Abstract
Comme les cellules gliales dans le cerveau, les astrocytes ont divers rôles fonctionnels dans le système nerveux central. En présence de stimuli nocifs, les astrocytes modifier leurs propriétés fonctionnelles et structurales, une condition appelée astrogliose réactif. Ici, un protocole pour l'évaluation des propriétés morphologiques des astrocytes est présenté. Ce protocole inclut la quantification des 12 paramètres différents à savoir la zone de surface et le volume du tissu couvert par un astrocyte (territoire des astrocytes), l'ensemble des astrocytes notamment les branches, le corps de la cellule, et le noyau, ainsi que la longueur totale et le nombre de branches, l'intensité de fluorescence immunoréactivité des anticorps utilisés pour la détection des astrocytes, des astrocytes et de la densité (nombre / 1000 um 2). A cet effet en trois dimensions (3D) des images microscopiques confocales ont été créés, et des logiciels d'analyse d'images 3D comme Volocity 6.3 a été utilisé pour les mesures. Les tissus du cerveau de rat exposés à la bêta-amyloïde 1-40 1-40), avec ou sans une intervention thérapeutique a été utilisé pour présenter la méthode. Ce protocole peut également être utilisé pour la 3D analyse morphométrique d'autres cellules provenant soit in vivo soit in vitro dans des conditions.
Introduction
En bonne santé du système nerveux central (SNC), les astrocytes jouent un rôle important dans la régulation de la circulation sanguine, le métabolisme énergétique, la fonction et la plasticité synaptique, et l'ion extracellulaire et neurotransmetteur homéostasie 1-3. En outre, les astrocytes répondent à différents stimuli nocifs et les conditions anormales telles qu'un traumatisme, une infection, une ischémie ou une neurodégénérescence via astrogliose réactif qui est caractérisée par une hypertrophie, la prolifération et le remodelage fonctionnel de 4,5 astrocytes.
Astrogliose réactif peut concevoir la réponse inflammatoire et processus de réparation dans le tissu et, par conséquent, peuvent influer sur l'issue clinique des interventions thérapeutiques. En conséquence, les astrocytes ont retenu l'attention de neuroscientifique au cours des dernières décennies que des cibles potentielles pour des interventions thérapeutiques pour une variété de maladies affectant le système nerveux central.
Les astrocytes ont normalement une forme stellaire avec bien defined branches qui se propagent à travers le soma 6. Dans un état pathologique dans le cerveau, les branches d'astrocytes deviennent compliquées et 7 montrent un gonflement des extrémités, par exemple en présence de bêta-amyloïde (Aß).
Cet article présente un protocole d'analyse d'images 3D d'astrocytes acquises par microscopie confocale. Douze paramètres quantitatifs différents pour chaque astrocytes ont été mesurés: les surfaces et les volumes du territoire des astrocytes (tissu couverte par une astrocytes), la cellule entière (y compris les succursales), corps de la cellule, et le noyau; la longueur totale et le nombre de branches; l'intensité de fluorescence des anticorps utilisés pour la détection des astrocytes; et la densité des astrocytes (nombre / 1000 um 2). A cet effet, nous avons utilisé des coupes de cerveau de rats exposés à une injection intrahippocampique de Aß 1-40 avec ou sans traitement de génistéine en tant que substance anti-inflammatoire. Le protocole décrit peut être utilisé pour une morphométriealyse de différents types de cellules in vitro ou in vivo dans des conditions différentes.
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Protocol
Cette étude a été réalisée en conformité avec les politiques énoncées dans le Guide pour l'entretien et l'utilisation des animaux de laboratoire (NIH) approuvées par le Comité d'éthique de l'Université des sciences médicales de l'Iran (Téhéran, Iran).
1. Les animaux, la chirurgie et spécimens Préparatifs
NOTE: Préparer les tissus du cerveau pour l'analyse microscopique confocale 3D.
- Diviser les animaux au hasard en deux groupes: le peptide Aß 1-40 -Injection (n = 8), et Aß 1-40 -Injection traitement avec la génistéine (n = 8); administrer la génistéine (10 mg / kg diluée dans un véhicule tel que l'huile de ricin polyéthoxylée) par gavage 1 heure avant la chirurgie.
- Anesthésier les animaux avec de la kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (10 mg / kg). Confirmez anesthésie appropriée par le manque de réflexe de retrait après pincement de l'orteil. Utilisez pommade sur les yeux pendant la chirurgie pour prévenir la sécheresse.
- Placez animaux appareil stéréotaxique et de la tête de rasage. Appliquer IODine solution pour nettoyer le cuir chevelu avant l'incision et de garder le site de l'opération stérile pendant la chirurgie pour réduire le risque d'infection. Injecter Aß 1-40 stéréotaxique (4 pi) dans l'hippocampe à -3.5 mm derrière le bregma, ± 2 mm de la ligne médiane latérale, et -2.8 mm sous la dure, selon cerveau de rat atlas 8. Pour la méthode stéréotaxique s'il vous plaît voir la publication précédente 9.
- Fournir observation post-opératoire / soins jusqu'à ce que les animaux sont pleinement conscients pour assurer le confort des animaux. Gardez les animaux au chaud lors de la récupération, et ne les renvoie pas à une cage avec les autres animaux jusqu'à ce que la récupération complète. Faites attention à tout signe d'infection chez les animaux après la chirurgie.
- Anesthésier les animaux profondément par la kétamine (150 mg / kg) trois semaines après la chirurgie. Effectuer la fixation transcardial en perfusant les animaux avec saline à 0,9%, suivi par 4% de paraformaldehyde dans PBS 0,1 M (pH = 7,4), puis retirer et fixer le cerveau comme décrit dans 10 </ sup>.
- Post-fixer les cerveaux dans 4% de paraformaldehyde pendant 2-3 jours à 4 ° C.
- Incluez le tissu dans des blocs de paraffine par l'utilisation d'équipements de enrobage de tissus, et d'éviter la sous-remplissage ou de trop remplir la cassette car il peut interférer avec l'alignement ou de sectionner correcte. Faites attention à l'orientation du tissu dans le bloc de paraffine.
NOTE: L'hippocampe de rat, par exemple, est proche de la partie postérieure de l'hémisphère cérébral. Ainsi, le tissu doit être intégrée dans une manière qui sectionnement commence à partie postérieure du cerveau. Utilisez l'atlas de Paxinos 8 comme un guide pour atteindre la structure anatomique désiré. - Placez le microtome loin des courants d'air ou des portes, car les mouvements de l'air font de la manipulation des sections difficiles.
- Utilisez sections avec un um d'épaisseur ≥20 que cette profondeur avec soit nécessaire de produire des images Z-Stack de astrocytes complets. Ne pas utiliser les premières sections couple, car ils peuvent avoir une épaisseur indésirable en raison de e thermiqueXpansion.
- Placez les sections sur la surface de l'eau chaude (5 ± 2 ° C inférieure à la température de fusion de la paraffine) juste assez longtemps pour aplatir les sections.
Remarque: Au cours de l'expansion de la section peut perturber la morphologie de la structure. Utilisez petit pinceau pour transférer soigneusement sections. Recueillir deux à trois sections sur chaque diapositive. - Stocker les lames dans un rack dans une position verticale et laissez-les sécher à 37 ° C pendant plusieurs heures ou O / N.
2. immunohistochimie
- Déparaffiner sections de xylene, 2 x 10 min, et se réhydratent par gradient d'alcool (99,8%, 95%, 70% et, 10 minutes chacun) et du PBS.
- Incuber avec des anticorps contre la protéine gliale fibrillaire acide (GFAP) dilué à 1: 1500 dans du PBS contenant 0,25% d'albumine de sérum bovin (BSA), 0,25% de Triton X-100 à 3,5% et du sérum normal (O / N à 4 ° C).
- Laver les coupes dans du PBS pendant 3 x 5 min.
- Incuber avec phosphate alcalin conjugué secondaire antibodies pendant 1 h (1: 100, 21 ° C, dilué dans du PBS).
- Laver les coupes dans du PBS pendant 3 x 5 min.
NOTE: Il est important de se laver les sections correctement après Anticorps secondaires afin de minimiser la coloration de fond. - Incuber les coupes dans l'obscurité avec liquide rouge permanent chromogène (15-20 min). Note: Préparer la solution pas plus de 30 min avant utilisation.
- Laver les coupes dans du PBS pendant 3 x 5 min.
- Enfin, colorer les noyaux avec 4-6-diamidino-2-phénylindole (DAPI; 1: 500, dilué dans du PBS) avant de couvrir-glisser. Conserver les diapositives dans le réfrigérateur 24-48 h avant la microscopie.
3. microscopie confocale
REMARQUE: Pour l'évaluation quantitative (voir ci-dessous), sélectionnez un astrocyte avec un noyau de DAPI teinté clairement visible avec un minimum de chevauchement des branches pour réduire le risque d'erreurs. Produire des images Z-Stack prend du temps. Soyez patient et ne vous arrêtez pas au cours du traitement. Confocale à balayage laser vertical microscope est used pour créer des images 3D à partir des astrocytes.
- Mettez la lame sur le microscope-scène, et sélectionnez l'objectif 63X.
- Ouvrez le logiciel d'imagerie et cliquez sur système Start. Cliquez sur l'onglet Rechercher. Aller à céder, et sélectionnez GFP pour ajuster la lumière adéquate.
- Ouvrez le déclencheur pour réfléchir la lumière. Trouver le réflecteur Revolver sur le côté droit de l'obturateur et choisir la couleur qui devrait être reflétée par les astrocytes (vert, rouge ou violet); couleur rouge (FSet20 de WF) a été utilisé ici.
REMARQUE: Ne pas oublier de mettre l'image directement dans l'oculaire du microscope. - Pour trouver la meilleure mise au point, cliquez sur All fermée, mettre la goupille de microscope en mode écran, puis cliquez sur l'onglet Acquisition.
- Cliquez sur Configuration Smart sous l'onglet Acquisition; ouvre une fenêtre. Sélectionnez le fluorophore appropriée (c.-à-DAPI et Alexa Fluor 555, dans le projet actuel) dans la liste. La couleur est automatiquement sélectionné.
- Cliquez sur meilleur signal, et sur Appliquer, puis cliquez sur Définir exposition; l'ordinateur va alors régler automatiquement les paramètres d'exposition.
- Pour optimiser l'image, allez dans la fenêtre Couches. Enlever Track2, mettez en surbrillance Track1 et cliquez sur Live. Concentrer l'image si nécessaire.
- Dans la fenêtre Chaînes ajuster les touches suivantes; cliquer sur 1AU pour optimiser automatiquement le sténopé. Il est très important de faire cette étape sinon les images confocales seront non-optimale. Régler le gain d'avoir la meilleure intensité (garder ce réglage en dessous de 800 pour réduire le bruit en sus). Enfin, réglez le gain numérique entre 2 et 3.
- Enlever Track1, cliquez sur Track2 et répétez l'étape 3.8 pour Track2. Puis arrêtez Live.
- Allez à la fenêtre Mode d'acquisition. Améliorer l'image en optimisant Taille de l'image et de la moyenne. Pour changer la taille du cadre aller à X * Y et sélectionnez 1024 x 1024. Choisissez une vitesse lente pour créer une meilleure image.
- Aller à la moyenne et sélectionner un numéro ≥4. Cette valeur moyenne indique le nombre de balayages qui sera en moyenne de productione l'image acquise. Maintenant, cliquez sur le bouton Snap, et enregistrer l'image 2D capturé.
- Pour l'imagerie 3D, marquer l'élément Z-Stack sous Configuration Smart provoquant la fenêtre Z-Stack pour l'ouvrir.
- Régler les première et dernière positions pour le Z-Stack, à savoir la profondeur de la cellule. Cliquez d'abord sur le Live. Ensuite, utilisez la commande de mise au point du microscope à se concentrer sur la position la plus élevée de astrocyte dans le tissu, où le Z-Stack est de commencer. Cliquez sur Set Premier. Puis se concentrer vers la position la plus basse de l'astrocyte dans le tissu, où la numérisation Z-Stack doit être arrêté. Cliquez sur Set Dernier. Puis arrêtez Live.
- Choisissez l'intervalle; 1,01 um est utilisée dans la présente étude; intervalle choix peut être fait en cliquant sur Optimal pour définir le nombre de tranches.
- Cliquez sur Début de l'expérience. Enregistrez les images une fois la numérisation terminée. Cette image sera utilisée pour la mesure des paramètres suivants: surface spécifique et le volume du territoire des astrocytes, le soutien-gorge entier compris astrocyteNches, corps de la cellule, et le noyau.
- Acquérir une image 2D en utilisant un objectif 10X ou 20X comme décrit dans les étapes 3.6-3.11. Cette image peut être utilisée pour la mesure de l'intensité de fluorescence de l'immunoréactivité des anticorps, des astrocytes et de la densité (nombre / 1000 um 2).
4. Astrocyte Densité et GFAP + Fluorescence Intensity
- Ouvrez l'image 20X 2D. Cliquez sur Histo (Hisogram) sur le côté gauche de la fenêtre d'image.
- Pour calculer la densité des astrocytes, sélectionnez trois champs visuels consécutives relevant de l'objectif 20X. Comptez le nombre d'astrocytes qui présentent une soma clair avec moins de chevauchement des succursales dans les champs.
- Pour quantifier l'intensité de fluorescence, sélectionner un outil approprié (rectangulaire ou circulaire) sur le pied de page de la fenêtre d'image, et de choisir une zone pour la mesure. Notez la valeur moyenne et l'écart type apparaissent automatiquement sous l'image. Dans l'étude actuelle, une zone rectangulaire de 0,7 mm 2 entre striatum et la lame médiale du gyrus denté a été utilisé.
5. Branches d'astrocytes
- Pour quantifier la longueur et le nombre total de branches, utilisez des images 3D (acquis avec 20X) dans le logiciel d'analyse d'image. Tracez une ligne manuellement le long de la longueur de chaque branche de l'astrocyte sélectionné. Ensuite, sélectionnez la mesure-outil qui est spécialisé pour mesurer la longueur des lignes. Afin de quantifier le nombre de branches, sélectionnez le compte-outil pour compter le nombre de points marqués.
6. Volume et Superficie
NOTE: Marquage manuellement une structure en 3D des logiciels d'analyse d'image exige une attention et de la formation. Pratiquer plusieurs fois avant de commencer une expérience.
- Pour quantifier la zone de volume et de surface de l'astrocyte noyau, soma, corps cellulaire et territoire, transférer les images 3D (acquises dans les étapes 3.1-3.16) à un logiciel 3D d'analyse d'image tels que Volocity 6.1.
- Ouvrez le logiciel et créer un nouveaubibliothèque. Faites glisser toutes les images à la colonne grise à gauche dans la nouvelle bibliothèque. Ensuite, sélectionnez une image 3D. Sur la droite, il existe différents canaux de couleurs différentes. Tourner sur un canal d'intérêt; par exemple le canal bleu pour DAPI lors de la mesure du noyau. Changer manuellement la luminosité pour obtenir un contraste optimal.
- Sélectionnez le menu Outils, aller à faire du volume et de produire une seule image 3D à partir d'images Z-stack. Cliquez sur Propriétés dans le menu Edition et assurez-vous que X, Y et Z propriétés sont présentés; sinon il est impossible d'effectuer une analyse 3D.
- Cliquez sur Freehand icône de l'outil de RIO dans la barre. Pour mesurer la zone de volume et de surface du noyau astrocyte tracer une ligne autour du noyau de DAPI marqué.
- Pour mesurer la zone de volume et de surface du corps cellulaire d'astrocytes tracer une ligne autour du soma hors branches.
- Pour mesurer la zone de volume et de surface de l'ensemble des astrocytes (du corps cellulaire y compris les succursales) tracer une ligne autour de la suite de la somasurface de toutes les branches.
- Pour évaluer la zone de volume et de surface du territoire des astrocytes tracer une ligne entre les extrémités des branches.
REMARQUE: Appuyez sur Suppr du clavier pour effacer les dessins indésirables. - Cliquez sur le menu Mesures en haut de la fenêtre d'image pour créer un protocole de mesure; une fenêtre contenant différents outils ouvre.
- Drag trouver des objets pour haut de la fenêtre (panneau). Donnez un nom descriptif à la population 1, sélectionnez la couleur associée, et cliquez sur Mesure. Une autre fenêtre ouvre.
- Choisissez une zone paramètre-à-dire, le volume ou la surface. Cliquez sur OK. Les données apparaissent dans une table.
- Pour enregistrer les données, cliquez sur le menu de mesure et sélectionnez Faire Point de mesure.
- Sélectionnez un nouvel élément de mesure appelée à partir de la fenêtre ouverte. Ensuite, donner un nom aux données et cliquez sur OK.
- Enfin, exporter les données vers un logiciel de statistiques telles que Graph Pad ou le programme exceller. Utilisez t-test pour analyser les données, puis tracer 2D grAPHS.
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Representative Results
Cette section présente quelques exemples des observations qualitatives et quantitatives produites par l'analyse morphométrique 3D. Pour les résultats complets de l'ensemble des 12 paramètres mentionnés plus tôt, s'il vous plaît voir notre publication précédente 10.
Observations qualitatives
Les astrocytes exposées branches minces ou épaisses qui étaient généralement longtemps dans Aß 1-40 rats injectés (Figure 1). Quelques petits astrocytes forme étoilées-avec des branches courtes ont été observées dans le cortex cérébral, et un réseau compact d'astrocytes se sont produites dans le corps calleux.
Astrocytes dans les tissus cérébraux des animaux avec Aß 1-40 -Injection suivi par un traitement génistéine présentaient une forme étoilée avec des branches courtes et minces (figure 2) 10. Quelques astrocytes ont montré un aspect atrophique.
Densité et astrocytes GFAP +Intensité de fluorescence
Le nombre moyen d'astrocytes / 1000 2 um était significativement plus élevé chez les rats avec le peptide Aß 1-40 -Injection en comparaison avec les animaux dans Aß 1-40 -Injection groupe de traitement et de la génistéine (P <0,0001). En outre, l'intensité de fluorescence GFAP + était significativement plus faible dans la section de traitement avec la génistéine cerveau par rapport à Aß 1-40 non traité des animaux injecté (figure 3).
Analyse morphométrique des astrocytes Volume
Le volume du territoire astrocyte noyau, le corps de la cellule, l'ensemble des astrocytes et des astrocytes a diminué de manière significative dans le groupe traité par la génistéine par comparaison aux animaux non traités. Ce résultat suggère que la génistéine améliorée astrogliose provoquée par la présence de l'amyloïde (Figure 4A - D).
Figure 1. Image confocale d'un astrocyte. Un des astrocytes individuelle avec des branches épaisses et longues (pointe de flèche) et le noyau de DAPI marqué (flèche) dans un cerveau de rat soumis à l'injection de l'hippocampe de Aß 1-40. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Image confocale d'un astrocyte. Un astrocytes avec des branches courtes (pointe de flèche). Dans un cerveau de rat soumis à l'hippocampe Aß 1-40 -Injection, et pré-traitement génistéine administrée par gavage. P louer cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. GFAP + intensité de fluorescence a diminué de manière significative chez les animaux avec A β 1-40 -. Injection qui a reçu de pré-traitement génistéine valeurs sont la moyenne ± SEM. Cinquante astrocytes par animal ont été évalués. P <0,05 a été considérée comme significative, et T-test a été utilisé pour comparer les données entre les groupes avec ou sans traitement. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 4. Le volume moyen de noyau (A), le corps de la cellule (B), des astrocytes (y compris les branches; (C), et le territoire (D) dans des échantillons de cerveau prélevés sur des rats soumis à Aß 1-40 -Injection, avec ou sans génistéine pré-traitement. Genistein amélioré considérablement l'élargissement de noyau, corps de la cellule, l'ensemble des astrocytes, et territoire des astrocytes (voir ref 10). valeurs sont la moyenne ± SEM. Cinquante astrocytes par animal ont été évalués. P <0,05 a été considérée comme significative, et T-test a été utilisé pour comparer les données entre les groupes avant et après traitement. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Dans le protocole actuel, nous avons utilisé la morphométrie confocale 3D pour évaluer 12 paramètres différents qui ont été associés à la morphologie des astrocytes. A cet effet, l'hippocampe de rats tissu avec Aß 1-40 - astrogliose induit, avec ou sans prétraitement de la génistéine en tant qu'agent anti-inflammatoire ont été utilisés. En utilisant des images 3D et des logiciels morphométrique, nous avons pu montrer l'effet de la génistéine sur astrogliose-à-dire la morphologie des astrocytes.
Les changements dans l'environnement cellulaire intra et extra du tissu du cerveau peuvent modifier le volume et / ou la taille des cellules / tissus. Ces modifications sont considérées comme caractéristiques pathologiques dans diverses lésions cérébrales 3,11. Afin de quantifier ces modifications, un certain nombre de techniques sont utilisées. La plupart des enquêtes sont basées sur l'utilisation des images de basse résolution 2D capturées par microscopie éclairage ou électronique (EM) qui donnent des informations que sur une petite fraction de la CEll. Pour contourner cette limitation, 3D confocale morphométrie sur les images à haute résolution a été élaboré 11. Un autre avantage de la microscopie confocale est que l'architecture d'une cellule peut être étudiée depuis plusieurs images 2D consécutives sont obtenues tandis que Z-Stack imagerie est effectuée. En outre, la microscopie confocale 3D soulève la possibilité d'améliorer la qualité des images par filtrage le bruit de fond 11.
La méthode présentée ici est temps; prendre des images Z-stack avec un microscope confocal prend plusieurs minutes pour chaque cellule unique. En outre, le marquage manuellement une structure dans le logiciel nécessite un peu de pratique, et le chercheur peut avoir besoin de refaire les dessins plusieurs fois pour être sûr que la structure est correctement marqué. Il convient de mentionner que l'onglet 'Magic' en 3D logiciel d'analyse d'image comme Volocity, peut être utilisé pour marquer automatiquement tous les noyaux DAPI teinté dans une seule image. Cette option peut être utilisée lorsqueles astrocytes sont cultivés. Les coupes de cerveau, cependant, contiennent non seulement les astrocytes, mais aussi beaucoup d'autres cellules telles que les microglies et les neurones. Cela signifie que la plupart des noyaux de DAPI taché ne font pas partie des astrocytes. Les noyaux associés avec des astrocytes devraient être marqués manuellement à l'aide des images ayant deux noyaux DAPI-étiquetés et les astrocytes GFAP-immunoréactifs.
Dans ce protocole, des anticorps contre GFAP ont été utilisés pour visualiser les astrocytes dans les sections de paraffine. Les astrocytes peuvent également être visualisés à l'aide d'autres antigènes 12,13, ou des souris transgéniques. Les enquêteurs doivent être conscients des limites des méthodes, et d'utiliser la meilleure conception expérimentale possible en fonction de leurs objectifs. La limitation de l'utilisation d'anticorps contre la GFAP, par exemple, est que seulement 10 à 15% du cytosquelette peut être détectée. Cette limitation, toutefois, peut devenir un avantage lorsque l'on étudie astrogliose; l'augmentation du nombre d'astrocytes et un réseau dense de succursales de astrocytes en tanttrogliosis il peut être difficile d'identifier une seule cellule si une plus grande surface de la cellule est détectée. Bien que ce protocole décrire la quantification de 12 paramètres différents, mais l'enquêteur peut choisir ceux qui conviennent à leur but. Selon notre expérience, les mesures de tous les paramètres peuvent donner des informations précieuses sur les paramètres qui sont affectées de manière significative dans un certain état ou par un traitement. La méthode de quantification réalisée sur des images 3D dans capturées microscope confocal peut également être effectuée sur des coupes congelées. La question est de traiter les échantillons (fixation, déshydratation, inclusion et la coupe) d'une manière similaire depuis ces étapes peuvent conduire à un retrait ou un gonflement du tissu.
En conclusion, l'imagerie confocale 3D, en combinaison avec un logiciel morphométrique, permet de quantifier plusieurs paramètres associés à la morphologie de la cellule. Le protocole que nous avons présenté ici peut être utilisé pour l'évaluation des morphologique changes qui apparaissent dans une cellule, dans différentes conditions pathologiques, ou en tant que l'effet d'une stratégie d'intervention.
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Disclosures
Ce travail a été soutenu par des subventions du Conseil Comté d'Östergötland, (Suède) et le Centre de recherche cellulaire et moléculaire à l'Université des sciences médicales de l'Iran (Téhéran, Iran).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amyloid beta 1-40 | Sigma Aldrich | 79793 | Keep in -70 °C |
| Genistein | Sigma Aldrich | 446-72-0 | keep in -20 °C |
| polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein | DAKO | Z0334 | |
| alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies | DAKO | ||
| Liquid Permanent Chromogen | DAKO | K0640 | |
| Liquid permanent Red Substrate Buffer | DAKO | K0640 | |
| Cremophor EL | Sigma Aldrich | 27963 | Polyethoxylated castor oil - Step 1.1 |
| LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy | Carl Zeiss | ||
| Volocity 6.3 | Perkin Elmer Inc., | ||
| Image Analysis 2000 | Tekno Optic | ||
| Streotaxic apparatus | Stoelting | ||
| Graph pad Prism 5 | Graph pad software Inc. |
References
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Pellerin, L., et al. Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia. 55 (12), 1251-1262 (2007).
- Sofroniew, M. V., Vinters, H. V. Astrocytes: biology and pathology. Acta Neuropathol. 119 (1), 7-35 (2010).
- Pekny, M., Nilsson, M. Astrocyte activation and reactive gliosis. Glia. 50 (4), 427-434 (2005).
- Sofroniew, M. V. Molecular dissection of reactive astrogliosis and glial scar formation. Trends Neurosci. 32 (12), 638-647 (2009).
- Anderova, M., et al. Cell death/proliferation and alterations in glial morphology contribute to changes in diffusivity in the rat hippocampus after hypoxia-ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (3), 894-907 (2011).
- Hatten, M. E. Neuronal regulation of astroglial morphology and proliferation in vitro. J Cell Biol. 100 (2), 384-396 (1985).
- Paxinos, G., Watson, C. A stereotaxic atlas of the rat brain. , Academic. New York. (1998).
- Kirby, E. D., Jensen, K., Goosens, K. A., Kaufer, D. Stereotaxic surgery for excitotoxic lesion of specific brain areas in the adult rat. J Vis Exp. (65), e4079 (2012).
- Bagheri, M., et al. Amyloid beta(1-40)-induced astrogliosis and the effect of genistein treatment in rat: a three-dimensional confocal morphometric and proteomic study. PloS One. 8 (10), e76526 (2013).
- Chvatal, A., Anderova, M., Kirchhoff, F. Three-dimensional confocal morphometry - a new approach for studying dynamic changes in cell morphology in brain slices. J Anat. 210 (6), 671-683 (2007).
- Kulkarni, P. M., et al. Quantitative 3-D analysis of GFAP labeled astrocytes from fluorescence confocal images. J Neuroscie Methods. 15 (246), 38-51 (2015).
- Wagner, D. C., et al. Object-based analysis of astroglial reaction and astrocyte subtype morphology after ischemic brain injury. Acta Neurobiol Exp. 73 (1), 79-87 (2013).
