Abstract
मस्तिष्क में glial कोशिकाओं के रूप में, astrocytes के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में विविध कार्यात्मक भूमिका है। हानिकारक उत्तेजनाओं की उपस्थिति में, astrocytes उनके कार्यात्मक और संरचनात्मक गुणों, प्रतिक्रियाशील astrogliosis एक की हालत कहा संशोधित। इधर, astrocytes की रूपात्मक संपत्तियों के मूल्यांकन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है। इस प्रोटोकॉल शाखाओं की सतह क्षेत्र और एक अस्थिकणिका (अस्थिकणिका क्षेत्र) द्वारा कवर ऊतक, शाखाओं, सेल शरीर, और नाभिक सहित पूरे अस्थिकणिका, की मात्रा यानी 12 विभिन्न मापदंडों की मात्रा का ठहराव के साथ ही कुल लंबाई और नंबर शामिल हैं, तीव्रता अस्थिकणिका का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के प्रतिदीप्ति immunoreactivity, और अस्थिकणिका घनत्व (संख्या / 1000 माइक्रोन 2) के। Volocity 6.3 मापन के लिए इस्तेमाल किया गया था के रूप में इस प्रयोजन के लिए तीन आयामी (3 डी) कोंफोकल सूक्ष्म चित्र बनाया है, और 3 डी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर इस तरह के थे। Amyloid बीटा 1-40 के संपर्क में चूहे के मस्तिष्क के ऊतकों 1-40) विधि पेश करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। इस प्रोटोकॉल भी विवो में या इन विट्रो की स्थिति में या तो अन्य कोशिकाओं के 3 डी morphometric विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Introduction
स्वस्थ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में, astrocytes रक्त प्रवाह, ऊर्जा चयापचय, synaptic समारोह और plasticity, और बाह्य आयन के नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और न्यूरोट्रांसमीटर 1-3 homeostasis। इसके अलावा, astrocytes के विभिन्न हानिकारक उत्तेजनाओं और इस तरह के अतिवृद्धि, प्रसार और astrocytes 4,5 के कार्यात्मक remodeling के द्वारा होती है जो प्रतिक्रियाशील astrogliosis के माध्यम से आघात, संक्रमण, ischemia या neurodegeneration के रूप में असामान्य परिस्थितियों का जवाब।
रिएक्टिव astrogliosis उपचारात्मक उपायों के नैदानिक परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं, इसलिए, ऊतकों में सूजन प्रतिक्रिया और मरम्मत की प्रक्रिया इंजीनियर और कर सकते हैं। तदनुसार, astrocytes सीएनएस प्रभावित रोगों की एक किस्म के लिए उपचारात्मक उपायों के लिए संभावित ठिकानों के रूप में पिछले दशकों के दौरान न्यूरोसाइंटिस्ट से ध्यान प्राप्त हुआ है।
Astrocytes सामान्य रूप से अच्छी तरह-डी के साथ एक ताराकार आकार दिया हैसोमा 6 चारों ओर फैल गया है कि efined शाखाओं। मस्तिष्क में कोढ़ की हालत में, अस्थिकणिका शाखाओं जटिल हो जाते हैं और amyloid बीटा (Aβ) की उपस्थिति में, उदाहरण के लिए, सूजन समाप्त होता है 7 दिखा।
यह लेख confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा अधिग्रहीत astrocytes की 3 डी छवियों का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। प्रत्येक अस्थिकणिका के लिए बारह विभिन्न मात्रात्मक मापदंडों मापा गया: सतह क्षेत्रों और अस्थिकणिका क्षेत्र (एक अस्थिकणिका द्वारा कवर ऊतक), (शाखाओं सहित) पूरे सेल, सेल शरीर, और नाभिक की मात्रा; कुल लंबाई और शाखाओं की संख्या; अस्थिकणिका का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के प्रतिदीप्ति तीव्रता; और astrocytes का घनत्व (संख्या / 1000 माइक्रोन 2)। इस प्रयोजन के लिए, हम साथ या एक विरोधी भड़काऊ पदार्थ के रूप में genistein इलाज के बिना Aβ 1-40 के इंजेक्शन intrahippocampal के संपर्क में चूहों से मस्तिष्क वर्गों का इस्तेमाल किया। वर्णित प्रोटोकॉल morphometric एक के लिए इस्तेमाल किया जा सकताइन विट्रो में या अलग अलग परिस्थितियों में विवो में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं alysis।
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Protocol
इस अध्ययन मेडिकल साइंसेज ईरान विश्वविद्यालय की नीति समिति (तेहरान, ईरान) द्वारा अनुमोदित की देखभाल और प्रयोगशाला पशु का प्रयोग (एनआईएच) के लिए गाइड में निर्धारित नीतियों के अनुसार बाहर किया गया था।
1. पशु, सर्जरी और नमूना तैयारी
नोट: 3 डी कोंफोकल सूक्ष्म विश्लेषण के लिए मस्तिष्क के ऊतकों को तैयार है।
- दो समूहों में बेतरतीब ढंग से फूट डालो जानवर: Aβ 1-40 इंजेक्शन (एन = 8), और genistein उपचार के साथ Aβ 1-40 इंजेक्शन (एन = 8); सर्जरी से पहले gavage 1 घंटा से genistein (जैसे polyethoxylated अरंडी के तेल के रूप में एक वाहन में पतला 10 मिलीग्राम / किग्रा) प्रशासन।
- Ketamine (100 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ पशुओं anesthetize। पैर की अंगुली बन्द रखो के बाद वापसी पलटा के अभाव के कारण उचित संज्ञाहरण की पुष्टि करें। सूखापन को रोकने के लिए सर्जरी के दौरान आंखों पर मरहम का प्रयोग करें।
- Stereotaxic तंत्र और दाढ़ी सिर में जानवरों की जगह। IOD लागू करेंine समाधान चीरा पहले खोपड़ी को साफ और संक्रमण का खतरा कम करने के लिए सर्जरी के दौरान बाँझ आपरेशन साइट रखने के लिए। चूहे के मस्तिष्क एटलस 8 के अनुसार, शीर्षस्थान के लिए -3.5 पीछे मिमी, midline के लिए ± 2 मिमी पार्श्व, और ड्यूरा नीचे -2.8 मिमी पर हिप्पोकैम्पस में Aβ 1-40 stereotaxically (4 μl) इंजेक्षन। Stereotaxic विधि के लिए पिछले प्रकाशन 9 देखें।
- पशु पशु की सुविधा सुनिश्चित करने के लिए पूरी तरह से सचेत कर रहे हैं जब तक पोस्ट ऑपरेटिव अवलोकन / देखभाल प्रदान करें। वसूली के दौरान गर्म पशुओं को रखने के लिए, और पूरी वसूली तक अन्य जानवरों के साथ एक पिंजरे में उन्हें वापस नहीं है। सर्जरी के बाद पशुओं में संक्रमण का कोई संकेत पर ध्यान दे।
- तीन सप्ताह के बाद सर्जरी ketamine (150 मिलीग्राम / किग्रा) ने गहरा जानवरों anesthetize। 0.1 एम पीबीएस (पीएच = 7.4) में 4% paraformaldehyde द्वारा पीछा 0.9% खारा के साथ जानवरों perfusing द्वारा transcardial निर्धारण करते हैं, तो निकालें और 10 में वर्णित के रूप में <मस्तिष्क को ठीक/ Sup>।
- 4 सी में 2-3 दिनों के लिए 4% paraformaldehyde में दिमाग पोस्ट-ठीक।
- ऊतक embedding उपकरणों के उपयोग द्वारा आयल ब्लॉकों में ऊतक एम्बेड करें, और यह सही संरेखण या सेक्शनिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के बाद से भरने के तहत या अधिक भरने कैसेट से बचें। पैराफिन ब्लॉक में ऊतक के उन्मुखीकरण पर ध्यान दे।
नोट: चूहे हिप्पोकैम्पस, उदाहरण के लिए, मस्तिष्क गोलार्द्ध के पीछे भाग के करीब है। इस प्रकार, ऊतक एक तरह से एम्बेडेड होना चाहिए मस्तिष्क के पीछे भाग पर सेक्शनिंग शुरू होता है। वांछित शारीरिक संरचना तक पहुँचने के लिए एक गाइड के रूप में Paxinos एटलस 8 का प्रयोग करें। - हवा आंदोलनों कठिन वर्गों की हैंडलिंग बनाने के बाद से दूर हवा ड्राफ्ट या दरवाजे से microtome रखें।
- इस गहराई आवश्यक हो साथ के रूप में पूरा astrocytes की जेड ढेर छवियों का उत्पादन करने के लिए एक मोटाई ≥20 माइक्रोन के साथ वर्गों का प्रयोग करें। वे अवांछित मोटाई हो सकता है के रूप में होने के कारण थर्मल ई करने के लिए, पहली जोड़ी वर्गों का प्रयोग न करेंXpansion।
- (5 ± 2 सी, आयल के लिए पिघलने तापमान नीचे) अभी काफी लंबा वर्गों समतल करने के लिए गर्म पानी की सतह पर वर्गों रखें।
नोट: खंड के विस्तार संरचना की आकृति विज्ञान परेशान कर सकते हैं ओवर। ध्यान से वर्गों स्थानांतरण करने के लिए छोटे तूलिका का प्रयोग करें। प्रत्येक स्लाइड पर 2-3 वर्गों लीजिए। - स्टोर एक ईमानदार स्थिति में एक रैक में स्लाइड और कई घंटे या हे / N के लिए 37 सी पर उन्हें सूखी।
2. Immunohistochemistry
- Deparaffinize xylene में वर्गों, 2 एक्स 10 मिनट, और शराब ढाल के माध्यम से (99.8%, 95%, और 70%, 10 मिनट प्रत्येक) और पीबीएस rehydrate।
- 0.25% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए), 0.25% ट्राइटन X-100 और 3.5% सामान्य सीरम (4 सेल्सियस पर हे / एन) युक्त पीबीएस में 1,500: glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ सेते हैं 1 पतला।
- 3 एक्स 5 मिनट के लिए पीबीएस में वर्गों धो लें।
- माध्यमिक क्षारीय फॉस्फेट संयुग्मित antibodie साथ सेते1 के लिए एस (1: पीबीएस में पतला 100, 21 सी,)।
- 3 एक्स 5 मिनट के लिए पीबीएस में वर्गों धो लें।
नोट: यह पृष्ठभूमि धुंधला कम करने के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के बाद ठीक से वर्गों को धोने के लिए महत्वपूर्ण है। - तरल स्थायी लाल Chromogen (15-20 मिनट) के साथ अंधेरे में वर्गों सेते हैं। नोट: उपयोग करने से पहले कोई अधिक से अधिक 30 मिनट के समाधान तैयार है।
- 3 एक्स 5 मिनट के लिए पीबीएस में वर्गों धो लें।
- अंत में, 4-6-diamidino-2-phenylindole साथ नाभिक दाग (DAPI; 1: पीबीएस में पतला 500) से पहले कवर फिसल करने के लिए। माइक्रोस्कोपी से पहले फ्रिज 24-48 घंटे में स्लाइड्स स्टोर।
3. confocal माइक्रोस्कोपी
नोट: मात्रात्मक मूल्यांकन (देखें नीचे) के लिए, त्रुटियों के जोखिम को कम करने के लिए शाखाओं ओवरलैपिंग की एक न्यूनतम के साथ एक स्पष्ट रूप से दिखाई DAPI से सना हुआ नाभिक के साथ एक अस्थिकणिका का चयन करें। जेड ढेर छवियों का निर्माण समय लगता है। धीरज रखो और प्रसंस्करण के दौरान रोक नहीं है। ईमानदार लेजर confocal खुर्दबीन स्कैनिंग यू हैastrocytes से 3 डी चित्र बनाने के लिए sed।
- माइक्रोस्कोप-मंच पर स्लाइड रखो, और 63x उद्देश्य का चयन करें।
- इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें और शुरू प्रणाली पर क्लिक करें। पता लगाएँ टैब पर क्लिक करें। निरुपित करने के लिए जाओ, और उचित प्रकाश को समायोजित करने GFP का चयन करें।
- प्रकाश को प्रतिबिंबित करने के लिए शटर खुला। शटर के दाईं ओर परावर्तक रिवॉल्वर का पता लगाएं, और astrocytes (हरे, लाल या बैंगनी) द्वारा परिलक्षित होना चाहिए कि रंग का चयन करें; (FSet20 WF) लाल रंग का यहां इस्तेमाल किया गया था।
नोट: माइक्रोस्कोप की आंख में सीधे चित्र ध्यान केंद्रित करने के लिए मत भूलना। - सबसे अच्छा ध्यान लगाने के लिए, सभी बंद पर क्लिक करें स्क्रीन मोड में माइक्रोस्कोप पिन डाल दिया, और अधिग्रहण टैब पर क्लिक करें।
- अधिग्रहण टैब के तहत स्मार्ट सेटअप पर क्लिक करें; एक विंडो खुलती है। सूची में से (वर्तमान परियोजना में यानी DAPI और एलेक्सा स्त्राव 555) उचित fluorophore का चयन करें। रंग स्वचालित रूप से चयन किया जाता है।
- सबसे अच्छा संकेत पर क्लिक करें और लागू करें, तो सेट एक्सपोजर पर क्लिक करें; कंप्यूटर तो स्वचालित रूप से जोखिम के मापदंडों की स्थापना की जाएगी।
- छवि का अनुकूलन के लिए, चैनल खिड़की के पास जाओ। अचिह्नित Track2, track1 पर प्रकाश डाला और लाइव पर क्लिक करें। यदि आवश्यक हो तो छवि को ध्यान।
- चैनल विंडो में निम्न कुंजियाँ समायोजित; स्वचालित रूप से पिनहोल अनुकूलन करने के लिए 1AU पर क्लिक करें। यह अन्यथा confocal छवियों गैर इष्टतम हो जाएगा इस कदम करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। सबसे अच्छा तीव्रता (अतिरिक्त शोर को कम करने के लिए 800 से नीचे इस सेटिंग रखने) के लिए लाभ को समायोजित। अंत में, 2 और 3 के बीच डिजिटल लाभ सेट।
- अचिह्नित track1, Track2 पर क्लिक करें और Track2 के लिए 3.8 चरण दोहराएँ। उसके बाद Live बंद करो।
- अधिग्रहण मोड खिड़की के पास जाओ। फ्रेम आकार के अनुकूलन और औसत से छवि सुधारें। बदलने के क्रम में फ्रेम का आकार एक्स * Y के लिए जाने के लिए और एक्स 1024 1024 का चयन करें। एक बेहतर छवि बनाने के लिए एक धीमी गति का चयन।
- औसत का करने के लिए जाओ और एक नंबर ≥4 का चयन करें। यह औसत मूल्य उत्पादन करने के लिए औसतन किया जाएगा कि स्कैन की संख्या को इंगित करता हैअधिग्रहीत छवि ई। अब स्नैप बटन पर क्लिक करें, और कब्जा कर लिया 2 डी छवि बचाने के लिए।
- 3 डी इमेजिंग के लिए, Z ढेर खिड़की खोलने के लिए पैदा स्मार्ट सेटअप के अंतर्गत Z ढेर आइटम निशान।
- सेल की गहराई यानी, जेड ढेर के लिए पहली और आखिरी पदों पर सेट करें। पहला लाइव पर क्लिक करें। तब Z ढेर शुरू करने के लिए है, जहां के ऊतकों में अस्थिकणिका के ऊपरवाला स्थिति पर ध्यान केंद्रित करने के लिए माइक्रोस्कोप का ध्यान केंद्रित ड्राइव का उपयोग करें। सेट पहली पर क्लिक करें। तब Z ढेर स्कैनिंग बंद कर दिया जाना चाहिए जहां ऊतक में अस्थिकणिका की न्यूनतम स्थिति के लिए नीचे ध्यान केंद्रित। सेट अंतिम पर क्लिक करें। उसके बाद Live बंद करो।
- अंतराल चुनें; 1.01 माइक्रोन वर्तमान अध्ययन में प्रयोग किया जाता है; चुनने के अंतराल स्लाइस की संख्या निर्धारित करने के लिए इष्टतम पर क्लिक करके किया जा सकता है।
- प्रारंभ प्रयोग पर क्लिक करें। स्कैन पूरा हो गया है एक बार छवियों को बचाओ। सतह क्षेत्र और अस्थिकणिका के इलाके की मात्रा, पूरे अस्थिकणिका सहित ब्रा: यह छवि निम्नलिखित मानकों की माप के लिए इस्तेमाल किया जाएगाnches, सेल शरीर, और नाभिक।
- कदम 3.6-3.11 में वर्णित के रूप में एक 10x या 20x उद्देश्य का उपयोग एक 2 डी छवि मोल। इस छवि को माप के लिए एंटीबॉडी के प्रतिदीप्ति immunoreactivity, और अस्थिकणिका घनत्व (संख्या / 1000 माइक्रोन 2) की तीव्रता का इस्तेमाल किया जा सकता है।
4. अस्थिकणिका घनत्व और GFAP + प्रतिदीप्ति तीव्रता
- 20X 2 डी छवि खोलें। छवि खिड़की के बाईं ओर histo (Hisogram) पर क्लिक करें।
- अस्थिकणिका घनत्व की गणना करने के लिए, 20X उद्देश्य के तहत लगातार तीन दृश्य क्षेत्रों का चयन करें। खेतों में शाखाओं ओवरलैपिंग, न्यूनतम के साथ एक स्पष्ट सोमा कि प्रदर्शन astrocytes की संख्या की गणना।
- प्रतिदीप्ति तीव्रता यों, छवि खिड़की के पाद लेख पर एक उचित उपकरण (आयत या वृत्त) का चयन करें, और माप के लिए एक क्षेत्र का चयन करें। मतलब मूल्य और मानक विचलन छवि के तहत स्वचालित रूप से दिखाई ध्यान दें। एसटीआर के बीच वर्तमान अध्ययन में, एक 0.7 मिमी 2 आयताकार क्षेत्रiatum और दांतेदार गाइरस के औसत दर्जे का ब्लेड का इस्तेमाल किया गया था।
5. अस्थिकणिका शाखाओं
- शाखाओं की लंबाई और कुल संख्या यों, छवि का विश्लेषण सॉफ्टवेयर में (20X साथ अधिग्रहीत) 3 डी छवियों का उपयोग करें। चयनित अस्थिकणिका की प्रत्येक शाखा की लंबाई के साथ स्वयं एक लाइन ड्रा। फिर लाइन की लंबाई मापने के लिए विशेष है कि माप-उपकरण का चयन करें। शाखाओं की संख्या यों करने के लिए, चिह्नित आइटम की संख्या गिनती गिनती उपकरण का चयन करें।
6. मात्रा और सतह क्षेत्र
नोट: 3 डी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में स्वयं एक संरचना चिह्नित ध्यान और प्रशिक्षण की आवश्यकता है। एक प्रयोग शुरू करने से पहले कई बार अभ्यास करें।
- अस्थिकणिका नाभिक, सोमा, सेल शरीर और क्षेत्र की मात्रा और सतह क्षेत्र यों, ऐसे Volocity 6.1 के रूप में एक 3 डी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए (कदम 3.1-3.16 में अधिग्रहीत) 3 डी छवियों को स्थानांतरित।
- सॉफ्टवेयर खोलें और एक नया बनानेपुस्तकालय। नए पुस्तकालय में छोड़ दिया ग्रे स्तंभ के लिए सभी छवियों खींचें। फिर, एक 3 डी छवि का चयन करें। सही पर, अलग अलग रंग के साथ अलग अलग चैनल हैं। ब्याज के एक चैनल पर बारी; उदाहरण के लिए DAPI के लिए नीले चैनल नाभिक जब मापने। एक इष्टतम विपरीत पाने के लिए मैन्युअल चमक बदलें।
- उपकरण मेनू का चयन करें, मात्रा बनाने और जेड ढेर छवियों के बाहर एक भी 3 डी छवि का निर्माण करने के लिए जाना। संपादन मेनू में गुण पर क्लिक करें और एक्स, वाई और जेड गुण प्रस्तुत कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित हो; अन्यथा यह 3 डी विश्लेषण से बाहर ले जाने के लिए असंभव है।
- टूलबार में मुक्तहस्त रियो उपकरण आइकन पर क्लिक करें। अस्थिकणिका नाभिक की मात्रा और सतह क्षेत्र को मापने के लिए DAPI लेबल नाभिक के चारों ओर एक रेखा खींचना।
- अस्थिकणिका सेल शरीर की मात्रा और सतह क्षेत्र को मापने के लिए शाखाओं को छोड़कर सोमा के चारों ओर एक रेखा खींचना।
- पूरे अस्थिकणिका (शाखाओं सहित सेल शरीर) की मात्रा और सतह क्षेत्र को मापने के लिए निम्न सोमा के चारों ओर एक रेखा खींचनासभी शाखाओं की सतह।
- अस्थिकणिका के इलाके की मात्रा और सतह क्षेत्र का आकलन करने के लिए शाखाओं के सुझावों के बीच एक रेखा खींचना।
नोट: प्रेस अवांछित चित्र को मिटा करने के लिए कीबोर्ड पर हटाएँ। - एक माप प्रोटोकॉल बनाने के लिए छवि विंडो के शीर्ष पर माप मेनू पर क्लिक करें; विभिन्न उपकरणों से युक्त एक विंडो खुलती है।
- खींचें खिड़की (फलक) के शीर्ष करने के लिए वस्तुओं का पता लगाएं। , जनसंख्या 1 के लिए एक वर्णनात्मक नाम दें जुड़े रंग का चयन करें, और उपाय पर क्लिक करें। एक और विंडो खुलती है।
- एक पैरामीटर यानी, मात्रा या सतह क्षेत्र का चयन करें। ठीक पर क्लिक करें। डेटा एक तालिका में दिखाई देगा।
- मापन मेनू पर डेटा क्लिक बचाने के लिए और मापन मद बनाओ का चयन करें।
- खोला खिड़की से नामक एक नई माप आइटम का चयन करें। फिर डेटा को एक नाम देने के लिए और ठीक पर क्लिक करें।
- अंत में, इस तरह के ग्राफ़ पैड के रूप में आँकड़े सॉफ्टवेयर में डेटा निर्यात या कार्यक्रम उत्कृष्टता। डेटा का विश्लेषण करने के लिए टी परीक्षण का प्रयोग करें, तो 2 डी जीआर साजिशaphs।
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Representative Results
यह खंड 3 डी morphometric विश्लेषण द्वारा उत्पादित गुणात्मक और मात्रात्मक टिप्पणियों के कुछ उदाहरण प्रस्तुत करता है। जैसा कि पहले उल्लेख सभी 12 मापदंडों का पूरा परिणामों के लिए, हमारे पिछले प्रकाशन 10 देखें।
गुणात्मक टिप्पणियों
Astrocytes Aβ 1-40 इंजेक्ट चूहों (चित्रा 1) में लंबे समय आमतौर पर थे कि पतली या मोटी शाखाओं का प्रदर्शन किया। लघु शाखाओं के साथ एक छोटे से कुछ ताराकार के आकार का astrocytes सेरेब्रल कॉर्टेक्स में मनाया गया, और astrocytes की एक कॉम्पैक्ट नेटवर्क महासंयोजिका में हुई।
Genistein उपचार के बाद Aβ 1-40 इंजेक्शन के साथ पशुओं के मस्तिष्क के ऊतकों में astrocytes (चित्रा 2) 10 छोटी और पतली शाखाओं के साथ एक ताराकार प्रपत्र का प्रदर्शन किया। कुछ astrocytes एक एट्रोफिक उपस्थिति देखी गई।
अस्थिकणिका घनत्व और GFAP +प्रतिदीप्ति तीव्रता
astrocytes का मतलब संख्या / 1000 माइक्रोन 2 Aβ 1-40 इंजेक्शन में जानवरों और genistein इलाज के समूह (पी <0.0001) के साथ तुलना में Aβ 1-40 इंजेक्शन के साथ चूहों में काफी अधिक था। इसके अलावा, GFAP + प्रतिदीप्ति तीव्रता जानवरों (चित्रा 3) गैर इलाज Aβ 1-40 के साथ तुलना में genistein उपचार के साथ मस्तिष्क खंड में काफी कम इंजेक्ट किया गया था।
Astrocytes खंड के morphometric विश्लेषण
अस्थिकणिका नाभिक, सेल शरीर, पूरे अस्थिकणिका और अस्थिकणिका के इलाके की मात्रा इलाज जानवरों के साथ तुलना genistein इलाज के समूह में काफी कमी आई है। यह परिणाम genistein एमीलोयड की उपस्थिति (- डी चित्रा -4 ए) की वजह से astrogliosis ameliorated कि पता चलता है।
एक अस्थिकणिका की चित्रा 1. Confocal छवि। Aβ 1-40 के हिप्पोकैम्पस इंजेक्शन के अधीन एक चूहे के मस्तिष्क में मोटी और लंबी शाखाओं (नोक) और DAPI लेबल नाभिक (तीर) के साथ एक व्यक्ति अस्थिकणिका। एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह आंकड़ा की।
एक अस्थिकणिका 2. Confocal छवि चित्रा। लघु शाखाओं (नोक) के साथ एक अस्थिकणिका। Aβ 1-40 इंजेक्शन, और gavage द्वारा प्रशासित genistein पूर्व उपचार हिप्पोकैम्पस के अधीन एक चूहे के मस्तिष्क में। पी पट्टे यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. GFAP + प्रतिदीप्ति तीव्रता एक β 1-40 के साथ पशुओं में काफी कमी आई है -। Genistein पूर्व उपचार प्राप्त किया है कि इंजेक्शन मूल्यों मतलब ± SEM हैं। पशु प्रति पचास astrocytes 0.05 महत्वपूर्ण माना जाता था <पी। का मूल्यांकन किया गया है, और टी परीक्षण के साथ या बिना इलाज के समूहों के बीच डेटा की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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चित्रा 4. मतलब शाखाओं सहित नाभिक (ए), सेल शरीर (बी), अस्थिकणिका (की मात्रा, के साथ या बिना, Aβ 1-40 इंजेक्शन के अधीन चूहों से लिया मस्तिष्क नमूनों में (सी), और क्षेत्र (डी) genistein पूर्व उपचार। Genistein काफी नाभिक, सेल शरीर, पूरे अस्थिकणिका, और अस्थिकणिका क्षेत्र (Ref 10 देखें)। मान पशु प्रति ± सेम। पचास astrocytes मूल्यांकन किया गया, मतलब हैं। पी <0.05 की वृद्धि ameliorated महत्वपूर्ण माना जाता था और टी परीक्षण से पहले और बाद में इलाज समूहों के बीच डेटा की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम अस्थिकणिका आकृति विज्ञान के साथ जुड़े थे कि 12 विभिन्न मापदंडों का मूल्यांकन करने के लिए 3 डी कोंफोकल morphometry कार्यरत हैं। इस प्रयोजन के लिए, Aβ 1-40 साथ चूहों के हिप्पोकैम्पस ऊतक - साथ या एक विरोधी भड़काऊ एजेंट के रूप में genistein pretreatment के बिना प्रेरित astrogliosis, इस्तेमाल किया गया। 3 डी छवियों और morphometric सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, हम astrocytes की आकृति विज्ञान यानी astrogliosis पर genistein के प्रभाव को दिखाने के लिए सक्षम थे।
मस्तिष्क के ऊतकों के अंतर और अतिरिक्त सेलुलर पर्यावरण में परिवर्तन कोशिकाओं / ऊतक की मात्रा और / या आकार बदल सकते हैं। ये परिवर्तन विभिन्न मस्तिष्क की चोटों 3,11 में रोग पहचान माना जाता है। इन परिवर्तनों यों के क्रम में, तकनीकों का एक नंबर का इस्तेमाल कर रहे हैं। अधिकांश जांच केवल सीई का एक छोटा सा अंश के बारे में जानकारी देना है कि प्रकाश या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) ने कब्जा कर लिया 2D कम संकल्प छवियों का उपयोग कर रहे हैं पर आधारितकरूँगा। इस सीमा को पार करने के लिए, उच्च संकल्प छवियों पर 3 डी कोंफोकल morphometry 11 विकसित किया गया था। Confocal माइक्रोस्कोपी का एक और लाभ Z ढेर इमेजिंग किया जाता है, जबकि कई लगातार 2 डी छवियों प्राप्त कर रहे हैं के बाद से एक सेल की स्थापत्य कला का अध्ययन किया जा सकता है। इसके अलावा, 3 डी confocal माइक्रोस्कोपी पृष्ठभूमि शोर 11 छान कर छवियों की गुणवत्ता में सुधार करने की संभावना को जन्म देती है।
यहाँ प्रस्तुत विधि समय लेने वाली है; एक confocal खुर्दबीन के साथ जेड ढेर छवियों लेने के प्रत्येक एकल कक्ष के लिए कई मिनट लगते हैं। इसके अलावा, मैन्युअल सॉफ्टवेयर में एक संरचना अंकन कुछ अभ्यास की आवश्यकता है, और शोधकर्ता संरचना को सही ढंग से चिह्नित किया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए ड्राइंग कई बार फिर से करना पड़ सकता है। यह ऐसी Volocity रूप में 3 डी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में 'मैजिक' टैब, स्वचालित रूप से एक ही छवि में सभी DAPI से सना हुआ नाभिक चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि उल्लेख किया जाना चाहिए। यह विकल्प जब इस्तेमाल किया जा सकताastrocytes सुसंस्कृत हैं। मस्तिष्क वर्गों, तथापि, astrocytes बल्कि ऐसी microglia और न्यूरॉन्स के रूप में कई अन्य कोशिकाओं को न केवल होते हैं। इस DAPI से सना हुआ नाभिक के कई astrocytes का सदस्य नहीं है कि इसका मतलब है। astrocytes के साथ जुड़े नाभिक मैन्युअल DAPI लेबल नाभिक और GFAP-immunoreactive astrocytes दोनों होने छवियों का उपयोग कर चिह्नित किया जाना चाहिए।
इस प्रोटोकॉल में, GFAP के खिलाफ एंटीबॉडी आयल वर्गों में astrocytes कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया। Astrocytes भी अन्य एंटीजन 12,13, या ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके देखे जा सकते हैं। जांचकर्ताओं तरीकों की सीमाओं के बारे में पता होना चाहिए, और अपने उद्देश्य के आधार पर सर्वोत्तम संभव प्रयोगात्मक डिजाइन का उपयोग करना चाहिए। GFAP के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग की सीमा है, उदाहरण के लिए, cytoskeleton के केवल 10-15% से पता लगाया जा सकता है। Astrogliosis का अध्ययन करते समय यह सीमा है, तथापि, एक फायदा हो सकता है; astrocytes की संख्या में वृद्धि के रूप में और में astrocytes 'शाखाओं के एक घने नेटवर्कtrogliosis सेल के एक बड़े क्षेत्र का पता लगाया जाता है, तो यह मुश्किल एक एकल कोशिका की पहचान करने के लिए कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल हालांकि 12 विभिन्न मापदंडों की मात्रा का ठहराव का वर्णन लेकिन अन्वेषक अपने उद्देश्य के अनुरूप है कि लोगों का चयन कर सकते हैं। हमारे अनुभव के अनुसार, सभी मापदंडों के मापन के लिए काफी एक निश्चित स्थिति में या एक उपचार से प्रभावित हैं कि मापदंडों के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी दे सकते हैं। confocal खुर्दबीन में कब्जा 3 डी चित्रों पर प्रदर्शन मात्रा का ठहराव विधि भी जमे हुए वर्गों पर प्रदर्शन किया जा सकता है। इन चरणों के ऊतकों की सिकुड़न या सूजन पैदा कर सकते हैं, क्योंकि इस मुद्दे को एक समान तरीके से नमूने (निर्धारण, निर्जलीकरण, embedding और सेक्शनिंग) के इलाज के लिए है।
अंत में, 3 डी confocal इमेजिंग, morphometric सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन में, यह संभव है एक सेल की आकृति विज्ञान से जुड़े कई मापदंडों यों के लिए बनाता है। हम यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल रूपात्मक चान के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकताविभिन्न रोग की स्थिति में, या एक हस्तक्षेप रणनीति के प्रभाव के रूप में, एक सेल में दिखाई देते हैं कि GES।
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Disclosures
इस काम के मेडिकल साइंसेज ईरान विश्वविद्यालय (तेहरान, ईरान) में ऑस्टरगोटलैंड की काउंटी परिषद, (स्वीडन) और सेलुलर और आण्विक अनुसंधान केन्द्र से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amyloid beta 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | Keep in -70 °C |
| Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | keep in -20 °C |
| polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein | DAKO | Z0334 | |
| alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies | DAKO | ||
| Liquid Permanent Chromogen | DAKO | K0640 | |
| Liquid permanent Red Substrate Buffer | DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | Polyethoxylated castor oil - Step 1.1 |
| LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
| Image Analysis 2000 | Tekno Optic | ||
| Streotaxic apparatus | Stoelting | ||
| Graph pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |
References
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