Abstract
La administración dirigida de las células y agentes terapéuticos se beneficiaría de una amplia gama de aplicaciones biomédicas concentrando el efecto terapéutico en el sitio diana, mientras que se minimizan los efectos deletéreos a sitios desviado. Focalización celular magnética es una técnica de suministro eficiente, seguro y sencillo. Nanopartículas de óxido de hierro superparamagnético (SPION) son biodegradables, biocompatibles, y pueden ser endocitosis en células para hacerlos sensibles a los campos magnéticos. El proceso de síntesis implica la creación de magnetita (Fe 3 O 4) Nanopartículas seguido por emulsificación de alta velocidad para formar un poli (ácido láctico-co-glicólico) revestimiento (PLGA). Los SPIONs PLGA-magnetita son de aproximadamente 120 nm de diámetro incluyendo el núcleo de magnetita diámetro aproximadamente 10 nm. Cuando se coloca en medio de cultivo, SPIONs son naturalmente endocitosis por las células y se almacenan como pequeños grupos dentro de endosomas citoplasmáticos. Estas partículas imparten masa magnética suficiente para las célulaspara permitir la orientación dentro de los campos magnéticos. Numerosos clasificación de células y aplicaciones dirigidas están habilitadas por la prestación de diversos tipos de células sensibles a los campos magnéticos. SPIONs tienen una variedad de otras aplicaciones biomédicas, así como el uso como agente de contraste de imagen médica, la administración de fármacos o gen diana, ensayos de diagnóstico, y la generación de la hipertermia local para la terapia de tumores o de soldadura de tejidos.
Protocol
1. Síntesis de la magnetita de Gel
- Lave toda la cristalería usando ácido clorhídrico concentrado seguido de agua desionizada seguido por el alcohol etílico. Deje secar O / N, preferiblemente en un horno de secado.
¡CUIDADO! ácido clorhídrico es perjudicial - llevar equipo de protección personal y el trabajo en una campana de humos; alcohol etílico es perjudicial -, usar equipo de protección personal. - Utilice una botella Dreschel para de-gas 500 ml de H2O desionizada burbujeando suavemente gas N2 durante 30 minutos.
- Puesta en marcha del aparato de síntesis de magnetita dentro de una campana de humos química.
- Coloque un frasco ml de tres bocas de fondo redondo de 500 dentro de un calentador isomantle y asegure la boca central utilizando una pinza y el soporte.
- Instalar un septum de goma en uno de los cuellos laterales del matraz de fondo redondo y un condensador de reflujo con un septo de caucho en el cuello lado restante. Continuamente correr agua fría a través del condensador de reflujo.
- Punción ªe septo de caucho del matraz de fondo redondo con una aguja conectada a una línea de gas N 2 y perforar tabique de caucho del condensador de reflujo con una aguja conectada a una línea de gas corriendo a un burbujeador (es decir, matraz con agua) para visualizar de salida de gas.
- Instale una paleta de hoja en el cuello central del matraz de fondo redondo a través de un adaptador de paddle. Coloque el eje de la paleta de cuchilla para un agitador de cabeza montado en un soporte.
- Purgar el matraz de fondo redondo con gas N2 y dejar N2 gas que fluye a una velocidad baja, pero detectable.
- Retire el condensador de reflujo desde el matraz de fondo redondo y añadir 1,000 g de hierro (III) cloruro, 0,6125 g de hierro (II) tetrahidrato de cloruro, y 50 ml de de-gaseados H 2 O.
¡CUIDADO! hierro (III) y cloruro de hierro (II) tetrahidrato de cloruro son perjudiciales -, usar equipo de protección personal. - Vuelva a colocar el condensador de reflujo y se agita a 1000 rpm mientras se calienta a 50° C. La agitación en estas condiciones produce 10 nanopartículas de magnetita nm de diámetro.
- Una vez en 50 ° C, añadir 10 ml de solución de hidróxido de amonio al 28% mediante la inyección a través del septo de caucho en el matraz de fondo redondo mientras que todavía se agitaba.
¡CUIDADO! hidróxido de amonio es perjudicial -, usar equipo de protección personal.
NOTA: La solución de hidróxido de amonio se utiliza para precipitar la magnetita y la solución debe volverse negro. - Quitar el tapón de caucho y N 2 línea de gas desde el matraz de fondo redondo y se calienta a 90 ° C a hervir el gas amoniaco mientras que todavía se agitaba.
NOTA: Es opcional para mantener el flujo de N 2 en el matraz de fondo redondo por punción de tabique de caucho del condensador de reflujo, sin embargo, la oxidación de la magnetita a maghemita es insignificante durante este paso. - Una vez en 90 ° C, añadir 1 ml de ácido oleico a la matraz de fondo redondo mientras que todavía se agitaba. El ácido oleico se utiliza para recubrir la magnetita nanoparticles para formar gel de magnetita.
¡CUIDADO! ácido oleico es perjudicial -, usar equipo de protección personal. - Vuelva a colocar el tapón de goma y N 2 línea de gas en el matraz de fondo redondo y retire el condensador de reflujo.
- Apagar el fuego y revuelva a 500 rpm durante 2 horas.
- Retire el matraz de fondo redondo desde el calentador isomantle y decantar el líquido sobrante durante el uso de un imán fuerte sostenido contra la parte inferior del matraz para retener el gel de magnetita.
¡CUIDADO! manejar el imán fuerte con extremo cuidado para evitar daños o lesiones. - Permita gel de magnetita a O-aire seco / N (opcional).
2. Purificación de la magnetita de Gel
- Añadir 40 ml de hexano en el matraz de fondo redondo para disolver el gel de magnetita
¡CUIDADO! hexano es perjudicial -, usar equipo de protección personal y el trabajo en una campana de humos. - Use un embudo de separación con 40 ml de de-gaseados H2O para eliminar H 2 O residual frosoy la solución magnetita.
- Vierta lentamente la solución de magnetita en el H 2 O en el embudo de decantación y agitar suavemente el líquido de dos fases durante 5 minutos.
- Escurra y deseche la fracción acuosa inferior.
- Poco a poco agregue 40 ml de de-gaseados H2O para el embudo de separación de tal manera que se instala debajo de la solución de magnetita y agitar suavemente y drene como antes.
- Repetir para lavar por tercera vez.
- Transfiera la solución de magnetita a un matraz Erlenmeyer, añadir unas espátulas valor de sulfato de sodio anhidro, y agitar para eliminar cualquier H 2 O residual que queda de la solución de magnetita.
- Filtrar la solución a través de papel de filtro de magnetita 1 m en un embudo de filtro para eliminar el sulfato de sodio y H 2 O. residual
NOTA: Se recomienda la asistencia de vacío. - Transferir la solución de magnetita a un matraz de evaporación de 50 ml y el uso de un evaporador rotatorio para evaporar el hexano durante2 h con las siguientes condiciones: Velocidad de rotación moderada, el vacío aplicado, evaporando matraz en un baño de agua 50 ° C, y 24 ° C de circulación de agua a través del condensador.
NOTA: De forma opcional, almacenar el gel magnetita antes de recubrir con PLGA.
3. Recubrimiento de nanopartículas de magnetita con PLGA Shell
- Disolver 3,60 g de PLGA (75/25 mezcla) en 240 ml de acetato de etilo para crear un (m / v) solución de 1,5%. PRECAUCIÓN: acetato de etilo es perjudicial -, usar equipo de protección personal y el trabajo en una campana de humos.
- Disolver 25,00 g de Pluronic F-127 en 500 ml de de-gaseados H 2 O usando un agitador magnético para crear un (m / v) solución de 5,0%.
NOTA: Pluronic F-127 es un copolímero de bloques anfifílico no iónico que actúa como un agente tensioactivo biocompatible. Esto ayuda a estabilizar la emulsión aceite-en-agua en la etapa 3.3.2. - Utilizando una microespátula, recoger el gel de magnetita en seis alícuotas 0,040 g dentro de viales de vidrio ponderados. Perform el siguiente proceso de recubrimiento y lavado para cada alícuota.
NOTA: Las alícuotas son necesarias para asegurar una manipulación eficiente y decantación magnética, que maximizará pureza y el rendimiento y reducir al mínimo la degradación antes de la liofilización en el paso 4.- Añadir un 0,040 g alícuota de gel de magnetita y 40 ml de la solución de PLGA a un vaso de precipitados de plástico y se somete a ultrasonidos en un limpiador ultrasónico durante 10 minutos.
- Añadir 80 ml de la solución de Pluronic al vaso de precipitados de plástico y emulsionar inmediatamente con un mezclador de laboratorio en la posición más alta durante 7 minutos para formar el revestimiento de PLGA en las nanopartículas de magnetita como una emulsión de aceite-en-agua.
- Inmediatamente diluir la solución SPION en 1 litro de H2O desionizada y sonicar durante 1 h en una campana de extracción química para evaporar el acetato de etilo.
- Coloque un imán fuerte junto a la solución SPION y revuelva suavemente para recoger SPIONs parduscos en el imán.
NOTA: Puede ser necesario agitar de forma intermitente durante varias horass antes de que la solución se vuelve blanquecina que indica que la mayoría de los SPIONs se han recogido. - Decantar la solución acuosa al tiempo que conserva los SPIONs en el vaso de precipitados con el imán.
- Lavar las SPIONs tres veces como sigue.
- Suspender los SPIONs en 1 litro de H2O desionizada
- Sonicar la solución SPION durante 20 minutos.
- Coloque un imán fuerte junto a la solución SPION y revuelva suavemente para recoger SPIONs parduscos en el imán. Puede ser necesario agitar intermitentemente durante varias horas antes de que la solución se vuelve clara que indica que la mayoría de los SPIONs han sido recogidos.
- Decantar la solución acuosa al tiempo que conserva los SPIONs en el vaso de precipitados con el imán.
- Recoge los SPIONs sintetizados a partir de cada una de las seis partes alícuotas de gel de magnetita en un único vial de vidrio ponderada como una suspensión acuosa. Opcionalmente decantar el exceso de agua magnéticamente según sea necesario.
4. CongelaciónSECADO de SPIONs
- Congelar la solución SPION.
- Liofilizar la solución SPION O / N en un liofilizador.
- Pesar los SPIONs liofilizados. SPIONs liofilizados pueden almacenarse a -20 ° C hasta su uso para el marcaje celular.
NOTA: El almacenamiento a -20 ° C dramáticamente reduce la cinética de degradación y aumenta la vida útil.
5. Etiquetado de células con SPIONs
- Suspender una alícuota de SPIONs en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una concentración de 40 mg / ml y sonicar durante 30 minutos.
- Añadir la solución a un matraz SPION casi confluente de células a una concentración de 5 l / ml de medio de cultivo celular. Asegurar una distribución uniforme moviendo suavemente el matraz.
- Se incuban las células durante 16 horas a 37 ° C.
- Aspirar suavemente el medio de cultivo y lavar las células dos veces con PBS.
- Recoger las células marcadas magnéticamente y usar para los experimentos.
- Solución SPION no utilizado se puede almacenar a 4 ° C y debe ser nosotrosed dentro de unos meses. Sonicar durante 30 minutos antes de cada uso.
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Representative Results
Nanopartículas de magnetita son de aproximadamente 10 nm de diámetro, como resultado de agitación una solución acuosa de hierro (III) y cloruro de hierro (II) cloruro tetrahidrato a 50 ° C y 1000 rpm (Figura 1). Estos resultados demuestran la síntesis exitosa de nanopartículas de magnetita. Es importante para verificar el tamaño y la forma de nanopartículas de magnetita tomadas de una pequeña muestra del lote cuando se intenta la síntesis por primera vez. Microscopía electrónica de transmisión (TEM) es el método preferido para la visualización de estas partículas. El lote debe ser desechada y la síntesis debe intentarse de nuevo si las nanopartículas de magnetita no son de aproximadamente 10 nm de diámetro y esférica como se muestra en la Figura 1.
El recubrimiento de las nanopartículas de magnetita con PLGA utilizando una alta velocidad resultados emulsionante en SPIONs PLGA-magnetita con un diámetro de 120 nm (Figura 2). Estos resultados demuestran el éxitosíntesis de SPIONs PLGA-magnetita. Es importante para verificar el tamaño y la forma de SPIONs PLGA-magnetita tomadas de una pequeña muestra del lote cuando se intenta la síntesis por primera vez. Microscopía electrónica de barrido (SEM) es el método preferido para la visualización de estas partículas. El lote debe ser desechada y la síntesis debe intentarse de nuevo si los SPIONs PLGA-magnetita no son de aproximadamente 120 nm de diámetro y esférica como se muestra en la Figura 2. Mientras que las partículas más grandes o más pequeñas pueden ser deseables para ciertas aplicaciones, la composición será desconocida y por lo tanto la celda etiquetado, susceptibilidad magnética, y la citotoxicidad será impredecible.
La incubación de células endoteliales excrecencia de sangre con SPIONs para 16 hr resultados en la endocitosis de las nanopartículas (Figura 3). Estos resultados demuestran etiquetado con éxito de células con SPIONs. Es importante verificar la presencia de SPIONs dentro de las células tomadas deuna pequeña muestra del lote cuando se intenta el etiquetado por primera vez. Microscopía electrónica de transmisión es el método preferido para la visualización de estas células SPION marcado. Las células deben ser descartados y el etiquetado se debe intentar de nuevo si los SPIONs PLGA-mangetite no aparecen como ronda partículas negras agrupados juntos dentro de endosomas citoplasmáticos como se muestra en la Figura 3. Por otra parte, las concentraciones más bajas de SPIONs pueden no permitir celular magnética focalización y concentraciones más altas de SPIONs pueden ser citotóxico. Si es necesario, la concentración de SPIONs utilizados para las células de la etiqueta se puede ajustar en consecuencia.
La cantidad de hierro cargado en las células es suficiente para lograr la captura magnética de células viables a los dispositivos médicos implantables ferromagnéticos (Figura 4). Estos resultados demuestran con éxito la orientación magnética de células SPION mediada. Si se desea un efecto más fuerte de células diana, la estrategia preferida es INCREASE La fuerza o el gradiente del campo magnético generado o aplicada 8,30. El aumento de la concentración de SPIONs utilizados para las células de la etiqueta sólo debe ser juzgado como un último recurso debido a las preocupaciones de citotoxicidad. Si se desea la mejora de la viabilidad celular, la concentración de SPIONs utilizados para las células de la etiqueta se debe disminuir.
Figura 1. Imagen TEM de nanopartículas de magnetita. Nanopartículas de magnetita son aproximadamente 10 nm de diámetro como se ve por microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las partículas son esféricas y de tamaño uniforme. Barra de escala = 100 nm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Imagen TEM de una célula endotelial marcado magnéticamente. Una célula endotelial excrecencia de la sangre marcado magnéticamente se visualizó mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). Los SPIONs son naturalmente endocitosis por las células y se almacenan en pequeños grupos dentro de endosomas citoplasmáticos. Izquierda bar = 2 micras escala y barra de escala derecha = 0,5 micras. Vuelva a imprimir con permiso de 24./files/ftp_upload/53099/53099fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Imagen de microscopía de fluorescencia de captura de células magnético. Células endoteliales marcado magnéticamente se sienten atraídos por una endoprótesis vascular ferromagnética (derecha) en una tasa significativamente más alta que un stent no magnético (izquierda). Las barras de escala = 100 micras. Vuelva a imprimir con permiso de 24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Como con cualquier protocolo de síntesis de nanopartículas, la pureza de los productos químicos reactivos es crítico para la consecución de SPIONs de alta calidad que tendrán efectos citotóxicos mínimos. Por tanto, es importante adquirir reactivos muy puros incluyendo el ácido oleico (≥99%), hierro (II) tetrahidrato de cloruro de (≥99.99%), (III) cloruro de hierro (≥99.99%), acetato de etilo (grado HPLC, ≥99.9% ), hexano (grado HPLC, ≥97.0%), hidróxido de amonio (≥99.99%), y sulfato de sodio (≥99.0%). Es de particular importancia para comprar muy puro y de alta calidad PLGA, que puede ser relativamente caro. Además, todo el material de vidrio se lava a fondo con ácido clorhídrico, agua desionizada, y alcohol etílico y se deja secar antes de su uso.
Del mismo modo, las etapas de purificación y lavado dentro del protocolo son críticos para asegurar que los SPIONs finales serán de alta calidad y tienen efectos citotóxicos mínimos. El gel de magnetita debe estar libre decomo hidróxido de amonio tanto, el agua y hexano como sea posible antes del recubrimiento con PLGA. En consecuencia, gran parte del protocolo está dedicado a garantizar la pureza del gel de magnetita. Posteriormente, los SPIONs PLGA-magnetita deben estar libres de acetato de etilo, Pluronic, y el exceso de PLGA. Las etapas de lavado SPION finales son la mayor parte del tiempo parte del protocolo de consumir, sino que deben ser completados para asegurar una alta pureza. Específicamente, la recogida magnética de las partículas durante cada etapa de lavado puede ser mucho tiempo. Agitación de la solución puede aumentar considerablemente la velocidad de recogida de partículas, pero barras de agitación magnéticas no puede ser utilizado. Agitadores que operan a baja velocidad son los medios más eficaces para la recogida de partículas rápido. Asegurar una gran colección de color marrón de SPIONs aparece al imán y la solución aparece de color blanco o claro antes de decantación. Esto a menudo puede requerir varias horas de agitación, pero dará lugar a un rendimiento final superior. Los pasos de decantación magnéticos también sirven para garantizar que sólo magnetic partículas son retenidas mientras que todos los materiales no magnéticos se descartan.
Los niveles de hierro excesiva puede ser citotóxico, por lo que la cantidad de masa magnética que se puede impartir a una célula usando esta técnica es limitada. La concentración de hierro puede necesitar ser disminuido para tipos de células particularmente sensibles o aumento para los campos magnéticos particularmente débiles, pero el protocolo descrito aquí proporciona un punto de partida para equilibrar demostrado seguridad y eficacia. Los SPIONs sintetizados por este protocolo se realizan a partir de una solución con una proporción en masa de una y quince magnetita de PLGA y de los SPIONs se introducen a las células a una concentración de 200 g / ml de medio de cultivo celular. Cualquiera de estos parámetros se pueden ajustar para alterar la cantidad de hierro endocitosis por cada célula según sea necesario.
SPIONs son seguros para la implantación humana y se biodegradan con el tiempo (vida media de aproximadamente de 40-50 días) 31. Tanto la magnetita y PLGA forman Degrad inofensivosproductos ación y se elimina del cuerpo a través de vías naturales 32. La naturaleza biodegradable de los SPIONs significa cualquier efectos citotóxicos disminuirá con el tiempo, sino que también limita las posibles aplicaciones a los que no requieren células para mantener sus propiedades magnéticas más allá de unos pocos meses. SPIONs también tienen la ventaja de etiquetar células e impartiendo sus efectos magnéticos sin la necesidad de proteínas de la superficie ni ligandos que son susceptibles a la formación de una corona de proteínas tras la exposición al medio biológico 33,34.
Impartir propiedades magnéticas a las células es útil para una amplia gama de aplicaciones biomédicas que requieren la entrega célula diana o de clasificación 29. Una variedad de tipos de células han demostrado la capacidad de endocitosis de manera segura SPIONs incluyendo las células madre mesenquimales 35, las células progenitoras endoteliales, células de los islotes 36 beta 37, y células madre neurales 38. Cel magnétical focalización puede ser preferible sobre otra célula técnicas de orientación cuando es necesario un alto grado de control sobre las condiciones de entrega.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium Hydroxide solution, 28% NH3 in H2O, ≥99.99% trace metal basis | Sigma-Aldrich | 338818-100ML | Harmful reagent - wear personal protective equipment |
| Dreschel bottle, 500 ml | Ace Glass | 5516-16 | |
| Ethyl Acetate, CHROMASOLVR Plus, for HPLC, 99.9% | Sigma-Aldrich | 650528-1L | Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood |
| Ethyl alcohol | Sigma-Aldrich | E7023 | Harmful reagent - wear personal protective equipment |
| Evaporating flask, 50 ml, 24/40 joint | Sigma-Aldrich | Z515558 | For use with rotoevaporator |
| Filter paper, 3 cm dia, grade 1 | Fisher | 09-805P | For use with glass filter funnel |
| Glass beakers, 1 L | Fisher | FB-101-1000 | For washing SPIONs |
| Glass filter funnel, vacuum hose adapter, fits 24/40, 30 mL | Fisher | K954100-0344 | |
| Glass vial caps | Fisher | 03-391-46 | For use with glass vials |
| Glass vials, 2 ml | Fisher | 03-391-44 | For collecting magnetite gel & SPIONs |
| Hexane, CHROMASOLVR, for HPLC, ≥97.0% (GC) | Sigma-Aldrich | 34859-1L | Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | Harmful reagent - wear personal protective equipment & work in fume hood |
| Iron(II) chloride tetrahydrate, ≥99.99% trace metals basis | Sigma-Aldrich | 380024-5G | Harmful reagent - wear personal protective equipment |
| Iron(III) chloride anhydrous, powder, ≥99.99% trace metals basis | Sigma-Aldrich | 451649-1G | Harmful reagent - wear personal protective equipment |
| Isomantle heater, 500 mL | Voight Global | EM0500/CEX1 | |
| Laboratory mixer | Silverson | L5M-A | |
| Lyophilizer | Labconco | 7670520 | |
| Microspatulas | Fisher | 21-401-25A | For transfering magnetite gel |
| NdFeB magnet, 1 in x 1 in x 1 in | Amazing Magnets | C1000H-M | Very strong magnet, handle with care |
| Oleic acid, ≥99% (GC) | Sigma-Aldrich | O1008-5G | Store in freezer; Harmful reagent - wear personal protective equipment |
| Overhead stirrer | IKA | 2572201 | |
| Overhead stirrer clamp | IKA | 2664000 | For use with overhead stirrer |
| Overhead stirrer H-stand | IKA | 1412000 | For use with overhead stirrer |
| Phosphate buffered saline | Life Technologies | 10010-023 | |
| Plastic beakers, 250 ml | Fisher | 02-591-28 | |
| PLGA PURASORB PDLG (75/25 blend) | Purac | PDLG 7502 | PDLG 7502A may be used as well; Store in freezer |
| Pluronic F-127 powder, BioReagent, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | P2443-250G | |
| PTFE expandable blade paddle, 8 mm dia | SciQuip | SP4018 | |
| PTFE vessel adapter, fits 24/40, 8 mm dia paddle | Monmouth Scientific | PTFE Vessel Adaptor A480 | For use with PTFE expandable blade paddle |
| Recirculating chiller | Clarkson | 696613 | For use with rotoevaporator |
| Reflux condenser, fits 24/40, 250 mm | Ace Glass | 5997-133 | |
| Rotoevaporator | Clarkson | 216949 | |
| Rubber septa, fits 24/40 | Ace Glass | 9096-56 | |
| Separatory funnel with stopper, 250 ml | Fisher | 10-438E | |
| Sodium sulfate ACS reagent, ≥99.0%, anhydrous, granular | Sigma-Aldrich | 239313-500G | |
| Three neck round bottom flask, angled, 24/40 joints, 500 ml | Ace Glass | 6948-16 | |
| Ultrasonic cleaner perforated pan | Fisher | 15-335-20A | For use with ultrasonic cleaner |
| Ultrasonic cleaner, 2.8 L | Fisher | 15-335-20 | |
| Vacuum controller | Clarkson | 216639 | For use with rotoevaporator (optional) |
| Vacuum pump | Clarkson | 219959 | For use with rotoevaporator |
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