Summary
Здесь мы приводим протокол для получения постоянного дистального окклюзии средней мозговой артерии у пожилых самок крыс с одновременным окклюзии сонных артерий генерировать большие корковых инфарктов и устойчивые дефициты. Покажем подтверждение размера повреждения, используя структурную МРТ через 24 часа и 8 недель после инсульта.
Abstract
Инсульт, как правило, происходит у пожилых людей с целым рядом сопутствующих заболеваний, включая сонной (или другого артериального) атеросклероз, высокое кровяное давление, ожирение и диабет. Соответственно, при оценке терапии инсульта у животных, важно, чтобы выбрать модель с превосходной номинальной действия. Ишемический инсульт приходится 80% всех случаев инсульта, а большинство из них происходят на территории средней мозговой артерии (СМА), часто вызывая инфаркты, которые влияют на сенсомоторной коре, вызывая стойкое плегией или парез на противоположной стороне тела. Покажем в этом видео способ получения ишемический инсульт у пожилых крыс, который вызывает устойчивый сенсомоторную инвалидности и существенные корковых инфарктов. В частности, мы побудить постоянный дальний окклюзии средней мозговой артерии (МСАО) у пожилых самок крыс с помощью диатермии щипцы для закупоривания короткий отрезок этой артерии. Сонную артерию на той же стороне к поражения было то рermanently окклюзии и контралатеральной сонной артерии, временно окклюзии в течение 60 мин. Мы измеряем размер инфаркта с помощью структурной T2-взвешенных магнитно-резонансной томографии (МРТ) через 24 часа и 8 недель после инсульта. В этом исследовании, средняя инфаркта объем был 4,5% ± 2,0% (стандартное отклонение) ипсилатерального полушария через 24 часа (с поправкой на набухание мозга с использованием уравнения Gerriet, в п = 5). Эта модель является реальным и клинически значимыми, поскольку позволяет индукцию устойчивых дефицитов сенсомоторных, что очень важно для выяснения патофизиологических механизмов и новых методов лечения.
Introduction
Инсульт в настоящее время является третьей наиболее распространенной причиной смерти во всем мире и ведущей причиной инвалидности 1. Ишемический инсульт, который включает 80% всех инсультов, часто приводит к инфарктов в коре, вызывающего потерю ощущения (например, Проприоцепция), в моторной функции и во внимании к пораженной стороне 2-4. Средней мозговой артерии (СМА) является самым крупным из сосудов, что привлекает снабжение из круга Уиллис и проистекает из внутренней сонной артерии 5. MCA является церебральный судно чаще всего пострадавших при ишемическом инсульте, штрихами на этой территории составляет 65% от всех ишемических инсультов 6,7. MCA поставляет как корковых и подкорковых областей и неврологические отклонения, вызванные инсультом MCA в зависимости от точного местоположения окклюзии 7. Проксимальный MCA окклюзии влияют на глубокую территорию через lenticulostriatal артерий и вызвать большие инфаркты охватывающее как Кортикал и подкорковых областях. В противоположность этому, более дистальных окклюзии, лишающие исключительно областях коры кровотока, как правило, производят меньшие корковых инфарктов.
В крупных популяционных исследованиях, поражения инсульт человека варьируются от 5-14% ипсилатерального полушария 8,9; злокачественная инсульта составляет 10% инсультов и порождает больших инфарктов, требуя hemicraniectomy снизить внутричерепное давление, и пациенты с меньшими повреждениями, более вероятно, чтобы выжить 10. Покажем воспроизводимый модель, которая производит поражений, которые занимают аналогичную пропорцию полушарии как многих человеческих штрихами.
Инсульт является гетерогенным заболеванием; 75% ишемических инсультов индуцируются либо лакунарных инфарктов (от обструкции внутричерепных мелких сосудов); кардиоэмболического инсульта; или большой атеросклероз артерий, на долю которого приходится 30% инсультов. Симптомом атеросклероз чаще всего наблюдается в точке, где общий грarotid артерии (ССА) разветвляется на внутренних и внешних сонных артерий 11.
Доклинические модели инсульта должны быть максимально приближены к человеческому состоянии, насколько это возможно, чтобы имитировать его патофизиологии и должны включать в себя факторы риска инсульта. 92% ишемического инсульта возникает у людей в возрасте старше 65 лет, а также другие факторы риска включают ожирение, высокое кровяное давление и атеросклероз, как обсуждалось ранее 12. Чтобы лучше представить эти факторы риска, рекомендуется использовать модель, которая может поделиться некоторыми из патофизиологических особенностей естественного состояния. В этом протоколе, мы включили преклонного возраста и осложненные кровоток через сонные артерии.
Классическая модель окклюзии средней мозговой артерии (МСАО) является внутрипросветное модель нить проксимального окклюзии МСА, что снижает кровоток в передней и средней мозговых артерий. Короткое время окклюзии, использующие эту модель фокусирует лesion к подкорковых области, в то время как более длительные времена окклюзии может привести к крупным поражением вербовкой области обоих корковых и подкорковых областях, в результате чего более высокой смертности у пожилых крыс. Для сравнения, модель, используемая в нашей группе включает в себя проведение краниотомии и открытие твердой мозговой оболочки с последующим свертывания крови и разрушения небольшого участка MCA использованием биполярных прижигание щипцов. Эта модель диаметрия приспособлен от 1981 бумаге Тамура и др. 23 и использование удаление фрагментов костей черепа может ограничить повышенное внутричерепное давление, которое является особенностью закрытом черепе, и приводит к увеличению воспроизводимости и низкий уровень смертности в нашей хирургии когорте по сравнению с некоторыми другими моделями 13. Для создания воспроизводимых инфаркты и устойчивый инвалидности мы постоянно закрывают проксимальный ОАС и временно закрывают дистального CCA согласно Chen и др. 14 Мы используем неинвазивной T2-взвешенных магнитно-резонансной томографии (МРТ), Чтобы оценить размеры и местоположение церебрального инфаркта, и степень набухания мозга в сенсомоторной коре.
Protocol
Этот протокол был одобрен Институциональные руководящими принципами, изложенными Королевского колледжа в Лондоне, и был выполнен в соответствии с руководящими принципами Британского МВД и животных (научные процедуры) Акт 1986 Руководства могут быть различными учреждениями; пожалуйста обеспечить соблюдение институциональных принципов перед выполнением данного действия. Для поддержания асептики при прикосновении оборудование, автоклав большой кусок алюминиевой фольги и использовать это, чтобы обернуть вокруг оборудование обрабатывает такие как на микроскопа и анестезии машины. Также могут быть использованы стерильные скотч (полиэтиленовой пленкой).
1. Подготовка
- Ознакомиться крыс с пакетами геля жидкости (ветеринарная гелевых восстановления) и мягкой чау, по крайней мере 48 часов до инсульта хирургии. Как животные часто затрудняются с едой и питьем после процедуры, ввести животным этих пунктов до операции, чтобы свести к минимуму неофобией. Дом престарелых крыс с деревянными Бло жеватьCKS, чтобы снизить заболеваемость заросших зубов (смотри главу 6).
- Стерилизовать всех хирургических инструментов перед началом хирургических процедур автоклавированием (минимальный 121 ° C, 15 PSI, в течение 15 мин). Санируйте все рабочие поверхности с использованием 1% хлоргексидин в 70% -ном этаноле и использовать хирургические простыни и поддерживать асептики в течение всего срока процедуры.
- Вызвать поражений на полушарии контралатеральной предпочтительном лапы. Выделяют поражений на левую или правое полушарие в зависимости от предпочтительного лапы каждой крысы, заданного предоперационной базовых при испытании лестница Montoya 15 (смотри рисунок 4). Для простоты при описании этой процедуры в этой рукописи, левая лапа является предпочтительным лапы, и операции выполняются на правом полушарии. Используйте Листер капюшоном или Long Evans крыс для этих поведенческих тестов, как они учатся быстро.
Примечание: Тест лестница предназначена для измерения изменений в обоих тонкой и грубой квалифицированной мovements следующие повреждения системы двигателя. Лестница состоит из семи этапов на каждой стороне центральной платформы. Если оборудование для испытания лестниц недоступен, тест цилиндра является подходящей альтернативой для тестирования рукости, но обратите внимание, что есть только переходный дефицит на этом тесте в этой модели инсульта, и, следовательно, будет малопригоден для измерения долгосрочного восстановления после лечение.- Поместите три сахарных гранул в лунку каждого шага (21 гранулы с каждой стороны). Поместите крыс в лестничной аппарата в течение 10 мин и записывают число гранул, получаемых и количество гранул, перемещенных на каждой стороне.
Примечание: Чтобы быть включенным в задаче после операции, крыс необходимо извлечь минимум 75% гранул в начале исследования.
- Поместите три сахарных гранул в лунку каждого шага (21 гранулы с каждой стороны). Поместите крыс в лестничной аппарата в течение 10 мин и записывают число гранул, получаемых и количество гранул, перемещенных на каждой стороне.
2. Хирургическое
- Используйте женские пожилых крыс Lister-капюшоном 16-18 месяцев (от 250 до 400 г) и индуцировать анестезию с 5% изофлуран в 1,5 л / мин O 2. После вводного наркоза, сократитьуровень ИФ и поддерживать его на должном но свернутом глубины для хирургии (например, 1,5-2%). Доставка анестезию животному с помощью маски, а также использовать систему поглощать, чтобы ограничить воздействие хирурга к ИФ.
- Выполните все процедуры до, но не включая краниотомии на фиктивных животных, так как эта процедура может производить поведенческих дефицитов 16. Рассмотрим экспериментальные цели при проектировании экспериментов MCAO, и решить, следует ли обман группа для контроля краниотомии быть включены.
- Администрирование Обезболивание до или производить периодическую оперативно (Carprieve, 0,25 мг / кг, с. Вырезать).
- Добавить 1 мл до 19 мл стерильной 0,9% солевой раствор, чтобы маточного раствора и вводят 0,6 мл на 300 г крыс. Использование Carprieve предпочтительнее Carprofen потому бывший стабилен при комнатной температуре.
- Бритье мех на вентральной области шеи и височной области на правом полушарии подвергать кожу. Лечить хирургические сайты Uпеть тампоны этанола. Обязательно следуйте местных директив IACUC для удаления волос.
- Выполните этот шаг в сторону от рабочей зоны, чтобы свести к минимуму количество меха на месте разреза.
- Поместите крысу на пробковый покрытый стерильной драпировки в положении лежа на спине на грелку. Применить лидокаина крем с бритыми регионов головы и шеи. Вставьте ректального зонда для контроля и поддержания температуры животного между 36.5-37.5 ° C с теплокровного системы.
- Поместите lacrilube мазь на глазах, чтобы предотвратить высыхание. Дайте крысе инъекцию раствора сульфата атропина (0,05 мл 600 мкг / мл раствора, подкожно), чтобы уменьшить трахеи выделениями.
Примечание: Исследователи должны изучить возможность проведения измерений физиологических переменных, таких как газов крови и давление.
- Поместите lacrilube мазь на глазах, чтобы предотвратить высыхание. Дайте крысе инъекцию раствора сульфата атропина (0,05 мл 600 мкг / мл раствора, подкожно), чтобы уменьшить трахеи выделениями.
- Перед началом операции, проверить вывод заднюю лапу шнура и мигает рефлексы, чтобы подтвердить полную анестезию.
- При вскрытии микроСфера, сделать 2 см центральный срединный разрез на открытой шее, используя скальпель. Перемещение слюнные железы аккуратно боковые трахеи с обеих сторон.
- Петля неабсорбируемым шов шелковой нитью вокруг кожи, что перекрывает общую сонную артерию на одной стороне. Аккуратно отодвигать кожу в месте использования шелковой нити и придерживаться их до пробковый использованием хирургической лентой, чтобы выявить общую сонную артерию. Осторожно тупым рассекать артерии свободные от окружающих фасции и блуждающие нервы, используя тонкий пинцет.
- Будьте осторожны, чтобы не повредить мышцы или блуждающих нервов на этом этапе, так как это уменьшит подачу, глотания и дыхания.
- После того, как общая сонная артерия подвергается, использовать не поглощаемый шелковую нить (5/0), чтобы изолировать сонной, первый отделения сонной от блуждающего нерва с помощью обращенно рассечения с тонким пинцетом и осторожно, чтобы не вступать в контакт с нервом. После того, как судно было петлей (но не привязан) с шовного, тподражать концы шовного материала вместе с использованием хирургической лентой, чтобы предотвратить этот шаг быть сведены на нет. Удалить швы сдерживают покрывающей кожи.
- Повторите для другой стороны (разделы 2.7-2.8)
- Поместите стерильным физиологическим пропитанной марли в рану, чтобы сохранить ткани влажные течение оставшейся части операции. Свободно шов кожу и разместить дополнительную солевой пропитанной марли на площади, чтобы предотвратить дальнейшее обезвоживание.
- Поместите крыс в боковом положении и сделать надрез в коже в середине между правым орбиты и наружного слухового прохода. Отвести кожу, используя до пяти упругих крючков преднатяжителями 3 мм, закрепленных на пробковый, а затем притупить рассекают височной мышцы раскрыть череп.
- Поместите колесико с поправкой тяжести приводом солевой капельного над открытой площадке (расход около 2 мл / мин) и создать систему аспиратор для удаления костей мусора и очистить незначительное кровотечение из открытой площадке на протяжении всего этого этапа операции ( сектаИоны 2.13-2.16).
- Поместите насадку доставки солевой в наивысшей точке черепа возле уха, и аспиратор сопло в нижней точке. Регулировка колесо во кровотечений поставлять более соленой к области, чтобы лучше визуализировать источник любого продувании для прижиганием сосуда, уменьшая количество времени животные находятся под анестезией.
Рисунок 1. Хирургическое набор из постоянного дистальной средней мозговой артерии окклюзионной модели. Оборудование, используемое в наборе для трепанации черепа крыс показана для правого полушария, а вставка, позиционирование аспиратора и солевым капельно вокруг места удаление фрагментов костей черепа. Также показаны основные особенности сосудистой; средний мозговой артерии (красный) и уступает церебральный вены (синий) показаны, а заштрихованная область указывает, где происходит коагуляция артерии.Подтверждение окклюзии выполняется путем разрезания MCA ниже нижнего мозгового вены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
- Выполните трепанацию черепа на открытой области (около 5 мм х 5 мм) с использованием бормашины с грубой 1,6 мм с алмазным покрытием буровой заусенцев примерно 8000 оборотов в минуту, обеспечивая применение круговых и бокового давления и не понижательное давление при сверлении пораженный участок , После того, как кости достаточно тонким, что он выглядит совершенно прозрачным, удалить с помощью пинцета.
- Используйте самодельный твердой мозговой оболочки крючка, выполненный путем изгиба одной кончик тонким пинцетом примерно 180 °, чтобы сформировать дугу, чтобы тщательно открыть твердую мозговую оболочку, быть осторожным, чтобы избежать большой поверхности кровеносных сосудов, так как они являются тонкими и легко разрываются.
Примечание: на пораженном участке мозга покажет средней мозговой артерии (MCA); желаемый сегментМеры примерно 2 мм в длину (см рис 1, вставка). - Коагуляции MCA откуда уступает церебральный вены кресты, к точке бифуркации артерии, а затем вдоль хвостовых ветвей СМА не используя пару диатермии щипцов до полного закупоренной 17. Используйте угловые Ювелир диаметрия щипцов с 0,25 мм заостренными.
- При окклюзии артерии, изменяют солевой течь по мере необходимости, чтобы сохранить эту область круто, предотвращая коагулирующей щипцов от присоединения к кровеносного сосуда. При окклюзии, кровеносный сосуд выглядит черным и никаких признаков кровотока не должны присутствовать; Кровоток можно увидеть в частично Окклюдированный сосудов.
- Вырезать MCA в этой точке, чтобы подтвердить полную закупорку. Используя микрососудистых ножницы, разрезать под где нижний мозговой вены пересекает MCA.
- Накройте открытые участки с солевым пропитанной марлевым тампоном перед переходом к следующему шагу.
- Включите крысу обратно в лежачем положеции и снова открыть слабо связаны шов на шее повторно выставить сонных артерий. Перевязывать сонную артерию на той же стороне, что и закупоренной MCA (справа) постоянно, завязывая узел в шелковой нити вокруг сонной артерии, в то время как левой сонной артерии окклюзии временно используя зажим из нержавеющей стали артерии 13 мм с 125 г давления для 60 минимум Свободно шов до разрез на шее в течение этого времени и места стерильным физиологическим замачивают марлю сверху, чтобы предотвратить обезвоживание.
- Обратите внимание, что правая часть животного будет на левой стороне хирурга, учитывая положении на спине.
- Для фиктивных животных, открыть вентральной части шеи и височной областей и отделить мышцы, чтобы найти общие сонные артерии, но не закрывают. Были дутые животные подвергаются процедуры до, но не включая трепанацию черепа, так как эта процедура может производить поведенческих дефицитов 16. Для поддержания ослепление других тУчастники EAM (например, во время поздней поведенческим тестированием), выполнить разрезы и наложение швов.
Рисунок 2. Тандем сонной окклюзии после окклюзии средней мозговой артерии. Правая общая сонная артерия (ОСО) постоянно окклюзии путем привязывания шелковым швом (5/0) вокруг кровеносного сосуда (на левой стороне изображения). Оставили ОСО (на правой стороне) поглощается в течение 1 часа с использованием зажимного микрососудов. Эти операции проводились заботясь, чтобы не вступать в контакт с блуждающего нерва на каждой стороне (белый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
- Шовный разрез в височной области во время 1 ч левого общей сонной окклюзии.
- Дайте крыс 20 мл физиологического раствора подкожно (5 мл на двух участках на каждом фланге) для поддержания гидратации (см6.2).
- Когда 60 мин прошло, снять клип. Применить физиологический раствор местно на окружающую мышцы, и закрыть разрез в области шеи с использованием подкожной непрерывного сшивание рассасывающиеся швы (4/0).
3. послеоперационный уход
- Поместите крысу в C инкубаторе 31 °, чтобы оправиться от наркоза до 4 ч.
Примечание: Исследователи предпочитают использовать другие температуры и длительности в соответствии с местной практикой. - Повторите carprieve (0,25 мг / кг), для облегчения боли через 24 часа. Поскольку все животные получают одинаковую дозу Carprieve, этот фактор контролируется для систематического. Любой нейропротекторное действие Carprieve, вероятно, будет незначительным.
- Дайте инъекции физиологического раствора ежедневно, чтобы предотвратить обезвоживание, по крайней мере в первые три дня. В предположении, что крыса требует 65 мл жидкости на кг массы тела (каждый 24 ч), гарантировать, что каждый 300 г крыса получает ~ 22 мл жидкости в сутки.
4. Контверждением инфаркта
- Для измерения объем инфаркта использовать структурную МРТ.
Примечание: Альтернативный метод может быть использование гистологического окрашивания, такие как тетразолия хлорида (TTC), который был предварительно коррелирует со структурными данными МРТ 18. Тем не менее, это может быть использовано только в конечной точке исследования, а не в продольном направлении.- Через двадцать четыре часа после индукции MCAO, анестезию крыс с ИФ (5% для индукции, 1-1,5% для поддержания) в 0,9 л / мин медицинского воздуха и 1 л / мин O 2, безопасный в квадратурный птичьей клетки магнитно-резонансной катушкой (диаметр 43 мм) и место в горизонтальное отверстие сканера 7 Тесла.
- Получить взвешенный по Т2 сканирования с помощью быстрого спин-эхо последовательность: эхо времени (TE) 60 мс, время повторения (TR) 4000 мс, поле зрения (FOV) 40 х 40 мм, матрица приобретение 128 128, приобретая 40 х 0,5 мм срезы толщиной примерно в 8 мин. Впоследствии, конвертировать 40 ломтиков толстыми ломтиками 20 х 1 мм с помощью resamplING функция в программном обеспечении медицинской визуализации.
- Получить объемы очаг в пакете дисплея медицинских изображений путем измерения площади поперечного сечения миокарда в 20 объемах. Получение общего объема путем умножения суммы этих областях за счет толщины (1 мм). Вычислить группу средний объем и стандартное отклонение. Для процентных вычислений объема поражения, также приобретают объемы ipsilesional и contralesional полушарий.
- Для коррекции отека мозга из-за отека, настроить эти значения, используя формулы Gerriets "18. Только включать ломтики, которые содержат кору и не содержащие мозжечок или обонятельные луковицы в соответствии со стандартным атласа крысы 19, чтобы избежать чрезмерной коррекции, так как это может генерировать отрицательные объемы поражения.
- Приобретать T2 взвешенных изображениях снова через 8 недель после инсульта хирургии.
5. Размер выборки Расчеты для будущих исследований по оценке нейропротекции и поведенческие восстановления </ Р>
- Выполните вычисления размера выборки для оценки минимального размера выборки, которые потребуются в будущем гипотетических нейропротекторов экспериментов с использованием двух групп (контроль VS. Лечения), чтобы определить процедурные эффекты трех различных величин (снижение на 25%, 50% снижение, уменьшение на 75%), используя априорные алгоритмы реализованы в программном обеспечении анализа мощности 20.
Примечание: Чтобы включить читателей сделать аналогичные расчеты со своими собственными данными, есть скриншоты из свободно-доступного программного обеспечения анализа мощности (см Представитель Результаты). Используйте следующие параметры: приемлемый ложных срабатываний (т.е. пороговое Ошибка типа I; α) ≤0.05, и власть (которая равна 1-бета) ≥0.80 (т.е. более 80% мощности). Ниже объяснений и обсуждение 21.
6. Пожилые защиты животных после инсульта Хирургическое
- Сделать доступным дополнительный мягкий чау Aй регидратации геля пакеты, что крысы приучали к перед операцией, в дополнение к бутылок воды с расширенными советы для облегчения идущие последствия. Кроме того, есть поглощаемый площадку восстановления в клетках вместо рыхлой подстилки (т.е. избежать щепки) в течение первых 24 ч, и обеспечивают дополнительную вложенности постельные принадлежности. Не используйте пюре пищу (например, детское питание), которые могут подавиться крысы с дисфагией.
- Взвешивание животных ежедневно в течение 7 дней, чтобы контролировать восстановление. Потеря веса является основным показателем обезвоживания и стресса. Потеря веса в первые несколько дней после операции, главным образом отражает обезвоживание (вместо потери массы тела за счет снижения кормления).
- Где старение крысы показывает потерю веса, не связанного с операцией, заменить потерянный вес тела с эквивалентным весом жидкости и осмотрите верхние и нижние зубы. Где зубы зарастают, обезболить крысу с изофлуран (как в разделе 2.1), и место в лежачем положении
- Поместите цилиндра шприца 1 мл за тээт для защиты мягких тканей. Вырезать с помощью ручной дисковой пилой (например, примерно 3 см в диаметре) на высокой скорости вращения, но с медленными, фирменных движений рук (например, 3 прохода SEC). Разрешить зубы крысы остыть между разрезами. Убедитесь, что вращающийся пильный монтируется на оправке таким образом, что зубья пильного сталкиваются в направлении вращения. Стоит держать в индивидуальной упаковке, стерилизовали поворотные пилы готов к таким неожиданностям.
Примечание: Чрезмерный может произойти у пожилых крыс, даже если сохраняется на жестком диеты гранул. Мы рекомендуем, что зубы регулярно проверяются у пожилых крыс.
- Поместите цилиндра шприца 1 мл за тээт для защиты мягких тканей. Вырезать с помощью ручной дисковой пилой (например, примерно 3 см в диаметре) на высокой скорости вращения, но с медленными, фирменных движений рук (например, 3 прохода SEC). Разрешить зубы крысы остыть между разрезами. Убедитесь, что вращающийся пильный монтируется на оправке таким образом, что зубья пильного сталкиваются в направлении вращения. Стоит держать в индивидуальной упаковке, стерилизовали поворотные пилы готов к таким неожиданностям.
- Где пожилой крысы показывает потерю веса и пилоэрекцию не связанную с хирургией, обсудить варианты лечения с ветеринаром. Рассмотрим гуманно убивать животное. МРТ таких животных может показать опухоль гипофиза (часто у пожилых самок крыс), что не работает, причем со смертельным исходом.
Representative Results
Постоянная МСАО индуцировали выполняющего краниотомия последующим коагуляции и разрушению средней мозговой артерии диатермией сочетании с постоянной окклюзии ipsilesional общей сонной артерии и 60 мин окклюзии contralesional общей сонной артерии. Схема установки оборудования и окклюзии MCA показано на рисунке 1, и сонных артерий на рисунке 2 (выше).
Исход Инсульт оценивали через 24 ч и через 8 недель после инсульта путем измерения объема инфаркта на 40 х 0,5 мм срезов (от ростральной конце обонятельной луковицы к ростральной конце спинного мозга) с помощью области интереса инструментария в пакете дисплея медицинских изображений. Представитель Т2 взвешенных структурное МРТ показано на том же животном в 24 ч и 8 недель (фиг.3А). Объем инфаркта был опознан областях мозга крысы показывающий сигнал гиперинтенсивна; как вес T2ред изображения показывают воду или плазму как яркий белый области. Известно, что есть увеличение в отек и набухание головного мозга после инсульта, и это может быть измерено с T2-взвешенных сканирования, которая была коррелирует с гистологическими измерениями объема 18 инфаркта. Тем не менее, отек присутствует в ранние сроки после инсульта (например, через 24 часа) может привести к завышению объема окончательным поражением (например, через 8 недель), и поэтому мы также представляем средние инфаркта объемы скорректированы с использованием формул Gerriet в. 3В показывает средние данные, полученные сырой (без корректировок) объем поражения через 24 часа, как 62,8 мм 3 (± 25,4 мм 3 SD, верхний график); это занимает 9,8% пораженной полушария (± 4,2% SD, средний график). Когда делают поправку на набухание мозга с использованием формул Gerriets "это значение снижается до 4,5% (± 2,0% SD, нижний график).
Тяжесть инсульта также измеряли с помощью теста 15 лестница Монтойя. Короче говоря, аnimals были предварительно обучены для извлечения сахара гранулы в течение 4 недель до MCAO инсульта хирургии, и проходят в течение 8 недель после инсульта (рисунок 4), чтобы подтвердить устойчивый дефицит. Крыс помещали в лестничной аппарата в течение 10 мин, а количество гранул извлекается был записан (из 21 гранул) и отображается в процентах (группа означает ± стандартные ошибки). Регрессионный анализ был проведен, чтобы соответствовать строку данных.
На рисунке 5 показана Расчет размера выборки с использованием данных объема инфаркта (для потенциальных последствий кандидатов терапии), анализировали с использованием алгоритма в программном обеспечении анализа мощности для Т-тест с использованием "Разница между двумя независимыми средствами (две группы)" и с помощью кнопок (без поправки ) и стандартные отклонения от 3В. Информация, содержащаяся в рисунке 5 и в таблице 1, показывают, что 12 крыс потребуется на группу обнаружить терапию, которая сократила инфОбъем ARCT на 50% через 24 часа, в то время как на фиг.6 показан "XY участок" власти достигнута при использовании различного количества животных. В таблице 1 приведены расчеты размер выборки для всех временных точках.
Рисунок 3. Т2-взвешенных структурное МРТ используется для определения размера инфаркта и отека мозга после инсульта. (A) Т2-взвешенных магнитного резонанса изображение того же мозга крысы 24 ч и 8 недель после индукции инсульта. Белая область представляет собой поражение, но также содержит некоторую Вазогенный отек, который разрешает на 8 недель. Объемы (Б) инфаркта измеряли с помощью медицинского изображения дисплея пакетов интересующей области Toolkit, и наносят на график, представляющий собой среднее ± SD для 3 временных точек, используемых (N = 6). Сырье объем поражения (без поправки на мозге опухоль из-за редEMA), процент поражения пострадавших полушарии (без поправки для набухания), и процент поражения полушария с поправкой на набухание мозга с использованием формул Gerriets, раскрываются здесь. SD был использован вместо SEM для выполнения расчетов размера выборки (рисунок 5). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 4. Тест подъезд показывает нарушения в понимании и извлечения гранул. В этой модели инсульта было очень мало спонтанное выздоровление. Инсульт у пожилых крыс упорно ухудшает ловкость, показанный еженедельной тестирования с использованием "тест лестница" пеллет идущие. Врезка: Изображение крысы проводящего испытания в поведении. График показывает среднее (± стендаа р д ошибка) количество гранул, получаемых (из 21, выраженное в процентах) в неделю пострадавшей лапы. п = 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 5. Расчет размера выборки для определения номера группы крыс, необходимых для обнаружения желаемого терапевтического эффекта. Это снимок экрана, взяты из программного обеспечения для анализа мощности, показывает, что 12 крыс в группе необходимо будет обнаружить терапию, которая сократила объем инфаркта на 50% Через 24 часа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
Рисунок 6. Мощность достигается использованием различных общего числа животных. А.Н. "XY график для диапазона значений" из программного обеспечения для анализа мощности показывает силу которая будет получена в экспериментах с использованием различных (общая) число пожилых крыс, учитывая параметры показано на рисунке 5. в таблице 1 приведены все наши результаты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.
| Время после инсульта: | Количество крыс на группу, необходимого для обнаружения снижение объема повреждения от: | ||
| 75% | 50% | 25% | |
| 24 ч | 6 | 12 | 42 |
| 8 недель | 4 | 5 | 17 |
Таблица 1. Расчеты размеров выборки в каждой группе для гипотетических будущих экспериментов. Расчетное с использованием программного обеспечения для анализа мощности (рисунки 5 и 6). Таблица показывает количество крыс в группе, необходимого для двухгрупповой эксперимента в обнаруживать 25%, 50% и 75% уменьшение объема поражения в на каждом из временных точках в этом исследовании.
Discussion
МСАО у грызунов является метод часто используется для моделирования человеческого инсульта. Эта модель имеет несколько деталей отметить в протоколе. Во-первых, важно, чтобы поддерживать температуру тела животного в течение всего эксперимента, как это влияет на размер инфаркта и количество случаев гибели в исследовании. Это может быть возможным, чтобы прекратить изофлуран течение временной окклюзии правой ССА и держать крыс в подогретый, спокойной обстановке, чтобы увеличить выживаемость за счет снижения воздействия изофлуран. Исследователи должны рассмотреть вопрос о целесообразности более короткий период анестезии перевешивает стресса дополнительного индукции. Сосудистую (например, MCA ветвления) крыс изменяется в пределах и между когорт животных 22. Важно иметь в виду, когда начинают новое исследование. Различные CCA раз окклюзии может быть оценена (например, 30, 45, 60 и 90 мин). В этом исследовании используют временную окклюзию 60 мин. В других исследованиях было обнаружено, что 45мин окклюзии вызвать подобную размера корковой инфаркт, но с неподтвержденной улучшенных показателей выживаемости. Соответственно, есть хирурги начинают с коротким временем окклюзии (например, 30 мин), чтобы увидеть, будут ли получены достаточные объемы поражения (и / или необходимые поведенческие дефициты) и только потом увеличивать раз окклюзии, где это необходимо. Поведенческие дефициты не выдержал у взрослых крыс по сравнению с пожилыми крыс с одинаковыми раза окклюзии.
МРТ может использоваться, чтобы судить ли (после определенного времени окклюзии) объемы поражения являются подходящими для целей исследования. Небольшой поражение будет охватывать менее десяти 0,5 мм корональные срезы (из 40). Поражение среднего размера будет охватывать между десятью и двадцатью корональных ломтиками. Большая поражение будет охватывать между двадцатью и тридцатью корональных ломтиками. Очень большое поражение будет охватывать более тридцати из сорока ломтиками. По нашему опыту, крысы с очень большими поражениями (более тридцати ломтиками) и / или данные о грыжи ACROSы по средней линии, как правило, имеют плохой прогноз: сокращение времени окклюзии может рассматриваться. МРТ также полезно для оценки местоположения инфаркта: некоторые более каудально расположены и некоторые из них более ростральным расположен.
Проявите особую осторожность при отделении блуждающего нерва с обеих общих сонных артерий. Хрипы (грубая) может возникнуть после инсульта хирургии, и это может быть из-за повреждения нерва в некоторых животных, хотя причина в настоящее время неясно: по нашему опыту, прогноз очень плохой для этих животных, и это, как правило, рекомендуется гуманно убить их.
Постоянные результаты модели диаметрия MCAO в воспроизводимых корковых инфарктов и приемлемым ставкам послеоперационных выживания в пожилых крыс. Техника, тем не менее, требуют инвазивной хирургии под стереомикроскопа. Важно поддерживать асептики, если животные хорошо восстановиться после хирургического вмешательства. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить MCA разоблачая и коагулянты артерию,и повреждение поверхности коры должно быть минимизировано в противном случае открытые участки коры могут образовывать часть области инфаркта. Рекомендуется для получения как можно больше опыта, как это возможно, чтобы установить порядок и добиться согласованных инфаркты и определить раз окклюзии, прежде чем исследование выполняется для проверки кандидатов терапии, например. Экспериментаторы должны выборочно любые процедуры в рамках операции сессий ( "блок рандомизации"), где это возможно. Стоит отметить, что эта модель не предполагает MCA реперфузии (если переходный MCA перевязки не используется вместо диатермией). Смертность может быть высокой у пожилых крыс с этих больших корковых инфарктов, но это должно быть возможным, чтобы снизить смертность при использовании более короткого времени окклюзии и сведения к минимуму воздействия на общий наркоз, где это возможно (например, во время окклюзии). Использование 70% N 2 O и 30% O 2 в качестве носителя может позволить более низкие уровни изофлуран, которые будут использоваться: это снижение воздействия isofluRane может привести к увеличению выживаемости.
Еще один момент, чтобы рассмотреть, что атеросклероз это постепенный процесс, в то время как в этом протоколе мы его имитации с острым ОСО окклюзии. Тем не менее, существенное снижение кровотока и устойчивых дефицитов имитации тандем окклюзии, которые происходят во многих пациентов, перенесших инсульт. Постоянная дистальный МСАО без тандеме CCA окклюзии у крыс не может стимулировать штрихи воспроизводимо 14: кроме того, без тандемного ОСО окклюзии, мы нашли значительное спонтанное восстановление происходит, что исключает долгосрочное поведенческое оценку хода терапии в течение 8 недель. В противоположность этому, мы покажем, что дистальная МСАО с тандеме ОСО окклюзия вызывает долгосрочные дефицита у пожилых крыс.
В заключение, эта процедура у крыс вызывает инсульты, которые похожи по размеру и расположению к тем, которые наблюдаются в человеческом состоянии, с устойчивой инвалидности, которые можно использовать для того, чтобы тестирование новых методов лечения и выяснения репара механизмы после ишемического инсульта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carprofen | Norbrook | Vm No; 02000/4229 | give 0.25 mg/kg |
| Atropine Sulfate | AmTech | RXATRINJ-100 | |
| Alcohol swabs | UHS | 20021 | |
| Lidocaine cream (Emla) | AstraZeneca | 0012901 | Apply a pea sized drop to the shaved neck and temporal regions |
| Homeothermic Blanket System | Harvard Instruments | 507222F | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11019-12 | |
| Isoflurane | Abbott | B506 | |
| Silk sutures | Harvard Apparatus | 723288 | |
| Cautery system | Eschmann | ||
| 0.25 mm Jeweler cautery forceps | Eschmann | 8330349 | |
| fine Dumont forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Thumb driven saline drip system | |||
| Vacusafe aspirator system | INTEGRA BIOSCIENCES | 158320 | |
| 1.6 mm coarse diamond coated Steel burrs | K801 104 016 | ||
| Handheld dental drill | NSK | NSKVMAXVRE (Handpiece NSKEX6B) | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | |
| Microvascular scissors | World Precision Instruments | 501790 | |
| 4-0 Vicryl sutures | Ethicon | ||
| Vascular clip and applicator | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| Compact Anaesthesia System Isoflurane K/F Single Gas | VetTech Solutions | ||
| Carbon Steel Scalpel blades No. 10 | Swann-Morton | 201 | |
| 25 g needles | Terumo | NN-2525R | |
| syringes (1 ml and 5 ml) | Terumo | SS+01T1 / SS*05SE1 | |
| Saline (Sodium Chloride 0.9%) | Fresenius Kabi | Pl 08828/0178 | |
| cotton buds | Johnson and Johnson | 5000207582502 | sterilize before use |
| gauze | sterilize before use | ||
| Medical Imaging Package (Jim) | Xinapse | Free software | |
| Statistical Parametric Mapping Software (SPM8) | UCL | Free software | |
| Power Analysis Software (G*Power) | Universität Düsseldorf | Free software |
References
- Pendlebury, S. T., et al. Underfunding of stroke research: a Europe-wide problem. Stroke. 35, 2368-2371 (2004).
- Doyle, S., Bennett, S., Fasoli, S. E., McKenna, K. T. Interventions for sensory impairment in the upper limb after stroke. Cochrane Database Syst Rev. 6, CD006331 (2010).
- Reep, R. L., et al. A rodent model for investigating the neurobiology of contralateral neglect. Cogn Behav Neurol. 17, 191-194 (2004).
- Carey, L. M., et al. Relationship between touch impairment and brain activation after lesions of subcortical and cortical somatosensory regions. Neurorehabil Neural Repair. 25, 443-457 (2011).
- Mohr, J. P., Lazar, R. M., Marshall, R. S., et al. Ch. 24. Stroke: Pathophysiology, Diagnosis and Management. Mohr, J. P., et al. , Elsevier. 384-424 (2011).
- Sacco, R. L., et al. Subarachnoid and intracerebral hemorrhage: Natural history, prognosis, and precursive factors in the Framingham Study. Neurology. 34, 847-847 (1984).
- Hossmann, K. A., Heiss, W. D. Ch. 1. Textbook of Stroke Medicine. Brainin, M., Heiss, W. D. , Cambridge University Press. 1-27 (2009).
- The National Institute of Neurological Disorders and Stroke rt-PA Stroke Study Group. Tissue Plasminogen Activator for Acute Ischemic Stroke. N Engl J Med. 333, 1581-1587 (1995).
- Brott, T., et al. Measurements of Acute Cerebral Infarction: Lesion Size by Computed Tomography. Stroke. 20, 871-875 (1989).
- Lövblad, K. O., et al. Ischemic Lesion Volumes in Acute Stroke by Diffusion-Weighted Magnetic Resonance Imaging Correlate with Clinical Outcome. Ann Neurol. 42, 164-170 (1997).
- Norrving, B. Ch. 2. Textbook of Stroke Medicine. Brainin, M., Heiss, W. D. , Cambridge University Press. 28-39 (2009).
- Truelsen, T., et al. Stroke incidence and prevalence in Europe: a review of available data. Eur J Neurol. 13, 581-598 (2006).
- Ord, E. N., et al. Positive impact of pre-stroke surgery on survival following transient focal ischemia in hypertensive rats. J Neurosci Methods. 211, 305-308 (2012).
- Chen, S. T., Hsu, C. Y., Hogan, E. L., Maricq, H., Balentine, J. D. A model of focal ischemic stroke in the rat: reproducible extensive cortical infarction. Stroke. 17, 738-743 (1986).
- Montoya, C. P., Campbell-Hope, L. J., Pemberton, K. D., Dunnett, S. B. The 'staircase test': a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats. J Neurosci Methods. 36, 219-228 (1991).
- Adams, F. S., Schwarting, R. K., Huston, J. P. Behavioral and neurochemical asymmetries following unilateral trephination of the rat skull: is this control operation always appropriate? Physiol Behav. 55, 947-952 (1994).
- Macrae, I. M. Ch. 5. Rodent Models of Stroke, Neuromethods. U, D. irnagl 47, Humana Press, Springer. 41-53 (2010).
- Gerriets, T., et al. Noninvasive Quantification of Brain Edema and the Space-Occupying Effect in Rat Stroke Models Using Magnetic Resonance Imaging. Stroke. 35, 566-571 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. R., Emson, P. C. AChE-stained horizontal sections of the rat brain in stereotaxic coordinates. J Neurosci Methods. 3, 129-149 (1980).
- Faul, F., Erdfelder, E., Buchner, A., Lang, A. G. Statistical power analyses using G*Power 3.1: tests for correlation and regression analyses. Behav Res Methods. 41, 1149-1160 (2009).
- Button, K. S., et al. Power failure: why small sample size undermines the reliability of neuroscience. Nature Reviews Neuroscience. 14, 365-376 (2013).
- Fox, G., Gallacher, D., Shevde, S., Loftus, J., Swayne, G. Anatomic variation of the middle cerebral artery in the Sprague-Dawley rat. Stroke. 24, 2087-2093 (1993).
- Tamura, A., Graham, D. I., McColloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. J. Cereb. Blood Flow Metab. 1, 53-60 (1981).
