Summary
Hier presenteren we een protocol om permanent distale middelste cerebrale slagader occlusie bij oudere vrouwelijke ratten te produceren met gelijktijdige afsluiting van de halsslagaders om grote corticale infarcten en aanhoudende tekorten te genereren. We tonen de bevestiging van de laesie grootte met behulp van structurele MRI bij 24 uur en 8 weken na een beroerte.
Abstract
Beroerte ontstaat meestal bij oudere mensen met een bereik van comorbiditeit, waaronder carotis (of andere arteriële) atherosclerose, hoge bloeddruk, obesitas en diabetes. Dienovereenkomstig, bij de beoordeling therapieën voor een beroerte bij dieren, is het belangrijk om een model met uitstekende face validity selecteren. Ischemische beroerte is goed voor 80% van alle beroertes, en de meerderheid van deze optreedt op het grondgebied van de middelste cerebrale slagader (MCA), vaak induceren infarcten dat de sensorimotorische cortex beïnvloeden, waarbij een aanhoudende plegia of parese aan de contralaterale zijde van het lichaam. We tonen in deze video een methode voor het produceren van ischemische beroerte bij oudere ratten, waarvoor aanhoudende sensomotorische handicap en substantiële corticale infarcten veroorzaakt. In het bijzonder, we veroorzaken permanente distale middelste cerebrale slagader occlusie (MCAO) bij oudere vrouwelijke ratten met behulp van diathermie tang om een korte segment van de slagader af te sluiten. De halsslagader aan de ipsilaterale kant van de laesie werd vervolgens permanently afgesloten en de contralaterale halsslagader werd transient afgesloten gedurende 60 minuten. Wij meten de infarctgrootte met behulp van genoemde T2-gewogen magnetische resonantie beeldvorming (MRI) en 24 uur en 8 weken na een beroerte. In deze studie, de gemiddelde infarct volume was 4,5% ± 2,0% (standaard deviatie) van de ipsilaterale hemisfeer na 24 uur (gecorrigeerd voor zwelling van de hersenen met behulp Gerriet de vergelijking, n = 5). Dit model is uitvoerbaar en klinisch relevant omdat het de inductie van tekorten aanhoudende sensorimotorische, wat belangrijk is voor het ophelderen van pathofysiologische mechanismen en nieuwe behandelingen toestaat.
Introduction
Beroerte is momenteel de derde meest voorkomende doodsoorzaak wereldwijd en de belangrijkste oorzaak van invaliditeit 1. Ischemische beroerte, die 80% van alle beroertes omvat, resulteert vaak in infarcten in de cortex waardoor het verlies in de sensatie (bv, proprioceptie), in de motorische functie en in de aandacht op de aangedane zijde 2-4. De middelste cerebrale slagader (MCA) is de grootste van de schepen dat het aanbod trekt uit de cirkel van Willis en vloeit voort uit de interne halsslagader 5. Het MCA is de cerebrale schip meest getroffen in ischemische beroerte, met slagen in dit gebied goed voor 65% van alle ischemische beroerte 6,7. De MCA levert zowel corticale en subcorticale regio's en neurologische afwijkingen veroorzaakt door MCA een beroerte zijn afhankelijk van de exacte locatie van de occlusie 7. Proximale MCA afsluitingen van invloed op de diepe grondgebied door de lenticulostriatal slagaders en veroorzaken grote infarcten die zowel cortical en subcorticale regio's. In contrast, meer distale afsluitingen die uitsluitend corticale gebieden te beroven van de bloedstroom hebben de neiging om kleinere corticale infarcten veroorzaken.
In grote populatie studies, de menselijke beroerte laesies variëren 5-14% van de ipsilaterale hemisfeer 8,9; maligne lijn vertegenwoordigt 10% van beroertes en leidt tot grotere infarcten, die een hemicraniectomy intracraniële druk te verlagen, en patiënten met kleinere laesies vaker overleven 10. We tonen een reproduceerbaar model dat laesies die een vergelijkbaar deel van de halve bol als vele menselijke beroertes bezetten produceert.
Beroerte is een heterogene ziekte; 75% van ischemische beroerte worden veroorzaakt door een van beide lacunaire infarcten (van obstructie van de intracraniële kleine schepen); cardioembolische beroerte; of grote atherosclerose, die goed is voor 30% van de beroertes. Symptomatische atherosclerose wordt meestal waargenomen op het punt waar de gemeenschappelijke carotid slagader (CCA) zich vertakt in de interne en externe halsslagaders 11.
Pre-klinische modellen van een beroerte moet als vergelijkbaar met de menselijke conditie zijn mogelijk bij de pathofysiologie simuleren en moet de risicofactoren van een beroerte te nemen. 92% van ischemische beroerte komt voor bij mensen ouder dan 65, en andere risicofactoren omvatten obesitas, hoge bloeddruk en atherosclerose, zoals eerder besproken 12. Om beter vertegenwoordigen deze risicofactoren, is het raadzaam om een model dat een aantal van de pathofysiologische kenmerken van de natuurlijke toestand kunnen delen te gebruiken. In dit protocol hebben we opgenomen leeftijd en belemmerd bloedstroom door de halsslagaders.
Het klassieke model van middelste cerebrale arterie occlusie (MCAO) is de intraluminale filament model proximale MCA occlusie, die bloedstroom in de voorste en middelste cerebrale arteriën vermindert. Korte occlusie tijden het gebruik van dit model richt zich op de lEsion de subcorticale regio, terwijl langere occlusie tijd leiden tot grote laesies werven delen van zowel de corticale en subcorticale gebieden, wat resulteert in een hoger sterftecijfer bij oudere ratten. Ter vergelijking, het model van de groep omvat het uitvoeren van een craniotomie en opening van de dura gevolgd door bloedstolling en vernietiging van een klein gedeelte van de MCA via het verbranden bipolaire tang. Dit diathermie model is aangepast van het 1981 artikel van Tamura et al. 23 en het gebruik van de craniectomy kan beperken verhoogde intracraniale druk, die een kenmerk van de gesloten schedel en resulteert in hogere reproduceerbaarheid en een lagere sterfte in onze praktijk cohort in vergelijking met andere modellen 13. Reproduceerbare infarcten en langdurige invaliditeit genereren we permanent afsluiten en het proximale CCA tijdelijk afsluiten het distale CCA volgens Chen et al. 14 Wij maken gebruik van niet-invasieve T2-gewogen magnetische resonantie beeldvorming (MRI) De omvang en locatie van herseninfarct, en de mate van zwelling van de hersenen in de sensorimotorische cortex evalueren.
Protocol
Dit protocol werd goedgekeurd door Institutional richtsnoeren van King's College in Londen in te stellen en werd uitgevoerd in overeenstemming met het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken richtlijnen en Dieren (Scientific Procedures) Act van 1986. Richtsnoeren kan variëren tussen de instellingen; zorg er dan voor de naleving van institutionele richtlijnen voordat deze procedure. Met het oog op aseptische techniek te behouden bij het aanraken van apparatuur, autoclaaf een groot stuk aluminiumfolie en gebruik deze om rond apparatuur zoals handvatten Op de microscoop en anesthesieapparaat. Steriele plastic folie (plastic) kunnen ook worden gebruikt.
1. Voorbereiding
- Vertrouwd ratten met gel vloeistof packs (veterinaire herstel gel) en zachte chow voor ten minste 48 uur voorafgaand aan de slag operatie. Zoals dieren vaak moeite met eten en drinken na de procedure, de invoering van de dieren om deze items voor de operatie, om neofobie minimaliseren. Huis oude ratten met houten kauwen blocks om de incidentie van overwoekerde tanden te verminderen (zie hoofdstuk 6).
- Steriliseren alle chirurgische instrumenten voor het begin chirurgische procedures autoclaaf (ten minste 121 ° C, 15 psi, gedurende 15 min). Ontsmetten alle werkende oppervlakken met 1% chloorhexidine in 70% ethanol en gebruik chirurgische gordijnen en handhaven aseptische techniek gedurende de duur van de procedure.
- Induceren laesies op de contralaterale halfrond naar de gewenste poot. Toewijzen letsels aan de linker of de rechter hersenhelft, afhankelijk van de voorkeur voorpoot elke rat bepaald door de pre-operatieve basislijnen in de Montoya trap-test 15 (zie figuur 4). Eenvoudigheidshalve bij de beschrijving van deze procedure in dit handschrift, de linkerpoot de voorkeur poot en operaties worden uitgevoerd op de rechter hersenhelft. Gebruik Lister Hooded of Long Evans ratten gedurende deze gedragstesten als ze snel te leren.
Let op: De trap test is bedoeld om veranderingen in zowel fijne en grove geschoolde m metenovements volgende motor schade aan het systeem. De trap bestaat uit zeven stappen aan weerszijden van een centraal platform. Als uitrusting voor de trap-test niet beschikbaar is, de cilinder test is een geschikt alternatief voor het testen van linkshandigheid, maar er rekening mee dat er slechts een tijdelijke tekort aan deze test in dit model van een beroerte, en zal daarom niet geschikt zijn voor herstel op lange termijn na te meten behandeling.- Plaats drie suiker pellets in het putje van elke trede (21 korrels per zijde). Plaats ratten in de trap inrichting voor 10 min en het aantal pellets opgehaald en het aantal pellets verplaatst aan weerszijden opnemen.
Opmerking: Om te worden opgenomen in de taak postoperatief moet ratten een minimum van 75% pellets te halen bij baseline.
- Plaats drie suiker pellets in het putje van elke trede (21 korrels per zijde). Plaats ratten in de trap inrichting voor 10 min en het aantal pellets opgehaald en het aantal pellets verplaatst aan weerszijden opnemen.
2. Chirurgie
- Gebruik vrouwelijke ouderen Lister-een kap ratten bij 16-18 maanden (250 tot 400 g) en induceren anesthesie met 5% isofluraan in 1,5 l / min O 2. Na de inductie van de anesthesie, te verminderenhet niveau van isofluraan en onderhouden van een voldoende maar minimale diepte voor chirurgie (bijvoorbeeld 1,5-2%). Lever verdoving om het dier door een gezichtsmasker, en gebruik een scavenging systeem om blootstelling van de chirurg om isofluraan te beperken.
- Voer alle procedures tot aan, maar niet inclusief craniotomie on sham dieren, aangezien deze procedure gedragsstoornissen 16 kan produceren. Denk aan experimentele doelen bij het ontwerpen van MCAO experimenten, en beslissen of een schijnvertoning groep te controleren voor craniotomy moeten worden opgenomen.
- Dien pijnbestrijding pre- of de peri- operatief (Carprieve, 0,25 mg / kg, s. Snijden).
- Voeg 1 ml tot 19 ml steriele 0,9% zoutoplossing om de voorraad oplossing te maken en injecteer 0,6 ml per 300 g rat. Het gebruik van Carprieve voorkeur boven Carprofen omdat de eerste stabiel bij kamertemperatuur.
- Scheren de vacht op de ventrale halsgebied en temporale gebied op de rechterhelft aan de huid bloot. Ontsmet de chirurgische plaatsen Uzingen ethanol swabs. Zorg ervoor dat de lokale IACUC richtlijnen voor ontharing volgen.
- Voer deze stap verwijderd van het werkgebied om de hoeveelheid vacht op de incisieplaats minimaliseren.
- Plaats de rat op een prikbord bedekt met een steriel laken in rugligging op een verwarmingselement. Solliciteer lidocaïne room aan de geschoren gebieden van het hoofd en de nek. Plaats een rectale sonde om toezicht te houden en de temperatuur van het dier tussen 36,5-37,5 ° C te houden met een homeothermic systeem.
- Zet lacrilube zalf op de ogen om uitdroging te voorkomen. Geven de rat een injectie met atropine sulfaat oplossing (0,05 ml van een 600 ug / ml oplossing, subcutaan) op tracheasecreet verminderen.
Opmerking: Onderzoekers moeten overwegen het meten van fysiologische variabelen zoals bloed gassen en druk.
- Zet lacrilube zalf op de ogen om uitdroging te voorkomen. Geven de rat een injectie met atropine sulfaat oplossing (0,05 ml van een 600 ug / ml oplossing, subcutaan) op tracheasecreet verminderen.
- Voor het begin van de operatie, controleer dan de achterpoot knijpen terugtrekking en knipperen reflexen volledige narcose te bevestigen.
- Onder een micro ontledenscope, maak een 2 cm centrale middellijn incisie op de blootgestelde hals met een scalpel. Verplaats de speekselklieren voorzichtig lateraal van de trachea aan beide zijden.
- Lus nietabsorbeerbare zijden hechtdraad rond de huid die de halsslagader overlapt aan één zijde. Trek weg de huid van de site met behulp van de zijden hechtdraad en plak deze naar beneden naar het prikbord met behulp van chirurgische tape om de halsslagader te onthullen. Zorgvuldig blunt ontleden de slagaders vrij van omliggende fascia en de vagale zenuwen met behulp van fijne pincet.
- Zorg ervoor dat de spier of nervus vagus niet beschadigt tijdens deze stap, omdat deze voeding zal schaden, slikken en ademen.
- Zodra de halsslagader wordt blootgesteld, gebruikt nietabsorbeerbare zijden hechtdraad (5/0) om de halsslagader te isoleren, eerst de carotis scheiden van de nervus vagus door omgekeerde ontleden met fijne pincet en zorg dat contact met de zenuw maken. Zodra het schip is een lus (maar niet gebonden) met de hechtdraad, taap de uiteinden van de hechtdraad aan elkaar met chirurgische tape deze stap ongedaanmaking voorkomen. Verwijder de hechtingen het tegenhouden van de bovenliggende huid.
- Herhaal dit voor de andere zijde (secties 2,7-2,8)
- Plaats een steriele zoutoplossing gedrenkt gaas in de wond vochtig weefsel gedurende de rest van de operatie te houden. Losjes hechtdraad de huid en het plaatsen van een extra-zoutoplossing gedrenkt gaas over het gebied om verdere uitdroging te voorkomen.
- Plaats ratten in een laterale positie en een insnijding in de huid in het midden tussen de juiste baan en de uitwendige gehoorgang. Trek de huid met behulp van maximaal vijf elastiek 3 mm haak oprolmechanismen vastgemaakt aan het prikbord en dan stomp ontleden de temporalis spier aan de schedel te onthullen.
- Plaats een duim-wiel aangepast zwaartekracht gedreven zoutoplossing druppelen boven de open plaats (debiet ongeveer 2 ml / min) en het opzetten van een aspirator systeem om het bot vuil te verwijderen en om kleine bloeden in deze fase van de operatie te verwijderen uit de blootgestelde website ( Sekteionen 2,13-2,16).
- Plaats de zoutoplossing mondstuk op het hoogste punt van de schedel bij de oren en de aspirator mondstuk op het laagste punt. Stel het wiel tijdens bloedt zouter leveren aan het gebied om de bron van een bloeding beter zichtbaar voor cauterisatie van het schip, waardoor de hoeveelheid tijd die de dieren onder narcose.
Figuur 1. Chirurgische set up van de permanente distale middelste cerebrale slagader occlusie model. Het wordt gebruikt in de set-up voor de rat craniotomie apparatuur wordt getoond voor de rechter hersenhelft, en inzet, de positionering van de afzuiger en zoute druppelen rond de craniectomy website. Ook getoond zijn de belangrijkste kenmerken van het vaatstelsel; de middelste cerebrale slagader (rood) en inferieure cerebrale ader (blauw) getoond, en het gearceerde gebied geeft aan waar stolling van de slagader plaatsvindt.Bevestiging van de occlusie wordt uitgevoerd door het snijden van de MCA onder de inferieure cerebrale ader. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Voer een craniotomie op het blootgestelde gebied (ongeveer 5 mm x 5 mm) met een tandartsboor een grove 1,6 mm diamantlaag boor braam bij ongeveer 8000 rpm, bij de toepassing van circulaire en laterale druk en geen neerwaartse druk tijdens het boren van het blootgestelde gebied . Zodra het bot is dun genoeg dat het lijkt volledig transparant, verwijderen met een tang.
- Gebruik een zelfgemaakte durale haak, gemaakt door het buigen van een uiteinde fijne tang ongeveer 180 ° om een boog te vormen, de dura zorgvuldig openen, waarbij voorzichtig het grote oppervlak bloedvaten te voorkomen, omdat ze gevoelig en gemakkelijk te scheuren.
Opmerking: Het blootgestelde oppervlak van de hersenen de middelste cerebrale slagader (MCA) tonen; het gewenste segmentis ongeveer 2 mm (zie figuur 1, bijvoegsel). - Coaguleren MCA waar de onderste cerebrale ader kruisen, tot het punt van slagader bifurcatie en dan langs de caudale takken van de MCA met een paar pincetten diathermie tot goede afsluiting 17. Gebruik schuine Juwelier diathermie pincet met 0,25 mm puntige uiteinden.
- Bij het afsluiten van de slagader, passen de zoutoplossing stroom nodig om dit gebied te koelen, waardoor de coagulerende forceps het opvolgen van het bloedvat. Wanneer afgesloten, het bloedvat blijkt zwart en geen teken van de bloedstroom aanwezig te zijn; bloedstroming kan worden gezien in gedeeltelijk afgesloten vaten.
- Snijd de MCA op dit punt om volledige afsluiting te bevestigen. Gebruik microvasculaire schaar gesneden onder waarbij de onderste cerebrale ader kruist het MCA.
- Bedek het blootgestelde gebied met een zoutoplossing gedrenkt gaasje voordat u doorgaat naar de volgende stap.
- Draai de rat terug naar een liggende positietie en de heropening van de losjes gebonden hechting op de hals om opnieuw bloot de halsslagaders. Ligeren de halsslagader aan dezelfde kant als de ingesloten MCA (rechts) permanent met een knoop in de zijden hechtdraad rond de carotis, terwijl de linker carotide slagader wordt afgesloten onder tijdelijke toepassing van een 13 mm roestvrijstalen slagader clip met 125 g druk gedurende 60 min. Losjes hechtdraad de incisie in de nek gedurende deze tijd en plaats een steriele zoutoplossing gedrenkt gaas geplaatst om uitdroging te voorkomen.
- Merk op dat de rechtse kant van het dier zal worden op de chirurg linkerkant, gezien de liggende positionering.
- Voor sham dieren, opent het ventrale deel van de nek en temporale gebieden en scheiden de spieren aan de gemeenschappelijke halsslagaders te lokaliseren, maar niet af te sluiten. Hebben sham dieren ondergaan procedures tot aan, maar niet inclusief craniotomy, aangezien deze procedure afwijkend gedrag 16 kan produceren. Om verblinding van andere t behoudeneam-leden (bijvoorbeeld tijdens latere gedrags- testen), het uitvoeren van insnijdingen en hechten.
Figuur 2. Tandem carotis occlusie volgende middelste cerebrale arterie occlusie. De rechter gemeenschappelijke halsslagader (CCA) permanent afgesloten door het leggen van een zijden hechtdraad (5/0) rond het bloedvat (aan de linkerkant van het beeld). De linker CCA (rechts) wordt geoccludeerd gedurende 1 uur met behulp van een microvasculaire klem. Deze operaties werden uitgevoerd zorg ervoor dat u contact met de nervus vagus aan elke kant (wit) te maken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Hechtdraad de incisie in de temporale gebied tijdens de 1 h linker halsslagader occlusie.
- Geef ratten 20 ml zoutoplossing subcutaan (5 ml tot twee plaatsen op elke flank) hydratatie te handhaven (zie6.2).
- Bij 60 min voorbij is, verwijdert u de clip. Solliciteer zoutoplossing plaatselijk naar de omliggende spieren, en sluit de incisie in de nek met behulp van subcutane continue stiksels van absorbeerbare hechtingen (4/0).
3. Plaats operatieve zorg
- Plaats de rat in een 31 ° C incubator om te herstellen van de anesthesie tot 4 uur.
Opmerking: De onderzoekers kunnen de voorkeur aan andere temperaturen en duur volgens de lokale praktijk te gebruiken. - Herhaal carprieve (0,25 mg / kg), voor pijnbestrijding bij 24 uur. Omdat alle dieren dezelfde dosis Carprieve ontvangt, wordt deze factor gecontroleerd voor het systematisch. Elke neuroprotectieve effect van Carprieve is waarschijnlijk verwaarloosbaar zijn.
- Geef zoutoplossinginjecties dagelijks dehydratatie ten minste de eerste drie dagen voorkomen. In de veronderstelling dat een rat vereist 65 ml vocht per kg lichaamsgewicht (elke 24 uur), ervoor zorgen dat iedere 300 g rat ontvangt ~ 22 ml vocht per dag.
4. Conbevestigingsscherm van Infarct
- Voor het meten van het infarct volume gebruiken structurele MRI.
Opmerking: Een alternatieve methode kan zijn om histologische kleuring gebruiken zoals tetrazolium chloride (TTC), die eerder is gecorreleerd met structurele MRI gegevens 18. Dit kan echter alleen worden gebruikt aan het eindpunt van de studie en niet langsrichting.- Vierentwintig uur na de inductie van MCAO, verdoven ratten met isofluraan (5% voor inductie, 1-1,5% voor onderhoud) in 0,9 L / min Medical Air en 1 l / min O 2, beveiligd een kwadratuur birdcage magnetische resonantie spoel (43 mm diameter) en in een 7 Tesla horizontale boring scanner.
- Het verkrijgen van T2-gewogen scans met behulp van een fast-spin echo volgorde: echo tijd (TE) 60 msec, herhalingstijd (TR) 4000 msec, gezichtsveld (FOV) 40 x 40 mm, acquisitie matrix 128 x 128, het verwerven van 40 x 0,5 mm dikke plakken ongeveer 8 minuten. Vervolgens zetten 40 schijfjes in 20 x 1 mm dikke plakken met behulp van de RESAMPLing functie in de medische beeldvorming software.
- Verkrijgen laesie delen in een medisch beeld vertonende verpakking door meting van de dwarsdoorsnede van infarct in 20 volumes. Verkrijgen van het totale volume van de som van deze gebieden te vermenigvuldigen met de dikte (1 mm). Bereken het groepsgemiddelde volume en de standaarddeviatie. Het percentage laesie volume berekeningen, ook de volumes van de ipsilesional en contralesional hemisferen te verwerven.
- Om te corrigeren voor zwelling van de hersenen als gevolg van oedeem, passen deze waarden met behulp van Gerriets 'formules 18. Alleen onder plakjes dat cortex bevatten en niet de kleine hersenen of olfactorische bollen bevatten volgens een standaard rat atlas 19 om te voorkomen dat over-correctie, omdat dit negatieve laesie volumes kan genereren.
- Acquire T2 gewogen beelden weer 8 weken na een beroerte operatie.
5. steekproefgrootte for Future Studies beoordelen van Neuroprotectie en Behavioral Recovery </ P>
- Voer steekproefgrootte berekeningen om de minimumomvang die in de toekomst hypothetische neuroprotectieve experimenten met behulp van twee groepen (controle vs. Behandeling) op de behandeling effecten van drie verschillende grootheden (25% reductie, 50% korting, 75% reductie) te identificeren die nodig zou gebruiken schatten de a priori algoritmes geïmplementeerd in de macht analyse software 20.
Opmerking: Om de lezer in staat te stellen soortgelijke berekeningen doen met hun eigen gegevens, zijn er screenshots van vrij verkrijgbare macht analyse software (zie Representatieve resultaten). Gebruik de volgende parameters: aanvaardbaar vals-positieve tarief (dat wil zeggen, type I fout drempel; α) ≤0.05 en macht (waarvan 1-β gelijk) ≥0.80 (dat wil zeggen, meer dan 80% vermogen). Zie hieronder voor uitleg en een discussie 21.
6. Ouderen Dierenwelzijn na een beroerte Surgery
- Maak beschikbare extra zachte chow eennd rehydratatie gel packs dat de ratten werden gewend aan voor de operatie, naast water flessen met uitgebreide tips voor eenvoudiger verstrekkende. Daarnaast hebben een absorbeerbare herstel pad in de kooien in plaats van losse bedden (dat wil zeggen, voorkomen dat hout chip) voor de eerste 24 uur, en zorgen voor extra nesten bedden. Heeft gepureerde voeding (bv babyvoeding) niet als ratten met dysfagie kan stikken.
- Weeg dieren dagelijks gedurende 7 dagen om herstel te controleren. Gewichtsverlies is een eerste indicatie van uitdroging en stress. Gewichtsverlies in de eerste dagen na de operatie geeft hoofdzakelijk uitdroging (in plaats van verlies van lichaamsgewicht als gevolg van verminderde voeding).
- Wanneer een verouderende rat toont gewichtsverlies die niets met de operatie, te vervangen verloren lichaamsgewicht met een equivalent gewicht van vloeistoffen en inspecteren de bovenste en onderste tanden. Waar tanden zijn overwoekerd, verdoven van de rat met isofluraan (zoals in paragraaf 2.1), en plaats in een liggende positie
- Plaats een 1 ml spuit achter de teeth aan de zachte weefsels te beschermen. Snijd met behulp van een hand-held cirkelzaag (bijvoorbeeld ongeveer 3 cm diameter) met een hoog toerental, maar met trage, stevige handbewegingen (bijvoorbeeld 3 sec cuts). Laat de tanden van de rat afkoelen tussen bezuinigingen. Waarborgen dat de roterende zaag op de doorn is gemonteerd dat de tanden van de zaag staan in de draairichting. Het is de moeite waard om individueel verpakt, gesteriliseerd roterende zagen klaar voor dit soort gevallen.
Opmerking: overgroei kunnen optreden bij oudere ratten zelfs wanneer gehouden op een vaste pellet dieet. We raden aan dat de tanden worden gecontroleerd bij oudere ratten regelmatig.
- Plaats een 1 ml spuit achter de teeth aan de zachte weefsels te beschermen. Snijd met behulp van een hand-held cirkelzaag (bijvoorbeeld ongeveer 3 cm diameter) met een hoog toerental, maar met trage, stevige handbewegingen (bijvoorbeeld 3 sec cuts). Laat de tanden van de rat afkoelen tussen bezuinigingen. Waarborgen dat de roterende zaag op de doorn is gemonteerd dat de tanden van de zaag staan in de draairichting. Het is de moeite waard om individueel verpakt, gesteriliseerd roterende zagen klaar voor dit soort gevallen.
- Wanneer een oudere rat toont gewichtsverlies en pilo-erectie niet gerelateerd aan de operatie, bespreken behandeling opties met een dierenarts. Beschouw humaan doden van het dier. MRI van deze dieren kan een hypofysetumor (vaak bij oudere vrouwelijke ratten) dat is onuitvoerbaar en fatale tonen.
Representative Results
Permanente MCAO werd geïnduceerd door het uitvoeren craniotomie, gevolgd door coagulatie en vernietiging van de middelste cerebrale slagader door diathermie combinatie met permanente occlusie van de ipsilesional halsslagader en 60 min occlusie van de contralesional halsslagader. Een schema van de instelling van de apparatuur en afgesloten MCA is weergegeven in figuur 1, en de halsslagaders in Figuur 2 (hierboven).
Beroerte uitkomst werd bepaald 24 uur en 8 weken na een beroerte door meting van het infarct volume van 40 x 0,5 mm segmenten (van rostrale eind bulbus olfactorius tot rostrale eind ruggenmerg) via het interessegebied toolkit in een medische beeldweergave pakket. Een representatieve T2-gewogen MRI-scan structurele getoond voor hetzelfde dier bij 24 uur en 8 weken (figuur 3A). Het infarctvolume werd geïdentificeerd door de gebieden van de rattenhersenen met een hyperintense signaal; als T2 gewichted beelden tonen water of plasma als een helder wit gebied. Het is bekend dat er een toename in oedeem en zwelling van de hersenen na een beroerte, en dit kan worden gemeten van een T2-gewogen scan die gecorreleerd is aan histologische metingen van infarctvolume 18. Echter, oedeem vroeg na beroerte (bijvoorbeeld 24 uur) kan leiden tot een overschatting van de uiteindelijke laesievolume (bijvoorbeeld bij 8 weken) en daarom hebben we ook aanwezig gemiddelde infarct volumes aangepast volgens Gerriet de formules. Figuur 3B toont de gemiddelde gegevens van het ruwe (niet-aangepaste) laesie volume bij 24 uur als 62,8 mm 3 (± 25,4 mm 3 SD, bovenste grafiek); Dit neemt 9,8% van de getroffen halfrond (± 4,2% SD, midden grafiek). Wanneer gecorrigeerd voor zwelling van de hersenen met behulp van formules Gerriets 'deze waarde wordt verlaagd tot 4,5% (± 2,0% SD, onderste grafiek).
Stroke ernst werd ook gemeten met behulp van de Montoya trap-test 15. Kortom, eennimals werden vooraf getraind om suiker pellets ophalen voor 4 weken vóór MCAO beroerte chirurgie, en getest op 8 weken na beroerte (figuur 4) een aanhoudend tekort bevestigen. Ratten werden in het trappenhuis apparaat geplaatst gedurende 10 min en het aantal pellets opgehaald werd opgenomen (van 21 korrels) en weergegeven als een percentage (groepsgemiddelden ± standaardfout). Een regressie-analyse werd uitgevoerd om de lijn naar de gegevens aanpassen.
Figuur 5 toont de steekproefbepaling behulp infarct volumegegevens (potentiële effecten van kandidaat therapieën), geanalyseerd met behulp van een algoritme macht analysesoftware een t-test met "Verschil tussen twee onafhankelijke middelen (twee groepen)" en met de (ongecorrigeerde ) en standaarddeviaties uit figuur 3B. De informatie in Figuur 5 en Tabel 1 laten zien dat 12 ratten per groep nodig zou zijn om een therapie die inf verminderd detecterenArct volume met 50% bij 24 uur, terwijl Figuur 6 toont een "XY plot" vermogen bereikt met diverse aantallen dieren. Tabel 1 vat steekproefgrootte voor alle tijdstippen.
Figuur 3. T2-gewogen MRI structuur wordt gebruikt om de grootte van het infarct en zwelling van de hersenen na een beroerte te meten. (A) een T2-gewogen magnetische resonantie afbeelding van dezelfde rattenhersenen 24 uur en 8 weken na inductie van een beroerte. Het witte gebied vertegenwoordigt de laesie, maar bevat ook een aantal vasogeen oedeem dat lost met 8 weken. (B) Infarct volumes werden gemeten met een medisch beeld vertonende verpakking Region of Interest Toolkit, en worden uitgezet in een grafiek vertegenwoordigt het gemiddelde ± SD voor 3 tijdstippen gebruikt (n = 6). Raw laesie volume (niet gecorrigeerd voor zwelling van de hersenen als gevolg van edema), zijn percentage letsel van de getroffen halfrond (niet gecorrigeerd voor zwelling), en het percentage letsel van halfrond gecorrigeerd voor zwelling van de hersenen met behulp van formules Gerriets 'hier afgebeeld. BR werd in plaats van SEM gebruikt om steekproefgrootte (zie figuur 5) uit te voeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. De trap test blijkt beperkingen in te grijpen en het ophalen van pellets. In deze slag model was er zeer weinig spontaan herstel. Beroerte bij oudere ratten schaadt aanhoudend behendigheid, blijkt uit de wekelijkse testen met behulp van de "trap test" van de pellet te bereiken. Inzet: Een foto van een rat het uitvoeren van de gedragstest. De grafiek toont de gemiddelde (± standard fout) aantal pellets opgehaald (van de 21, uitgedrukt als een percentage) per week door de getroffen voorpoot. n = 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Voorbeeld grootteberekeningen groep aantallen ratten passen om het gewenste therapeutische effect te detecteren bepalen. Deze screenshot, genomen uit macht analysesoftware, blijkt dat 12 ratten per groep zou zijn om een therapie die infarct volume met 50% detecteren bij 24 uur. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Vermogen bereikt met verschillende totale aantallen dieren. Een "XY plot voor een reeks waarden" van kracht analysesoftware toont de kracht die zou worden verkregen voor experimenten met diverse (totaal) aantal oude ratten, gezien de parameters weergegeven in figuur 5. Tabel 1 geeft een overzicht van al onze resultaten. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Tijd na een beroerte: | Aantal ratten per groep vereist om een vermindering laesievolume van sporen: | ||
| 75% | 50% | 25% | |
| 24 hr | 6 | 12 | 42 |
| 8 weken | 4 | 5 | 17 |
Tabel 1. Berekeningen van steekproefomvang per groep voor hypothetische toekomstige experimenten. Berekend op basis van de macht analyse-software (zie de figuren 5 en 6). Tabel geeft het aantal ratten per groep nodig om een twee-groep experiment waarin 25%, 50% en 75% vermindering laesievolume detecteren bij elk van de tijdstippen in de studie.
Discussion
MCAO in knaagdieren is een techniek vaak toegepast om menselijke slagmodel. Dit model heeft wel een paar details op te merken in het protocol. Ten eerste is het essentieel om de lichaamstemperatuur van het dier te handhaven gedurende het experiment wordt de grootte van het infarct en het aantal sterfgevallen in een studie beïnvloedt. Het kan mogelijk zijn om isofluraan stoppen tijdens de transiënte occlusie van de rechter CCA en bewaar ratten in een verwarmde, rustige overleving te verhogen door het verminderen van de blootstelling aan isofluraan. Onderzoekers moeten overwegen of een kortere periode verdoving opweegt tegen de stress van extra inductie. Het vaatstelsel (bijv MCA vertakking) van de ratten varieert binnen en tussen cohorten van 22 dieren. Het is belangrijk om dit in gedachten te houden bij het begin van een nieuwe studie. Verschillende CCA occlusie tijd worden geëvalueerd (bijvoorbeeld 30, 45, 60 en 90 min). In dit onderzoek een occlusie van 60 min wordt gebruikt. In andere studies hebben we gevonden dat 45min afsluitingen veroorzaken een vergelijkbare grootte corticale infarct, maar met anekdotisch bewijs van verbeterde overleving. Dienovereenkomstig hebben de chirurgen beginnen met een korte occlusietijd (bijvoorbeeld 30 minuten) om te zien of er voldoende laesie volumes (en / of vereist gedragsstoornissen) verkregen en pas daarna indien nodig occlusie malen te verhogen. Behavioural tekorten worden niet ondersteund in volwassen ratten dan bij oudere ratten met identieke occlusie tijden.
MRI kan worden gebruikt om te beoordelen of (na een bepaalde occlusietijd) laesie volumes geschikt voor de studie doelen. Een kleine laesie zou overspannen minder dan tien 0,5 mm coronale plakjes (van de 40). Een middelgrote laesie zou overbruggen tussen de tien en twintig coronale plakjes. Een grote laesie zou overbruggen tussen de twintig en dertig coronale plakjes. Een zeer grote laesie zou meer dan dertig van de veertig plakjes overspannen. In onze ervaring, ratten met zeer grote laesies (meer dan dertig plakjes) en / of het bewijs van herniation across de middellijn hebben meestal een slechte prognose: kortere occlusie tijden kan worden beschouwd. MRI is ook handig voor de beoordeling van de infarct locatie: sommige zijn meer caudaal gelegen en sommige zijn meer rostraal gevestigd.
Wees extra voorzichtig bij het scheiden van de nervus vagus van zowel de gemeenschappelijke halsslagaders. Rales (raspen) kunnen optreden na een beroerte chirurgie en dit kan worden veroorzaakt door schade aan de zenuwen in sommige dieren, hoewel de oorzaak is op dit moment onduidelijk: in onze ervaring, prognose is zeer slecht voor deze dieren en het is meestal aangeraden om ze op humane wijze te doden.
De permanente diathermie MCAO model resulteert in reproduceerbare corticale infarcten en acceptabele postoperatieve overleving bij oudere ratten. De techniek heeft echter, vereisen invasieve chirurgie onder een stereomicroscoop. Het is belangrijk om aseptische omstandigheden te handhaven als dieren zeer snel herstellen van een operatie. Let erop dat de MCA niet beschadigd terwijl het blootstellen en coaguleren de slagader,en beschadiging van het corticale oppervlak moet worden geminimaliseerd anders het blootgestelde oppervlak van de cortex mag in de infarct zone vormen. Het verdient aanbeveling om zoveel mogelijk ervaring te verkrijgen om de procedure en om consistente infarcten bereiken en vast occlusie keer voordat een onderzoek wordt uitgevoerd om kandidaat therapieën testen, bijvoorbeeld. Onderzoekers moeten alle behandelingen binnen chirurgie sessies willekeurig ( "block randomisatie") waar mogelijk. Het is vermeldenswaard dat dit model MCA reperfusie geen sprake is (tenzij transient MCA ligatie wordt gebruikt in plaats van diathermie). Hoge mortaliteit bij oudere ratten met deze grote corticale infarcten maar het moet mogelijk zijn om de mortaliteit verminderen door occlusie kortere tijden en door het minimaliseren van de blootstelling aan algemene anesthesie plaats mogelijk is (bijvoorbeeld tijdens occlusie). Het gebruik van 70% N2 en 30% O O 2 als drager kunnen lagere isofluraan laten gebruiken: deze verminderde blootstelling aan isofluRane kan resulteren in hogere overlevingskansen.
Een ander punt van overweging is dat atherosclerose is een geleidelijk proces, dat in dit protocol te simuleren we het met acute CCA occlusie. De aanzienlijke vermindering van de bloedstroom en aanhoudende tekorten simuleren tandem occlusies die komen in veel patiënten met een beroerte. Permanente distale MCAO zonder tandem CCA occlusie bij ratten niet beroertes reproduceerbaar 14 opwekken bovendien zonder tandem CCA occlusie, hebben we aanzienlijke treedt spontaan herstel opzicht uit langdurige gedragsevaluatie beroerte therapieën dan 8 weken. In tegenstelling, tonen wij aan dat distale MCAO met tandem CCA occlusie induceert tekorten langdurig bij oudere ratten.
Tot slot, deze procedure bij ratten veroorzaakt slagen die vergelijkbaar in grootte en locatie met die bij de menselijke conditie zijn, met aanhoudende handicap die men kan gebruiken om het testen van nieuwe behandelingen en opheldering van hergebruik mogelijk te makenpair mechanismen na ischemische beroerte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen | Norbrook | Vm No; 02000/4229 | give 0.25 mg/kg |
| Atropine Sulfate | AmTech | RXATRINJ-100 | |
| Alcohol swabs | UHS | 20021 | |
| Lidocaine cream (Emla) | AstraZeneca | 0012901 | Apply a pea sized drop to the shaved neck and temporal regions |
| Homeothermic Blanket System | Harvard Instruments | 507222F | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
| Isoflurane | Abbott | B506 | |
| Silk sutures | Harvard Apparatus | 723288 | |
| Cautery system | Eschmann | ||
| 0.25 mm Jeweler cautery forceps | Eschmann | 8330349 | |
| fine Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Thumb driven saline drip system | |||
| Vacusafe aspirator system | INTEGRA BIOSCIENCES | 158320 | |
| 1.6 mm coarse diamond coated Steel burrs | K801 104 016 | ||
| Handheld dental drill | NSK | NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B) | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microvascular scissors | World Precision Instruments | 501790 | |
| 4-0 Vicryl sutures | Ethicon | ||
| Vascular clip and applicator | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas | VetTech Solutions | ||
| Carbon Steel Scalpel blades No. 10 | Swann-Morton | 201 | |
| 25 g needles | Terumo | NN-2525R | |
| syringes (1 ml and 5 ml) | Terumo | SS+01T1 / SS*05SE1 | |
| Saline (Sodium Chloride 0.9%) | Fresenius Kabi | Pl 08828/0178 | |
| cotton buds | Johnson and Johnson | 5000207582502 | sterilize before use |
| gauze | sterilize before use | ||
| Medical Imaging Package (Jim) | Xinapse | Free software | |
| Statistical Parametric Mapping Software (SPM8) | UCL | Free software | |
| Power Analysis Software (G*Power) | Universität Düsseldorf | Free software |
References
- Pendlebury, S. T., et al. Underfunding of stroke research: a Europe-wide problem. Stroke. 35, 2368-2371 (2004).
- Doyle, S., Bennett, S., Fasoli, S. E., McKenna, K. T. Interventions for sensory impairment in the upper limb after stroke. Cochrane Database Syst Rev. 6, CD006331 (2010).
- Reep, R. L., et al. A rodent model for investigating the neurobiology of contralateral neglect. Cogn Behav Neurol. 17, 191-194 (2004).
- Carey, L. M., et al. Relationship between touch impairment and brain activation after lesions of subcortical and cortical somatosensory regions. Neurorehabil Neural Repair. 25, 443-457 (2011).
- Mohr, J. P., Lazar, R. M., Marshall, R. S., et al. Ch. 24. Stroke: Pathophysiology, Diagnosis and Management. Mohr, J. P., et al. , Elsevier. 384-424 (2011).
- Sacco, R. L., et al. Subarachnoid and intracerebral hemorrhage: Natural history, prognosis, and precursive factors in the Framingham Study. Neurology. 34, 847-847 (1984).
- Hossmann, K. A., Heiss, W. D. Ch. 1. Textbook of Stroke Medicine. Brainin, M., Heiss, W. D. , Cambridge University Press. 1-27 (2009).
- The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. Tissue Plasminogen Activator for Acute Ischemic Stroke. N Engl J Med. 333, 1581-1587 (1995).
- Brott, T., et al. Measurements of Acute Cerebral Infarction: Lesion Size by Computed Tomography. Stroke. 20, 871-875 (1989).
- Lövblad, K. O., et al. Ischemic Lesion Volumes in Acute Stroke by Diffusion-Weighted Magnetic Resonance Imaging Correlate with Clinical Outcome. Ann Neurol. 42, 164-170 (1997).
- Norrving, B. Ch. 2. Textbook of Stroke Medicine. Brainin, M., Heiss, W. D. , Cambridge University Press. 28-39 (2009).
- Truelsen, T., et al. Stroke incidence and prevalence in Europe: a review of available data. Eur J Neurol. 13, 581-598 (2006).
- Ord, E. N., et al. Positive impact of pre-stroke surgery on survival following transient focal ischemia in hypertensive rats. J Neurosci Methods. 211, 305-308 (2012).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17, 738-743 (1986).
- Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The 'staircase test': a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. J Neurosci Methods. 36, 219-228 (1991).
- Adams, F. S., Schwarting, R. K., Huston, J. P. Behavioral and neurochemical asymmetries following unilateral trephination of the rat skull: is this control operation always appropriate? Physiol Behav. 55, 947-952 (1994).
- Macrae, I. M. Ch. 5. Rodent Models of Stroke, Neuromethods. U, D. irnagl 47, Humana Press, Springer. 41-53 (2010).
- Gerriets, T., et al. Noninvasive Quantification of Brain Edema and the Space-Occupying Effect in Rat Stroke Models Using Magnetic Resonance Imaging. Stroke. 35, 566-571 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. R., Emson, P. C. AChE-stained horizontal sections of the rat brain in stereotaxic coordinates. J Neurosci Methods. 3, 129-149 (1980).
- Faul, F., Erdfelder, E., Buchner, A., Lang, A. G. Statistical power analyses using G*Power 3.1: tests for correlation and regression analyses. Behav Res Methods. 41, 1149-1160 (2009).
- Button, K. S., et al. Power failure: why small sample size undermines the reliability of neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 14, 365-376 (2013).
- Fox, G., Gallacher, D., Shevde, S., Loftus, J., Swayne, G. Anatomic variation of the middle cerebral artery in the Sprague-Dawley rat. Stroke. 24, 2087-2093 (1993).
- Tamura, A., Graham, D. I., McColloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).
