Summary
Nous présentons ici un protocole pour produire une occlusion permanente distale de l'artère cérébrale moyenne chez les rats femelles âgées avec occlusion simultanée des artères carotides de produire de grandes infarctus corticaux et des déficits subis. Nous montrons la confirmation de la taille de la lésion en utilisant l'IRM structurelle à 24 h et 8 semaines après un AVC.
Abstract
Accident vasculaire cérébral se produit généralement chez les personnes âgées avec une gamme de comorbidités dont la carotide (ou autre artérielle) l'athérosclérose, l'hypertension artérielle, l'obésité et le diabète. En conséquence, lors de l'évaluation des thérapies pour les AVC chez les animaux, il est important de choisir un modèle avec une excellente validité apparente. représente un AVC ischémique de 80% de tous les AVC, et la majorité d'entre eux se produisent sur le territoire de l'artère cérébrale moyenne (MCA), induisant souvent infarctus qui affectent le cortex sensori-moteur, provoquant plégie persistante ou parésie sur le côté opposé du corps. Nous démontrons dans cette vidéo un procédé pour produire un accident ischémique cérébral chez les rats âgés, ce qui provoque un handicap sensori soutenue et infarctus corticaux substantielles. Plus précisément, nous provoquons une occlusion permanente distale de l'artère cérébrale moyenne (MCAO) chez les rats femelles âgées à l'aide des pinces de diathermie pour obturer un court segment de cette artère. L'artère carotide du côté homolatéral à la lésion était alors permanently occlus et l'artère carotide controlatérale a été transitoirement occlus pendant 60 min. Nous mesurons la taille de l'infarctus en utilisant l'imagerie par résonance magnétique pondérée en T2 structurelle (IRM) à 24 h et 8 semaines après un AVC. Dans cette étude, le volume infarctus moyen était de 4,5% ± 2,0% (écart-type) de l'hémisphère ipsilatéral à 24 h (corrigée de l'enflure du cerveau en utilisant l'équation de Gerriet, n = 5). Ce modèle est faisable et cliniquement pertinente car elle permet l'induction des déficits sensori-moteurs soutenus, ce qui est important pour l'élucidation des mécanismes physiopathologiques et de nouveaux traitements.
Introduction
L'AVC est actuellement la troisième cause la plus fréquente de décès dans le monde et la première cause d'invalidité 1. Accident vasculaire cérébral ischémique, qui comprend 80% de tous les AVC, se traduit souvent par infarctus dans le cortex causant la perte de sensation (par exemple, la proprioception), de la fonction motrice et l'attention sur le côté affecté 2-4. L'artère cérébrale moyenne (MCA) est le plus grand des navires qui attire l'offre du cercle de Willis et provient de l'artère carotide interne 5. Le MCA est le vaisseau cérébral le plus souvent affecté dans un accident ischémique cérébral, avec des coups dans ce territoire qui représente 65% de tous les AVC ischémiques 6,7. Le MCA fournit deux régions corticales et sous-corticales et des anomalies neurologiques causés par MCA AVC varient selon l'emplacement exact de l'occlusion 7. occlusions proximale MCA affectent le territoire profonde à travers les artères lenticulostriatal et causent de grandes infarctus englobant à la fois cortical et régions sous-corticales. En revanche, les occlusions plus distales qui privent les régions corticales uniquement du flux sanguin ont tendance à produire plus petits infarctus cortical.
Dans les grandes études de population, les lésions de course humains vont de 5 à 14% de l'hémisphère ipsilatéral 8,9; représente course maligne pour 10% des accidents vasculaires cérébraux et donne lieu à de plus grandes infarctus, nécessitant une hémicrâniectomie pour réduire la pression intracrânienne, et les patients avec des lésions plus petites sont plus susceptibles de survivre 10. Nous démontrons un modèle reproductible qui produit des lésions qui occupent une proportion similaire de l'hémisphère autant de coups droits.
L'AVC est une maladie hétérogène; 75% des accidents vasculaires cérébraux ischémiques sont induites soit par des infarctus lacunaires (de l'obstruction des petits vaisseaux intracrâniens); AVC cardio-embolique; ou grande athérosclérose de l'artère, qui représente 30% des accidents vasculaires cérébraux. athérosclérose symptomatique est plus fréquemment observé à l'endroit où le c communeartère arotid (CCA) aux artères carotides internes et externes 11.
modèles pré-cliniques de course doivent être aussi proche de la condition humaine que possible de simuler sa physiopathologie et intégrer les facteurs de risque d'accident vasculaire cérébral. 92% des AVC ischémique se produit chez les personnes âgées de plus de 65 ans, et d'autres facteurs de risque sont l'obésité, l'hypertension artérielle et l'athérosclérose, tel que discuté précédemment 12. Pour mieux représenter ces facteurs de risque, il est recommandé d'utiliser un modèle qui peut partager certaines des caractéristiques physiopathologiques de l'état naturel. Dans ce protocole, nous avons inclus un âge avancé et le flux sanguin obstrué à travers les artères carotides.
Le modèle classique de l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne (MCAO) est le modèle de filament intraluminale proximale occlusion MCA, ce qui réduit le flux sanguin dans la partie antérieure et les artères cérébrales moyennes. temps d'occlusion courts en utilisant ce modèle se concentre la lEsion à la région sous-corticale, tandis que de plus longs temps d'occlusion peuvent entraîner d'importantes lésions recrutement zones des deux aires corticales et sous-corticales, ce qui entraîne un taux de mortalité plus élevé chez les rats âgés. A titre de comparaison, le modèle utilisé par notre groupe consiste à effectuer une craniotomie et l'ouverture de la dure-mère, suivi par la coagulation du sang et la destruction d'une petite portion de la MCA en utilisant une pince de cautérisation bipolaire. Ce modèle de diathermie est adapté du papier 1981 par Tamura et al. 23 et l'utilisation de la craniectomie peut limiter augmentation de la pression intracrânienne, qui est une caractéristique du crâne fermé, et les résultats de reproductibilité élevé et un taux de mortalité plus faible dans notre cohorte de chirurgie par rapport à d'autres modèles 13. Pour générer infarctus reproductibles et l'invalidité soutenue nous boucher définitivement le proximale CCA et l'occlusion transitoire le CCA distale selon Chen et al. 14 Nous utilisons l'imagerie par résonance magnétique pondérée en T2 non-invasive (IRM) Pour évaluer l'étendue et la localisation de l'infarctus cérébral, et le degré de gonflement du cerveau dans le cortex sensori-moteur.
Protocol
Ce protocole a été approuvé par les directives institutionnelles établies par King College de Londres, et a été réalisée en conformité avec les lignes directrices et les animaux (Scientific Procedures) UK Home Office Act de 1986. Les lignes directrices peut varier entre les institutions; s'il vous plaît assurer le respect des directives institutionnelles avant de tenter cette procédure. Afin de maintenir une technique aseptique en touchant l'équipement, l'autoclave un grand morceau de papier d'aluminium et l'utiliser pour enrouler autour de l'équipement gère comme sur le microscope et l'anesthésie machine. une pellicule de plastique stérile (une pellicule de plastique) peut également être utilisé.
1. Préparation
- Familiarisez-rats avec des packs de liquide de gel (gel de récupération vétérinaire) et chow doux pendant au moins 48 heures avant la chirurgie de la course. Comme les animaux ont souvent de la difficulté à manger et à boire après la procédure, présenter les animaux à ces éléments avant la chirurgie, afin de minimiser la néophobie. Maison rats âgés atteints de blo à mâcher en boisCKS à réduire l'incidence de dents envahi (Voir la section 6).
- Stériliser tous les instruments chirurgicaux avant de commencer les procédures chirurgicales à l'autoclave (minimum 121 ° C, 15 PSI, pendant 15 min). Désinfecter les surfaces de travail à l'aide de 1% de chlorhexidine à 70% d'éthanol et en utilisant les draps chirurgicaux et de maintenir une technique aseptique pendant la durée de la procédure.
- Induire des lésions sur l'hémisphère controlatéral à la patte préféré. Allouer des lésions à gauche ou à l'hémisphère droit en fonction de patte préféré de chaque rat, déterminé par les lignes de base pré-opératoires dans le test de l'escalier Montoya 15 (voir la figure 4). Par souci de simplicité, dans la description de cette procédure dans ce manuscrit, la patte gauche est la patte préféré, et les chirurgies sont effectuées sur l'hémisphère droit. Utilisez rats Hooded Lister ou Long Evans pour ces tests comportementaux comme ils apprennent vite.
Remarque: Le test de l'escalier a été conçu pour mesurer les changements dans la fois fine et globale m qualifiésovements suivantes dommages du système moteur. L'escalier se compose de sept étapes sur chaque côté d'une plate-forme centrale. Si l'équipement pour le test de l'escalier est indisponible, le test du cylindre est une alternative appropriée pour les essais impartialité, mais il faut noter qu'il ya seulement un déficit transitoire sur ce test dans ce modèle d'accident vasculaire cérébral, et ne sera donc pas convenir pour mesurer le rétablissement à long terme à la suite traitement.- Placez trois granules de sucre dans le puits de chaque étape (21 granules de chaque côté). Placez rats dans l'appareil de l'escalier pendant 10 minutes et noter le nombre de boulettes récupérées et le nombre de pastilles déplacées de chaque côté.
Remarque: Pour être incluses dans la tâche après l'opération, les rats doivent récupérer un minimum de 75% des pastilles à l'inclusion.
- Placez trois granules de sucre dans le puits de chaque étape (21 granules de chaque côté). Placez rats dans l'appareil de l'escalier pendant 10 minutes et noter le nombre de boulettes récupérées et le nombre de pastilles déplacées de chaque côté.
2. Surgery
- Utilisez rats âgés féminins Lister-capuche à 16-18 mois (250 à 400 g) et induire une anesthésie avec 5% d'isoflurane dans 1,5 L / min O 2. Après l'induction de l'anesthésie, de réduirele niveau de l'isoflurane et le maintenir à une profondeur suffisante, mais minimisée pour la chirurgie (par exemple, 1,5 à 2%). Livrer l'anesthésie à l'animal par un masque, et d'utiliser un système de balayage pour limiter l'exposition du chirurgien à l'isoflurane.
- Effectuer toutes les procédures jusqu'à, mais sans inclure craniotomie sur les animaux factices, que cette procédure peut produire des déficits comportementaux 16. Considérez objectifs expérimentaux lors de la conception des expériences MCAO, et décider si un groupe témoin pour contrôler les craniotomie doit ou non être inclus.
- Administrer soulagement de la douleur pré- ou péri fonctionnellement (Carprieve, 0,25 mg / kg, s. Coupé).
- Ajouter 1 ml à 19 ml stérile saline à 0,9% pour rendre la solution de stock et injecter 0,6 ml par 300 g rat. L'utilisation de Carprieve est préférable à carprofène parce que le premier est stable à température ambiante.
- Raser la fourrure sur la région du cou ventral et région temporale sur l'hémisphère droit d'exposer la peau. Désinfecter les sites chirurgicaux uchanter tampons d'éthanol. Assurez-vous de suivre les directives du IACUC locales pour l'épilation.
- Effectuez cette étape loin de la zone d'exploitation de minimiser la quantité de poils sur le site d'incision.
- Placez le rat sur un tableau de liège recouvert d'un drap stérile dans la position couchée sur un coussin chauffant. Appliquer la crème de lidocaïne dans les régions rasée de la tête et du cou. Insérer une sonde rectale pour surveiller et maintenir la température de l'animal entre 36,5 à 37,5 ° C avec un système homéotherme.
- Mettez pommade lacrilube sur les yeux pour éviter le dessèchement. Donner le rat par injection de la solution de sulfate d'atropine (0,05 ml d'une / ml, solution de 600 ug, par voie sous- cutanée) pour réduire les sécrétions de la trachée.
Remarque: Les chercheurs devraient envisager de mesurer les variables physiologiques tels que les gaz et la pression artérielle.
- Mettez pommade lacrilube sur les yeux pour éviter le dessèchement. Donner le rat par injection de la solution de sulfate d'atropine (0,05 ml d'une / ml, solution de 600 ug, par voie sous- cutanée) pour réduire les sécrétions de la trachée.
- Avant de commencer la chirurgie, de vérifier le retrait patte arrière de pincement et clignote réflexes pour confirmer anesthésie générale.
- En vertu d'un micro dissectionchamp d'application, faire un 2 cm médiane centrale incision dans le cou exposé à l'aide d'un scalpel. Déplacer les glandes salivaires doucement latérales de la trachée, des deux côtés.
- Boucle non absorbable suture en soie autour de la peau qui recouvre l'artère carotide commune sur un côté. tirez doucement la peau à partir du site en utilisant le fil de soie et collez-les vers le bas pour le tableau de liège avec du ruban adhésif chirurgical de révéler l'artère carotide commune. Soigneusement Blunt disséquer les artères libres de fascia et les nerfs vagues à l'aide de pinces fines environnante.
- Veillez à ne pas endommager le muscle ou nerf vague au cours de cette étape, car cela pourrait nuire l'alimentation, de la déglutition et de la respiration.
- Une fois l'artère carotide commune est exposée, utiliser une suture de soie non absorbable (5/0) pour isoler la carotide, séparant d'abord la carotide du nerf vague en disséquant inverse avec une pince fine et en faisant attention à ne pas entrer en contact avec le nerf. Une fois que le navire a été bouclé (mais pas lié) avec la suture, tsinger les extrémités de la suture ensemble en utilisant une bande chirurgicale pour éviter cette étape étant annulée. Retirer les sutures qui freinent la peau sus-jacente.
- Répétez l'opération pour l'autre côté (Sections 2.7-2.8)
- Placer une gaze imbibée de sérum physiologique stérile dans la plaie pour maintenir humides les tissus pendant le reste de l'opération. Librement suturer la peau et placer une gaze imbibée de solution saline supplémentaire sur la zone pour éviter une déshydratation.
- Placez rats dans une position latérale et faire une incision dans la peau au point médian entre l'orbite droite et du conduit auditif externe. Rétracter la peau en utilisant jusqu'à cinq élastiques rétracteurs de crochet 3 mm épinglés au tableau de liège puis Blunt disséquer le muscle temporal pour révéler le crâne.
- Placez le pouce roues ajusté par gravité saline goutte à goutte au-dessus du site ouvert (débit d'environ 2 ml / min) et mettre en place un système d'aspiration pour enlever les débris d'os et pour effacer un saignement mineur du site exposé tout au long de cette phase de l'opération ( Secteions 2.13-2.16).
- Placez la buse de distribution de solution saline au point du crâne près de l'oreille la plus élevée, et la buse d'aspiration au point le plus bas. Ajuster la roue lors de saignements de fournir plus salée dans la région afin de mieux visualiser la source de toute purge pour la cautérisation de la cuve, ce qui réduit la quantité de temps les animaux sont sous anesthésie.
Figure 1. ensemble chirurgical d'distale milieu modèle permanent d'occlusion de l'artère cérébrale. L'équipement utilisé dans la mise en place pour la craniotomie de rat est représenté pour l'hémisphère droit, et encart, le positionnement de l'aspirateur et une solution saline goutte à goutte sur le site de craniectomie. On trouvera également les principales caractéristiques du système vasculaire; l'artère cérébrale moyenne (rouge) et la veine cérébrale inférieure (bleu) sont présentées, et la zone ombrée indique l'endroit où la coagulation de l'artère se produit.Confirmation de l'occlusion est réalisée en coupant le MCA-dessous de la veine cérébrale inférieure. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Effectuer une craniotomie sur la région exposée (environ 5 mm x 5 mm) à l'aide d'une fraise de dentiste avec un gros 1,6 mm revêtu de forage au diamant bavure à environ 8000 tours par minute, d'assurer l'application de la circulaire et de pression latérale et la pression ne baisse tandis que le forage de la zone exposée . Une fois que l'os est assez mince qu'il semble complètement transparent, retirez l'aide de pinces.
- Utilisez un crochet dural maison, faite par pliage une pointe de pinces fines d'environ 180 ° pour former un arc, à ouvrir avec précaution la dure-mère, être prudent pour éviter les gros vaisseaux sanguins de surface, car ils sont fragiles et faciles à rompre.
Remarque: La zone exposée du cerveau va révéler l'artère cérébrale moyenne (MCA); le segment désirémesure environ 2 mm de longueur (voir la figure 1, en médaillon). - Coaguler le MCA, d'où la veine cérébrale inférieure traverse, au point de bifurcation de l'artère, puis le long des branches caudales de la MCA en utilisant une paire de pinces de diathermie jusqu'à complète occlus 17. Utilisez inclinés pince bijoutier de diathermie à bouts pointus 0,25 mm.
- Lorsque l'occlusion de l'artère, modifier le débit si nécessaire la solution saline de garder cette endroit frais, ce qui empêche la pince de coagulation d'adhérer au vaisseau sanguin. Lorsque occlus, le vaisseau sanguin apparaît en noir et aucun signe de la circulation sanguine doit être présent; le flux sanguin peut être vu dans les vaisseaux partiellement occlus.
- Couper le MCA à ce point pour confirmer une occlusion complète. Avec des ciseaux, coupez microvasculaires sous où la veine cérébrale inférieure traverse le MCA.
- Couvrir la zone exposée avec une gaze pad saline imbibés avant de passer à l'étape suivante.
- Tournez le rat revenir à une posi couchéetion et de rouvrir la suture ou moins reliée sur le cou de ré-exposer les artères carotides. Ligaturer l'artère carotide sur le même côté que le MCA occlus (à droite) en permanence par un nœud dans le fil de suture en soie autour de la carotide, tandis que l'artère carotide gauche est obturée de manière transitoire en utilisant une pince à artère en acier inoxydable de 13 mm à 125 pression g pendant 60 min. Librement suturer l'incision dans le cou pendant ce temps et placer une solution saline imbibé une gaze stérile sur le dessus pour éviter la déshydratation.
- Notez que côté droit de l'animal sera sur main gauche du côté du chirurgien, compte tenu de la position couchée.
- Pour les animaux sham, ouvrir la partie ventrale du cou et les régions temporales et séparer les muscles pour localiser les artères carotides communes, mais ne pas obstruer. Ont animaux sham subir des procédures jusqu'à, mais sans inclure craniotomie, que cette procédure peut produire des déficits comportementaux 16. Pour maintenir l'insu des autres tmembres EAM (par exemple, au cours des essais de comportement plus tard), effectuer des incisions et des sutures.
Figure 2. Tandem occlusion de la carotide suite à l'occlusion de l'artère cérébrale moyenne. Le droit artère carotide commune (CCA) est obturée de façon permanente en attachant un fil de soie (5/0) dans le vaisseau sanguin (sur le côté gauche de l'image). Le CCA gauche (sur le côté droit) est obstruée pendant 1 heure en utilisant une pince microvasculaire. Ces opérations ont été réalisées en prenant soin de ne pas entrer en contact avec le nerf vague de chaque côté (blanc). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
- Suturer l'incision dans la région temporelle au cours de l'heure d'une occlusion de la carotide gauche commune.
- Donnez rats 20 ml de solution saline sous-cutanée (5 ml à deux sites sur chaque flanc) pour maintenir l'hydratation (voir6,2).
- Lorsque 60 min a passé, retirer le clip. Appliquer une solution saline par voie topique pour les muscles entourant, et fermer l'incision dans le cou à l'aide couture continue sous-cutanée de sutures absorbables (4/0).
3. Soins post-opératoires
- Placer le rat dans un incubateur à 31 ° pour récupérer de l'anesthésie pendant jusqu'à 4 heures.
Remarque: Les chercheurs peuvent préférer utiliser d'autres températures et durées selon la pratique locale. - Répétez carprieve (0,25 mg / kg), pour soulager la douleur à 24 h. Parce que tous les animaux reçoivent la même dose de Carprieve, ce facteur est contrôlé pour systématiquement. Tout effet neuroprotecteur de Carprieve est susceptible d'être négligeable.
- Donner des injections de solution saline par jour pour prévenir la déshydratation pendant au moins les trois premiers jours. Dans l'hypothèse où un rat nécessite 65 ml de liquide par kg de poids corporel (chaque 24 heures), en sorte que chaque 300 g rat reçoit ~ 22 ml de liquides par jour.
4. Conconfirmation de l'infarctus
- Pour mesurer le volume de l'infarctus utiliser IRM structurelle.
Remarque: Une autre méthode pourrait consister à utiliser une coloration histologique, tels que le chlorure de tétrazolium (TTC), qui a été précédemment corrélées aux données IRM de structure 18. Toutefois, cela ne peut être utilisé au moment de l'étude d'extrémité, et non longitudinalement.- Vingt-quatre heures après l'induction de MCAO, anesthésier les rats avec l'isoflurane (5% pour l'induction, 1-1,5% pour la maintenance) dans 0,9 L / min médicaux Climatisation et 1 L / min O 2, en sécurité dans une bobine de résonance magnétique en quadrature de cage à oiseaux (43 mm de diamètre) et placer dans un 7 Tesla scanner de forage horizontal.
- Obtenir T2 scans pondérés à l'aide d'une rapide rotation séquence d'écho: echo temps (TE) 60 ms, temps de répétition (TR) de 4000 ms, champ de vision (FOV) 40 x 40 mm, l'acquisition matrice de 128 x 128, l'acquisition de 40 x 0,5 mm épaisses tranches dans environ 8 min. Par la suite, convertir 40 tranches en 20 x 1 mm tranches épaisses en utilisant le RESAMPLfonction ING en logiciels d'imagerie médicale.
- Obtenir des volumes de lésion dans un emballage de présentation d'images médicales en mesurant l'aire en coupe transversale de l'infarctus dans 20 volumes. Obtenir le volume total en multipliant la somme de ces zones par l'épaisseur (1 mm). Calculer le groupe volume et écart-type moyenne. Pour pourcentage calcul du volume de la lésion, d'acquérir également les volumes des hémisphères ipsilésionnelle et contralésionnel.
- Pour corriger l'enflure du cerveau due à un œdème, ajuster ces valeurs en utilisant les formules de Gerriets 18. Inclure uniquement tranches qui contiennent cortex et ne contiennent pas le cervelet ou bulbes olfactifs selon un atlas de rat standard 19 pour éviter la sur-correction, car cela peut générer des volumes de lésion négatifs.
- Acquérir T2 images pondérées à nouveau 8 semaines après la chirurgie de la course.
5. calcul de la taille de l'échantillon pour les études futures Évaluation neuroprotection and Behavioral Recovery </ P>
- Effectuer des calculs de taille de l'échantillon pour estimer la taille minimale de l'échantillon qui serait nécessaire dans les futures expériences neuroprotecteurs hypothétiques en utilisant deux groupes (contrôle vs traitement.) Pour identifier les effets du traitement de trois grandeurs différentes (réduction de 25%, réduction de 50%, réduction de 75%) à l'aide a priori algorithmes mis en œuvre dans un logiciel d'analyse de puissance 20.
Remarque: Pour permettre aux lecteurs de faire des calculs similaires avec leurs propres données, il y a des captures d'écran librement accessible le logiciel d'analyse de puissance (voir résultats représentatifs). Utilisez les paramètres suivants: taux de faux positifs acceptable (c.-à-seuil d'erreur de type I; α) ≤0.05, et le pouvoir (ce qui équivaut à 1-β) ≥0.80 (ie, plus de 80% de la puissance). Voir ci-dessous pour obtenir des explications et une discussion 21.
6. Après la chirurgie de l'AVC âgées Animal Welfare
- Mettre à la disposition supplémentaire douce chow une gel de réhydratation emballe que les rats ont été habitués à avant la chirurgie, en plus de bouteilles d'eau avec des conseils étendus pour faciliter portée. En outre, avoir un pad de récupération absorbable dans les cages à la place de la literie lâche (ie, éviter les copeaux de bois) pour les 24 premières heures, et de fournir la literie imbrication supplémentaire. Ne pas utiliser la nourriture en purée (par exemple, les aliments pour bébés) que les rats atteints de dysphagie peuvent étouffer.
- Peser les animaux par jour pendant 7 jours pour surveiller la récupération. La perte de poids est une première indication de la déshydratation et de stress. La perte de poids dans les premiers jours après la chirurgie reflète principalement la déshydratation (plutôt que la perte de poids corporel en raison de réduction de l'alimentation).
- Lorsqu'un rat vieillissement montre une perte sans rapport avec la chirurgie de poids, de remplacer la perte de poids corporel avec un poids équivalent de fluides et d'inspecter les dents supérieures et inférieures. Où les dents sont envahies, anesthésier le rat avec de l'isoflurane (comme dans la section 2.1), et le placer dans une position couchée
- Placez une seringue de 1 ml baril derrière le teeth pour protéger les tissus mous. Couper avec une scie circulaire à main (par exemple, cm de diamètre environ 3) à une vitesse de rotation élevée, mais avec des mouvements de main ferme lents (par exemple, 3 coupes sec). Autoriser les dents du rat se refroidir entre les coupes. Faire en sorte que la scie circulaire est montée sur le mandrin de telle sorte que les dents de la scie font face dans la direction de rotation. Il est utile de garder emballés individuellement, stérilisés scies rotatives prêt pour de telles éventualités.
Remarque: Prolifération peut se produire chez les rats âgés, même lorsqu'ils sont maintenus à un régime dur de culot. Nous recommandons que les dents sont vérifiés chez les rats âgés régulièrement.
- Placez une seringue de 1 ml baril derrière le teeth pour protéger les tissus mous. Couper avec une scie circulaire à main (par exemple, cm de diamètre environ 3) à une vitesse de rotation élevée, mais avec des mouvements de main ferme lents (par exemple, 3 coupes sec). Autoriser les dents du rat se refroidir entre les coupes. Faire en sorte que la scie circulaire est montée sur le mandrin de telle sorte que les dents de la scie font face dans la direction de rotation. Il est utile de garder emballés individuellement, stérilisés scies rotatives prêt pour de telles éventualités.
- Lorsqu'un rat personnes âgées montre la perte de poids et l'horripilation sans rapport avec la chirurgie, de discuter des options de traitement avec un vétérinaire. Considérez humainement tuer l'animal. IRM de ces animaux peut montrer une tumeur de l'hypophyse (souvent chez les rats femelles âgées) qui est inutilisable et fatale.
Representative Results
MCAO permanente a été induite par craniotomie exécution, suivi de la coagulation et de la destruction de l'artère cérébrale moyenne par diathermie combinée à une occlusion permanente de l'ipsilésionnelle artère carotide commune et 60 min occlusion de l'contralésionnel artère carotide commune. Un schéma de l'installation de l'équipement et occlusion MCA est représenté sur la Figure 1, et des artères carotides de la figure 2 (ci-dessus).
résultat de la course a été évaluée 24 heures et 8 semaines après un AVC en mesurant le volume de l'infarctus de 40 x 0,5 mm tranches (de l'extrémité rostrale du bulbe olfactif à la fin rostrale de la moelle épinière) à l'aide de la région de boîte à outils d'intérêt dans un boîtier d'affichage d'images médicales. Une IRM structurelle représentant T2 pondérée est indiqué pour le même animal à 24 h et 8 semaines (figure 3A). Le volume de l'infarctus a été identifié par les zones du cerveau de rat montrant un signal hyperintense; que le poids de T2images ed montrent l'eau ou du plasma comme une zone blanche et brillante. On sait qu'il ya une augmentation des oedèmes et de l'enflure du cerveau après un AVC, et cela peut être mesurée à partir d'une analyse pondérée en T2 qui a été corrélée à des mesures histologiques de volume de l'infarctus 18. Cependant, oedème présente tôt après un AVC (par exemple, à 24 h) peut conduire à une surestimation du volume de la lésion final (par exemple, à 8 semaines) et, par conséquent, nous avons également présents volumes infarctus moyenne ajustée en utilisant les formules de Gerriet. La figure 3B montre les données moyennes de la première (non ajustés) volume de la lésion à 24 h en 62,8 mm 3 (± 25,4 mm 3 SD, graphique du haut); cette occupe 9,8% de l'hémisphère affecté (± 4,2% SD, graphique du milieu). Après correction pour tenir un gonflement du cerveau en utilisant les formules de Gerriets Cette valeur est réduite à 4,5% (± 2,0% SD, graphique inférieur).
La gravité de l'AVC a également été mesurée en utilisant le test de l'escalier Montoya 15. En bref, unNIMAUX ont été pré-formés pour récupérer des pastilles de sucre pour 4 semaines avant MCAO la chirurgie de la course, et testés pendant 8 semaines après un AVC (Figure 4) pour confirmer un déficit durable. Les rats ont été placés dans l'appareil d'escalier pendant 10 minutes et le nombre de pastilles récupérées ont été enregistrés (sur 21 pastilles) et affichées sous forme de pourcentage (groupe signifie ± erreur-type). Une analyse de régression a été réalisée pour être compatibles avec la ligne de données.
La figure 5 illustre le calcul de la taille de l'échantillon à l'aide de données de volume de l'infarctus (pour les effets potentiels des traitements candidats), analysée à l'aide d'un algorithme dans un logiciel d'analyse de puissance pour un t-test en utilisant "la différence entre les deux moyens indépendants (deux groupes)" et en utilisant le (non corrigé ) les moyens et les écarts-types de la figure 3B. Les informations sur la figure 5 et le tableau 1 montrent que 12 rats serait nécessaire par groupe pour détecter une thérapie qui réduit infvolume de CRAT de 50% à 24 h, tandis que la figure 6 montre un «complot XY" de la puissance obtenue en utilisant un nombre variable d'animaux. Le tableau 1 résume exemples de calcul de taille pour tous les points de temps.
Figure 3. IRM pondérée en T2 structurel est utilisé pour mesurer la taille de l'infarctus et l'enflure du cerveau après un AVC. (A) Une image par résonance magnétique pondérée en T2 du même cerveau de rat 24 h et 8 semaines après l'induction de l'accident vasculaire cérébral. La zone blanche représente la lésion, mais contient également un certain oedème vasogène qui résout de 8 semaines. Volumes (B) d'infarctus ont été mesurées en utilisant une image médicale emballage formant présentoir Region of Interest Toolkit, et sont reportés sur un graphique représentant la moyenne ± écart-type pour les points temporels utilisés 3 (n = 6). volume de la lésion Raw (non corrigée de l'enflure du cerveau due à edEMA), le pourcentage de lésion hémisphère affecté (non corrigé pour le gonflement), et le pourcentage de lésion hémisphère corrigée pour un gonflement du cerveau en utilisant les formules de Gerriets sont présentés ici. SD a été utilisé plutôt que SEM afin d'effectuer des calculs de taille de l'échantillon (voir figure 5). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Le test de l'escalier présente une déficience en saisir et récupérer des granulés. Dans ce modèle de course il y avait très peu de récupération spontanée. Accident vasculaire cérébral chez les rats âgés entrave persistante dextérité, montré par des essais la semaine en utilisant le "test de l'escalier" de culot atteindre. Encadré: Une image d'un rat d'effectuer le test comportemental. Le graphique montre la moyenne (± supportard erreur) le nombre de boulettes récupérées (sur 21, exprimée en pourcentage) par semaine par la patte affectée. n = 5. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. calcul de la taille de l'échantillon pour déterminer le nombre de groupes de rats nécessaires pour détecter un effet thérapeutique souhaité. Cette capture d'écran, prise à partir du logiciel d'analyse de puissance, montre que 12 rats par groupe seraient nécessaires pour détecter une thérapie qui réduit le volume de l'infarctus de 50% à 24 h. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. Puissance obtenue en utilisant divers nombre total d'animaux. Un «complot XY pour une plage de valeurs" de logiciel d'analyse de puissance montre la puissance que l'on obtiendrait pour des expériences à l'aide de (total) différents nombres de rats âgés, compte tenu des paramètres montre la figure 5. Le tableau 1 résume l'ensemble de nos résultats. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Temps après un AVC: | Nombre de rats par groupe nécessaire pour détecter une réduction du volume de la lésion de: | ||
| 75% | 50% | 25% | |
| 24 h | 6 | 12 | 42 |
| 8 semaines | 4 | 5 | 17 |
Tableau 1. Les calculs de la taille des échantillons par groupe pour des expériences futures hypothétiques. Calculé en utilisant un logiciel d'analyse de puissance (voir figures 5 et 6). Le tableau indique le nombre de rats par groupe requis pour une expérience de deux groupes afin de détecter une réduction de 25% 50% et 75% en volume de la lésion à chacun des points dans le temps dans cette étude.
Discussion
MCAO chez les rongeurs est une technique souvent utilisée pour modéliser la course humaine. Ce modèle ne possède quelques détails à noter dans le protocole. Premièrement, il est essentiel de maintenir la température du corps de l'animal pendant toute l'expérience car il influe sur la taille de l'infarctus et le nombre des animaux morts dans une étude. Il peut être possible de mettre fin à l'isoflurane pendant l'occlusion temporaire du droit CCA et de garder les rats dans un environnement calme réchauffé à augmenter les taux de survie en réduisant l'exposition à l'isoflurane. Les chercheurs devraient examiner si une période plus courte anesthésie emporte sur le stress de l'induction supplémentaire. Le système vasculaire (par exemple, MCA ramification) des rats varie à l'intérieur et entre les cohortes d'animaux 22. Il est important de garder cela à l'esprit lorsque l'on commence une nouvelle étude. Différents moments d'occlusion CCA peuvent être évaluées (par exemple, 30, 45, 60 et 90 min). Dans cette étude, un temps d'occlusion de 60 min est utilisé. Dans d'autres études, nous avons constaté que 45occlusions min provoquent un infarctus cortical de taille similaire mais avec des preuves anecdotiques de l'amélioration des taux de survie. En conséquence, ont les chirurgiens commencent par un court temps d'occlusion (par exemple, 30 min) pour voir si le volume des lésions adéquates (et / ou des déficits comportementaux nécessaires) sont obtenues et ensuite seulement à augmenter les temps d'occlusion si nécessaire. déficits comportementaux ne sont pas maintenus chez les rats adultes par rapport à des rats âgés avec des temps d'occlusion identiques.
IRM peut être utilisée pour juger si (après un temps d'occlusion notamment) volume des lésions sont appropriés pour les objectifs de l'étude. Une petite lésion serait couvrir moins de dix 0,5 mm coupes coronales (sur 40). Une lésion de taille moyenne serait étendre entre dix et vingt coupes coronales. Une grande lésion serait étendre entre vingt et trente coupes coronales. Une très grande lésion serait couvrir plus de trente des quarante tranches. Dans notre expérience, les rats avec de très grandes lésions (plus de trente tranches) et / ou la preuve d'Acros de hernies la ligne médiane ont généralement mauvais pronostic: la réduction des temps d'occlusion pourraient être envisagées. IRM est également utile pour l'évaluation de la localisation de l'infarctus: certains sont plus caudale situé et certains sont plus rostrale situé.
Prendre des précautions supplémentaires lors de la séparation du nerf vague des deux artères carotides communes. Râles (rauque) peut se produire après la chirurgie de la course, ce qui pourrait être dû à des lésions nerveuses chez certains animaux, bien que la cause est actuellement dans le flou: d'après notre expérience, le pronostic est très mauvais pour ces animaux et il est généralement recommandé d'humanité les tuer.
Les résultats permanents modèles diathermie MCAO en infarctus corticaux reproductibles et les taux de survie post-opératoires acceptables chez les rats âgés. La technique ne nécessite cependant la chirurgie invasive sous un stéréomicroscope. Il est important de maintenir une technique aseptique si les animaux sont bien récupérer de la chirurgie. Il faut prendre soin de ne pas endommager la MCA et de coagulation tout en exposant l'artère,et des dommages à la surface corticale doit être minimisée sinon la surface exposée du cortex peut faire partie de la zone de l'infarctus. Il est recommandé d'obtenir autant d'expérience que possible d'établir la procédure et de parvenir à des infarctus cohérentes et déterminer les temps d'occlusion avant une étude est effectuée pour tester des thérapies candidats, par exemple. Expérimentateurs doivent tirer au hasard des traitements au sein de sessions de chirurgie ( "randomisation de bloc") lorsque cela est possible. Il est à noter que ce modèle ne comporte pas MCA reperfusion (sauf transitoire ligature MCA est utilisé au lieu de diathermie). La mortalité peut être élevé chez les rats âgés atteints de ces grands infarctus corticaux mais il devrait être possible de réduire la mortalité en utilisant la réduction des temps d'occlusion et en réduisant au minimum l'exposition à l'anesthésie générale si possible (par exemple, lors de l'occlusion). L'utilisation de 70% de N 2 O et 30% de O 2 en tant que support peut permettre à des niveaux inférieurs de l'isoflurane à utiliser: cette exposition réduite aux isoflurane peut entraîner des taux de survie plus élevés.
Un autre point à considérer est que l'athérosclérose est un processus graduel, alors que dans ce protocole, nous simulons avec occlusion aiguë CCA. Cependant, la réduction substantielle de la circulation sanguine et les déficits soutenus simuler occlusions en tandem survenant dans de nombreux patients atteints d'un accident vasculaire cérébral. Permanent distale MCAO sans tandem CCA occlusion chez les rats ne parvient pas à induire des coups reproductible 14: d'ailleurs, sans tandem CCA occlusion, nous avons trouvé une guérison spontanée considérable se produit qui empêche l'évaluation du comportement à long terme des thérapies de course de plus de 8 semaines. En revanche, nous montrons que distale MCAO en tandem CCA occlusion induit des déficits à long terme chez les rats âgés.
En conclusion, cette procédure chez le rat provoque coups qui sont semblables en taille et l'emplacement à ceux observés dans la condition humaine, avec une incapacité soutenue que l'on peut utiliser pour permettre les essais de nouveaux traitements et l'élucidation de remécanismes de paires après un AVC ischémique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen | Norbrook | Vm No; 02000/4229 | give 0.25 mg/kg |
| Atropine Sulfate | AmTech | RXATRINJ-100 | |
| Alcohol swabs | UHS | 20021 | |
| Lidocaine cream (Emla) | AstraZeneca | 0012901 | Apply a pea sized drop to the shaved neck and temporal regions |
| Homeothermic Blanket System | Harvard Instruments | 507222F | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
| Isoflurane | Abbott | B506 | |
| Silk sutures | Harvard Apparatus | 723288 | |
| Cautery system | Eschmann | ||
| 0.25 mm Jeweler cautery forceps | Eschmann | 8330349 | |
| fine Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Thumb driven saline drip system | |||
| Vacusafe aspirator system | INTEGRA BIOSCIENCES | 158320 | |
| 1.6 mm coarse diamond coated Steel burrs | K801 104 016 | ||
| Handheld dental drill | NSK | NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B) | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microvascular scissors | World Precision Instruments | 501790 | |
| 4-0 Vicryl sutures | Ethicon | ||
| Vascular clip and applicator | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas | VetTech Solutions | ||
| Carbon Steel Scalpel blades No. 10 | Swann-Morton | 201 | |
| 25 g needles | Terumo | NN-2525R | |
| syringes (1 ml and 5 ml) | Terumo | SS+01T1 / SS*05SE1 | |
| Saline (Sodium Chloride 0.9%) | Fresenius Kabi | Pl 08828/0178 | |
| cotton buds | Johnson and Johnson | 5000207582502 | sterilize before use |
| gauze | sterilize before use | ||
| Medical Imaging Package (Jim) | Xinapse | Free software | |
| Statistical Parametric Mapping Software (SPM8) | UCL | Free software | |
| Power Analysis Software (G*Power) | Universität Düsseldorf | Free software |
References
- Pendlebury, S. T., et al. Underfunding of stroke research: a Europe-wide problem. Stroke. 35, 2368-2371 (2004).
- Doyle, S., Bennett, S., Fasoli, S. E., McKenna, K. T. Interventions for sensory impairment in the upper limb after stroke. Cochrane Database Syst Rev. 6, CD006331 (2010).
- Reep, R. L., et al. A rodent model for investigating the neurobiology of contralateral neglect. Cogn Behav Neurol. 17, 191-194 (2004).
- Carey, L. M., et al. Relationship between touch impairment and brain activation after lesions of subcortical and cortical somatosensory regions. Neurorehabil Neural Repair. 25, 443-457 (2011).
- Mohr, J. P., Lazar, R. M., Marshall, R. S., et al. Ch. 24. Stroke: Pathophysiology, Diagnosis and Management. Mohr, J. P., et al. , Elsevier. 384-424 (2011).
- Sacco, R. L., et al. Subarachnoid and intracerebral hemorrhage: Natural history, prognosis, and precursive factors in the Framingham Study. Neurology. 34, 847-847 (1984).
- Hossmann, K. A., Heiss, W. D. Ch. 1. Textbook of Stroke Medicine. Brainin, M., Heiss, W. D. , Cambridge University Press. 1-27 (2009).
- The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. Tissue Plasminogen Activator for Acute Ischemic Stroke. N Engl J Med. 333, 1581-1587 (1995).
- Brott, T., et al. Measurements of Acute Cerebral Infarction: Lesion Size by Computed Tomography. Stroke. 20, 871-875 (1989).
- Lövblad, K. O., et al. Ischemic Lesion Volumes in Acute Stroke by Diffusion-Weighted Magnetic Resonance Imaging Correlate with Clinical Outcome. Ann Neurol. 42, 164-170 (1997).
- Norrving, B. Ch. 2. Textbook of Stroke Medicine. Brainin, M., Heiss, W. D. , Cambridge University Press. 28-39 (2009).
- Truelsen, T., et al. Stroke incidence and prevalence in Europe: a review of available data. Eur J Neurol. 13, 581-598 (2006).
- Ord, E. N., et al. Positive impact of pre-stroke surgery on survival following transient focal ischemia in hypertensive rats. J Neurosci Methods. 211, 305-308 (2012).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17, 738-743 (1986).
- Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The 'staircase test': a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. J Neurosci Methods. 36, 219-228 (1991).
- Adams, F. S., Schwarting, R. K., Huston, J. P. Behavioral and neurochemical asymmetries following unilateral trephination of the rat skull: is this control operation always appropriate? Physiol Behav. 55, 947-952 (1994).
- Macrae, I. M. Ch. 5. Rodent Models of Stroke, Neuromethods. U, D. irnagl 47, Humana Press, Springer. 41-53 (2010).
- Gerriets, T., et al. Noninvasive Quantification of Brain Edema and the Space-Occupying Effect in Rat Stroke Models Using Magnetic Resonance Imaging. Stroke. 35, 566-571 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. R., Emson, P. C. AChE-stained horizontal sections of the rat brain in stereotaxic coordinates. J Neurosci Methods. 3, 129-149 (1980).
- Faul, F., Erdfelder, E., Buchner, A., Lang, A. G. Statistical power analyses using G*Power 3.1: tests for correlation and regression analyses. Behav Res Methods. 41, 1149-1160 (2009).
- Button, K. S., et al. Power failure: why small sample size undermines the reliability of neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 14, 365-376 (2013).
- Fox, G., Gallacher, D., Shevde, S., Loftus, J., Swayne, G. Anatomic variation of the middle cerebral artery in the Sprague-Dawley rat. Stroke. 24, 2087-2093 (1993).
- Tamura, A., Graham, D. I., McColloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).
