Abstract
Som gliaceller i hjernen, astrocytter har forskellige funktionelle roller i centralnervesystemet. Ved tilstedeværelse af skadelige stimuli, astrocytter ændre deres funktionelle og strukturelle egenskaber, en tilstand kaldet reaktiv astrogliose. Her er en protokol til vurdering af de morfologiske egenskaber af astrocytter fremlagt. Denne protokol omfatter kvantificering af 12 forskellige parametre dvs det areal og volumen af vævet omfattet af en astrocyt (astrocyt territorium), hele astrocyt herunder filialer, celle krop og kerne, samt total længde og antal filialer, intensiteten af fluorescens immunreaktivitet af antistoffer anvendes til påvisning astrocyt og astrocyt densitet (antal / 1000 um 2). Til dette formål tredimensionale (3D) konfokal mikroskopiske billeder blev skabt, og 3D-billede analyse software såsom Volocity 6.3 blev brugt til målinger. Rotte hjernevæv udsat for amyloid beta 1-40 1-40) med eller uden en terapeutisk intervention blev brugt til at præsentere metoden. Denne protokol kan også anvendes til 3D morfometriske analyse af andre celler fra enten in vivo eller in vitro betingelser.
Introduction
I sundt centralnervesystemet (CNS), astrocytter spille en vigtig rolle i reguleringen af blodgennemstrømningen, energiomsætning, synaptisk funktion og plasticitet, og ekstracellulær ion og neurotransmitter homeostase 1-3. Desuden astrocytter reagere på forskellige skadelige stimuli og unormale tilstande, såsom trauma, infektion, iskæmi eller neurodegeneration via reaktiv astrogliose som er karakteriseret ved hypertrofi, proliferation og funktionelle omformning af astrocytter 4,5.
Reaktiv astrogliose kan ingeniør den inflammatoriske respons og reparationsprocessen i vævet, og derfor kan påvirke det kliniske resultat for terapeutiske indgreb. Følgelig har astrocytter fået opmærksomhed fra neuroscientist løbet af de sidste årtier som potentielle mål for terapeutiske indgreb for en række sygdomme, der påvirker CNS.
Astrocytter normalt har en stjerneformet form med godt defined grene, der spredes omkring soma 6. I en sygdomstilstand i hjernen, astrocyt grenene bliver komplicerede og viser hævede ender 7, for eksempel i nærvær af amyloid beta (Ap).
Denne artikel præsenterer en protokol for analyse af 3D-billeder af astrocytter erhvervet af konfokal mikroskopi. Tolv forskellige kvantitative parametre for hver astrocyt blev målt: de arealer og mængder af astrocyt territorium (det væv dækket af en astrocyt), hele cellen (herunder filialer), celle krop, og kerne; den samlede længde og antal filialer; fluorescensintensiteten af antistoffer anvendes til påvisning astrocyt; og densiteten af astrocytter (antal / 1000 um 2). Til dette formål anvendte vi hjernesnit fra rotter udsat for intrahippocampal injektion af Ap 1-40 med eller uden genistein behandling som et anti-inflammatorisk stof. Den beskrevne protokol kan anvendes til morfometriske enANALYSE forskellige celletyper in vitro eller in vivo i forskellige forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev gennemført i overensstemmelse med de politikker, der er fastsat i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (NIH), der er godkendt af Etik Komité Iran University of Medical Sciences (Teheran, Iran).
1. Dyr, kirurgi og til prøvemateriale Forberedelser
BEMÆRK: Forbered hjernevæv til 3D konfokal mikroskopisk analyse.
- Opdel dyr tilfældigt i to grupper: Ap 1-40 -injection (n = 8) og Ap 1-40 -injection med genistein-behandling (n = 8); administrere genistein (10 mg / kg fortyndet i et vehikel, såsom polyethoxyleret ricinusolie) med sonde 1 time før operation.
- Bedøver dyrene med ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg). Bekræft ordentlig anæstesi ved manglende tilbagetrækning refleks, efter at klemme tåen. Brug salve på øjne under operationen for at forhindre tørhed.
- Placer dyr i stereotaktisk apparat og barbering hovedet. Anvend IODine opløsning til at rense hovedbunden før incision og holde operationsstedet sterile under operationen for at reducere risikoen for infektion. Injicer Ap 1-40 stereotaktisk (4 pi) i hippocampus på -3,5 mm posteriort for bregma, ± 2 mm lateralt for midterlinien og -2.8 mm under dura, ifølge rottehjerne atlas 8. For stereotaktisk metode se tidligere publikation 9.
- Giv postoperativ observation / pleje, indtil dyrene er ved fuld bevidsthed at sikre komfort af dyrene. Holde dyrene varm under genopretning, og ikke returnere dem til et bur med andre dyr, indtil fuld helbredelse. Vær opmærksom på ethvert tegn på infektion i dyrene efter operationen.
- Bedøve dyrene dybt af ketamin (150 mg / kg) tre uger efter operationen. Udfør transcardial fiksering ved perfusion af dyrene med 0,9% saltvand efterfulgt af 4% paraformaldehyd i 0,1 M PBS (pH = 7,4), fjern derefter og løse hjerne, som beskrevet i 10 </ sup>.
- Post-fix hjernerne i 4% paraformaldehyd i 2-3 dage ved 4 ° C.
- Integrer vævet i paraffinblokke ved brug af væv indlejring udstyr, og undgå under-fyldning eller over-fyldning af kassetten, da det kan forstyrre korrekt tilpasning eller sektionering. Vær opmærksom på orienteringen af vævet i paraffinblokken.
BEMÆRK: rottehippocampus, for eksempel, er tæt på bageste del af den cerebrale halvkugle. Således bør vævet indlejres på en måde, sektionering starter ved bageste del af hjernen. Brug Paxinos atlas 8 som en guide at opnå den ønskede anatomiske struktur. - Placer mikrotom væk fra luft udkast eller døråbninger, da luftbevægelser gør håndteringen af sektioner vanskelig.
- Brug sektioner med en tykkelse ≥20 um Som med nødvendigt denne dybde for at producere Z-Stack billeder af komplette astrocytter. Brug ikke de første par afsnit, da de kan have uønsket tykkelse på grund af termisk eXpansion.
- Placer sektionerne på overfladen af varmt vand (5 ± 2 C, under smeltetemperaturen for paraffin) lige længe nok til flade sektioner.
BEMÆRK: Over udvidelse af sektion kan forstyrre morfologi af strukturen. Brug lille pensel til forsigtigt at overføre sektioner. Saml to til tre sektioner på hvert dias. - Opbevar dias i et rack i oprejst stilling og lad dem tørre ved 37 C i flere timer eller O / N.
2. Immunohistokemi
- Afparaffiniser sektioner i xylen, 2 x 10 min, og rehydrere gennem alkohol gradient (99,8%, 95% og 70%, 10 min hver) og PBS.
- Inkuber med antistoffer mod glial fibrillært surt protein (GFAP) fortyndet 1: 1.500 i PBS indeholdende 0,25% bovint serumalbumin (BSA), 0,25% Triton X-100 og 3,5% normalt serum (O / N ved 4 ° C).
- Vask sektioner i PBS i 3 x 5 min.
- Inkuber med sekundært alkalisk phosphat-konjugeret antibodies i 1 time (1: 100, 21 C, fortyndet i PBS).
- Vask sektionerne i PBS i 3 x 5 min.
BEMÆRK: Det er vigtigt at vaske sektionerne korrekt efter sekundære antistoffer for at minimere baggrunden farvning. - Inkuber sektioner i mørke med Liquid Permanent Red Chromogen (15-20 min). Bemærk: Forbered løsningen ikke mere end 30 minutter før brug.
- Vask sektioner i PBS i 3 x 5 min.
- Endelig plette kernerne med 4-6-diamidino-2-phenylindol (DAPI, 1: 500, fortyndet i PBS) før dække-udskridning. Opbevar dias i køleskabet 24-48 timer før mikroskopi.
3. konfokal mikroskopi
BEMÆRK: kvantitativ evaluering (se nedenfor), skal du vælge en astrocyt med en klart synlig DAPI-farvet kerne med et minimum af overlappende grene for at mindske risikoen for fejl. Producerer Z-stack billeder er tidskrævende. Vær tålmodig og ikke stoppe under behandlingen. Opretstående konfokal laser scanning mikroskop er used at skabe 3D-billeder fra astrocytter.
- Sæt slide på mikroskopet-scenen, og vælg 63X målsætning.
- Åbn imaging software, og klik på Start-system. Klik på fanebladet Find. Gå til Tildel, og vælg GFP at justere korrekt lys.
- Åbn Shutter til at reflektere lys. Find reflektoren Revolver på højre side af Shutter og vælg den farve, der skal afspejles af astrocytter (grøn, rød eller violet); rød farve (FSet20 wf) blev her brugt.
BEMÆRK: Glem ikke at fokusere billedet direkte i okular af mikroskopet. - For at finde den bedste fokusering, skal du klikke på All lukket, satte mikroskopet pin i skærm, og klik på fanen Acquisition.
- Klik på Smart-opsætning under fanen Acquisition; et vindue åbnes. Vælg den korrekte fluoroforen (dvs. DAPI og Alexa Fluor 555, i det aktuelle projekt) på listen. Farven vælges automatisk.
- Klik på bedste signal, og Anvend, og klik derefter på Set Exposure; computeren vil så automatisk eksponering parametre.
- Til optimering af billedet, gå til Kanaler vinduet. Fjern markering TRACK2, fremhæve Track1 og klik på Live. Fokuser billedet, hvis nødvendigt.
- I Kanaler vinduet justere følgende taster; klik på 1AU til automatisk optimere pinhole. Det er meget vigtigt at gøre dette ellers konfokale billeder vil være ikke-optimale. Juster Gain at have den bedste intensitet (beholde denne indstilling under 800 for at reducere ekstra støj). Endelig indstilles Digital Gain mellem 2 og 3.
- Fjern markering Track1, klik på TRACK2 og gentag trin 3,8 til TRACK2. Så stopper Live.
- Gå til vinduet Acquisition Mode. Forbedre billedet ved at optimere Frame Size og Gennemsnit. For at ændre rammens størrelse gå til X * Y og vælg 1.024 x 1.024. Vælg en langsom hastighed for at skabe et bedre image.
- Gå til Gennemsnit og vælg et nummer ≥4. Dette gennemsnit værdi angiver antallet af scanninger, der vil blive gennemsnit at produktie den erhvervede billede. Klik nu på knappen Snap, og gemme det optagne 2D-billede.
- For 3D-billedbehandling, markere Z-Stack post under Smart Setup forårsager Z-Stack vinduet for at åbne.
- Sæt den første og sidste positioner for Z-Stack, dvs. dybden af cellen. Først klikke på Live. Brug derefter fokus drevet af mikroskopet til at fokusere på den øverste stilling astrocyt i vævet, hvor Z-Stack er at starte. Klik på Sæt først. Derefter fokusere ned til den laveste position af astrocyt i vævet, hvor Z-Stack scanning bør stoppes. Klik på Sæt Sidste. Så stopper Live.
- Vælg Interval; 1,01 um anvendes i den aktuelle undersøgelse; vælge interval kan gøres ved at klikke på Optimal at indstille antallet af skiver.
- Klik på Start Experiment. Gemme billederne, når scanningen er færdig. Dette billede vil blive brugt til måling af følgende parametre: overfladeareal og volumen af astrocyt territorium, hele astrocyt inklusive bhnches, cellelegeme og kernen.
- Anskaf et 2D-billede ved hjælp af en 10X eller 20X mål som beskrevet i trin 3.6-3.11. Dette billede kan anvendes til måling af fluorescensintensitet immunreaktivitet af antistoffer og astrocyt densitet (antal / 1000 um 2).
4. astrocyt Density og GFAP + Fluorescens Intensitet
- Åbn 20X 2D-billede. Klik på Histo (Hisogram) i venstre side af billedet vinduet.
- For at beregne astrocyt tæthed, skal du vælge tre på hinanden følgende visuelle felter under 20X mål. Tæl antallet af astrocytter, der udviser en klar soma med minimum overlappende filialer i felterne.
- For at kvantificere fluorescensintensitet, vælge en ordentlig værktøj (rektangel eller cirkel) på sidefoden på billedet vinduet, og vælg et område til målingen. Bemærk middelværdien og standardafvigelsen vises automatisk under billedet. I den aktuelle undersøgelse, en 0,7 mm2 rektangulært område mellem striatum og mediale klinge af gyrus dentatus blev anvendt.
5. astrocyt Filialer
- For at kvantificere længden og det samlede antal filialer, brug 3D-billeder (erhvervet med 20x) i billedet analysere software. Tegn en linje manuelt langs længden af hver gren af den valgte astrocyt. Vælg derefter målingen-værktøj, der er specialiseret til at måle line-længde. For at kvantificere antallet af filialer, skal du vælge count-værktøjet til at tælle antallet af markerede elementer.
6. Volumen og overfladeareal
BEMÆRK: Mærkning en struktur manuelt i 3D-billede analyse software kræver fokus og træning. Praksis flere gange, før du starter et eksperiment.
- For at kvantificere omfanget og overfladearealet af astrocyt kerne, soma, celle krop og territorium, overføre 3D-billeder (erhvervet i trin 3.1-3.16) til et 3D-billede analyse software såsom Volocity 6.1.
- Åbn softwaren og oprette en nybibliotek. Træk alle billeder til venstre grå kolonne i det nye bibliotek. Vælg derefter en 3D-billede. Til højre er der forskellige kanaler med forskellige farver. Tænd én kanal af interesse; for eksempel den blå kanal for DAPI ved måling kernen. Ændre lysstyrken manuelt for at få en optimal kontrast.
- Vælg menuen Funktioner, gå til Lav Volumen og producere et enkelt 3D-billede ud af Z-stack billeder. Klik på Egenskaber i menuen Rediger og være sikker på, at X er Y og Z egenskaber fremlagt; ellers er det umuligt at gennemføre 3D-analyse.
- Klik på Freehand RIO værktøj ikon i værktøjslinjen. For at måle volumen og overfladearealet af astrocyt kerne trække en linje omkring DAPI-mærkede kerne.
- For at måle volumen og overfladearealet af astrocyt celle krop trække en linje omkring soma eksklusive filialer.
- For at måle volumen og overfladearealet af hele astrocyt (celle kroppen, herunder filialer) trække en linje omkring soma efteroverflade af alle brancher.
- For at vurdere omfanget og overfladearealet af astrocyt territorium trække en linje mellem spidserne af grenene.
BEMÆRK: Tryk på Delete på tastaturet for at slette uønskede tegninger. - Klik på Målinger menuen øverst i billedet for at oprette en måling protokollen; et vindue, der indeholder forskellige værktøjer åbnes.
- Træk Find objekter til toppen af vinduet (ruden). Giv et beskrivende navn til befolkningen 1, skal du vælge den tilhørende farve, og klik på Measure. Et andet vindue åbnes.
- Vælg en parameter dvs. volumen eller overflade. Klik på OK. Dataene vises i en tabel.
- For at gemme dataene klik på menuen Måling og vælg Lav Måling Item.
- Vælg en ny måling element kaldes fra åbnede vindue. Så giv et navn til dataene, og klik på OK.
- Endelig eksportere data til statistiske software som Graph pad eller excel program. Brug t-test for at analysere data, så plotte 2D graphs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I dette afsnit præsenteres nogle eksempler på de kvalitative og kvantitative observationer produceret af 3D morfometrisk analyse. For fuldstændige resultater af alle 12 parametre nævnt tidligere, kan du se vores tidligere publikation 10.
Kvalitative observationer
Astrocytter udstillet tynde eller tykke grene, der var normalt længe i Ap 1-40 injicerede rotter (figur 1). Et par små stjerneformige-formede astrocytter med korte grene blev observeret i hjernebarken og en kompakt netværk af astrocytter opstod i corpus callosum.
Astrocytter i hjernevæv fra dyr med Ap 1-40 -injection efterfulgt af genistein behandling udviste en stjerneformet form, med korte og tynde grene (figur 2) 10. Et par astrocytter viste en atrofisk udseende.
Astrocyt Density og GFAP +Fluorescens Intensitet
Det gennemsnitlige antal astrocytter / 1000 um 2 var signifikant højere i rotter med Ap 1-40 -injection sammenlignet med dyr i Ap 1-40 -injection og genistein behandlingsgruppe (p <0,0001). Desuden GFAP + fluorescensintensiteten var signifikant lavere i hjernen sektion med genistein behandling sammenlignet med ikke-behandlede Ap 1-40 injicerede dyr (figur 3).
Morfometrisk analyse af Astrocytter bind
Lydstyrken for astrocyt kerne, celle krop, hele astrocyt og astrocyt område faldt betydeligt i genistein behandlingsgruppen sammenlignet med ubehandlede dyr. Dette resultat antyder, at genistein lindret den astrogliose forårsaget af tilstedeværelsen af amyloid (figur 4A - D).
Figur 1. Konfokal billede af en astrocyt. En individuel astrocyt med tykke og lange grene (pilespids) og DAPI-mærket kerne (pil) i en rotte hjerne udsættes for hippocampus injektion af Ap 1-40. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Konfokal billede af en astrocyt. En astrocyt med korte grene (pilespids). I en rottehjerne udsat for hippocampus Ap 1-40 -injection og genistein forbehandling indgives med mavesonde. P lease klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. GFAP + fluorescensintensiteten faldt betydeligt i dyr med A β 1-40 -. Injektion, der fik genistein forbehandling Værdier er gennemsnit ± SEM. Halvtreds astrocytter per dyr blev evalueret. P <0,05 blev betragtet som signifikant, og T-test blev anvendt til at sammenligne data mellem grupper med eller uden behandling. Klik her for at se en større version af dette tal.
g "/>
Figur 4. Det gennemsnitlige kernen (A), celle legeme (B), astrocyt (herunder filialer; (C), og territorium (D) i hjerneprøver taget fra rotter udsat for Ap 1-40 -injection, med eller uden genistein forbehandling. Genistein væsentligt forbedres udvidelsen af kernen, cellelegemet, hele astrocyt og astrocyt område (se ref 10). Værdier er gennemsnit ± SEM. Fifty astrocytter per dyr blev evalueret. P <0,05 blev betragtet som signifikant, og T-test blev anvendt til at sammenligne data mellem grupperne før og efter behandling. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den nuværende protokol, vi ansat 3D konfokal morfometri at vurdere 12 forskellige parametre, der var forbundet med astrocyt morfologi. Til dette formål, hippocampus væv af rotter med Ap 1-40 - blev induceret astrogliose, med eller uden forbehandling genistein som et anti-inflammatorisk middel anvendes. Ved at bruge 3D-billeder og morfometrisk software, var vi i stand til at vise effekten af genistein på astrogliose dvs morfologi astrocytter.
Ændringer i intra- og ekstracellulære miljø i hjernevævet kan ændre volumen og / eller størrelsen af celler / væv. Disse ændringer anses patologiske kendetegn i forskellige hjerneskader 3,11. For at kvantificere disse ændringer, anvendes en række teknikker. De fleste undersøgelser er baseret på brug af 2D-billeder med lav opløsning fanget af lys- eller elektronmikroskopi (EM), der giver kun oplysninger om en lille brøkdel af cell. For at overvinde denne begrænsning blev 3D konfokale morfometri på billeder i høj opløsning udviklet 11. En anden fordel ved konfokal mikroskopi er, at arkitekturen af en celle kan studeres da flere på hinanden følgende 2D-billeder opnås, medens Z-Stack billeddannelse udføres. Desuden 3D konfokal mikroskopi rejser muligheden for at forbedre kvaliteten af billederne ved at filtrere baggrundsstøj 11.
Den præsenteres her metode er tidskrævende; tage Z-Stack billeder med en konfokal mikroskop tager flere minutter for hver enkelt celle. Hertil kommer, manuelt markerer en struktur software kræver lidt øvelse, og forskeren kan være nødvendigt at gentage de tegning flere gange for at være sikker på, at strukturen er markeret korrekt. Det skal nævnes, at fanen 'Magic' i 3D-billede analyse software såsom Volocity, kan bruges til automatisk at markere alle DAPI-farvede kerner i et enkelt billede. Denne mulighed kan bruges, nårastrocytter dyrkes. Hjernen sektioner indeholder imidlertid ikke kun astrocytter men også mange andre celler, såsom microglia og neuroner. Det betyder, at mange af DAPI-farvede kerner ikke tilhører astrocytter. Kernerne er forbundet med astrocytter bør manuelt mærkes med billeder med både DAPI-mærkede kerner og GFAP-immunreaktive astrocytter.
I denne protokol, blev antistoffer mod GFAP bruges til at visualisere astrocytter i paraffinsnit. Astrocytter kan også visualiseres ved hjælp af andre antigener 12,13, eller transgene mus. Efterforskerne skal være opmærksomme på begrænsningerne i de metoder, og bruge den bedst mulige eksperimentelle design baseret på deres mål. Begrænsningen af anvendelse af antistoffer mod GFAP, for eksempel, er, at kun 10-15% af cytoskelettet kan detekteres. Denne begrænsning kan imidlertid blive en fordel, når man studerer astrogliose; stigningen antal astrocytter og et tæt net af astrocytter filialer i såtrogliosis kan gøre det vanskeligt at identificere en enkelt celle, hvis der detekteres et større område af cellen. Selv om denne protokol beskriver kvantificering af 12 forskellige parametre, men undersøgeren kan vælge dem, der passer deres mål. Ifølge vores erfaring, kan målingerne af alle parametre giver værdifulde oplysninger om de parametre, der i væsentlig grad er berørt i en bestemt tilstand eller ved en behandling. Kvantificeringsfremgangsmåden udført på 3D billeder fanget i konfokalt mikroskop kan også udføres på frosne snit. Spørgsmålet er at behandle prøverne (fiksering, dehydrering, indlejring og udskæring) på en lignende måde, da disse trin kan føre til krympning eller opsvulmning af vævet.
Afslutningsvis 3D konfokal billeddannelse, i kombination med morfometrisk software, der gør det muligt at kvantificere flere parametre i forbindelse med morfologien af en celle. Protokollen vi præsenteres her kan bruges til evaluering af morfologiske chanGES, der vises i en celle, i forskellige patologiske tilstande, eller som effekten af en intervention strategi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Amtsråd i Östergötland, (Sverige) og Cellulær og Molekylær Research Center ved Iran University of Medical Sciences (Teheran, Iran).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amyloid beta 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | Keep in -70 °C |
| Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | keep in -20 °C |
| polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein | DAKO | Z0334 | |
| alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies | DAKO | ||
| Liquid Permanent Chromogen | DAKO | K0640 | |
| Liquid permanent Red Substrate Buffer | DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | Polyethoxylated castor oil - Step 1.1 |
| LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
| Image Analysis 2000 | Tekno Optic | ||
| Streotaxic apparatus | Stoelting | ||
| Graph pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |
References
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).
- Pekny, M., Nilsson, M. Astrocyte activation and reactive gliosis. Glia. 50 (4), 427-434 (2005).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
- Anderova, M., et al. Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).
- Paxinos, G., Watson, C. A stereotaxic atlas of the rat brain. , Academic. New York. (1998).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. J Vis Exp. (65), e4079 (2012).
- Bagheri, M., et al. Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study. PloS One. 8 (10), e76526 (2013).
- Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices. J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).
- Kulkarni, P. M., et al. Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images. J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).
- Wagner, D. C., et al. Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury. Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).
