Abstract
脳内のグリア細胞のように、星状細胞は、中枢神経系における多様な機能的な役割を持っています。有害な刺激の存在下では、アストロサイトは、それらの機能的および構造的特性、反応性アストログリオーシスと呼ばれる状態を変更します。ここでは、星状細胞の形態学的特性の評価のためのプロトコルが提供されます。このプロトコルは、星状細胞（アストロサイト領土）で覆われた組織の表面積と体積、支店、細胞体、および核を含む全体のアストロサイトと同様に、枝の長さの合計と数、強度、すなわち12の異なるパラメータの定量化を含み星状細胞の検出のために使用した抗体の蛍光免疫反応性、及びアストロサイトの密度（個/1000μmで2）の。 Volocity 6.3測定のために使用されたように、この目的のために、三次元（3D）の共焦点顕微鏡画像を作成し、3D画像解析ソフトウェアかかるました。アミロイドベータ1-40に露出ラット脳組織>（Aβ1-40）治療的介入は、方法を提示するために使用されたの有無にかかわらず。このプロトコルは、 インビボまたはインビトロの条件のいずれかでの他のセルの3次元形態計測分析のために使用することができます。
Introduction
健康な中枢神経系（CNS）において、星状細胞は、血流の調節、エネルギー代謝、シナプス機能と可塑性、および細胞外イオン及び神経伝達物質の恒常性1-3の重要な役割を果たしています。また、アストロサイトは肥大、増殖およびアストロサイト4,5の機能改造することを特徴とする反応性アストログリオーシスを介した別の有害な刺激や、外傷、感染症、虚血または神経変性などの異常な状態に応答します。
反応性アストログリオーシスは、組織に炎症反応と修復プロセスを設計することができ、したがって、治療的介入の臨床転帰に影響を与えることができます。したがって、アストロサイトは、CNSに影響する種々の疾患のための治療的介入のための潜在的なターゲットとして最後の十年の間に神経科学者から注目を集めています。
アストロサイトは、通常、よくdで星状の形状を有しますソーマ6の周囲に広がる枝をefined。脳内の病的状態では、アストロサイトの枝が複雑になり、アミロイドベータ（Aβ）の存在下で、例えば、腫れ終了7を示しています 。
この記事では、共焦点顕微鏡で取得したアストロサイトの3次元画像を解析するためのプロトコルを提示します。各アストロサイトのための12の異なる定量的パラメータを測定した：アストロサイトの領土（アストロサイトで覆われた組織）の表面積と体積を、セル全体、細胞体、および核（支店を含みます）;枝の長さの合計と数。星状細胞の検出のために使用した抗体の蛍光強度。そして、アストロサイトの密度（数/千μm2で）。この目的のために、我々は、抗炎症物質としてゲニステイン処理の有無にかかわらず、Aβ1-40の海馬内注入に暴露されたラットからの脳切片を用いました。記載されているプロトコルは、形態学的ANのために使用することができますインビトロまたはインビボでの異なる条件で異なる細胞型のalysis。
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Protocol
この研究は、医学のイラン大学（テヘラン、イラン）の倫理委員会によって承認された実験動物の管理と使用（NIH）のためのガイドに記載されたポリシーに準じて行きました。
1.動物、手術検体の準備
注：3D共焦点顕微鏡分析のために、脳組織を準備します。
- 二つのグループに無作為に動物を分割：Aβ1-40 -injection（N = 8）、およびゲニステイン治療（N = 8）と、Aβ1-40 -injection。手術前に強制飼養1時間によってゲニステイン（例えばポリエトキシル化ヒマシ油等の車両に希釈した10mg / kgの）を管理。
- ケタミン（100mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）で動物を麻酔。つま先をつまん後引っ込め反射の欠如によって適切な麻酔を確認してください。乾燥を防ぐために、手術中に目に軟膏を使用してください。
- 定位固定装置と剃りヘッドの動物を配置します。 IODの適用INE溶液を切開前頭皮をきれいにし、感染のリスクを減らすために、手術中に無菌手術部位を維持します。ラット脳アトラス8によれば、ブレグマ-3.5ミリ後方、正中線±2ミリメートル、横方向、および硬膜下の-2.8 mmに海馬におけるAβ1-40定位（4μl）を注入します。定位方法については、以前の出版物9を参照してください 。
- 動物は動物の快適さを確保するために完全に意識されるまで術後観察/ケアを提供します。リカバリ中に暖かい動物を維持し、完全に回復するまで、他の動物とのケージにそれらを返しません。手術後、動物に感染の兆候に注意してください。
- 3週間手術後（150ミリグラム/ kg）をケタミンにより深く動物を麻酔。 0.1 M PBS（pH値= 7.4）中の4％パラホルムアルデヒドに続いて、0.9％の生理食塩水で動物を灌流することによってtranscardial固定を行い、その後、削除して、10で説明したように、<脳を修正/ SUP>。
- 4℃で2〜3日、4％パラホルムアルデヒドで脳をポスト修正。
- 組織包埋装置を使用することにより、パラフィンブロック中の組織を埋め込み、それが正しい位置合わせまたは切片を妨げる可能性があるため、充填アンダーまたはオーバー充填カセットを避けます。パラフィンブロック中の組織の向きに注意してください。
注：ラット海馬は、例えば、大脳半球の後部に近接しています。したがって、組織は、脳の後部で開始を区画する方法に埋め込まれるべきです。目的の解剖学的構造に到達するためのガイドとしてPaxinosアトラス8を使用してください 。 - 空気の動きがセクションの取り扱いが困難になることから離れて空気ドラフトや戸口からミクロトームを置きます。
- この深さは完全なアストロサイトのZスタック画像を生成するために必要なことのように厚さ≥20ミクロンでセクションを使用してください。彼らは望ましくない厚さを有することができるように熱電子に、最初のカップルのセクションを使用しないでくださいxpansion。
- （5±2 C、パラフィンの融解温度以下）だけで十分な長さのセクションを平坦化する温水の表面にセクションを配置します。
注：セクションの拡大にわたり構造の形態を乱すことができます。慎重にセクションを転送するために小さな絵筆を使用してください。各スライドの2〜3のセクションを収集します。 - ストア直立位置にあるラックにスライドし、いくつかの時間またはO / N 37℃でそれらが乾燥してみましょう。
2.免疫組織化学
- キシレン、2×10分間で脱パラフィン切片、及びアルコール勾配（99.8％、95％、70％、10分毎）およびPBSを介して再水和します。
- 0.25％ウシ血清アルブミン（BSA）、0.25％トリトンX-100および3.5％正常血清（4℃でO / N）を含有するPBSで1,500：グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）に対する抗体でインキュベートし、1に希釈しました。
- 3×5分間PBS中でセクションを洗ってください。
- 二次アルカリホスファターゼコンジュゲートantibodieでインキュベート1時間のためのS（1：PBSで希釈した100、21℃）。
- 3×5分間PBS中でセクションを洗ってください。
注：これは、バックグラウンド染色を最小限にするために、適切な二次抗体の後のセクションを洗浄することが重要です。 - 液体パーマネントレッドクロモゲン（15〜20分）で暗闇の中でのセクションをインキュベートします。注：使用する前に解決策がない以上30分以上を準備します。
- 3×5分間PBS中でセクションを洗ってください。
- 最後に、4-6ジアミジノ-2-フェニルと、核染色（DAPI; 1：PBSで希釈した500）の前にカバー・スリップします。顕微鏡の前に冷蔵庫24〜48時間でスライドを保管してください。
3.共焦点顕微鏡
注：定量的評価（下記参照）の場合は、エラーのリスクを減らすために枝を重複を最小限に抑えてはっきりと見えるDAPI染色核とアストロサイトを選択します。 Zスタック画像を生成することは時間がかかります。我慢して、処理中に停止しないでください。直立共焦点レーザー走査型顕微鏡は、Uでありますアストロサイトから3D画像を作成するためのsed。
- 顕微鏡ステージ上にスライドを入れて、63Xの目的を選択します。
- イメージングソフトウェアを開き、スタートシステムをクリックします。探しタブをクリックします。割り当てに移動し、適切な光を調整するために、GFPを選択します。
- 光を反射するようにシャッターを開きます。シャッターの右側にリフレクターリボルバーを見つけて、アストロサイト（緑、赤または紫）によって反射されるべき色を選択します。赤色（FSet20 WF）は、ここで使用しました。
注：顕微鏡の接眼レンズに直接絵を集中することを忘れないでください。 - 最適な焦点を見つけるために、すべての閉じをクリックして、画面モードで顕微鏡ピンを入れ、取得]タブをクリックします。
- 取得]タブの下でスマートセットアップをクリックします。ウィンドウが開きます。リストから適切な蛍光団（現在のプロジェクトで、すなわち DAPIおよびAlexaフルーア555、）を選択します。色が自動的に選択されます。
- 最良の信号をクリックして、[適用し、設定された露出をクリックしました;その後、コンピュータは自動的に露光パラメータを設定します。
- 画像を最適化するために、チャンネル・ウィンドウに移動します。マーク解除トラック2は、トラック1を強調表示し、ライブをクリックしてください。必要に応じて画像の焦点を合わせます。
- Channelsウィンドウで次のキーを調整します。自動的にピンホールを最適化するために、1AUをクリックしてください。それ以外の場合は、共焦点画像を非最適になりますこの手順を実行することは非常に重要です。最高の強度（余分なノイズを低減するために800の下には、この設定を保持する）を持つようにゲインを調整します。最後に、2と3の間のデジタルゲインを設定します。
- マーク解除トラック1は、トラック2をクリックして、トラック2のためのステップ3.8を繰り返します。そして、ライブを停止します。
- 取得モードのウィンドウに移動します。フレームサイズを最適化し、平均化することによって、画像を改善します。フレームサイズは、X * Yに移動して、1,024×1024を選択変更するには。良好な画像を作成するために遅い速度を選択してください。
- アベレージに移動し、数≥4を選択します。この平均値はな生産するために平均化されるスキャンの数を示します取得した画像を電子。今スナップボタンをクリックして、キャプチャされた2D画像を保存します。
- 3Dイメージングの場合は、Z-Stack]ウィンドウを開くには、原因となるスマートセットアップ下のZスタック項目をマークします。
- セルの深さ、すなわち 、zスタックのための最初と最後の位置を設定します。初のライブをクリックしてください。その後、Zスタックが開始する組織でアストロサイトの最上位の位置に集中する顕微鏡のフォーカス駆動を使用しています。設定された最初のをクリックします。その後、Zスタックのスキャンを停止する必要がある組織内のアストロサイトの最も低い位置まで焦点を当てます。最後に設定をクリックします。そして、ライブを停止します。
- 間隔を選択します。 1.01μmのは、現在の研究で使用されています。間隔を選択するスライスの数を設定することが最適でクリックすることによって行うことができます。
- スタート実験をクリックします。スキャンが完了すると、画像を保存します。この画像は、以下のパラメータの測定に使用されます：アストロサイトの領土の表面積と体積、ブラジャーを含む全体のアストロサイトnches、細胞体および核。
- ステップ3.6から3.11に記載されているように10倍または20倍対物レンズを使用して二次元画像を取得します。この画像は、測定抗体の蛍光免疫反応性、及びアストロサイトの密度（個/1000μmで2）の強度のために使用することができます。
4.星状細胞密度およびGFAP +蛍光強度
- 20X 2D画像を開きます。画像ウィンドウの左側にヒスト（Hisogram）をクリックします。
- アストロサイトの密度を計算するために、20Xの対物レンズの下に三つの連続視野を選択します。フィールドに支店を重ね、最小で明確なソーマを示すアストロサイトの数をカウントします。
- 蛍光強度を定量化するために、画像ウィンドウのフッターに適切なツール（長方形や円）を選択し、測定のための領域を選択します。平均値と標準偏差は、画像の下に自動的に表示されます注意してください。 strの間の現在の研究では、0.7ミリメートル2矩形領域iatumと歯状回の内側ブレードを使用しました。
5.星状細胞の分岐
- 長さと分枝の総数を定量化するために、画像解析ソフトウェアで（20Xで取得）の3D画像を使用。選択されたアストロサイトの各枝の長さに沿って手動で線を引きます。そして、ラインの長さを測定するために特化された測定ツールを選択します。ブランチの数を定量化するために、マークされた項目の数をカウントするカウントツールを選択します。
6.ボリュームと表面積
注：3D画像解析ソフトウェアで手動で構造をマーキングは、フォーカスと訓練が必要です。実験を開始する前に、何回か練習。
- アストロサイトの核、相馬、細胞体と領土の体積と表面積を定量化するために、このようなVolocity 6.1のように3次元画像解析ソフトに（ステップ3.1から3.16で取得された）3D画像を転送します。
- ソフトウェアを開き、新しいを作成します図書館。新しいライブラリの左側の灰色の列にすべての画像をドラッグします。そして、1 3D画像を選択します。右側には、異なる色の異なるチャネルがあります。興味のある一つのチャネルをオンにします。例えば、DAPI用の青のチャンネルは、核を測定するとき。最適なコントラストを得るために、手動で明るさを変更します。
- [ツール]メニューを選択し、ボリュームを作成し、Zスタック画像の中から、単一の3D画像を生成するために行きます。 [編集]メニューの[プロパティ]をクリックし、Xは、Y、Zの性質が提示されていることを確認してください。それ以外の場合は、3次元解析を行うことは不可能です。
- ツールバーのフリーハンドRIOツールアイコンをクリックします。アストロサイトの核の体積と表面積を測定するには、DAPIで標識された核の周りに線を引きます。
- アストロサイトの細胞体の体積と表面積を測定するには、枝を除く相馬の周りに線を引きます。
- 全体アストロサイト（支店を含む細胞体）の体積および表面積を測定するには、次のソーマの周りに線を引きますすべての枝の表面。
- アストロサイトの領土の体積と表面積を評価するには、枝の先端との間に線を引きます。
注：押して、不要な図面を消去するには、キーボード上で削除します。 - 測定プロトコルを作成するために、画像ウィンドウの上部にある測定のメニューをクリックします。さまざまなツールを含むウィンドウが開きます。
- ドラッグすると、ウィンドウ（ウィンドウ枠）の一番上にオブジェクトを検索します。人口1に名前を付け、関連する色を選択し、メジャーをクリックしてください。別のウィンドウが開きます。
- パラメータすなわち 、ボリュームまたは表面積を選択してください。 [OK]をクリックします。データがテーブルに表示されます。
- 測定メニューのデータをクリックして保存し、測定項目を確認し選択します。
- 開いたウィンドウから呼び出された新しい測定項目を選択します。次に、データに名前を付け、[OK]をクリックします。
- 最後に、グラフパッドまたはプログラムをExcelなどの統計ソフトウェアにデータをエクスポートします。データを分析するためにt検定を使用し、2DグラムをプロットAPHS。
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Representative Results
このセクションでは、3次元形態計測分析によって生成定性的および定量的な観測のいくつかの例を紹介します。前述した全12パラメータの完全な結果を得るために、私たちの以前の出版物10を参照してください 。
定性的観察
アストロサイトは、Aβ1-40注射したラット（ 図1）で、通常の長さで細いまたは太い枝を示しました。短い枝といくつかの小さな星形のアストロサイトは、大脳皮質で観察された、とアストロサイトのコンパクトなネットワークは、脳梁に発生しました。
ゲニステイン処理することにより、Aβ1-40 -injectionと動物の脳組織におけるアストロサイトは短く、細い枝（ 図2）10で星状の形を示しました。いくつかの星状細胞は萎縮外観を示しました。
星状細胞の密度およびGFAP +蛍光強度
アストロサイトの平均数/千μm2では、Aβ1-40 -injectionの動物とゲニステインの治療群（P <0.0001）と比較して、Aβ1-40 -injectionとラットで有意に高かったです。また、GFAP +蛍光強度がゲニステインの治療で脳切片で有意に低かった無処理と比較して、Aβ1-40（ 図3）動物を注射しました。
アストロサイトのボリュームの形態計測分析
アストロサイトの核、細胞体、全体のアストロサイトとアストロサイトの領土の量は、未処置動物と比較してゲニステイン治療群で有意に減少しました。この結果は、ゲニステインがアミロイド（ - D図4A）の存在に起因するアストログリオーシスを改善することを示唆しています。
アストロサイトの図1の共焦点画像。太くて長い枝（矢印）を有する個々のアストロサイトおよびAβ1-40の海馬注射を施したラット脳におけるDAPI標識核（矢印）。 拡大版を表示するには、こちらをクリックしてくださいこの図の。
アストロサイトの2共焦点イメージ図。短い枝（矢印）とアストロサイトを。 Aβ1-40 -injection、および強制経口投与ゲニステイン前処理した海馬を施したラットの脳内。Pリースこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3. GFAP +蛍光強度は、β1-40と動物で有意に減少した- 。ゲニステイン前処理を受けた注射値は平均±SEMです。動物当たり五十アストロサイトが評価された。P <0.05を有意とみなした、とT検定を伴うまたは処理していないグループとの間でデータを比較した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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図4.平均分岐を含む核（A）、細胞体（B）、アストロサイト（の容積;の有無にかかわらず、Aβ1-40 -injectionに供したラットから採取した脳サンプル中の（C）、及び地域（D）ゲニステイン前処理。ゲニステインが大幅に（参考文献10を参照）核の拡大、細胞体、全体のアストロサイト、及びアストロサイトの領土を改善した。値は平均±SEMである。動物あたり五十アストロサイトを評価した。P <0.05は、有意であると見なされていましたそして、T検定は、治療前後のグループ間のデータを比較した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
現在のプロトコルでは、アストロサイトの形態と関連していた12異なるパラメータを評価するための3次元共焦点形態計測を用いました。この目的のために、Aβ1-40とラットの海馬組織-とまたは抗炎症剤としてのゲニステイン前処理なし誘発性アストログリオーシスは、使用されました。 3D画像と形態計測ソフトウェアを使用することにより、我々は、アストロサイトの形態、すなわちアストログリオーシスに対するゲニステインの影響を示すことができました。
脳組織の細胞内および細胞外環境の変化は、細胞/組織の容積および/またはサイズを変更することができます。これらの変化は、様々な脳損傷3,11に病理学的特徴と考えられています。これらの変化を定量化するために、多数の技術が使用されます。ほとんどの調査は唯一のCEのごく一部についての情報を与える光 - または電子顕微鏡（EM）によって捕獲2D低解像度の画像を使用することに基づいていますLL。この制限を克服するために、高解像度画像上の3次元共焦点形態計測は、11を開発しました。共焦点顕微鏡法の別の利点は、Zスタック画像が行われている間、いくつかの連続した2D画像が得られるので、セルのアーキテクチャを検討することができることです。また、3次元共焦点顕微鏡は、背景雑音11をフィルタリングすることによって 、画像の品質を改善する可能性を高めます。
ここに提示された方法は、時間がかかります。共焦点顕微鏡を用いて、Zスタック画像を撮影すると、各単セルのために数分かかります。また、手動でソフトウェアの構造をマークすると、いくつかの練習が必要であり、研究者は、構造が正しくマークされていることを確認するために、描画を数回やり直しする必要があるかもしれません。このようなVolocityとして3D画像解析ソフトの「マジック」タブは、自動的に単一の画像内のすべてのDAPI染色した核をマークするために使用できることを言及すべきです。このオプションは、ときに使用することができますアストロサイトは、培養されます。脳切片は、しかし、アストロサイトだけでなく、ミクログリアと神経細胞のような他の多くの細胞ではないだけが含まれています。これは、DAPI染色された核の多くはアストロサイトに属していないことを意味します。アストロサイトに関連付けられている核は手動DAPI標識核およびGFAP免疫反応性アストロサイトの両方を有する画像を使用してマークする必要があります。
このプロトコルでは、GFAPに対する抗体は、パラフィン切片における星状細胞を可視化するために使用しました。星状細胞はまた、他の抗原12,13、またはトランスジェニックマウスを用いて可視化することができます。研究者らは方法の限界を認識して、その目標に基づいて、可能な限り最高の実験デザインを使用する必要があります。 GFAPに対する抗体を用いての制限は、例えば、細胞骨格のわずか10〜15％を検出することができるということです。アストログリオーシスを研究する場合、この制限は、しかし、利点になることができます。アストロサイトの増加数となどでアストロサイト「枝の密集ネットワークtrogliosis細胞の大きな領域が検出された場合にそれが困難な単一細胞を同定するために行うことができます。このプロトコルは、12の異なるパラメータの定量化を説明するが、研究者は自分の目的に合ったものを選ぶことができますが。我々の経験によると、すべてのパラメータの測定値が大きく、特定の条件または処理によって影響されるパラメータに関する貴重な情報を与えることができます。共焦点顕微鏡で捕捉3D画像上で実行定量方法は、また、凍結切片上で行うことができます。問題は、これらのステップは、組織の収縮や腫れを引き起こす可能性があるため、同様の方法で試料（固定、脱水、包埋および切片）を処理することです。
結論として、3次元共焦点イメージングは、形態計測ソフトウェアとの組み合わせで、細胞の形態に関連するいくつかのパラメーターを定量化することができます。ここで提示されたプロトコルは、形態学的ちゃんの評価のために使用することができます別の病理学的状態、または介入戦略の効果として、セルに表示さGES。
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Disclosures
この作品は、オスターゴットラントの州議会、（スウェーデン）と医学のイラン大学の細胞および分子研究センター（テヘラン、イラン）からの助成金によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amyloid beta 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | Keep in -70 °C |
| Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | keep in -20 °C |
| polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein | DAKO | Z0334 | |
| alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies | DAKO | ||
| Liquid Permanent Chromogen | DAKO | K0640 | |
| Liquid permanent Red Substrate Buffer | DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | Polyethoxylated castor oil - Step 1.1 |
| LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
| Image Analysis 2000 | Tekno Optic | ||
| Streotaxic apparatus | Stoelting | ||
| Graph pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |
References
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