Introduction
Ободочной эпителия подкладка высоко регенеративного ткани, с резидентов стволовые клетки пополнения ткани через каждые несколько дней 1. Этот процесс регенерации требует поддержания пролиферативного стволовых клеток отсеке. Со временем, вновь полученные дочерние клетки теряют пролиферативным потенциалом и мигрируют к поверхности просвета кишечника. Одновременно с миграцией, клетки-предшественники дифференцируются в зрелые барьерных формирования энтероцитов или слизистых бокаловидных клеток, продуцирующих. Отказ эта дифференциация программы, как полагают, внести свой вклад в угрозу эпителиальный барьер, таких как наблюдается при воспалительных заболеваниях кишечника и рака толстой кишки 2,3.
Детальное изучение этих процессов потребует методологии выделения крипт-базы и поверхности клеточной популяции. Существуют различные методы, каждый со своими уникальными преимуществами и недостатками. Современные методы выделения эпителиальных клеток кишечника включают CHelating агенты и механические диссоциации, в результате изоляции целых склепы, эпителиальных листов, или одиночных клеток, в зависимости от условий эксперимента. 4,5 Эти методы дают высокие, но изменения в межклеточной сигнализации сообщалось в этих условиях, которые не могут представлять родную среду 6,7. Лазерная захвата микродиссекции позволяет для сбора пространственной отдельного материала, но достигает низкой молекулярной 8,9 текучести. В человеческой толстой ткани, последовательные горизонтальные методы cryosectioning были разработаны 10. Тем не менее, мышиные слизистой ткани чрезмерно мал для непосредственного присвоения этой техники. В людях, длина кишечника склеп (отдаленные между склепа базы и поверхностных клеток) в толстой кишке колеблется от ~ 100-1000 мкм 11. У мышей, склеп длины между ~ 50-300 мкм (рис 1А). Небольшой размер мышиных склепов представляет проблему для Изолации этих двух клеточных популяций с использованием существующих протоколов.
Опишем низкую стоимость, метод высокого урожая для изоляции склепа базы и поверхности эпителиальных клеток мышиной населения в толстой ткани. Ткань собирали таким образом, может затем быть проанализированы с помощью ряда стандартных последующих применений, в том числе иммунофлуоресценции окрашивания, RT-PCR (в реальном времени полимеразной цепной реакции) или Вестерн-блоттинга.
Protocol
Эксперименты использованы мышей C57BL / 6 от 10 до 12-недельного возраста. Все процедуры с использованием животных были рассмотрены и утверждены университета Институциональная комитета Эмори Уход за животными и использование и были выполнены в соответствии с национальными институтами здравоохранения критериев.
1. Экспериментальная установка
- Настройка криостат
- Равновесие криостат до -20 ° С, в том числе лезвия микротома и патронов (проявлять особую осторожность вокруг лезвия!).
- Заполните пустой cryomold с октября (оптимальное температуры резания соединение) и уравновешивают до -20 ° С (~ 30 мин). Удалить замороженного октября из формы и закрепить его на патроне с жидким октября Поместите блок / патрон в микротома руку и позволяют ОКТ установить в течение 10 мин.
- Установите криостат до 10 мкм на секции и бриться блок октябре, пока он не является плоской. Назад микротоме руку подальше от ножа на несколько сантиметров. На данный момент не отрегулировать лезвие или патрон для оставшейся части Experiment.
- Подготовка бритвенных лезвий: Подготовка 2 лезвия на образец. Использование металла файл, скучно обостряла край лезвия. Затем удалите алюминия фланец с щипцами.
- Предварительно охладить блюдо Pyrex или другой плоской поверхности на сухом льду.
- Подготовка рассечение блюдо с 10-15 булавки рассечение. 10 см культуре ткани блюдо 50% заполнены кремния хватит. Добавляют 5 мл буфера Хенкса при комнатной температуре.
2. Препарирование дистальной ободочной ткани
- Место мышей в герметичной камере и усыпить мышей ИФ ингаляции и шейных позвонков, затем спрей 70% этанола на животе и грудной клетки 12.
- Сделайте небольшой надрез в коже живота с ножницами, а затем сделать разрез, чтобы обнажить брюшную полость. Аналогичные процедуры могут быть найдены описано здесь 12.
- Вырезать толстую кишку на грани анального и дразнить друг от друга брыжейки толстой кишки до не свободен.
- Акцизный дистальный толстой кишкиСегмент между 0 и 6 см от заднего прохода. Здесь глубина крипт составляет ~ 150 мкм (см фиг.1В). Разрежьте продольно толстой кишки с помощью ножниц и удалить содержимое фекальные.
- Прикрепите ткань к рассечение блюдо с поверхности слизистой оболочки вверх. Стретч ткани с помощью булавки рассечение на кремниевой блюдо в Хэнкс буфера и оставьте на 10 мин при комнатной температуре (рис 1в). Это устраняет складки из ткани и позволяет мышечные слои, чтобы расслабиться.
3. Установите ткани на криостат для секционирования
- Слайд лезвие под нужный раздел ткани, а затем вылейте буфер Хэнкса. Добавить еще лезвие к вершине, делает бутерброд. Вырезать сегмент ткани и удалить штифты. Перевести бутерброд лезвие / тканей к сухим льдом. Разрешить ткани, чтобы заморозить (5-10 мин, рис 1D).
- Возьмите бритвы бутерброд / ткани и дайте ему прогреться слегка касаясь пальцем на верхнем блADE (слизистой стороной вверх. Это ориентирует ткани так, что базальные слои мышц подразделяются в первую очередь.). Отдельные бутерброд и вырезать вокруг краев сегмента ткани. Вырезать сегмент ткани примерно 0,5 см х 1 см. Краевые участки имеют тенденцию к скручиванию, в результате чего серийные срезы содержат много слоев ткани. Обратите внимание, что более-резки лучше, чем под резки, так ошибаться в сторону осторожности.
- Разрешить ткани, чтобы нагреть, пока лед в верхней части ткани не начинает плавиться. В этот момент быстро и тщательно нажать ткани в блоке октября в криостате.
- Удалить лезвие, расположив пальцы по образцу. Теплопередачи позволит вам удалить лезвие, не нарушая ткани.
- Пальто ткани с октября до равновесия в течение 5 мин. Сокращение на секции 10 мкм (рис 1E, F). Осмотрите секции до тех пор, склепы не видел. Место участки в 1,5 мл пробирки или на слайдах.
- Для анализа мРНК или белка, место тон пробует в трубах с 5 склепа базы, 5 переходный и 5 участков поверхности в трубке. Для сбора РНК добавить 1 мл реагента коммерческой изоляции и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 мин. Выполните очистку РНК в соответствии с инструкциями изготовителя. Использование 5-10 мкг общей РНК для генерации кДНК.
- Для очистки белка, добавить 0,5 мл холодного буфера для лизиса RIPA (плюс ингибиторы протеазы) за 5 разделов. Разрушать ультразвуком 3 раза по 70% цикла, на льду.
- Добавить примеры для SDS-PAGE загрузки буфера (буфера Лэммли) и инкубируют при 100 ° С в течение 10 мин. Предметные образцы в ДСН-ПААГ и передачи, то блок, в 5% молоке / PBS в течение 2 часов. Выполнение Вестерн-блоттинга с последующей инкубацией с Klf4 антител (1: 500) O / N при 4 ° С.
Representative Results
Разделы толстой кишки ткани были обработаны для гистологического оценки и Н & Е окрашивания 13. Традиционный разрез слизистой оболочки видно на фиг.2А. Базальные области содержат наружный мышечный, состоит в основном из круговых мышечной. Исходя сторону просвета, мышечной слизистой очевидно, прилегающих к Crypt-база эпителиальных клеток, переходные клетки находятся в середине ткани, и, наконец, популяции клеточной поверхности сталкиваются просвета кишечника. Последовательный метод секционирования описано здесь сохраняет ориентацию таким образом, чтобы продольные и круговые мышечной встречаются первый (фиг.2В), а затем в мышечной слизистой (фиг.2с). Обратите внимание на внешний вид немышечных интерстициальных клеток в верхнем левом углу изображения. Для анализа на выходе описано ниже, участки мышц, отбрасываются. Последующие разделы содержат эпителиальные клетки и интерстициальной ткани (собственная пластинка), Начиная с склеп-базовых элементов (рис 2D). Обратите внимание на отсутствие центрального просвета в наиболее склепы, которые темнее из-за плотно упакованных ядер. Эти слои содержат пролиферативную отсек. Переходные клетки появляются, как плотно железы с выдающимися центральных люмен (рис 2E). Наконец, население клеточной поверхности имеют неправильную структуру, с участками эпителия монослоя смотреть анфас (рис 2F).
Серийные срезы, как описанные выше, также могут быть обработаны для иммунофлуоресцентного маркировки и конфокальной микроскопии (как описано здесь, 14). Рисунок показывает 2G изолированные крипты фиксированные и проницаемыми в 100% метанола, а затем окрашивали в течение ядер (синий) и клетка-клетка соединительной белка блокатора малой зоны Occludens 1 (ZO-1, зеленый). В традиционной ориентации срезов, склеп и клеточной поверхности можно рассматривать одновременно (рис 2G (рис 2G). Расширенные ZO-1 пятно видно в популяциях поверхность клеток (рис 2I и J).
Несколько факторов дифференциации, как известно, выражается в пространственно-временной моды вдоль оси крипта-поверхность. Это включает транскрипционный фактор Kruppel-подобный фактор 4 (Klf4), который, как известно, обогащенный популяций клеточной поверхности. При использовании традиционных способов секционирования, KLF4 находится в ядрах просвет, стоящих население поверхности клетки (рис 2K). Поэтому мы предположили, что KLF4 мРНК будет преимущественно экспрессируется в популяциях поверхности клеток. Чтобы проверить это, серийные срезы были собраны и сгруппированы в поверхностные, в переходный период, и склеп-базовых образцов. Subsequently, РНК собирали при помощи стандартного извлечение тризола, с дополнительным Очистка колоночной RNeasy и лечения ДНКазы. РНК была получена из 5 объединенных последовательных секций, которые дали между 5-10 мкг общей РНК в образце. Эти образцы были затем подвергнуты полуколичественный ПЦР в реальном времени и для KLF4 и контрольного гена, ТАТА-блок связывающего белка 1 (ТБФ-1) (рис 2 л) 14. Как показано на рисунке 2 л, после нормализации до ТБФ-1, на поверхности клетки экспрессируют вплоть до 8 раз KLF4 мРНК, что выражается в клеток крипт. Аналогичным образом, уровень белка KLF4 было обнаружено обладают пространственной регулирование вдоль оси крипты поверхности. Серийные срезы были объединены, как описано выше, а затем инкубировали в буфере для лизиса в течение 20 мин при 4 ° С. Это давало между 200-250 мкг белка в образце. Затем образцы подвергали анализу с помощью SDS-PAGE (рис 2М) 15. Как показано на рисунке 2М, KLF4 рУровни rotein являются значительно выше в популяциях клеточной поверхности. Вышеуказанные результаты показывают способность этого протокола, чтобы изолировать большое количество поверхности и эпителиальных клеток крипт из мышиного слизистой оболочки толстой кишки.
Рисунок 1: () Схематическое изображение мышиный слизистой оболочки толстой кишки и внешние слои мышц. Наш метод направлен на сбор отдельные группы клеточной поверхности и склеп-базовые сотовые последовательным cryosectioning (10 мкм каждый). Внешние слои мышц, отбрасываются. Высота (В) Crypt изменяется вдоль длины ободочной кишки (расстояние между крипт-базовых и поверхностных слоев). Точки данных указывают отдельные измерения склеп и символы указывают на биологические повторов (N = 4). (C) сегментов толстой кишки собирают, пополам, и удержал на кремниевую рассекает блюдо. (D) тканей себеgment примерно 3 см от заднего прохода нажата между ними, чтобы бритвенных лезвий и замораживали на сухом льду. (Е) ткани затем монтируется на предварительно выровнена блока Октябрь. (F) криосрезах удаляют и визуально.
Рисунок 2:. Представительные данные () толстой ткани окрашивали гематоксилин-эозином в поперечном сечении, показывающий циклические мышечной (см), мышечной слизистой (мм), крипты-Базовые элементы, переходные клетки, и поверхностные клетки. (В - С) толстой слои мышц. (D) Склеп-базовые клетки. Обратите внимание на отсутствие центрального просвета. (Е) Переходные клетки. (F) поверхности клетки. (G), иммунофлуоресценции окрашивание изолированных кишечных крипт. ZO-1 (зеленый) и ядра (синий) наблюдаются в поперечном сечении. (HI) ZO-1 и ядерного окрашивание в переходных и поверхностных клеток. (J), увеличенный вид ZO-1 окрашивания. (К) KLF4 (зеленый) обогащен населения клеточной поверхности. (L), ПЦР в реальном времени оценка уровня мРНК KLF4 между тремя отделениями. (М) Вестерн-блот-анализ уровней белка Klf4 в этих клеточных популяций.
Discussion
Молекулярные механизмы, участвующие в толстой пролиферации эпителиальных клеток и дифференцировки плохо изучены. Это включает в себя пробелы в нашем понимании клеточной среде передачи сигналов из стволовых клеток отсеке в основании ободочной эпителиальных криптах. Существует также растущий интерес к процессам, которые лежат в основе дифференциации энтероцитов. Например, более глубокое понимание дифференциации в естественных условиях требуется в качестве ориентира для исследований, направленных на производство в пробирке первичных кишечных систем 16.
Выше процедура состоит из нескольких шагов, которые требуют особого внимания. Во-первых, удаление ребра вокруг замерзшего участка ткани (как описано в разделе 3.2) требуется как ткани краев скручиваться во время вскрытия и замерзания. Несоблюдение этих краях двигаться результатов является смешанное население наземных и склеп базовых клеток. Монтаж ткани на предварительно охлажденной, сравняли октября блок также имеет важное значение. Тего протокол может быть адаптирован для других областей дистального отдела толстой кишки, изменяя количество секций в каждом пуле. Например, как показано на фиг.1В, через слизистую оболочку длина крипт варьирует между 150-300 мкм. Таким образом, при изучении область между 4 см-6 см от заднего прохода, количество секций должна быть увеличена с 15 до 30. Важно отметить, что этот протокол не предложил для проксимального двоеточия (7 см-9 см) из-за складок ( смятия obliquae), которые проходят в полость делает невозможным отдельных поверхностных и крипт-базовых клеток путем последовательного секционирования.
Последовательные методы срезов были исследованы Crypt-базу и поверхности эпителиальных клеточных популяций в организме человека. Тем не менее, наш протокол добавляет дополнительные шаги, которые необходимы из-за небольшого размера мышиного ткани. Мы полагаем, что выше протокол позволит расследования склепа базы и населения поверхность эпителиальных клеток генетически послушными систем мыши. Действительно, объединенные разделы YieLD белок высокого качества и РНК подходит вниз анализ. Будущие приложения могут включать в себя изучение сигнальных путей клетки или иммунопреципитации хроматина. Тем не менее, следует отметить, что, как и некоторые из альтернативных методов, описанных выше, в результате участки содержат смесь эпителиальных и интерстициальных клеток собственной пластинки. В заключение, протокол, описанный здесь, обеспечивает быстрое, высокую урожайность метод для анализа молекулярных процессов в пространственно отдельных регионах мышиного слизистой оболочки толстой кишки.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microtome | Leica Biosystems, Nussloch Germany | CM 1510-3 | |
| MyiQ real time PCR detector | BioRad | ||
| LSM 510 | Carl Zeiss | Confocal microscope | |
| OCT | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4583 | |
| cryo-mold | Tissue-Tek, Sakura Finetek, Torrance CA | 4557 | 25mmx20mmx5mm |
| High profile microtome blade | Leica Biosystems, Nussloch germany | 818 | |
| GEM industrial blades | American Safety Razor Blades | 62-0314 | |
| Sylgard silicon elastomere base | Dow Corning, Midland MI | 3097358 | |
| 27 1/2 g needle | Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ | 305109 | pins for dissection |
| TRizol | Life Technologies | 15596018 | |
| Rneasy | Qiagen | 74104 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | |
| Antibody ZO-1 | Invitrogen | 187430 | |
| Antibody KLF4 | Cell Signaling | 4038S | |
| Antibody mGAPDH | Sigma | G8795 | |
| Antibody Secondary Alexa conjugate | Invitrogen | A11034 | 488 anti-rabbit |
| Antibody Secondary HRP conjugate | Jackson | 111/115-001-003 | rabbit/mouse |
| Topro-3 | Invitrogen | T3605 | |
| HANKs balanced salt buffer | Life Technologies | 14025092 | |
| RIPA lysis buffer | 50mM Tris-HCl pH 7.4 150mM NaCl 1% NP40 0.25% Na-deoxycholate | ||
| primer TBP 3' | GGAATTGTACCGCAGCTTCAAA | ||
| primer TBP 5' | GATGACTGCAGCAAATCGCTT | ||
| primer KLF4 3' | TGTGACTATGCAGGCTGTGGCAAA | ||
| primer KLF4 5' | ACAGTGGTAAGGTTTCTCGCCTGT |
References
- Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. Intestinal development and differentiation. Exp Cell Res. 317, 2702-2710 (2011).
- Humphries, A., Wright, N. A. Colonic crypt organization and tumorigenesis. Nat Rev Cancer. 8, 415-424 (2008).
- Weber, C. R., Turner, J. R. Inflammatory bowel disease: is it really just another break in the wall. Gut. 56, 6-8 (2007).
- Bjerknes, M., Cheng, H. Methods for the isolation of intact epithelium from the mouse intestine. Anat Rec. 199, 565-574 (1981).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
- Rand, M. D., et al. Calcium depletion dissociates and activates heterodimeric notch receptors. Mol Cell Biol. 20, 1825-1835 (2000).
- Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5, 29-38 (2012).
- Lechner, S., et al. Gene expression pattern of laser microdissected colonic crypts of adenomas with low grade dysplasia. Gut. 52, 1148-1153 (2003).
- Reizel, Y., et al. Colon stem cell and crypt dynamics exposed by cell lineage reconstruction. PLoS Genet. 7, e1002192 (2011).
- Kosinski, C., et al. Gene expression patterns of human colon tops and basal crypts and BMP antagonists as intestinal stem cell niche factors. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15418-15423 (2007).
- Tamura, S., et al. Pit pattern and three-dimensional configuration of isolated crypts from the patients with colorectal neoplasm. J Gastroenterol. 37, 798-806 (2002).
- Geem, D., Medina-Contreras, O., Kim, W., Huang, C. S., Denning, T. L. Isolation and characterization of dendritic cells and macrophages from the mouse intestine. Journal of visualized experiments : JoVE. , e4040 (2012).
- Laukoetter, M. G., et al. JAM-A regulates permeability and inflammation in the intestine in vivo. J Exp Med. 204, 3067-3076 (2007).
- Neumann, P. A., et al. Gut commensal bacteria and regional Wnt gene expression in the proximal versus distal colon. Am J Pathol. 184, 592-599 (2014).
- Capaldo, C. T., et al. Proinflammatory cytokine-induced tight junction remodeling through dynamic self-assembly of claudins. Mol Biol Cell. 25, 2710-2719 (2014).
- Wells, J. M., Spence, J. R. How to make an intestine. Development. 141, 752-760 (2014).
