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Bioengineering

Ferromagnético Bare Metal Stent para captura de células endoteliais e Retenção

Published: September 18, 2015 doi: 10.3791/53100
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 1,4
1Division of Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Cardiovascular Diseases, Mayo Clinic, 3Department of Cardioangiology, ICRC, St. Anne's University Hospital, 4Mayo Clinic College of Medicine

Summary

Nossos objetivos foram para projetar, fabricar e testar stents ferromagnéticos para a captura de células endoteliais. Dez stents foram testados quanto à fractura e mais 10 stents foram testados para o magnetismo retida. Finalmente, 10 stents foram testados in vitro e 8 mais stents foram implantados em 4 porcos para mostrar a captura e retenção celular.

Abstract

Endotelização rápida de stents cardiovasculares é necessária para reduzir a trombose de stent e para evitar a terapia anti-plaquetas que podem reduzir o risco de sangramento. A viabilidade do uso de forças magnéticas para capturar e reter as células endoteliais excrescência (EdC) marcadas com nanopartículas de óxido de ferro super-paramagnéticas (spion) foi mostrado anteriormente. Mas esta técnica requer o desenvolvimento de um stent funcional mecanicamente a partir de um material magnético e biocompatível seguido de in-vitro e in-vivo de ensaio para comprovar rápida endotelização. Nós desenvolvemos um stent fracamente ferromagnéticos de aço inoxidável 2205 duplex utilizando desenho assistido por computador (CAD) e seu design foi aperfeiçoada por meio de análise de elementos finitos (FEA). O desenho final do stent exibiu a principal pressão abaixo do limite de fratura do material durante cravamento mecânica e expansão. Cem stents foram fabricados e um subconjunto deles foi usado para ensaios mecânicos, tempo de retained medições do campo magnético, em estudos in vitro de captura de células, in vivo e estudos de implantação. Dez stents foram testados para implantação para verificar se eles sustentado friso e expansão ciclo sem falhas. Outros 10 stents foram magnetizadas usando um ímã de neodímio forte e seu campo magnético retido foi medido. Os stents mostrou que o magnetismo retido foi suficiente para capturar spion marcado EOC nos nossos estudos in vitro. Foi verificada marcado com spion captura e retenção de EOC em grandes modelos animais através da implantação de um stent magnetizado e um stent controle não-magnetizado em cada um dos 4 porcos. As artérias stented foram explantadas após 7 dias e analisados ​​histologicamente. Os stents fracamente magnéticos desenvolvidas neste estudo foram capazes de atrair e reter as células endoteliais marcado com spion que podem promover a cura rápida.

Protocol

Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Animal Care Institucional e Comitê de Utilização (IACUC) da Clínica Mayo.

1. Análise e Desenho de um 2205 de aço inoxidável Stent

  1. Projetando um nu metal stent usando CAD
    1. Faça um cilindro oco extrudido, selecionando em função 'de ressalto extrudado / base' com a espessura da parede igual à espessura haste do stent.
    2. Projetar um padrão de stent em um avião diferente esboço tangente ao cilindro extrudido. Adicione a largura do padrão plana para coincidir com a circunferência do cilindro oco extrudido.
    3. Transferir o projeto padrão plano para o cilindro oco usando o recurso de envoltório.
    4. Salve a peça em seu formato nativo e também em formato ACIS a ser exportado para FEA.
  2. Análise de elementos finitos para os modelos de stents
    1. Importe a geometria sólida salvo no formato ACIS no módulo de parte do software FEA para mais analysé.
    2. Modelo 2 cilindros analíticos de forma coaxial com o stent no modelador parte do software FEA. O cilindro tem um diâmetro exterior inicial maior do que o diâmetro da prótese endovascular para simular o punção e o cilindro interior tem um diâmetro inicial de 1 mm para simular um balão de inflação.
    3. Clique duas vezes no item da árvore 'casos' do modelador de montagem para montar o dito acima partes em posições relativas.
    4. Use o módulo de malha do software FEA, especifique o tipo de elemento como 20-nó de elemento de hexaedro com integração reduzida, especifique o tamanho do elemento, e malha do stent.
    5. Especificar pares de contato rígidas sem atrito entre o stent e os dois cilindros, respectivamente, no 'propriedades' de interação da árvore modelo.
    6. Atribuir comportamento tensão-deformação elasto-plástica de 2205 de aço inoxidável para o modelo de stent.
    7. Definir condições de contorno para cravar em primeiro lugar o cilindro exterior para 1 mm, o que simula o CRimping do stent. Remover o cilindro exterior para simular o relaxamento da prótese endovascular de cravamento. Expandir o cilindro interior a 3 mm para simular expansão e, finalmente, remover o cilindro interior para simular recuo da prótese endovascular.
    8. Defina os parâmetros de simulação, incluindo o número de processadores e quantidade de RAM alocados no 'Análise' item da árvore modelo e executar a simulação.
    9. Uma vez que a simulação é completa, abra o ficheiro de resultado (filename.odb) e pós-processar os resultados para estudar os principais estirpes e iterativamente melhorar a concepção do stent para alcançar um principal deformação de 20%, o que é menos do que o limite de falha do material .

2. Stent Fabricação e Teste de engaste e Expansão

  1. Fabricação Stent
    1. Obter os tubos de aço inoxidável 2205 por perfuração arma e precisão bar moagem material de estoque em uma empresa de usinagem de precisão, tais como produtos de precisão em Ação Pioneer,OH.
    2. Transferir os tubos terra de precisão e design plano padrão de stent para uma empresa stent corte como LaserAge Technology Corporation em Waukegan, IL para corte a laser e eletropolimento.
    3. Passivar a superfície dos stents eletropolidas submergindo-os em um ácido forte (50% de HCl) durante 10 min, seguido por uma base (10% de NaHCO3) durante mais 10 min. CUIDADO: lidar com produtos químicos com equipamento de proteção adequado e sob uma coifa. Finalmente, lavar os stents com álcool etílico e água desionizada. Este processo é chamado de decapagem ácida.
  2. Ensaios de stent fabricado para frisar e expansão
    1. Crimp o stent em um balão com três dobras usando uma mão ferramenta de friso. Segurar o stent eo balão com três dobras na ferramenta de compressão. Pressionar a alavanca para deformar radialmente o stent a ser cravado no balão.
    2. Inspecione o stent frisado usando um microscópio para uniforme de cravamento e quaisquer sinais de falha na estrutura devidoà deformação plástica.
    3. Expandi-lo para o diâmetro de 3 mm concebido pressurizando o balão com três dobras com água. Examine os stents expandidas para fraturas microscópicas e expansão uniforme.

3. Caracterização de Stent para Retenção de Campo Magnético

NOTA: ímã cilíndrico de 2 polegadas de diâmetro e 1 polegada de altura foi utilizado neste estudo. Os pólos do ímã estão alinhados ao longo do eixo. A densidade superficial do fluxo magnético do íman é de aproximadamente 1 T.

  1. Magnetizar os stents diametralmente ou axial utilizando um ímã de neodímio forte. Segurar o stent perto do forte ímã para cerca de 1 min para magnetização.
  2. Segurar o stent em uma das faces planas com o seu diâmetro ao longo das linhas de campo magnético para ser magnetizadas ou diametralmente Segurar o stent próximo à superfície cilíndrica com o seu eixo ao longo das linhas de campo magnético para magnetizar-lo axialmente. Fiel magnético retidod do stent foi encontrado para ser estável durante pelo menos 24 horas, mas o stent usar o mais rapidamente possível depois da magnetização.
  3. Monte os stents individualmente para mandris de vidro e, em seguida, montar os mandris de vidro no mandril de precisão do dispositivo de sondagem magnético. Sonda de micro-sensor magnético pode ser precisamente posicionada perto da prótese endovascular sem tocar na superfície utilizando o XYZ fases de montagem do dispositivo de sondagem magnética (Figura 4).
  4. Medir a leitura da linha de base do microssensor magnética longe da prótese endovascular e, em seguida, medir o campo magnético retida na superfície da prótese endovascular através do posicionamento da sonda utilizando as fases de XYZ a fixação magnética de sondagem.

4. Estudos de captura celular magnéticos

  1. Obtenção de células, a rotulagem com spion e coloração com corante fluorescente
    1. Derivar as células endoteliais excrescência (EdC) do sangue periférico de porco como descrito em 5,7. A cultura num frasco T-75 until aproximadamente 80% confluentes (5x10 6 a 8x10 6 células).
    2. Sintetizar SPIONs como a magnetita diâmetro de 10 nm (Fe 3 O 4) núcleo rodeado por 50 nm de espessura poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) shell como descrito em 8,9.
    3. Incubar a EOC derivado com spion a uma concentração de 200 ug / ml de meio de cultura celular durante 16 horas a 37 o C.
    4. Aspirar suavemente o meio de cultura celular. Lavar suavemente as células por adição de 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para o balão, de balanço, e aspirando o PBS.
    5. Corar as células com corante fluorescente (CM-DII) para a visualização durante as experiências. Isto é feito por as instruções do fabricante, adicionando o corante para 10 ml de meio de cultura celular numa concentração de 5 ul / ml e incubou-se com as células durante 30 min a 37 ° C.
    6. Lavam-se as células com PBS como no passo 4.1.4 e incubar com 3 ml de solução de tripsina-EDTA a 0,25% durante 5 min a 37 ° C alevantar as células do frasco.
    7. Transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml, superior fora com PBS, e centrifugar a 500 xg durante 5 minutos para formar um sedimento celular.
    8. Re-suspender o sedimento celular em PBS a uma concentração de 1-2x10 6 células / ml e misturar bem por pipetagem dentro e para fora do tubo cónico várias vezes.
  2. Em estudos in vitro de células-
    1. Concepção e fabricar (por exemplo, impressão em 3D) um acessório simples para manter o stent apenas acima da superfície de uma lamela de vidro.
    2. Desmagnetizar um stent utilizando um desmagnetizador eletromagnética ou magnetizar um stent diametralmente ou axial utilizando um ímã de neodímio forte.
    3. Pipeta da EOC marcado com spion suspensas em PBS no prato contendo os stents controle axialmente magnetizados ou diametralmente magnetizados ou não-magnetizados. Imagem dos stents com EOC suspensas em PBS imediatamente para a fluorescência utilizando um microscópio de fluorescência invertido.
Em estudos in vivo em animais

  1. Implante de stent
    1. Extrair sangue periférico a partir de 4 porcos Yorkshire saudáveis ​​- pesando aproximadamente 50 kg - 3 semanas antes da implantação do stent, respectivamente, e a cultura EOC como descrito em 5,7.
    2. Administrar a medicação anti-plaquetária começando 3 dias antes da cirurgia (325 mg de aspirina e clopidogrel 75 mg por dia).
    3. No dia em que o implante de stent, anestesiar os porcos com intramuscular Telazol, xilazina e atropina (5 / 2-3 / 0,05 mg / kg, respectivamente), conforme estabelecido nos cuidados de animais e utilização diretrizes institucionais aplicáveis.
    4. Entubar e colocar o porco em inalação de 1-2,5% anestesia isoflurano.
    5. Raspar a região do pescoço ventral do porco e realizar o procedimento em condições estéreis gerais.
    6. Implant 1 magnetizado e um stent não-magnetizado na artéria coronária direita (RCA) utilizando a técnica de cateterismo cardíaco normal.
      1. Cathetezação de animais deve ser realizado por um cardiologista intervencionista treinada. Acesse a artéria carótida direita com uma bainha 9 French.
      2. Canular a artéria coronária alvo e injetar corante de contraste iodado para obter imagens da fluoroscopia.
      3. Coloque um fio guia 0,014 polegadas padrão coronária na artéria. Avance o balão e stent usar este fio-guia e implantar o stent em um navio de diâmetro 3-3,5 mm.
    7. Ocluir o fluxo de sangue dentro do proximal RCA para os stents implantados utilizando um balão ao longo do fio e a entregar cerca de 2x10 6 EOC autólogas marcadas com spion suspenso em 4 ml de PBS através da central de cateter ao longo de um período de 2 min.
    8. Restaurar o fluxo sanguíneo para o RCA após 2 min de oclusão adicional.
    9. Transferir o animal para a sala de recuperação e acompanhar de perto o animal até que ele recuperou a consciência.
    10. Continue a administrar a medicação anti-plaquetas (aspirina 325 mg e clopidogrel 75 mg) pós operatório até o sacrifício.
  2. Explante Stent e histologia
    1. Eutanásia dos animais 7 dias após a cirurgia por anestesia primeiro animal, tal como explicado anteriormente, e em seguida administrar por via intravenosa uma dose letal de pentobarbital de sódio (100 mg / kg) de acordo com cuidado e uso de animais com as orientações institucionais aplicáveis.
    2. Cirurgicamente colher os segmentos arteriais com stent. Fixar as artérias explantados em tampão de formalina a 10% durante um período mínimo de 30 min. Deixe as amostras em tampão de formalina para análise histológica.
    3. Terceirizar a amostra fixa às instalações capazes de realizar histologia com stents de metal. Durante este processamento, as amostras são incorporadas em metilo, em corte transversal, e analisados ​​histologicamente usando técnica de coloração de Mallory com mancha azul da Prússia para partículas de ferro.

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Representative Results

Desenho de stent iterativo com base em FEA (Figura 1) revelou um stent que pode friso e expandir-se com uma entidade de deformação de 20%, o que é menos do que a estirpe final de 30%. Engaste e ensaio de expansão (Figura 2) não mostrou sinais de fractura. Fotos do stent deformado mostrou boa concordância com deformações FEA calculados e também imagens de microscopia mostrou nenhuma fratura (Figura 3). Como esperado a partir das medições do campo magnético retidos (Figuras 4 e 5), as células foram marcadas com spion preferencialmente atraída para segmentos curvos em stents axialmente magnetizados e mais uniformemente atraído por segmentos rectos em stents diametralmente magnetizados (Figura 6). Imagens Histologia mostrou coloração de ferro perto das hastes do stent provando EOC atração e retenção ao stent durante o período de implantação 7 dias (Figura 7).

"> figura 1
Figura 1. modelagem Stent e fluxo de análise de prontuários. O esquema mostra a modelagem assistida por computador e análise de elementos finitos, mostrando um processo passo-a-passo aplicada a um stent de aço inoxidável 2205. Modificado de Uthamaraj et ai. 2014 6 com a permissão de re-impressão.

Figura 2
Figura 2. aço inoxidável de cravamento e expansão do stent. Corte a laser e um stent electropolida) como de corte, b) comprimida contra um cateter de balão com três dobras, e c) expandiu a 3 mm, utilizando o balão com três dobras. Modificado de Uthamaraj et ai. 2014 6 com a permissão de re-impressão.

Figura 3
Figura 3. inspecção microscópica do stent. A microscopia de luz foi usada para a imagem do stent expandido que foi comparado com a simulação FEA.

Figura 4
Figura 4. Sonda magnética configuração fase de medição. Os estágios XYZ e estágios rotacionais foram montados para o posicionamento dos stents e sonda magnética durante as medições do campo magnético.

Figura 5
Figura 5. regiões de medição de campo magnético em um stent e os valores de medição. A imagem mostra os campos magnéticos retidos medidos de 2205 stents em configurações axialmente magnetizados e diametralmente magnetizados. Modificado de Uthamaraj et ai. 2014 6 com a permissão de re-impressão.


Figura 6. Em estudos in vitro de captura de células. As imagens de microscopia de fluorescência de 2205 stent de aço inoxidável que mostram captação celular em (A) do stent não-magnetizado, (B) de stent diametralmente magnetizado e (C) de stent axialmente magnetizados. Modificado de Uthamaraj et ai. 2014 6 com a permissão de re-impressão.

Figura 7
Figura 7. Imagens de cortes histológicos de segmentos da artéria coronária com stent de (A) stent magnético com coloração de ferro azul perto do suporte e (B) stent controle não-magnético não apresentando coloração azul perto do suporte. As amostras foram coradas utilizando a coloração de Mallory técnica com partículas de ferro stained com mancha azul prussiano. O símbolo "*" indica locais de braço stent. Modificado de Uthamaraj et ai. 2014 6 com a permissão de re-impressão.

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Discussion

Desenvolvemos um stent magnético que pode funcionar como um stent convencional e pode atrair células endoteliais marcado com spion. Em estudos anteriores envolvendo stents magnéticas, os pesquisadores usaram níquel stents revestidos comerciais e bobinas ou malhas feitas de materiais magnéticos devido à indisponibilidade de um stent ferromagnético 5,10-14. Outros grupos também têm utilizado a natureza paramagnética de stents de aço inoxidável 304 de grau comercialmente disponíveis para o direcionamento de nanopartículas carregadas células endoteliais 3. Revestimentos de níquel podem ser alergénicos para os pacientes que receberam as próteses endovasculares e os stents paramagnéticas precisa de um campo magnético externo para atrair e reter as nanopartículas magnéticas 3,5. Assim, a concepção e desenvolvimento de um stent ferromagnético funcional é importante para aplicações de entrega de células, bem como outras aplicações clínicas 10,15-20. A natureza duplex do material escolhido para este estudo - 2205 aço inoxidável - torna wEakly ferromagnético. Além disso, 2,205 de aço inoxidável tem uma tensão final de 30% inferior quando comparado com outros aços inoxidáveis ​​usados ​​para fazer os stents, como o aço inoxidável 316L (70%) 6,21,22.

Com base nesta nova aplicação de 2.205 em aço inoxidável, o protocolo apresentado neste estudo explica os métodos para projetar, fabricar e testar um stent fracamente magnético. Em primeiro lugar, um padrão de design simples stent foi desenvolvido utilizando um padrão de stent existente como um guia. Os resultados das simulações FEA sugeriu que o material necessário para ser adicionado aos segmentos dobrados da endoprótese para obter um principal tensão máxima de 20%, o que é menos do que a tensão extrema do material. O desenho final stent tinha uma espessura de 90 um braço. Em segundo lugar, os stents foram fabricados magnetizado e seus campos magnéticos retidos foram medidos. A força do campo magnético retido do stent de aço inoxidável 2205 depende da orientação do campo magnético aplicado 23. Stents magnetizados mostrou um campo magnético mantido na gama de 100-750 mg em comparação com um máximo de 10 mg para controlo, stents não-magnetizado. Finalmente, os grandes estudos de implantação em animais mostraram que a BMS 2205 fabricado a partir de aço inoxidável pode ser utilizado para atrair e reter as células endoteliais marcado com spion mesmo quando o fluxo sanguíneo é restaurado pós-implantação. Histologia mostrou a presença de coloração azul de ferro perto das hastes do stent do stent magnetizado, provando assim a captura e retenção celular após 7 dias de implantação.

CAD e FEA utilizado em nosso estudo pode ser aplicado para o projeto e análise de balão semelhante endopróteses expansíveis adequada. No protocolo atual, As etapas 1.2.5, 1.2.6, 1.2.7 e são fundamentais para a criação de condições de contorno e atribuição de propriedade de material e são necessários para projetar corretamente um stent. Resultando magnetizados 2205 stents de aço inoxidável implantadas em grandes animais apresentaram captação e retenção celular. Passos 5.1.7 e 5.1.8 são também fundamentais para alcançar semeadura de células adequada sobre stents magnetizadas. Além disso, a introdução de células para o sítio do implante de stent magnético durante 2 minutos de oclusão é único para o nosso estudo apresentado.

Os stents desenvolvidas no presente estudo foram capazes de endothelialize rapidamente e resistir a implantação curto prazo, mas não está claro se os stents pode suportar implantação de longo prazo. Até à data, materiais ferromagnéticos não foram extensivamente estudada para entender suas limitações para aplicações clínicas. No entanto, nossos dados implantação porco 7 dias mostrou que 2.205 aço inoxidável tinha sangue bom e compatibilidade tecidual. Os métodos apresentados neste estudo não fazert abordar as técnicas para testes mecânicos avançados do stent, tais como testes de fadiga ou interacção de longo prazo do material magnético com o sangue 24-28. Além disso, a natureza ferromagnético fraco de aço inoxidável de 2205 foi capaz de capturar as células magneticamente marcadas, mas um novo material com propriedades magnéticas mais fortes pode melhorar a captura de células. Mais pesquisas também são necessárias para estudar a biocompatibilidade ea longo prazo a segurança de materiais ferromagnéticos. As células endoteliais excrescência utilizados neste estudo foram obtidos seguindo um protocolo publicado previamente que mostrou como isolar e caracterizar as células endoteliais excrescência 5,7. O presente estudo também foi limitada pelo pequeno número de animais.

Em resumo, rápida endotelização de stents tem sido limitada até à data, devido à indisponibilidade de dispositivos de administração óptimas e fraca adesão de células endoteliais. Os stents ferromagnéticos desenvolvidas neste estudotem a vantagem de funcionar como uma BMS ao mesmo tempo proporcionar suficiente campo magnético retido para capturar as células endoteliais magneticamente marcadas. Como parte de nossos estudos contínuos de efeitos de implantação de longo prazo, os stents precisa se submeter a testes mecânicos e biocompatível mais rigorosa. O stent desenvolvido neste estudo mostra uma grande promessa como um stent ferromagnético funcional capaz de captação e retenção de células endoteliais e os métodos apresentados neste estudo podem ser usados ​​para o desenvolvimento futuro stent e testes.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
2205 Stainless steel Carpenter Technology Corporation Round bar stock material
Abaqus Dassault systems Software
Atropine Prescription drug.
Clopidogrel Commercial name: Plavix. Prescription drug.
CM-DiI Life Technologies V-22888 Molecular Probes, Eugene, OR
Endothelial growth medium-2 Lonza CC-3162
Hand Held Crimping tool Blockwise engineering M1-RMC
Hydrochloric acid (HCl) Sigma Aldrich MFCD00011324 CAUTION: wear proptective equipment and handle under fume hood
Isoflurane anesthesia Piramal Critical Care, Inc. 
Ethyl alcohol Sigma Aldrich MFCD00003568
NdFeB magnet 2" Dia x 1" thick Amazing magnets D1000P Axially magnetized disc magnet with poles on flat faces
Over-The-Wire trifold balloon Any commercially available OTW trifold balloon can be used
Phosphate buffered saline Life Technologies 10010-023 Commonly known as PBS
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma Aldrich MFCD00003528
Sodium pentobarbital Zoetis Commercial Name: Sleepaway (26%), FatalPlus, Beuthanasi.  Controlled substance to be ordered only by licensed veternarian
SolidWorks Dassault systems Software
SpinTJ-020 micro sensor MicroMagneitcs Sensible Solutions Long probe STJ-020 microsensor
SPION Mayo Clinic Nanoparticles synthesized internally (Ref: Lee, S. J. et al. Nanoparticles of magnetic ferric oxides encapsulated with poly(D,L latide-co-glycolide) and their applications to magnetic resonance imaging contrast agent. J Magn Magn Mater 272, 2432-2433, doi:DOI 10.1016/j.jmmm.2003.12.416 (2004))
Telazol Zoetis Controlled substance to be ordered only by licensed veternarian
Trypsin EDTA Life Technologies 25200-056 Gibco, Grand Island, NY
Xylazine Bayer Animal Health Commercial name: Rompun. Controlled sunstance to be ordered only by a licensed veternarian

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References

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Uthamaraj, S., Tefft, B. J., Hlinomaz, O., Sandhu, G. S., Dragomir-Daescu, D. Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention. J. Vis. Exp. (103), e53100, doi:10.3791/53100 (2015).

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