas não pode ser utilizado. Agitadores suspensos operam a uma velocidade baixa são os meios mais eficazes de recolha de partículas rápida. Certifique-se de uma grande coleção de acastanhado SPIONs aparece no ímã ea solução parece branco ou claro antes de decantação. Este muitas vezes pode necessitar de várias horas de agitação, mas irá resultar num rendimento final mais elevado. As etapas de decantação magnéticos também servem para garantir que apenas magnetic partículas são retidas enquanto que todos os materiais não magnéticos são descartados.
Os níveis de ferro excessivos podem ser citotóxicos, de modo que a quantidade de massa magnética que pode ser transmitida a uma célula através desta técnica é limitada. A concentração de ferro pode ter de ser diminuída para tipos celulares particularmente sensíveis ou aumentada para campos magnéticos particularmente fracos, mas o protocolo aqui descrito proporciona um ponto de partida para equilibrar comprovada segurança e eficácia. Os SPIONs sintetizados por este protocolo são feitas a partir de uma solução com uma razão de 1:15 em massa de magnetite de PLGA e os SPIONs são introduzidos para as células a uma concentração de 200 ug / ml de meio de cultura celular. Qualquer destes parâmetros pode ser ajustada para alterar a quantidade de ferro endocitose por cada célula quando necessário.
SPIONs são seguros para implantação em humanos e irá biodegradar ao longo do tempo (meia-vida de cerca de 40-50 dias) 31. Tanto a magnetita e PLGA formar DEGRAD inofensivoprodutos ation e são eliminado do organismo através de vias naturais 32. A natureza biodegradável dos SPIONs significa quaisquer efeitos citotóxicos irá diminuir com o tempo, mas também limita as aplicações potenciais para aqueles que não necessitam de células para manter as suas propriedades magnéticas além de alguns meses. SPIONs também têm a vantagem de marcação das células e transmitir os seus efeitos magnéticos, sem a necessidade de proteínas de superfície nem ligandos de direccionamento que são sensíveis à formação de uma coroa proteína após exposição ao meio biológico 33,34.
Conferir propriedades magnéticas para as células é útil para uma ampla gama de aplicações biomédicas que exigem a entrega de células alvo ou de triagem 29. Uma variedade de tipos de células demonstraram a capacidade de endocitar segurança SPIONs incluindo células estaminais mesenquimais, as células 35 36 progenitoras endoteliais, células dos ilhéus beta 37, e células estaminais neurais 38. Cel magnétical segmentação pode ser preferido sobre outra célula técnicas de segmentação quando é necessário um alto grau de controle sobre as condições de entrega.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metal basis | Sigma-Aldrich | 338818-100ML | Harmful reagent - wear personal protective equipment |
| Dreschel bottle, 500 ml | Ace Glass | 5516-16 | |
| Ethyl Acetate, CHROMASOLVR Plus, for HPLC, 99.9% | Sigma-Aldrich | 650528-1L | Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | Harmful reagent - wear personal protective equipment |
| Evaporating flask, 50 ml, 24/40 joint | Sigma-Aldrich | Z515558 | For use with rotoevaporator |
| Filter paper, 3 cm dia, grade 1 | Fisher | 09-805P | For use with glass filter funnel |
| Glass beakers, 1 L | Fisher | FB-101-1000 | For washing SPIONs |
| Glass filter funnel, vacuum hose adapter, fits 24/40, 30 mL | Fisher | K954100-0344 | |
| Glass vial caps | Fisher | 03-391-46 | For use with glass vials |
| Glass vials, 2 ml | Fisher | 03-391-44 | For collecting magnetite gel & SPIONs |
| Hexane, CHROMASOLVR, for HPLC, ≥97.0% (GC) | Sigma-Aldrich | 34859-1L | Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood |
| Iron(II) chloride tetrahydrate, ≥99.99% trace metals basis | Sigma-Aldrich | 380024-5G | Harmful reagent - wear personal protective equipment |
| Iron(III) chloride anhydrous, powder, ≥99.99% trace metals basis | Sigma-Aldrich | 451649-1G | Harmful reagent - wear personal protective equipment |
| Isomantle heater, 500 mL | Voight Global | EM0500/CEX1 | |
| Laboratory mixer | Silverson | L5M-A | |
| Lyophilizer | Labconco | 7670520 | |
| Microspatulas | Fisher | 21-401-25A | For transfering magnetite gel |
| NdFeB magnet, 1 in x 1 in x 1 in | Amazing Magnets | C1000H-M | Very strong magnet, handle with care |
| Oleic acid, ≥99% (GC) | Sigma-Aldrich | O1008-5G | Store in freezer; Harmful reagent - wear personal protective equipment |
| Overhead stirrer | IKA | 2572201 | |
| Overhead stirrer clamp | IKA | 2664000 | For use with overhead stirrer |
| Overhead stirrer H-stand | IKA | 1412000 | For use with overhead stirrer |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Plastic beakers, 250 ml | Fisher | 02-591-28 | |
| PLGA PURASORB PDLG (75/25 blend) | Purac | PDLG 7502 | PDLG 7502A may be used as well; Store in freezer |
| Pluronic F-127 powder, BioReagent, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| PTFE expandable blade paddle, 8 mm dia | SciQuip | SP4018 | |
| PTFE vessel adapter, fits 24/40, 8 mm dia paddle | Monmouth Scientific | PTFE Vessel Adaptor A480 | For use with PTFE expandable blade paddle |
| Recirculating chiller | Clarkson | 696613 | For use with rotoevaporator |
| Reflux condenser, fits 24/40, 250 mm | Ace Glass | 5997-133 | |
| Rotoevaporator | Clarkson | 216949 | |
| Rubber septa, fits 24/40 | Ace Glass | 9096-56 | |
| Separatory funnel with stopper, 250 ml | Fisher | 10-438E | |
| Sodium sulfate ACS reagent, ≥99.0%, anhydrous, granular | Sigma-Aldrich | 239313-500G | |
| Three neck round bottom flask, angled, 24/40 joints, 500 ml | Ace Glass | 6948-16 | |
| Ultrasonic cleaner perforated pan | Fisher | 15-335-20A | For use with ultrasonic cleaner |
| Ultrasonic cleaner, 2.8 L | Fisher | 15-335-20 | |
| Vacuum controller | Clarkson | 216639 | For use with rotoevaporator (optional) |
| Vacuum pump | Clarkson | 219959 | For use with rotoevaporator |
References
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