Abstract
Innervation spelar en nyckelroll i utvecklingen, homeostas och förnyelse av organ och vävnader. Emellertid är de mekanismer som ligger bakom dessa fenomen inte förstått än. Framför allt försummas roll innervation i tand utveckling och förnyelse.
Flera in vivo-studier har gett viktig information om mönster innervation av tandvävnad under utveckling och reparationsprocesser i olika djurmodeller. Men de flesta av dessa tillvägagångssätt är inte optimala för att belysa den molekylära grunden för växelverkan mellan nervfibrer och målorgan och vävnader.
Samodlingar utgör en värdefull metod för att undersöka och manipulera interaktioner mellan nervfibrer och tänder i en kontrollerad och isolerad miljö. Under de senaste årtiondena har konventionella samkulturer med samma odlingsmedium utförts under mycket korta perioder (t.ex., två dagar)att undersöka de attraktiva eller motbjudande effekterna av att utveckla orala och dentala vävnader på sensoriska nervfibrer. Dock är en förlängning av odlingsperioden som krävs för att undersöka effekterna av innervation på tand morfogenes och cytodifferentiation.
Mikrofluidik system kan co-kulturer av nervceller och olika celltyper i sitt lämpligt odlingsmedia. Vi har nyligen visat att trigeminala ganglierna (TG) och tänderna kan överleva under en lång tidsperiod när samodlade i mikrofluidikanordningar, och att de upprätthåller under dessa förhållanden samma innervation mönster som de visar in vivo.
På grundval av detta beskriver vi hur man isolera och co-kultur utvecklar trigeminala ganglier och tand bakterier i en mikroflödessystem co-kultur system.Detta protokoll beskriver ett enkelt och flexibelt sätt att samarbeta kultur ganglierna / nerver och målvävnader och att studera rollerna specifika molekyler på sådana interaktioner i en controlled och isolerad miljö.
Introduction
Innervation spelar en nyckelroll i utvecklingen, homeostas och förnyelse av organ och vävnader 1,2. Dessutom är innervationen involverat i regleringen av stamcellsproliferering, mobilisering och differentiering 3 - 5. I själva verket har nya studier genomförda i vävnader i orofacial komplex visat att parasympatiska nerver är nödvändiga för epitel progenitorceller funktion under utveckling och förnyelse av spottkörtlarna 6,7. På samma sätt har det visat sig att innervation är nödvändigt för utveckling och underhåll av smaklökar 8-11. Därför är det viktigt att analysera ännu försummade roller innervation i utvecklingen av andra viktiga orofaciala organ och vävnader såsom tänder.
Trots den rika innervation av vuxna tänder, och i motsats till alla andra organ och vävnader i kroppen, utveckping tänderna börjar att innerveras tidigast efter födseln. Tänder utvecklas som en följd av sekventiella och ömsesidiga samspelet mellan den muntliga ektoderm och hjärn neurallisten härrörande mesenkym. Dessa interaktioner ger upphov till epitelceller härledda ameloblaster och mesenkym-derived odontoblaster som är ansvariga för bildandet av emalj och dentin, respektive 12. Sensoriska nerver från trigeminala ganglier och sympatiska nerver från den överlägsna livmoderhalscancer ganglierna innerverar de permanenta tänderna 13-15. Under embryogenes, nervfibrer som härrör från trigeminala ganglia projektet gentemot utvecklingstand bakterier och successivt omger dem, men att de inte tränger in i tand papilla mesenkymet 13. Nervfibrer in i tandens pulpa mesenkymet på mer avancerade utvecklingsstadier som korrelerar med odontoblast differentiering och tandben matrisavsättning 16. Tandpulpa innervation är kompleted strax efter tand utbrott i munhålan 13. Tidigare studier har visat att olika semaforiner och neurotrofinerna är inblandade i regleringen av innervation under odontogenes 16-19. Tidigare studier har tydligt visat att innervation är en förutsättning för att tandbildning i fiskar 20. Senare studier har visat att homeostas av dental mesenkym stamceller i mus framtänder regleras av sensoriska nerver via utsöndring av sonic hedgehog (Shh) 21. Ändå är den roll som innervation i tand initiering, utveckling och förnyelse fortfarande mycket kontroversiell hos däggdjur 22 - 24.
En uppsjö av in vivo-studier har gett viktig information om mönster innervation av tandvävnad under utveckling och reparationsprocesser i olika djurmodeller 13,25,26. De flesta av dessa Approvärk är inte optimalt att belysa den molekylära grunden för samspelet mellan nervfibrer och målorgan och vävnader. Samodlingar utgör en värdefull metod för att undersöka och manipulera interaktioner mellan nervfibrer och tänder i en kontrollerad och isolerad miljö 26-29. Samtidigt, är samodling föremål för olika tekniska justeringar. Till exempel, nerver och specifika dentala vävnader (t.ex. tandvård massa, tandvård follikelstimulerande, tandvård epitel) ofta kräver olika odlingsmedier för att säkerställa vävnadsöverlevnad under långa tidsperioder 30-32.
Under de senaste decennierna har konventionella samkulturer med samma odlingsmedium utförts under mycket korta perioder (t.ex., två dagar) att undersöka de attraktiva eller motbjudande effekterna av att utveckla orala och dentala vävnader på sensoriska nervtrådar 27-29.Dock är en förlängning av odlingsperioden som krävs för att undersöka effekterna av innervation på tand morfogenes och cytodifferentiation och studera dynamiken i nervfibrer förgrening inom målorgan. Därför skulle icke-angränsande samkulturer vara lämpligare att genomföra studier på neuronala-dentala vävnader interaktioner.
Mikrofluidik system kan co-kulturer av nervceller och olika celltyper i sitt lämpligt odlingsmedia. I dessa anordningar är dentala vävnader och nervceller separerade i olika avdelningar, samtidigt som tillväxten av axoner från de neurala cellkroppar genom mikro mot facket som innehåller deras målvävnad 33. Mikrofluidikanordningar har redan använts för att studera samspelet mellan nervceller och mikroglia 34,35, liksom cell till cell interaktioner i cancer och kärlnybildning 35. Dessutom har dessa system använts för att studera samspelet mellan dorsal rotganglier och osteoblaster 36.
Vi har nyligen visat att trigeminala ganglierna (TG) och tänderna kan överleva under långa tidsperioder när samodlade i mikrofluidikanordningar 37. Dessutom har vi visat att tänderna från olika utvecklingsstadier upprätthålla dessa in vitro betingelser samma frånstötande eller attraktiva effekter på trigeminala innervation som de visar in vivo 37. Detta protokoll ger information om en enkel, kraftfull och flexibelt sätt att samarbeta kultur ganglierna / nerver och målvävnader och att studera roller specifika molekyler på sådana interaktioner i en kontrollerad och isolerad miljö.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla möss bibehölls och hanteras enligt den schweiziska djurskyddslagen och i enlighet med bestämmelserna i kontoret Cantonal veterinär, Zürich.
1. Framställning av Dissection Material, Kultur Media, mikroflödessystem enheter
- Autoklav mikro-dissektion pincett och sax (121 ° C, sterilisering tid: 20 min) och lagra dem i en steril behållare.
- Sterilisera glas täckglas (24 mm x 24 mm) genom att inkubera dem i en 1 M HCl under 24 timmar på en orbital skakanordning vid 37 ° C. Tvätta dem tre gånger med sterilt, destillerat H2O och tre gånger med etanol 99%. Torka sedan täck vid 37 ° C eller under sterila flöde huva. Slutligen, autoklavering eller utsätta täckglasen för UV-ljus (30 min) för att slutföra sterilisering. Täckglas kan sedan lagras i etanol 70%.
- Ta noga AXIS Axon Isolation Enheter från förpackningen med sterila pincett och placera dem i en steril petriskål. Med hjälp av en steril biopsistans (ø: 1 mm) skapar ett hål per prov som odlas (Figur 1) i överensstämmelse med odlingskammare.
OBS: inte slå för nära mikrospåren, eftersom de kan skadas av trycket tillämpas. - Sterilisera AXIS Axon Isolation Enheter efter immerging dem i etanol 70%. Torka sedan AXIS Axon isoleringsanordningar och täck helt under en steril flöde huva. Vänta minst 3 timmar innan du fortsätter.
OBS: ofullständig torkning kommer att resultera i bristfällig montering av mikroflödessystem enheter. - Placera varje täck i en 35 mm petriskål eller i en brunn i en 6-brunnar platta.
- Placera AXIS Axon Isolering enhet på täckglas och tryck försiktigt men bestämt med en pincett med böjda ändar för att möjliggöra fullständig vidhäftning mellan isoleringsanordningen och glastäck.
- I varje odlingskammare, pipett 150 pl av poly-D-lysin (0,1 mg / ml i sterilt, destillerat H2OO). Placera mikrofluidikanordningama under vakuum under 5 minuter, för att avlägsna all luft från odlingskamrarna.
- Om luft fortfarande kan ses i kamrarna, åter pipett poly-D-lysin lösning i kamrarna.
- Inkubera enheter med poly-D-lysin O / N vid 37 ° C.
- Tvätta kammare tre gånger med sterilt, destillerat H2O
- Fyll kammare med 150 | j, l laminin arbetslösning (Sigma-Aldrich, 5 ^ g / ml, i PBS eller serumfritt medium), och inkubera O / N vid 37 ° C.
- Förbered 50 ml av medium för trigeminala ganglia kulturer 37, sammansatt enligt följande: 48 ml Neurobasal medium, 1 ml B-27, 100 U / ml penicillin / streptomycin, 2 mM L-glutamin, 5 ng / ml nervtillväxtfaktor (NGF) , 12:25 cytosinarabinosid.
- Bered 50 ml medium för tandgroddar kulturer 37, sammansatt enligt följande: 40 ml DMEM-F12, 10 ml fetalt bovint serum (FBS, slutkoncentration: 20%), 100 U / ml penicillin / streptomycin, 2 mM L-glutamin, 150 | ig / ml askorbinsyra.
2. Mouse Embryo Generation och Dissection
- Bestäm embryonala ålder enligt vaginal plugg (vaginal plug: embryonala dag av utveckling 0,5, E0.5) och bekräfta det via morfologiska kriterier. För detta protokoll använder vi i allmänhet E14.5-E17.5 musembryon.
- Rengör dissektion området och stereoskop med etanol 70%.
- Offra den gravida mamman via halsdislokation. Blockera hals musen med första och andra finger på ett rutnät, och dra med beslutet svansen.
- Dissekera huden runt nedre delen av magen, och öppna buken med hjälp av en sax. Leta reda på livmodern: under sådana sena stadier av graviditeten, livmodern rikligt fylla bukhålan.
- Dissekera ut livmodern och plats i ett rör fyllt med PBS på is. När på is, kan vävnaden lämnas för flera timmar. Kasta liket av modern enligt institutionens riktlinjer <li> Dissekera ut embryon från livmodern och befria dem från deras extraembryonic vävnader. Placera embryon i PBS på is.
- Halshugga embryon med sax, och separera underkäken från resten av huvudet med hjälp av mikro-dissektion sax (Figur 2A). Ta exakt underkäken, utan att skada trigeminala ganglier; eftersom dessa är lokaliserade i nära anslutning till den nedre käften, kan deras oavsiktlig skada. Bevara underkäken och resten av huvudet i kall PBS, på is.
- Att dissekera TG, ta huvudet och placera den på en dissektion glas petriskål, som tidigare fylld med kall PBS. Med hjälp av pincett, ta bort huden och skallen. Ta sedan telencefalon och lillhjärnan genom att placera pincett under telencefalon och lyft; telencephalon och cerebellum kommer flip tillsammans, som lämnar botten av skallen exponerades.
- Lokalisera trigeminala ganglia (visad i Figur 2B). Använd pincettatt separera TG från trigeminala nerverna. Eliminera resterna av de trigeminala prognoser med hjälp av dissektion nålar som knivar. Placera dissekerade TG i en petriskål fylld med kall PBS och hålla dem på is.
- Att dissekera embryonala tänder, placera underkäken, tidigare separerad från skallen, på dissektion glas petriskål fylld med kallt PBS. Använda dissektion nålar som knivar, ta bort tungan och huden runt käken. Separera de vänstra och de högra hemi-käftar genom att skära längs mittlinjen i käken. De tand bakterier är lätt att se, som visas i figur 1C. Isolera tand bakterier använder dissektion nålar och avlägsna överskottet av icke-dentala vävnader. Placera dissekerade tand bakterier i en petriskål fylld med kallt PBS och hålla dem på is.
3. Mikroflödes Samkulturer
- Efter dissektion bort laminin från mikrofluidikanordningar. Fyll kamrarna med 200 ul av respective media.
- Med pincett, överföra försiktigt dissekerade TG och tand bakterier i hålen som skapas genom stansning (Figur 1D). Se till att tand bakterier inte flyta och att de sjunker tills de kontakt med täck.
- Kultur proverna i inkubator vid 37 ° C, 5% CO2.
- Ändra odlingsmediet varje 48 timmar. Töm inte kamrarna helt och inte pipett direkt i odlingskammare. Komplett tömning av kammare skulle resultera i bildandet av luftbubblor i kamrarna; direkt pipettering in i kammaren skulle resultera i axonal skada. För att undvika dessa problem, avlägsna mediet pekar pipetten mot utsidan av brunnarna; på liknande sätt, pipett färskt medium på den sida av brunnarna är belägna motsatt till kamrarna.
- Under odlingsperioden, kan co-kulturer lätt avbildas av tidsförlopp mikroskopi. Samodlingar kan bibehållas i över 10 dagar.
- Efter odlings Period, tvätta kamrarna genom att pipettera 150 l PBS i en brunn per kammare, och låta PBS strömma genom kamrarna tre gånger.
- Ta bort PBS och fixa proverna genom att pipettera 150 il paraformaldehyd 4% (i PBS) i en brunn per kammare; inkubera vid RT i 15 min.
- Tvätta kamrarna två gånger med PBS såsom beskrivits i 3.6.
- Fortsätt med ytterligare analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dessa resultat visar att isolerade trigeminala ganglier kan växa i en avdelning av mikroflödessystem enheten och dessutom att utvecklingen av de isolerade tand bakterier upprätthålls under en lång tid i den andra avdelningen av mikroflödessystem enhet. Olika odlingsmedier används i de båda avdelningarna, och mikrospåren mellan de två avdelningarna medger förlängning av Axon från trigeminala ganglion mot utvecklingstand bakterier. Figur 3 representerar en visualisering av neurofilament via immunofluorescens 37, i en co-kultur av en mus embryonal trigeminala ganglion och mus embryonala framtand i den beskrivna mikroflödes samodlingssystemet. Mus framtänder inte innerveras under utvecklingen in vivo;. Konsekvent, är axoner från trigeminala ganglion upphävdes genom att utveckla tandgroddar i kultur för så mycket som 10 dagar Figur 3A visar en översikt över den axonal kammaren i detta samodlingssystemet. Fig 3B och 3C visar progressiva förstoringar av neuriterna inom axonala kamrar och mikroodlingar. Tand bakterier (eller någon samodlingar organ eller vävnader) kan lätt avlägsnas från mikrofluidikanordningama och analyserades separat t.ex. behandlas för histologiska färgningar eller för genuttryck analys.
Figur 1. Visningar av monterade mikroflödes samodlad anordning (A) från ovan; . (B) delvis sidled Odlingskamrarna (cc) är markerade i rött (eosin) och blå (toluidinblått); mikrospår (mg) kan ses som en vit linje mellan odlingskamrarna. Ganglier och samodlades organ / vävnader placeras i lämpligt odlingskammaren via de stansade hålen (ph) i anordningen. Medium tillsätts och avlägsnas via brunnarna (MW). "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53114/53114fig1large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. (A) sidovy av en musembryo huvud (embryonal dag av utvecklings E14.5). Den svarta linjen anger var underkäken bör skäras för att bevara integriteten av både trigeminala ganglier och tand bakterier. (B) mus embryo huvudet (E14.5) efter avlägsnande av underkäken, skalle och telencefalon. Svarta pilar indikerar trigeminala ganglierna (TG). (C) underkäken av musembryo (E14.5) efter avlägsnande av tungan. Svarta pilar visar lokaliseringen av de olika tand bakterier (Inc: framträder och, FM: första molarer). (D) Schematisk representation av mikroflödes samodlad anordning.p_upload / 53114 / 53114fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Co-kultur av trigeminus ganglion och framtand groddar från vild-typ E15.5 musembryon. (A) Översikt över axonal kammaren (neurofilament, DAPI). Skala bar: 300 pm. (B) Högre förstoring av mikrospåren och neurites växer i axonal kammaren (neurofilament, DAPI, överlagring av fluorescerande och bright bilder). Skala bar: 150 nm. (C) Högre förstoring som visar tillväxten av axoner inom mikrospåren (neurofilament). Skala bar:. 75 pm klicka Vänligen här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tidigare in vitro studier av tand innervation baserades på konventionella samkulturer av trigeminala ganglier och dentala vävnader eller celler 26,28,29. Dessa studier genomfördes för att undersöka huvudsakligen de attraktiva effekterna av dessa celler eller vävnader på sensoriska axoner 38. Även föra betydande framsteg inom området, har flera tekniska frågor upp. Tand bakterier börjar urarta efter några dagars odling 37. Baserat på dessa observationer, växande neuroner och tänder i samma odlingsbetingelser försämra en eventuell analys av molekyler som är involverade i överhörning mellan dessa två vävnader. Optimala odlingsbetingelser krävs för att bevara den fysiologiska molekylära profilen trigeminala ganglier och dentala vävnader.
Mikrofluidik system har använts hittills för att samodling neuroner och olika celltyper i optimerade medier 34,36. Detta mikrofluidik-systemet kan representera mer trofullt situationen in vivo, där neurala cellkroppar, axonal terminaler och målvävnader allmänhet utsätts för olika cellulära och molekylära mikromiljöer. På senare tid har mikrofluidik anordningar använts för att samarbeta kultur hela dorsalrotsganglier och osteoblaster 36. Vi visade nyligen att trigeminala ganglier och tänder kan överleva under långa tidsperioder när co-odlade i mikrofluidikanordningar 37. Dessutom visade vi att tänder från olika utvecklingsstadier upprätthålla dessa in vitro betingelser samma frånstötande eller attraktiva effekter på trigeminala innervation som de uppvisade in vivo 37.
Protokollet som beskrivs kräver övning och fingerfärdighet, särskilt när det gäller microdissection av trigeminala ganglier och tand bakterier. Trigeminala ganglier lätt slits under dissekering. Därför föreslår vi användning av dissektion nålar i stället för dissektion kraftps, för att avlägsna vävnaden som omger ganglierna. På samma sätt bör särskild försiktighet iakttas när dissekera tand bakterier, för att undvika skador på tand epitel samtidigt skiljer den från de omgivande mesenkymala vävnader. Dessutom, under den första dagen av co-kultur, särskild försiktighet bör iakttas vid hantering av inkubatorn, eftersom kraftiga vibrationer kan försämra trigeminala ganglion vidhäftning till kulturen täck. Under sam-odlingsperioden, bör mediet avlägsnas och sattes genom att pipettera i brunnarna, på sidan motsatt till odlingskamrarna. Blivande eller pipetteringsmedia i närhet av odlingskamrarna skulle resultera i axonal skada.
Protokollet som beskrivs kan modifieras för att studera innervation av flera embryonala organ och embryon eller postnatala vävnader och celltyper. Mikrofluidik system skulle kunna utgöra en lämplig plattform för att tillåta längre odlingsperioder för att studera interaktioner mellan nervceller och växande teeth. Dessutom, separering av neuronala från tandutrymmet medger analys av effekterna av specifikt protein lokalisering och kvantifiering 33,37. Blockerande antikroppar eller rekombinanta proteiner kan även sättas till de separata facken hos mikroflödesanordningar för att analysera deras effekter på neuronala och dentala vävnader. Till exempel, behandling av trigeminal ganglia med NGF stöder deras överlevnad och tillåter neuronal utväxt. Men i detta arbete exogen NGF är frånvarande från tandgroddar avdelningen, där tandhärledda signalerna är den bara ansvarig för neuronal attraktion eller repulsion. På liknande sätt kan andra rekombinanta molekyler, antikroppar eller läkemedel kan användas för att manipulera systemet under kontrollerade betingelser.
De stora begränsningar av Protokollet presenteras uppehålla sig i den relativa höga kostnaderna för kommersiella mikrofluidikanordningar och i huvudsak 2D-inrättats av samodlingssystemet. I själva verket, även om hela organ kan vara kulturd, både organ och axoner växer i 2D-vidhäftande odlingsbetingelser på ett täckglas; anpassning av systemet skulle behövas för att erhålla ett tredimensionellt, realistisk återgivning av innervation.
Sammanfattningsvis mikrofluidikanordningar är optimala för att undersöka betydelsen av innervation att utveckla eller regenere organ och tillåta studier av samspelet mellan neuronala och målvävnader i optimala odlingsbetingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AXIS Axon Isolation Devices | Millipore | AX15010-TC | Microchannels of different lenght are available |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| B27 | Gibco | 17504 | |
| Recombinant Mouse beta-NGF | R&D Systems | 1156-NG-100 | Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 |
References
- Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 71, 2241-2251 (2014).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
- Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 552-565 (2011).
- Katayama, Y., Battista, M., et al. Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from bone marrow. Cell. 124 (2), 407-421 (2006).
- Fitch, S. R., Kimber, G. M., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell stem cell. 11 (4), 554-566 (2012).
- Knox, S. M., Lombaert, I. M. a, Reed, X., Vitale-Cross, L., Gutkind, J. S., Hoffman, M. P. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. Science(New York, N.Y.). 329 (5999), 1645-1647 (2010).
- Knox, S. M., Lombaert, I. M. A., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature communications. 4, 1494 (2013).
- Oakley, B., Witt, M. Building sensory receptors on the tongue. Journal of neurocytology. 33 (6), 631-646 (2004).
- Oakley, B., Brandemihl, A., Cooper, D., Lau, D., Lawton, A., Zhang, C. The morphogenesis of mouse vallate gustatory epithelium and taste buds requires BDNF-dependent taste neurons. Brain research. Developmental brain research. 105 (1), 85-96 (1998).
- Sun, H., Oakley, B. Development of anterior gustatory epithelia in the palate and tongue requires epidermal growth factor receptor. Developmental biology. 242 (1), 31-43 (2002).
- Mistretta, C. M., Goosens, K. a, Farinas, I., Reichardt, L. F. Alterations in size, number, and morphology of gustatory papillae and taste buds in BDNF null mutant mice demonstrate neural dependence of developing taste organs. The Journal of comparative neurology. 409 (1), 13-24 (1999).
- Mitsiadis, T. a, Graf, D. Cell fate determination during tooth development and regeneration. Birth defects research. Part C, Embryo today reviews. 87 (3), 199-211 (2009).
- Mohamed, S. S., Atkinson, M. E. A histological study of the innervation of developing mouse teeth. Journal of anatomy. 136 (Pt 4), 735-749 (1983).
- Luukko, K. Immunohistochemical localization of nerve fibres during development of embryonic rat molar using peripherin and protein gene product 9.5 antibodies. Archives of oral biology. 42 (3), 189-195 (1997).
- Johnsen, D. Innervation of teeth: qualitative, quantitative, and developmental assessment. Journal of dental research. 64, 555-563 (1985).
- Mitsiadis, T. a, Dicou, E., Joffre, A., Magloire, H. Immunohistochemical localization of nerve growth factor (NGF) and NGF receptor (NGF-R) in the developing first molar tooth of the rat. Differentiation; research in biological diversity. 49 (1), 47-61 (1992).
- Mitsiadis, T. a, Luukko, K. Neurotrophins in odontogenesis. The International journal of developmental biology. 39 (1), 0214-6282 (1995).
- Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation; research in biological diversity. 84 (5), 371-379 (2012).
- Kettunen, P., Løes, S., et al. Coordination of trigeminal axon navigation and patterning with tooth organ formation: epithelial-mesenchymal interactions and epithelial Wnt4 and Tgfbeta1 regulate semaphorin 3a expression in the dental mesenchyme. Development (Cambridge, England). 132 (2), 323-334 (2005).
- Tuisku, F., Hildebrand, C. Evidence for a neural influence on tooth germ generation in a polyphyodont species. Developmental biology. 165, 1-9 (1994).
- Zhao, H., Feng, J., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell stem cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Kettunen, P., Kvinnsland, H., Luukko, K. Mouse rudimentary diastema tooth primordia are devoid of peripheral nerve fibers. Anatomy and embryology. 205 (3), 187-191 (2002).
- Lumsend, A., Buchanan, J. An experimental study of timing and topography of early tooth development in the mouse embryo. Archives of oral biology. , 301-311 (1986).
- Kollar, E., Lumsend, A. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de Biologia Buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
- Luukko, K., Kettunen, P. Coordination of tooth morphogenesis and neuronal development through tissue interactions: lessons from mouse models. Experimental cell research. 325 (2), 72-77 (2014).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
- Lumsend, A., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323 (9), 538-539 (1986).
- Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
- Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience letters. 308 (3), 161-164 (2001).
- Petrinovic, M. M., Duncan, C. S., et al. Neuronal Nogo-A regulates neurite fasciculation, branching and extension in the developing nervous system. Development(Cambridge, England). 137 (15), 2539-2550 (2010).
- Otsu, K., Fujiwara, N., Harada, H. Odontogenesis. Methods in Molecular Biology. 887, (2012).
- Mitsiadis, T. a, Drouin, J. Deletion of the Pitx1 genomic locus affects mandibular tooth morphogenesis and expression of the Barx1 and Tbx1 genes. Developmental biology. 313 (2), 887-896 (2008).
- Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
- Hosmane, S., Tegenge, M. A., et al. Toll/interleukin-1 receptor domain-containing adapter inducing interferon-β mediates microglial phagocytosis of degenerating axons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7745-7757 (2012).
- Delamarche, E., Tonna, N., Lovchik, R. D., Bianco, F., Matteoli, M. Pharmacology on microfluidics: multimodal analysis for studying celll-cell interaction. Current opinion in pharmacology. 13 (5), 821-828 (2013).
- Neto, E., Alves, C. J., et al. Sensory neurons and osteoblasts: close partners in a microfluidic environment. Integrative Biology. , (2014).
- Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in physiology. 5 (August), (2014).
- Connor, R., Tessier-Lavigne, M. Identification of maxillary factor, a maxillary process-derived chemoattractant for developing trigeminal sensory axons. Neuron. 24, 165-178 (1999).
