Abstract
Innervation spiller en central rolle i udviklingen, homeostase og regenerering af organer og væv. Imidlertid er mekanismerne bag disse fænomener ikke godt forstået endnu. Især er den rolle, innervation i tand udvikling og regeneration forsømt.
Adskillige in vivo-undersøgelser har givet vigtige oplysninger om de mønstre af innervation af dental væv under udviklings- og reparation processer i forskellige dyremodeller. Men de fleste af disse fremgangsmåder ikke er optimale til at fremhæve den molekylære basis for interaktionerne mellem nervefibre og målorganer og væv.
Co-kulturer udgør en værdifuld metode til at undersøge og manipulere samspillet mellem nervefibre og tænder på en kontrolleret og isoleret miljø. I de sidste årtier har konventionelle co-kulturer under anvendelse af samme dyrkningsmedium udført i meget korte perioder (f.eks, to dage)at undersøge de attraktive eller frastødende effekter af at udvikle mundtlige og dental væv på sensoriske nervefibre. Imidlertid er udvidelse af kulturen periode, der kræves for at undersøge virkningerne af innervation på tanden morfogenese og cytodifferentiation.
Mikrofluidiksystemer tillader co-kulturer af neuroner og forskellige celletyper i deres passende kulturmedier. Vi har for nylig påvist, at trigeminale ganglier (TG) og tænder er i stand til at overleve i en lang periode, hvor co-dyrket i mikrofluide anordninger, og at de opretholder i disse betingelser samme innervation mønster, at de viser in vivo.
På dette grundlag beskriver vi, hvordan at isolere og co-kultur udvikler trigeminusganglier og tand bakterier i en mikrofluid co-kultur system.This protokol beskriver en enkel og fleksibel måde at co-kultur ganglier / nerver og målvæv og studere roller specifikke molekyler på sådanne interaktioner i et controlled og isoleret miljø.
Introduction
Innervation spiller en central rolle i udviklingen, homeostase og regenerering af organer og væv 1,2. Endvidere er innervation involveret i reguleringen af stamcelleproliferation, mobilisering og differentiering 3-5. Faktisk har de seneste undersøgelser realiseret i væv af orofacial kompleks vist, at parasympatiske nerver er nødvendige for epitelial stamceller funktion under udvikling og revitalisering af spytkirtlerne 6,7. Ligeledes er det blevet vist, at innervation er nødvendigt for udviklingen og vedligeholdelsen af smagsløgene 8-11. Det er således vigtigt at analysere de endnu forsømte roller innervation i udviklingen af andre vigtige orofaciale organer og væv, såsom tænder.
På trods af den rige innervation af voksne tænder, og i modsætning til alle andre organer og væv i kroppen, udvikping tænder begynder at blive innerveret tidligst postnatale faser. Tænder udvikles som et resultat af sekventielle og gensidige interaktioner mellem den mundtlige ectoderm og kraniel neurale crest-afledte mesenchyme. Disse interaktioner giver anledning til epitel-afledte ameloblaster og mesenchym-afledte odontoblasts, der er ansvarlige for dannelsen af emalje og dentin, henholdsvis 12. Sensoriske nerver fra trigeminusganglier og sympatiske nerver fra den overlegne cervikale ganglier innerverer den voksne tænder 13-15. Under embryogenese, nervefibre udgår fra trigeminale ganglier projekt over for udviklingslandene tand kim, og gradvis omgiver dem, men de ikke trænge ind i dentale papil mesenkym 13. Nervefibre ind i dental pulp mesenchym på mere avancerede udviklingsstadier, der korrelerer med odontoblast differentiering og dentin matrixdeponering 16. Dental pulp innervation er gratiseted snart efter tandfrembrud i mundhulen 13. Tidligere undersøgelser har vist, at forskellige semaphorins og neurotrophiner er involveret i reguleringen af innervation under odontogenese 16-19. Tidligere undersøgelser har klart vist, at innervation er en forudsætning for tand dannelse i fishes 20. Nyere undersøgelser har vist, at homeostase af dental mesenchym stamceller i mus fortænder reguleres af sensoriske nerver via sekretion af sonisk pindsvin (Shh) 21. Ikke desto mindre rolle innervation i tand initiering, udvikling og regeneration er stadig meget kontroversielt i pattedyr 22-24.
En overflod af in vivo studier har givet vigtige oplysninger om de mønstre af innervation af dental væv under udviklings- og reparation processer forskellige dyremodeller 13,25,26. Men de fleste af disse hensigtsømhed ikke er optimale til at fremhæve den molekylære basis for samspillet mellem nervefibre og målorganer og væv. Co-kulturer udgør en værdifuld metode til at undersøge og manipulere samspillet mellem nervefibre og tænder på en kontrolleret og isoleret miljø 26-29. Samtidig, co-dyrkning er underlagt forskellige tekniske justeringer. For eksempel, nerver og specifikke dental væv (f.eks dental pulp, dental follicle, dental epitel) kræver ofte forskellige kulturmedier for at sikre væv overlevelse for lange perioder 30-32.
I de sidste årtier har konventionelle co-kulturer ved hjælp af den samme dyrkningsmedium udført i meget korte perioder (f.eks to dage) for at undersøge de attraktive eller frastødende effekter af at udvikle mundtlige og dental væv på sensoriske nervefibre 27-29.Imidlertid er udvidelse af kulturen periode forpligtet til at undersøge virkningerne af innervation på tanden morfogenese og cytodifferentiation, og studere dynamikken i nervefibre forgrening inden målorganer. Derfor ville ikke-sammenhængende co-kulturer være mere passende at foretage undersøgelser neuronale-dental væv interaktioner.
Mikrofluidiksystemer tillader co-kulturer af neuroner og forskellige celletyper i deres passende kulturmedier. I disse indretninger er dental væv og neuroner adskilt i forskellige rum, samtidig med at væksten af axoner fra de neurale cellelegemer gennem mikrokanaler mod rum indeholdende deres målvæv 33. Mikrofluidenheder er allerede blevet brugt til at studere samspillet mellem neuroner og mikroglia 34,35 samt celle til celle interaktioner i kræft og neovaskularisering 35. Desuden er disse systemer blevet anvendt til at undersøge samspillet mellem dorsal rodganglier og osteoblaster 36.
Vi har for nylig påvist, at trigeminale ganglier (TG) og tænder er i stand til at overleve i lange perioder, hvor co-dyrket i mikrovæskeanordninger 37. Desuden har vi påvist, at tænderne fra forskellige udviklingsstadier opretholde disse in vitro betingelser de samme frastødende eller attraktive virkninger på trigeminus innervation, at de viser in vivo 37. Denne protokol indeholder oplysninger om en enkel, kraftfuld og fleksibel måde at co-kultur ganglier / nerver og målvæv og at studere roller specifikke molekyler på sådanne interaktioner i et kontrolleret og isoleret miljø.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus blev opretholdt og håndteres i henhold til den schweiziske dyrevelfærd Law og i overensstemmelse med reglerne i Cantonal Veterinary kontoret, Zürich.
1. Udarbejdelse af Dissektion Materiel, Kultur Media, mikrofluidenheder
- Autoklave mikro-dissektion pincet og sakse (121 ° C, sterilisering tid: 20 min) og gemme dem i en steril beholder.
- Sterilisere dækglas (24 mm x 24 mm) ved at inkubere dem i 1 M HCI i 24 timer på en orbital ryster ved 37 ° C. Vaske dem tre gange med sterilt, destilleret H 2 O og tre gange med ethanol 99%. Tør derefter dækglassene ved 37 ° C eller under sterile flow hætte. Endelig autoklaveres eller udsættes dækglassene til UV-lys (30 min) for at fuldføre sterilisering. Dækglas kan derefter opbevares i ethanol 70%.
- Fjern forsigtigt AXIS Axon Isolation Enheder fra pakken med sterile pincetter og placere dem i en steril petriskål. Ved hjælp af en steril biopsitang (ø: 1 mm) oprette et hul per prøve, der skal dyrkes (figur 1) i korrespondance med kultursupernatanterne kamre.
BEMÆRK: Du må ikke slå for tæt på mikrorillerne, som de kunne blive beskadiget af det påførte tryk. - Sterilisere AXIS Axon Isolation Enheder ved immerging dem i ethanol 70%. Tørre derefter AXIS Axon Isolation Enheder og dækglas helt under en steril flow hætte. Vent mindst 3 timer, før du fortsætter.
BEMÆRK: ufuldstændig tørring vil resultere i mangelfuld samling af mikrofluidenheder. - Placer hver dækglas i en 35 mm petriskål eller i en brønd i en 6-brønde plade.
- Placer AXIS Axon Isolation Device på dækglasset, og tryk forsigtigt, men fast med en pincet med bøjede ender for at muliggøre fuld vedhæftning mellem isolering enheden og dækglas.
- I hver kultur kammer, pipette 150 pi af poly-D-lysin (0,1 mg / ml i sterilt, destilleret H2OO). Placer mikrofluidapparater under vakuum i 5 minutter, for at fjerne al luft fra kulturen kamre.
- Hvis luft kan stadig inden for kamre, re-pipette ses poly-D-lysin løsning ind i kamrene.
- Inkubér enheder med poly-D-lysin O / N ved 37 ° C.
- Vask kamre tre gange med sterilt, destilleret H2O
- Fyld kamre med 150 pi laminin arbejdsopløsning (Sigma-Aldrich, 5 ug / ml, i PBS eller serumfrit medium), og der inkuberes O / N ved 37 ° C.
- Forbered 50 ml medium til trigeminusganglier kulturer 37, sammensat som følger: 48 ml Neurobasal medium, 1 ml B-27, 100 U / ml penicillin / streptomycin, 2 mM L-glutamin, 5 ng / ml nervevækstfaktor (NGF) , 12:25 cytosinarabinosid.
- Forbered 50 ml medium til tand kim kulturer 37, sammensat som følger: 40 ml DMEM-F12, 10 ml føtalt bovint serum (FBS, slutkoncentration: 20%), 100 U / ml penicillin / streptomycin, 2 mM L-glutamin, 150 ug / ml ascorbinsyre.
2. Mouse Embryo Generation og Dissection
- Bestem embryonale Alder i henhold til vaginal prop (vaginal prop: embryonale dag i udvikling 0,5, E0.5), og bekræft det via morfologiske kriterier. Til denne protokol, vi generelt bruger E14.5-E17.5 museembryoer.
- Rengør dissektion område og Stereoskopet med ethanol 70%.
- Sacrifice den gravide mor via cervikal dislokation. Blokere halsen af musen med den første og anden finger på et gitter, og træk med afgørelse halen.
- Dissekere huden omkring maven, og åbne maven med en saks. Find livmoderen: under sådanne sene stadier af graviditeten, livmoderen rigeligt fylde bughulen.
- Dissekere ud livmoderen og anbringes i et rør fyldt med PBS på is. Når på is, kan vævet være tilbage til flere timer. Kassér liget af moderen efter institutionelle retningslinier <li> Dissekere ud embryoner fra livmoderen og befri dem fra deres extraembryonic væv. Placer embryoner i PBS på is.
- Halshugge embryoner med saks, og adskil underkæben fra resten af hovedet under anvendelse af mikro-dissektion saks (figur 2A). Fjerne netop underkæben, uden at beskadige trigeminus ganglier; da sidstnævnte er lokaliseret i tæt nærhed til underkæben, er muligt deres skade. Bevare underkæben og resten af hovedet i kold PBS, på is.
- At dissekere TG, tage hovedet og placere den på en dissektion glas petriskål, der tidligere fyldt med kold PBS. Under anvendelse af de pincet, fjern skindet og kraniet. Fjern derefter telencephalon og lillehjernen ved at placere pincet under telencephalon og elevator; telencephalon og cerebellum vil flip sammen, forlader bunden af kraniet blotlagt.
- Lokalisere det trigeminale ganglier (vist i figur 2B). Brug pincetat adskille TG fra trigeminus nerver. Fjerne resterne af trigeminus fremskrivninger ved hjælp af dissektion nåle som knive. Placer dissekeret TG i en petriskål fyldt med kold PBS og holde dem på is.
- At dissekere embryonale tænder, placere den nedre kæbe, der tidligere er adskilt fra kraniet, på dissektion glas petriskål, fyldt med kold PBS. Anvendelse af dissektion nåle som knive, fjern tungen og huden omkring kæben. Adskil venstre og højre hemi-kæber ved at skære langs midterlinien af kæben. De tand bakterier er let synlige, som vist i figur 1C. Isoler tanden bakterier ved hjælp dissektion nåle og fjerne overskuddet af ikke-dentale væv. Placer dissekerede tand bakterier i en petriskål fyldt med kold PBS og holde dem på is.
3. Mikrofluid Co-kulturer
- Efter dissektion fjernes laminin fra mikrofluidenheder. Fyld kamrene med 200 ul af respective medier.
- Med pincet, overføres forsigtigt de dissekerede TG og tand bakterier i hullerne skabt af stansning (figur 1D). Sørg for, at tand bakterier ikke flyder, og at de synker, indtil de kontakte dækglas.
- Kultur prøverne i inkubator ved 37 ° C, 5% CO2.
- Ændre dyrkningsmediet hver 48 timer. Må ikke tømmes kamrene helt, og ikke pipette direkte i kultur kamre. Fuldstændig tømning af kamre ville resultere i dannelsen af luftbobler inden kamrene; direkte afpipetteres kammeret ville resultere i axonal skade. For at undgå disse problemer, skal du fjerne mediet peger pipetten mod den udvendige side af brøndene; Tilsvarende pipettere det friske medium på siden af brøndene placeret modsat til kamrene.
- Under dyrkningsperioden, kan co-kulturer let afbildet af time-lapse mikroskopi. Co-kulturer kan opretholdes i over 10 dage.
- Efter kulturen period, vaske kamrene ved pipettering 150 pi PBS i en brønd pr kammer, og lade PBS flyde gennem kamrene tre gange.
- Fjern PBS og løse prøverne ved pipettering 150 ul paraformaldehyd 4% (i PBS) i en brønd pr kammer; inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter.
- Vask kamrene to gange med PBS som beskrevet i 3.6.
- Fortsæt med yderligere analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Disse resultater viser, at isolerede trigeminusganglier kan vokse i et rum af mikrovæskeanordning og desuden, at udviklingen af de isolerede tand bakterier opretholdes i en lang periode i det andet rum af mikrofluidapparatet. Forskellige kulturmedier anvendes i de to rum, og mikrorillerne mellem de to rum tillader udvidelse af axon fra trigeminus ganglion over for udviklingslandene tand bakterier. Figur 3 repræsenterer en visualisering af neurofilament via immunfluorescens 37, i en co-kultur af en mus embryonale trigeminus ganglion og muse embryonale fortand i den beskrevne mikrofluid co-dyrkningssystem. Mus fortænder ikke innerverede under udviklingen in vivo, konsekvent, er axoner fra trigeminus ganglion ophævet ved at udvikle tand kim i kultur for så meget som 10 døgn Figur 3A viser en oversigt over den axonal kammer i dette. co-dyrkningssystem. Figur 3B og 3C viser progressive forstørrelser af neuritter i de axonale kamre og mikro-lunde. Tand bakterier (eller eventuelle co-kulturer organer eller væv) kan nemt fjernes fra mikrofluidenheder og analyseret separat fx behandles til histologiske farvninger eller til genekspression analyse.
Figur 1. synspunkter monteret microfluidic samdyrkning indretning (A) oppefra; . (B) delvist lateral De kultur kamre (cc) er fremhævet med rødt (eosin) og blå (toluidinblå); mikroriller (mg) kan ses som en hvid streg mellem kultur kamre. Ganglier og samdyrket organer / væv placeres i passende kultur kammeret via de udstansede huller (ph) i enheden. Medier tilsættes og fjernes via brøndene (MW). "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53114/53114fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. (A) fra siden af en muse embryo head (embryonisk dag i udviklingen E14.5). Den sorte linje angiver, hvor underkæben skal skæres for at bevare integriteten af både trigeminusganglier og tand bakterier. (B) Mouse embryo hoved (E14.5) efter fjernelse af underkæben, kranium og telencephalon. Sorte pile angiver trigeminale ganglier (TG). (C) Underkæben af muse embryo (E14.5) efter fjernelse af tungen. Sorte pile angiver lokaliseringen af de forskellige tand bakterier (Inc: fortand; FM: første kindtænder). (D) Skematisk afbildning af mikrofluid co-kultur enhed.p_upload / 53114 / 53114fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Co-kultur af trigeminus ganglion og fortand kim fra vildtype-E15.5 museembryoer. (A) Overblik over den axonal kammer (neurofilament, DAPI). Målestok: 300 um. (B) Højere forstørrelse af mikrorillerne og neuritter vokser ind i axonal kammer (neurofilament, DAPI, superposition af fluorescerende og lysfelt billeder). Målestok: 150 um. (C) Højere forstørrelse viser væksten af axoner inden mikrorillerne (neurofilament). Målestok:. 75 um Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forrige in vitro studier af tand innervation var baseret på konventionelle co-kulturer af trigeminusganglier og dental væv eller celler 26,28,29. Disse undersøgelser blev udført for at undersøge hovedsagelig de attraktive virkninger af disse celler eller væv på sensoriske axoner 38. Selvom bringe betydelige fremskridt på området, blev en række tekniske spørgsmål rejst. Tooth bakterier begynder at degenerere efter få dages kultur 37. Baseret på disse observationer, voksende neuroner og tænder i de samme dyrkningsbetingelser forringer en eventuel analyse af molekyler involveret i krydstale mellem disse to væv. Optimale dyrkningsbetingelser er nødvendige for at bevare den fysiologiske molekylære profil trigeminale ganglier og dentale væv.
Mikrofluidiksystemer er blevet anvendt hidtil til at co-kultur neuroner og forskellige celletyper i optimerede medier 34,36. Dette mikrofluidik systemet kan repræsentere mere trofuldt in vivo-situationen, hvor neurale cellelegemer, axonale terminaler og målvæv er generelt udsat for forskellige cellulære og molekylære mikromiljøer. Senere er mikrofluidiksystemer anordninger blevet anvendt til at co-kultur hel dorsalrodsganglier og osteoblaster 36. Vi har for nylig vist, at trigeminusganglier og tænder er i stand til at overleve i lange perioder, hvor co-dyrket i mikrovæskeanordninger 37. Desuden har vi vist, at tænderne fra forskellige udviklingsstadier opretholde disse in vitro betingelser de samme frastødende eller attraktive virkninger på trigeminus innervation, at de udstillede in vivo 37.
Den beskrevne protokol kræver øvelse og håndelag, især til mikrodissektion af trigeminusganglier og tand bakterier. Trigeminale ganglier let revet under dissektion. Derfor foreslår vi brug af dissektion nåle i stedet for dissektion forceps, for at fjerne det væv, der omgiver ganglier. Ligeledes bør der udvises særlig omhu, mens dissekere tand bakterier, for at undgå at beskadige tand epitel, mens adskille det fra de omgivende mesenkymale væv. Desuden under den første dag i co-kultur, særlig omhu bør tages i håndtering inkubatoren, da kraftige vibrationer kan forringe trigeminus ganglion vedhæftning til kultur dækglasset. Under co-kultur periode, bør medier fjernes og tilføjes ved pipettering i brøndene, på siden modsat til kultur kamre. Håbefulde eller pipettering medier i nærheden af de kultur kamre ville resultere i axonal skade.
Den beskrevne protokol kan modificeres til at studere innervation af flere organer fra embryoner og embryoner eller postnatale væv og celletyper. Microfluidics systemer kunne udgøre en passende platform til at tillade længere kultur perioder for studiet af samspillet mellem neuroner og voksende teeth. Endvidere adskillelse af den neuronale fra dental rum tillader analyse af virkningerne af specifikke protein lokalisering og kvantificering 33,37. Blokerende antistoffer eller rekombinante proteiner kunne også tilsættes til de adskilte rum i de mikrofluidiksystemer anordninger til at analysere deres virkninger på neuronale og dentale væv. For eksempel behandling af trigeminale ganglier med NGF understøtter deres overlevelse og tillader neuronal udvækst. Men i dette arbejde exogen NGF er fraværende fra tanden kim rum, hvor signalerne tand-afledte er de eneste ansvarlige for neuronal tiltrækning eller frastødning. Tilsvarende kan andre rekombinante molekyler, antistoffer eller lægemidler anvendes til at manipulere systemet under kontrollerede forhold.
De store begrænsninger i protokollen præsenteret bor i den relative høje pris på kommercielle mikrofluidenheder og væsentlige 2D-set up af co-kultur-systemet. Faktisk, selvom hele organer kan være kulturd begge organer og axoner vokser i 2D-klæbende dyrkningsbetingelser på et dækglas; tilpasning af systemet ville være nødvendig for at opnå en tredimensional, realistisk gengivelse af innervation.
Afslutningsvis mikrofluidenheder er optimale for at undersøge den rolle, innervation i udviklingen eller regenererende organer og tillade studier af samspillet mellem neuronale og målvæv i optimale dyrkningsbetingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AXIS Axon Isolation Devices | Millipore | AX15010-TC | Microchannels of different lenght are available |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504 | |
| Recombinant Mouse beta-NGF | R&D Systems | 1156-NG-100 | Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 |
References
- Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 71, 2241-2251 (2014).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
- Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 552-565 (2011).
- Katayama, Y., Battista, M., et al. Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from bone marrow. Cell. 124 (2), 407-421 (2006).
- Fitch, S. R., Kimber, G. M., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell stem cell. 11 (4), 554-566 (2012).
- Knox, S. M., Lombaert, I. M. a, Reed, X., Vitale-Cross, L., Gutkind, J. S., Hoffman, M. P. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. Science(New York, N.Y.). 329 (5999), 1645-1647 (2010).
- Knox, S. M., Lombaert, I. M. A., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature communications. 4, 1494 (2013).
- Oakley, B., Witt, M. Building sensory receptors on the tongue. Journal of neurocytology. 33 (6), 631-646 (2004).
- Oakley, B., Brandemihl, A., Cooper, D., Lau, D., Lawton, A., Zhang, C. The morphogenesis of mouse vallate gustatory epithelium and taste buds requires BDNF-dependent taste neurons. Brain research. Developmental brain research. 105 (1), 85-96 (1998).
- Sun, H., Oakley, B. Development of anterior gustatory epithelia in the palate and tongue requires epidermal growth factor receptor. Developmental biology. 242 (1), 31-43 (2002).
- Mistretta, C. M., Goosens, K. a, Farinas, I., Reichardt, L. F. Alterations in size, number, and morphology of gustatory papillae and taste buds in BDNF null mutant mice demonstrate neural dependence of developing taste organs. The Journal of comparative neurology. 409 (1), 13-24 (1999).
- Mitsiadis, T. a, Graf, D. Cell fate determination during tooth development and regeneration. Birth defects research. Part C, Embryo today reviews. 87 (3), 199-211 (2009).
- Mohamed, S. S., Atkinson, M. E. A histological study of the innervation of developing mouse teeth. Journal of anatomy. 136 (Pt 4), 735-749 (1983).
- Luukko, K. Immunohistochemical localization of nerve fibres during development of embryonic rat molar using peripherin and protein gene product 9.5 antibodies. Archives of oral biology. 42 (3), 189-195 (1997).
- Johnsen, D. Innervation of teeth: qualitative, quantitative, and developmental assessment. Journal of dental research. 64, 555-563 (1985).
- Mitsiadis, T. a, Dicou, E., Joffre, A., Magloire, H. Immunohistochemical localization of nerve growth factor (NGF) and NGF receptor (NGF-R) in the developing first molar tooth of the rat. Differentiation; research in biological diversity. 49 (1), 47-61 (1992).
- Mitsiadis, T. a, Luukko, K. Neurotrophins in odontogenesis. The International journal of developmental biology. 39 (1), 0214-6282 (1995).
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation; research in biological diversity. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kettunen, P., Løes, S., et al. Coordination of trigeminal axon navigation and patterning with tooth organ formation: epithelial-mesenchymal interactions and epithelial Wnt4 and Tgfbeta1 regulate semaphorin 3a expression in the dental mesenchyme. Development (Cambridge, England). 132 (2), 323-334 (2005).
- Tuisku, F., Hildebrand, C. Evidence for a neural influence on tooth germ generation in a polyphyodont species. Developmental biology. 165, 1-9 (1994).
- Zhao, H., Feng, J., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell stem cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Kettunen, P., Kvinnsland, H., Luukko, K. Mouse rudimentary diastema tooth primordia are devoid of peripheral nerve fibers. Anatomy and embryology. 205 (3), 187-191 (2002).
- Lumsend, A., Buchanan, J. An experimental study of timing and topography of early tooth development in the mouse embryo. Archives of oral biology. , 301-311 (1986).
- Kollar, E., Lumsend, A. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de Biologia Buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
- Luukko, K., Kettunen, P. Coordination of tooth morphogenesis and neuronal development through tissue interactions: lessons from mouse models. Experimental cell research. 325 (2), 72-77 (2014).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
- Lumsend, A., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323 (9), 538-539 (1986).
- Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience letters. 308 (3), 161-164 (2001).
- Petrinovic, M. M., Duncan, C. S., et al. Neuronal Nogo-A regulates neurite fasciculation, branching and extension in the developing nervous system. Development(Cambridge, England). 137 (15), 2539-2550 (2010).
- Otsu, K., Fujiwara, N., Harada, H. Odontogenesis. Methods in Molecular Biology. 887, (2012).
- Mitsiadis, T. a, Drouin, J. Deletion of the Pitx1 genomic locus affects mandibular tooth morphogenesis and expression of the Barx1 and Tbx1 genes. Developmental biology. 313 (2), 887-896 (2008).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Hosmane, S., Tegenge, M. A., et al. Toll/interleukin-1 receptor domain-containing adapter inducing interferon-β mediates microglial phagocytosis of degenerating axons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7745-7757 (2012).
- Delamarche, E., Tonna, N., Lovchik, R. D., Bianco, F., Matteoli, M. Pharmacology on microfluidics: multimodal analysis for studying celll-cell interaction. Current opinion in pharmacology. 13 (5), 821-828 (2013).
- Neto, E., Alves, C. J., et al. Sensory neurons and osteoblasts: close partners in a microfluidic environment. Integrative Biology. , (2014).
- Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in physiology. 5 (August), (2014).
- Connor, R., Tessier-Lavigne, M. Identification of maxillary factor, a maxillary process-derived chemoattractant for developing trigeminal sensory axons. Neuron. 24, 165-178 (1999).
