Abstract
Som glialceller i hjernen, astrocytter har forskjellige funksjonelle roller i sentralnervesystemet. I nærvær av skadelige stimuli, astrocytter endre deres funksjonelle og strukturelle egenskaper, en tilstand som kalles reaktiv astrogliosis. Her er en protokoll for vurdering av de morfologiske egenskaper av astrocytter presenteres. Denne protokollen innbefatter kvantifisering av 12 forskjellige parametere dvs. overflatearealet og volumet av vev som dekkes av en astrocytt (astrocytt territorium), hele astrocytt inkludert grener, cellelegemet, og kjernen, samt den totale lengde og antall grener, intensiteten av fluorescens immunreaktiviteten av antistoffer som brukes for astrocytt deteksjon, og astrocytt tetthet (antall / 1000 mikrometer 2). For dette formål er tre-dimensjonale (3D) konfokale mikroskopiske bilder ble laget, og 3D-bildeanalyse-programvare som Volocity 6,3 ble brukt for målinger. Rottehjernevevet eksponeres for amyloid beta 1-40 1-40) med eller uten en terapeutisk intervensjon ble anvendt for å presentere metoden. Denne protokollen kan også benyttes for 3D morfometrisk analyse av andre celler fra enten in vivo eller in vitro betingelser.
Introduction
Hos friske sentralnervesystemet (CNS), astrocytter spiller en viktig rolle i reguleringen av blodstrøm, energimetabolisme, synaptisk funksjon og plastisitet, og ekstracellulær ion og nevrotransmitter homeostase 1-3. I tillegg, astrocytter svare på forskjellige skadelige stimuli og unormale tilstander som traumer, infeksjoner, ischemi eller nevrodegenerasjon via reaktive astrogliosis som er karakterisert ved hypertrofi, proliferasjon og funksjonell ombygging av astrocytter 4,5.
Reaktiv astrogliosis kan ingeniør den inflammatoriske respons og reparasjonsprosessen i vev og kan derfor påvirke det kliniske resultatet av terapeutiske intervensjoner. Følgelig har astrocytter fått oppmerksomhet fra hjerneforsker i løpet av de siste tiårene som potensielle mål for terapi for en rekke sykdommer som påvirker sentralnervesystemet.
Astrocytter har normalt en stel form med godt defined grener som sprer rundt soma 6. I en sykelig tilstand i hjernen, astrocyttkulturer grener blitt korrugert og viser hoven ender 7, for eksempel i nærvær av amyloid-beta (Ap).
Denne artikkelen presenterer en protokoll for å analysere 3D-bilder av astrocytter kjøpt av konfokalmikroskopi. Tolv ulike kvantitative parametre for hver astrocyte ble målt: de flater og volumer av astrocyte territorium (vevet dekket av en astrocyte), hele cellen (herunder filialer), cellekroppen, og kjernen; den totale lengden og antallet grener; fluorescensintensiteten av antistoffer som brukes for astrocytt deteksjon; og tettheten av astrocytter (antall / 1000 mikrometer 2). For dette formål, har vi brukt hjerneseksjoner fra rotter eksponert for intrahippocampal injeksjon av Ap 1-40 med eller uten genistein behandling som et anti-inflammatorisk substans. Den beskrevne protokoll kan benyttes for et morfometriskalysis av ulike celletyper in vitro eller in vivo i forskjellige forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble utført i samsvar med de retningslinjer som er fastsatt i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (NIH) er godkjent av Ethic Committee of Iran University of Medical Sciences (Teheran, Iran).
1. Dyr, kirurgi og Prøve Forberedelser
MERK: Forbered hjernevev for 3D confocal mikroskopisk analyse.
- Fordel dyr tilfeldig i to grupper: Ap 1-40 -injection (n = 8), og Ap 1-40 -injection med genistein behandling (n = 8); administrere genistein (10 mg / kg fortynnet i en bærer slik som polyetoksylert ricinusolje) ved gavage en time før kirurgi.
- Bedøve dyrene med ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg). Bekreft skikkelig anestesi ved mangel på uttak refleks etter klyping tå. Bruk salve på øynene under operasjonen for å hindre tørrhet.
- Plassere dyr i stereotaxic apparater og barbere hodet. Påfør iodine løsningen for å rense hodebunnen før såret og holde operasjonsområdet sterile under operasjonen for å redusere risikoen for infeksjon. Injisere Ap 1-40 stereotaksikalt (4 pl) i hippocampus på -3,5 mm posteriort for bregma, ± 2 mm lateralt for midtlinjen, og -2.8 mm under dura, ifølge rottehjerne atlas 8. For stereotaksisk metoden kan du se forrige publisering 9.
- Gi postoperativ observasjon / omsorg inntil dyrene er helt bevisst for å sikre komfort av dyrene. Hold dyrene varm under utvinning, og ikke returnere dem til et bur med andre dyr før full gjenoppretting. Vær oppmerksom på eventuelle tegn på infeksjon i dyrene etter operasjonen.
- Bedøve dyrene dypt med ketamin (150 mg / kg) i tre uker etter operasjonen. Utfør transcardial fiksering av perfusert dyrene med 0,9% saltvann etterfulgt av 4% paraformaldehyde i 0,1 M PBS (pH = 7,4), og ta ut og fikse hjernen som beskrevet i 10 </ sup>.
- Post-fikse hjernen i 4% paraformaldehyde i 2-3 dager ved 4 ˚C.
- Bygge inn vevet i parafinblokker ved å bruke vev innstøping utstyr, og unngår under-over-fylling eller fylling av kassetten, siden det kan forstyrre korrekt justering eller snitting. Ta hensyn til orientering av vev i parafinblokken.
MERK: rotte hippocampus, for eksempel i nærheten av bakre del av hjernehalvdel. Således bør være innleiret vev på en måte som seksjonering starter på bakre del av hjernen. Bruk Paxinos atlas 8 som en veiledning for å nå den ønskede anatomisk struktur. - Plasseres mikro- bort fra luft utkast eller døråpninger siden luftbevegelser gjør håndteringen av seksjoner vanskelige.
- Bruk seksjoner med en tykkelse ≥20 mikrometer som denne dybden med være nødvendig for å produsere Z-Stack bilder av komplett astrocytter. Ikke bruk de første par seksjoner, som de kan ha uønskede tykkelse på grunn av termisk expansion.
- Plasser seksjonene på overflaten av varmt vann (5 ± 2 ° C, under smeltetemperaturen for parafin) akkurat lenge nok til å flate seksjonene.
MERK: Over utvidelse av delen kan forstyrre morfologien av strukturen. Bruk liten pensel til å nøye overføre deler. Samle to til tre seksjoner på hvert lysbilde. - Lagre lysbilder i en reol i oppreist stilling og la dem tørke på 37 C i flere timer eller O / N.
2. Immunohistokjemi
- Deparaffinize seksjoner i xylen, 2 x 10 min, og rehydrere gjennom alkohol gradient (99,8%, 95% og 70%, 10 min hver) og PBS.
- Inkuber med antistoffer mot glial fibrillært surt protein (GFAP) fortynnet 1: 1500 i PBS inneholdende 0,25% bovint serumalbumin (BSA), 0,25% Triton X-100 og 3,5% normalt serum (O / N ved 4 C).
- Vask seksjoner i PBS i 3 x 5 min.
- Inkuber med sekundær alkaliske fosfat-konjugert antilegemers i 1 time (1: 100, 21 ° C, fortynnet i PBS).
- Vask delene i PBS i 3 x 5 min.
MERK: Det er viktig å vaske delene ordentlig etter sekundære antistoffer for å redusere bakgrunnsfarging. - Inkuber seksjoner i mørket med flytende Permanent Red kromogen (15-20 min). Merk: Forbered løsningen ikke mer enn 30 minutter før bruk.
- Vask seksjoner i PBS i 3 x 5 min.
- Til slutt, beis kjernene med 4-6-diamidino-to-phenylindole (DAPI; 1: 500, fortynnet i PBS) før cover-skli. Oppbevar lysbilder i kjøleskapet 24-48 timer før mikroskopi.
3. Konfokalmikroskopi
MERK: For kvantitativ vurdering (se nedenfor), velg en astrocyte med et godt synlig DAPI-farget kjerne med et minimum av overlappende grener for å redusere risikoen for feil. Produserer Z-Stack bilder er tidkrevende. Vær tålmodig og ikke stopp under behandlingen. Oppreist konfokal laser scanning mikroskop er used å lage 3D-bilder fra astrocytter.
- Sett lysbildet på mikroskopet-scenen, og velg 63X objektiv.
- Åpne bildebehandlingsprogrammer og klikk på Start-system. Klikk på Finn-kategorien. Gå til Tilordne, og velg GFP å justere riktig lys.
- Åpne Shutter til å reflektere lys. Finn den Reflektor Revolver på høyre side av Shutter og velge den fargen som bør reflekteres av astrocytter (grønn, rød eller fiolett); rød farge (FSet20 wf) ble brukt her.
MERK: Ikke glem å fokusere bildet direkte i okulær av mikroskopet. - For å finne den beste fokus, klikk på All lukket, sette mikroskop pinnen i skjerm-modus, og klikk på fanen Acquisition.
- Klikk på Smart Setup under fanen Acquisition; åpnes et vindu. Velg riktig fluorophore (dvs. DAPI og Alexa Fluor 555, i det aktuelle prosjektet) fra listen. Fargen velges automatisk.
- Klikk på Best signal, og Bruk, klikk deretter på Sett Exposure; datamaskinen vil da automatisk sette parametre eksponeringen.
- For å optimalisere bildet, gå til Channels vinduet. Spillbarhet track2, uthever track1 og klikk på Live. Fokuser bildet hvis det er nødvendig.
- I kanalvinduet justere følgende taster; klikk på 1AU å optimalisere pinhole automatisk. Det er veldig viktig å gjøre dette trinnet ellers konfokale bilder vil være ikke-optimal. Juster Gain å ha den beste intensitet (beholde denne innstillingen under 800 for å redusere ekstra støy). Endelig satt den digitale Gain mellom to og tre.
- Spillbarhet track1, klikk på track2 og gjenta trinn 3.8 for track2. Deretter stopper Live.
- Gå til vinduet Acquisition Mode. Forbedre bildet ved å optimalisere rammestørrelse og Midling. For å endre rammestørrelsen gå til X * Y og velg 1024 x 1024. Velg en langsom hastighet for å skape et bedre bilde.
- Gå til Averaging og velg et nummer ≥4. Dette averaging verdien angir antall skanninger som vil bli gjennomsnitt til produke det oppkjøpte bildet. Nå klikk på Snap-knappen, og lagre fanget 2D-bilde.
- For 3D imaging, markere Z-Stack element under Smart Setup forårsaker Z-Stack vinduet for å åpne.
- Angi de første og siste posisjoner for Z-Stack, det vil si dybden av cellen. Først klikke på Live. Deretter bruker fokus kjøring av mikroskopet til å fokusere på den øverste posisjonen astrocyte i vevet, hvor Z-Stack er å starte. Klikk på Set First. Deretter fokusere ned til laveste posisjon astrocyte i vevet, hvor Z-Stack skanning bør stoppes. Klikk på Set Siste. Deretter stopper Live.
- Velg Intervall; 1,01 mikrometer er brukt i denne studien; velge intervall kan gjøres ved å klikke på Optimal å angi antall skiver.
- Klikk på Start-eksperiment. Lagre bildene når skanningen er fullført. Dette bildet vil bli brukt til måling av de følgende parametre: overflateareal og volum på astrocytt territorium, hele astrocytt inkludert bhnches, cellelegemet, og kjernen.
- Tilegne seg et 2D-bilde med en 10X eller 20X objektiv som beskrevet i trinn 3.6-3.11. Dette bildet kan brukes til måling av intensiteten av fluorescens-immunoreaktivitet av antistoffer, og astrocytt tetthet (antall / 1000 mikrometer 2).
4. astrocytt Tetthet og GFAP + Fluorescensintensiteten
- Åpne 20X 2D-bilde. Klikk på Histo (Hisogram) på venstre side av bildevinduet.
- For å beregne astrocyte tetthet, velger tre påfølgende visuelle felt under 20X objektiv. Tell antall astrocytter som viser en klar soma med minimum, overlappende grener i feltene.
- For å kvantifisere fluorescens intensitet, velger du en skikkelig verktøy (rektangel eller sirkel) på bunnteksten på bildevinduet, og velg et område for målingen. Legg merke til middelverdi og standardavvik vises automatisk under bildet. I denne studien, en 0,7 mm 2 rektangulært område mellom striatum og medial blad av dentate gyrus ble anvendt.
5. astrocytt Grener
- Å kvantifisere lengden og antall grener, bruker 3D-bilder (ervervet med 20X) i bildeanalyseprogramvare. Trekke en linje manuelt langs lengden av hver gren av den valgte astrocytt. Deretter velger du måle-verktøy som er spesialisert for måling av linjelengde. For å tallfeste antall grener, velg count-verktøy for å telle antall merkede elementer.
6. volum og areal
MERK: Merking en struktur manuelt i 3D bildeanalyse programvare krever fokus og trening. Øv flere ganger før du starter et eksperiment.
- Å kvantifisere volum og areal av astrocyte kjernen, soma, cellekroppen og territorium, overføre 3D-bilder (ervervet i trinn 3.1-3.16) til en 3D-bildeanalyse programvare som Volocity 6.1.
- Åpne programvaren og opprette en nybibliotek. Dra alle bildene til venstre grå kolonnen i det nye biblioteket. Deretter velger du en 3D-bilde. Til høyre er det ulike kanaler med ulike farger. Slå på én kanal av interesse; for eksempel den blå kanalen for DAPI ved måling av kjernen. Endre lysstyrken manuelt for å få en optimal kontrast.
- Velg Verktøy-menyen, gå til Kontroller Volum og produsere en enkelt 3D-bilde av Z-stack bilder. Klikk på Egenskaper i Rediger-menyen, og være sikker på at X, Y og Z egenskaper presentert; ellers er det umulig 3D-analyse for å gjennomføre.
- Klikk på Freehand RIO verktøyikonet i verktøylinjen. For å måle volum og areal av astrocyte kjernen tegne en linje rundt DAPI-merket kjernen.
- For å måle volum og areal av astrocyte cellekroppen tegne en linje rundt soma unntatt grener.
- For å måle volum og areal av hele astrocyte (cellekroppen herunder filialer) tegne en linje rundt soma etteroverflaten av alle grener.
- For å vurdere volum og areal av astrocyte territorium trekke en linje mellom tuppen av greinene.
MERK: Trykk Slett på tastaturet for å slette uønskede tegninger. - Klikk på Målinger menyen øverst i bildevinduet for å opprette en måling protokollen; åpner et vindu med ulike verktøy.
- Dra Finn objekter til toppen av vinduet (panelet). Gi et beskrivende navn til Folke 1 velger tilhørende farge, og klikk på Measure. Et annet vindu åpnes.
- Velge en parameter dvs. volum eller overflateareale. Klikk på OK. Dataene vil vises i en tabell.
- For å lagre data, klikk på menyen Måling og velg Lag Måling varen.
- Velg En ny måling element kalt fra det åpne vinduet. Så gi et navn til data og klikk på OK.
- Til slutt, eksportere data til statistikk programvare som Graph pad eller excel program. Bruke t-test for å analysere dataene, og deretter plotte 2D graphs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne delen presenterer noen eksempler på kvalitative og kvantitative observasjoner produsert av 3D morfometrisk analyse. For fullstendige resultater fra alle 12 parametere som er nevnt tidligere, vennligst se vår forrige publisering 10.
Kvalitative Observasjoner
Astrocytter utstilt tynne eller tykke greiner som var vanligvis lenge i Ap 1-40 injisert rotter (Figur 1). Noen små stelformede astrocytter med korte grener ble observert i hjernebarken, og en kompakt nettverk av astrocytter skjedde i corpus callosum.
Astrocytter i hjernen vev av dyr med Ap 1-40 -injection genistein, etterfulgt av behandling oppviste en stel skjema med korte og tynne grener (figur 2) 10. Noen astrocytter viste en atrofisk utseende.
Astrocytt Tetthet og GFAP +Fluorescensintensiteten
Gjennomsnittlig antall astrocytter / 1000 mikrometer 2 var signifikant høyere hos rotter med Ap 1-40 -injection sammenlignet med dyrene i Ap 1-40 -injection og genistein behandlingsgruppe (P <0,0001). I tillegg GFAP + fluorescensintensiteten var signifikant lavere i hjernen delen med genistein behandling, sammenlignet med ikke-behandlede Ap 1-40 injisert dyr (figur 3).
Morfometrisk Analyse av Astrocytter Volume
Volumet av astrocyte kjernen, cellekroppen, hele astrocyte og astrocyte territorium sunket betraktelig i genistein behandlingsgruppen sammenliknet med ubehandlede dyr. Dette resultatet tyder på at genistein bedres den astrogliosis forårsaket av tilstedeværelsen av amyloid (figur 4A - D).
Figur 1. Confocal bilde av en astrocyte. Et individ astrocyte med tykke og lange grener (pilspiss) og DAPI-merket kjernen (pil) i en rottehjerne utsatt for hippocampus injeksjon av Ap 1-40. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Confocal bilde av en astrocyte. En astrocyte med korte grener (pilspiss). I en rottehjerne hippocampus kastet Ap 1-40 -injection, og genistein forbehandling administrert ved gavage. P lease klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. GFAP + fluorescensstyrke sunket betraktelig hos dyr med A β 1-40 -. Injeksjon som fikk genistein forbehandling Verdier er gjennomsnitt ± SEM. Femti astrocytter per dyr ble evaluert. P <0,05 ble ansett som signifikant, og T-test ble brukt til å sammenligne data mellom grupper med eller uten behandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
g "/>
Figur 4. Det midlere volum av kjernen (A), cellelegemet (B), astrocytt (inkludert grener, (C), og området (D) i hjerneprøver tatt fra rottene utsatt for Ap 1-40 -injection, med eller uten genistein før behandling. Genistein bedres betydelig utvidelse av kjernen, cellekroppen, hele astrocyte, og astrocyte territorium (se ref 10). Verdier er gjennomsnitt ± SEM. Femti astrocytter per dyr ble evaluert. P <0,05 ble ansett som viktig, og T-test ble brukt til å sammenligne data mellom gruppene før og etter behandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I dagens protokoll, benyttet vi 3D konfokal morfometri å vurdere 12 ulike parametere som var knyttet til astrocyte morfologi. For dette formål hippokampalt vev fra rotter med Ap 1-40 - ble indusert astrogliosis, med eller uten forbehandling genistein som et anti-inflammatorisk middel som anvendes. Ved å bruke 3D-bilder og morfometrisk programvare, var vi i stand til å vise effekten av genistein på astrogliosis dvs. morfologi astrocytter.
Endringer i den intra- og ekstracellulære miljø av hjernevevet kan endre volum, og / eller størrelser av celler / vev. Disse endringene anses patologiske kjennetegn i ulike hjerneskader 3,11. For å kvantifisere disse endringene, er brukt en rekke teknikker. De fleste undersøkelser er basert på bruk av 2D lavoppløselige bilder tatt av lys- eller elektronmikroskopi (EM) som gir informasjon om en liten brøkdel av cell. For å overvinne denne begrensningen, ble 3D konfokalmikroskoper morfometri på høyoppløselige utviklet 11. En annen fordel med konfokal mikroskopi er at arkitekturen av en celle kan studeres siden flere påfølgende 2D-bilder blir oppnådd, mens Z-stack bildebehandling er utført. I tillegg øker 3D konfokal mikroskopi mulighet for å forbedre kvaliteten av bildene ved å filtrere bakgrunnsstøy 11.
Metoden som presenteres her er tidkrevende; tar Z-Stack bilder med en konfokalmikroskop tar flere minutter for hver enkelt celle. I tillegg manuelt markerer en struktur i programvaren krever litt øvelse, og forskeren må kanskje gjøre om tegning flere ganger for å være sikker på at strukturen er korrekt merket. Det bør nevnes at "Magic" fanen i 3D bildeanalyse programvare som Volocity, kan brukes til automatisk å merke alle DAPI-farget kjerner i ett enkelt bilde. Dette alternativet kan brukes nårastrocytter dyrkes. Hjerneseksjoner, inneholder imidlertid ikke bare astrocytter, men også mange andre celler så som neuroner og mikroglia. Dette betyr at mange av de DAPI-farget kjerner ikke tilhører astrocytter. Kjernene forbundet med astrocytter bør manuelt merkes ved hjelp av bilder som har både DAPI-merket kjerner og GFAP-immunoreaktive astrocytter.
I denne protokollen, ble antistoffer mot GFAP brukes til å visualisere astrocytter i parafinsnitt. Astrocytter kan også visualisert ved hjelp av andre antigener 12,13, eller transgene mus. Etterforskerne bør være klar over begrensningene metodene, og bruke best mulig eksperimentell design basert på sine mål. Begrensningen til anvendelse av antistoffer mot GFAP, for eksempel, er at bare 10-15% av cytoskjelettet kan påvises. Denne begrensningen, men kan bli en fordel når en skal studere astrogliosis; økningen antall astrocytter og et tett nettverk av astrocytter filialer i såtrogliosis kan gjøre det vanskelig å identifisere en enkelt celle hvis et større område av cellen blir detektert. Selv om denne protokollen beskriver kvantifisering av 12 forskjellige parametre, men etterforsker kan velge de som passer deres mål. Ifølge vår erfaring, kan målingene av alle parametere gi verdifull informasjon om parameterne som er betydelig påvirket i en viss tilstand eller av en behandling. Kvantifisering metoden utføres på 3D-bilder tatt i konfokalmikroskop kan også utføres på frossen seksjoner. Problemet er å behandle prøvene (fiksering, dehydrering, innstøping og snitting) på en lignende måte, siden disse trinnene kan føre til krymping eller hevelse i vev.
Som konklusjon, 3D konfokal avbildning, i kombinasjon med morfometrisk programvare, som gjør det mulig å kvantifisere flere parametere knyttet til morfologi av en celle. Protokollen vi presenteres her kan brukes til evaluering av morfologiske chanGES som vises i en celle, i forskjellige patologiske tilstander, eller som en effekt av en intervensjon strategi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra fylkestinget i Östergötland, (Sverige) og celle- og molekylær Research Center på Iran University of Medical Sciences (Teheran, Iran).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amyloid beta 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | Keep in -70 °C |
| Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | keep in -20 °C |
| polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein | DAKO | Z0334 | |
| alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies | DAKO | ||
| Liquid Permanent Chromogen | DAKO | K0640 | |
| Liquid permanent Red Substrate Buffer | DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | Polyethoxylated castor oil - Step 1.1 |
| LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
| Image Analysis 2000 | Tekno Optic | ||
| Streotaxic apparatus | Stoelting | ||
| Graph pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |
References
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).
- Pekny, M., Nilsson, M. Astrocyte activation and reactive gliosis. Glia. 50 (4), 427-434 (2005).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
- Anderova, M., et al. Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).
- Paxinos, G., Watson, C. A stereotaxic atlas of the rat brain. , Academic. New York. (1998).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. J Vis Exp. (65), e4079 (2012).
- Bagheri, M., et al. Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study. PloS One. 8 (10), e76526 (2013).
- Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices. J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).
- Kulkarni, P. M., et al. Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images. J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).
- Wagner, D. C., et al. Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury. Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).
