Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Microfluidic सह संस्कृति उपकरणों का प्रयोग करना टूथ रोगाणु INNERVATION विकास का विश्लेषण

Published: August 14, 2015 doi: 10.3791/53114
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institute of Oral Biology, Unit of Orofacial Development and Regeneration, University of Zurich

Abstract

INNERVATION अंगों और ऊतकों के विकास, homeostasis और उत्थान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हालांकि, इन घटनाओं अंतर्निहित तंत्र अच्छी तरह से अभी तक समझ नहीं रहे हैं। विशेष रूप से, दांत विकास और उत्थान में तंत्रिका वितरण की भूमिका उपेक्षित है।

Vivo अध्ययन में कई विभिन्न पशु मॉडल के विकास और मरम्मत की प्रक्रिया के दौरान दंत ऊतकों के विन्यास के पैटर्न के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी उपलब्ध कराई है। हालांकि, इन तरीकों में से सबसे तंत्रिका तंतुओं और लक्ष्य अंगों और ऊतकों के बीच बातचीत के आणविक आधार उजागर करने के लिए इष्टतम नहीं कर रहे हैं।

सह संस्कृतियों की जांच करेंगे और एक नियंत्रित और अलग वातावरण में तंत्रिका तंतुओं और दांतों के बीच बातचीत में हेरफेर करने के लिए एक मूल्यवान विधि का गठन। पिछले दशकों में, एक ही संस्कृति के माध्यम का उपयोग कर पारंपरिक सह संस्कृतियों बहुत ही कम अवधि के लिए प्रदर्शन किया गया है (उदाहरण के लिए, दो दिन)संवेदी तंत्रिका तंतुओं पर मौखिक और दंत चिकित्सा के ऊतकों के विकास की आकर्षक या प्रतिकारक प्रभाव की जांच करने के लिए। हालांकि, संस्कृति अवधि के विस्तार के दांत morphogenesis और cytodifferentiation पर स्फूर्तिदान के प्रभाव की जांच करने के लिए आवश्यक है।

Microfluidics सिस्टम को उनके उपयुक्त संस्कृति मीडिया में न्यूरॉन्स और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के सह संस्कृतियों अनुमति देते हैं। हमने हाल ही में त्रिपृष्ठी गैन्ग्लिया (टीजी) और दांतों के समय की एक लंबी अवधि के लिए जीवित करने में सक्षम हैं दिखा दिया है कि जब सह सुसंस्कृत microfluidic उपकरणों में, और वे इन परिस्थितियों में वे vivo में पता चलता है कि एक ही तंत्रिका वितरण पैटर्न का कहना है कि।

इस आधार पर, हम अलग करने और एक microfluidic सह संस्कृति system.This प्रोटोकॉल में त्रिपृष्ठी ganglia और दांत कीटाणुओं के विकास सह संस्कृति एक सरल और लचीला तरीका करने के लिए सह संस्कृति गैन्ग्लिया / नसों और लक्ष्य ऊतकों और वर्णन करने के लिए कैसे का वर्णन भूमिकाओं अध्ययन करने के लिए एक contr में इस तरह की बातचीत पर की विशिष्ट अणुओंolled और अलग वातावरण।

Introduction

INNERVATION अंगों और ऊतकों 1,2 के विकास, homeostasis और उत्थान में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। 5 - इसके अलावा, तंत्रिका वितरण स्टेम सेल प्रसार, जुटाना और भेदभाव 3 के नियमन में शामिल है। दरअसल, orofacial परिसर के ऊतकों में एहसास हुआ कि हाल के अध्ययनों से परानुकंपी नसों लार के विकास और उत्थान 6,7 ग्रंथियों के दौरान उपकला मूल कोशिकाओं समारोह के लिए आवश्यक हैं कि पता चला है। 11 - इसी तरह, यह तंत्रिका वितरण स्वाद 8 के विकास और रखरखाव के लिए आवश्यक है कि प्रदर्शन किया गया है। इस प्रकार, यह इस तरह के दांत के रूप में अन्य महत्वपूर्ण orofacial अंगों और ऊतकों के विकास में तंत्रिका वितरण की अभी तक उपेक्षित भूमिकाओं का विश्लेषण करने के लिए महत्वपूर्ण है।

वयस्क दांत की समृद्ध स्फूर्तिदान के बावजूद, और इसके विपरीत में शरीर, विकास के अन्य सभी अंगों और ऊतकों कोपिंग दांत जल्द से जल्द प्रसव के बाद के चरणों में innervated जा करने के लिए शुरू करते हैं। दांत मौखिक बाहरी झिल्ली और कपाल तंत्रिका शिखा व्युत्पन्न mesenchyme के बीच अनुक्रमिक और पारस्परिक वार्तालाप का एक परिणाम के रूप में विकसित करना। इन मुलाकातों उपकला व्युत्पन्न ameloblasts और तामचीनी और दंतधातु, क्रमश: 12 के गठन के लिए जिम्मेदार हैं कि mesenchyme व्युत्पन्न odontoblasts को जन्म दे। 15 - बेहतर ग्रीवा गैन्ग्लिया से त्रिपृष्ठी ganglia और सहानुभूति नसों से संवेदी तंत्रिकाओं वयस्क दांत 13 अंदर आना। Embryogenesis दौरान, तंत्रिका तंतुओं के विकास के दांत कीटाणुओं की ओर त्रिपृष्ठी गैन्ग्लिया परियोजना से निकलती है और उत्तरोत्तर उन्हें घेर लेकिन वे दंत अंकुरक mesenchyme 13 में घुसना नहीं है। तंत्रिका तंतुओं odontoblast भेदभाव और दंतधातु मैट्रिक्स बयान 16 से परस्पर संबंधित और अधिक उन्नत विकास के चरणों में दंत लुगदी mesenchyme दर्ज करें। दंत लुगदी तंत्रिका वितरण compl हैeted जल्द ही मौखिक गुहा 13 में दांत विस्फोट के बाद। 19 - विभिन्न semaphorins और Neurotrophins odontogenesis 16 के दौरान तंत्रिका वितरण के नियमन में भी शामिल रहे हैं कि पिछले अध्ययनों से पता चला है। इससे पहले के अध्ययनों से स्पष्ट रूप से तंत्रिका वितरण मछलियों 20 में दांत के गठन के लिए एक शर्त है कि प्रदर्शन किया है। हाल के अध्ययनों ध्वनि हाथी (श) 21 के स्राव के माध्यम से संवेदी तंत्रिकाओं द्वारा नियंत्रित किया जाता है माउस कृन्तक में दंत mesenchyme स्टेम कोशिकाओं की है कि homeostasis को दिखाया है। 24 - फिर भी, दांत दीक्षा, विकास और उत्थान में तंत्रिका वितरण की भूमिका अभी भी स्तनधारियों की 22 में अत्यधिक विवादास्पद है।

Vivo अध्ययन के ढेर सारे विभिन्न पशु मॉडल 13,25,26 के विकास और मरम्मत की प्रक्रिया के दौरान दंत ऊतकों के विन्यास के पैटर्न के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी उपलब्ध कराई है। हालांकि, इनमें से सबसे approदर्द तंत्रिका तंतुओं और लक्ष्य अंगों और ऊतकों के बीच बातचीत के आणविक आधार उजागर करने के लिए इष्टतम नहीं कर रहे हैं। 29 - सह संस्कृतियों की जांच करेंगे और एक नियंत्रित और अलग वातावरण 26 में तंत्रिका तंतुओं और दांतों के बीच बातचीत में हेरफेर करने के लिए एक मूल्यवान विधि का गठन। इसी समय, सह संवर्धन विभिन्न तकनीकी समायोजन के अधीन है। 32 - उदाहरण के लिए, नसों और विशिष्ट दंत ऊतकों (जैसे, दंत लुगदी, दंत कूप, दंत उपकला) के लिए अक्सर समय 30 की लंबी अवधि के लिए ऊतक अस्तित्व की गारंटी करने के क्रम में विभिन्न संस्कृति मीडिया की आवश्यकता होती है।

29 - पिछले दशकों में, एक ही संस्कृति के माध्यम का उपयोग कर पारंपरिक सह संस्कृतियों संवेदी तंत्रिका तंतुओं 27 पर मौखिक और दंत चिकित्सा के ऊतकों के विकास की आकर्षक या प्रतिकारक प्रभाव की जांच करने के लिए बहुत ही कम अवधि (जैसे, दो दिन) के लिए प्रदर्शन किया गया है।हालांकि, संस्कृति अवधि के विस्तार के दांत morphogenesis और cytodifferentiation पर स्फूर्तिदान के प्रभाव की जांच करने के लिए, और लक्ष्य अंगों के भीतर शाखाओं में तंत्रिका तंतुओं की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए आवश्यक है। इसलिए, गैर-निरंतर सह संस्कृतियों न्यूरोनल-दंत ऊतकों बातचीत पर अध्ययन प्रदर्शन करने के लिए अधिक उपयुक्त होगा।

Microfluidics सिस्टम को उनके उपयुक्त संस्कृति मीडिया में न्यूरॉन्स और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के सह संस्कृतियों अनुमति देते हैं। अपने लक्ष्य ऊतक 33 से युक्त डिब्बे की ओर microchannels के माध्यम से तंत्रिका कोशिका निकायों से axons की वृद्धि की अनुमति है जबकि इन उपकरणों में, दंत ऊतकों और न्यूरॉन्स, अलग डिब्बों में अलग हो रहे हैं। Microfluidic उपकरणों पहले से ही कैंसर और neovascularization 35 में सेल बातचीत करने के लिए न्यूरॉन्स और microglia 34,35 के बीच बातचीत, साथ ही सेल अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इसके अलावा, इन प्रणालियों Dors के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैअल रूट ganglia और अस्थिकोरक 36।

हमने हाल ही में त्रिपृष्ठी गैन्ग्लिया (टीजी) और दांतों को लंबे समय के लिए जीवित करने में सक्षम हैं दिखा दिया है कि जब सह सुसंस्कृत microfluidic उपकरणों 37 में। इसके अलावा, हम विभिन्न विकास के चरणों से दांत इन में इन विट्रो शर्तों वे विवो 37 में पता चलता है कि त्रिपृष्ठी तंत्रिका वितरण पर एक ही प्रतिकारक या आकर्षक प्रभाव में बनाये रखने का प्रदर्शन किया है। इस प्रोटोकॉल एक सरल, शक्तिशाली और लचीला तरीका करने के लिए सह संस्कृति गैन्ग्लिया / नसों और लक्ष्य ऊतकों और एक नियंत्रित और अलग माहौल में इस तरह की बातचीत पर विशिष्ट अणुओं की भूमिका का अध्ययन करने के बारे में जानकारी प्रदान करता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

सभी चूहों स्विस पशु कल्याण कानून को और केंटन पशु चिकित्सा कार्यालय, ज्यूरिख के नियमों के अनुपालन में अनुसार बनाए रखा और संभाल रहे थे।

विच्छेदन सामग्री, संस्कृति मीडिया, microfluidic उपकरणों की 1. तैयारी

  1. आटोक्लेव माइक्रो विच्छेदन संदंश और कैंची (121 डिग्री सेल्सियस, नसबंदी समय: 20 मिनट) और एक बाँझ कंटेनर में स्टोर।
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर 24 घंटे के लिए 1 एम एचसीएल में उन्हें incubating द्वारा कांच coverslips (24 मिमी x 24 मिमी) जीवाणुरहित। इथेनॉल 99% के साथ बाँझ, आसुत एच के साथ उन्हें 2 हे और तीन बार तीन बार धोएं। सूखी फिर 37 डिग्री सेल्सियस या बाँझ प्रवाह हुड के तहत coverslips। अंत में, आटोक्लेव या नसबंदी को पूरा करने के लिए पराबैंगनी प्रकाश (30 मिनट) के लिए coverslips के बेनकाब। Coverslips तो इथेनॉल 70% में संग्रहित किया जा सकता है।
  3. बाँझ संदंश का उपयोग सावधानी से पैकेज से धुरी एक्जॉन अलगाव उपकरणों को हटाने और एक बाँझ पेट्री डिश में उन्हें जगह है। एक बाँझ बायोप्सी पंच का उपयोग (हे: 1mm) संस्कृति कक्षों में से पत्राचार में नमूना प्रति एक छेद संवर्धित किया जा करने के लिए (चित्रा 1) बना।
    नोट: वे लागू दबाव से क्षतिग्रस्त हो सकता है, के रूप में microgrooves को भी बंद पंच मत करो।
  4. इथेनॉल 70% में उन्हें immerging द्वारा एक्सिस एक्जॉन अलगाव उपकरणों जीवाणुरहित। पूरी तरह से एक बाँझ प्रवाह हुड के नीचे सूखी तो एक्सिस एक्जॉन अलगाव उपकरण और coverslips। आगे बढ़ने से पहले 3 घंटा की एक न्यूनतम रुको।
    नोट: अधूरा सुखाने microfluidic उपकरणों की दोषपूर्ण विधानसभा में परिणाम होगा।
  5. एक 6 कुओं थाली के भीतर एक 35 मिमी पेट्री डिश में या एक कुएं में प्रत्येक coverslip रखें।
  6. अलगाव डिवाइस और गिलास coverslip के बीच पूर्ण आसंजन की अनुमति देने के क्रम में तुला समाप्त होता है के साथ एक संदंश के साथ धीरे लेकिन दृढ़ता से coverslip और प्रेस पर एक्सिस एक्जॉन अलगाव डिवाइस जगह।
  7. प्रत्येक संस्कृति कक्ष में, पिपेट पाली डी lysine के 150 μl (बाँझ में 0.1 मिलीग्राम / एमएल, एच 2 आसुतओ)। संस्कृति कक्षों से सब हवा निकालने के क्रम में, 5 मिनट के लिए वैक्यूम के तहत microfluidic उपकरणों रखें।
  8. हवा में अभी भी कक्षों, फिर से पिपेट भीतर कक्षों में पाली-डी lysine समाधान देखा जा सकता है।
  9. 37 डिग्री सेल्सियस पर पाली डी lysine हे / एन के साथ उपकरणों सेते हैं।
  10. बाँझ, आसुत एच 2 ओ के साथ कक्षों तीन बार धोएं
  11. 150 (पीबीएस में सिग्मा Aldrich, 5 माइक्रोग्राम / एमएल, या सीरम मुक्त मध्यम) μl laminin काम कर समाधान के साथ कक्षों भरें, और 37 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन सेते हैं।
  12. इस प्रकार के रूप में संयोजित, त्रिपृष्ठी गैन्ग्लिया संस्कृतियों 37 के लिए माध्यम के 50 मिलीलीटर की तैयारी: 48 मिलीलीटर Neurobasal मध्यम, 1 मिलीलीटर बी -27, / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2 मिमी एल glutamine, 5 एनजी / एमएल तंत्रिका वृद्धि कारक 100 यू (NGF) , 12:25 साइटोसिन arabinoside।
  13. 40 मिलीलीटर DMEM-F12, 10 मिलीलीटर भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS, अंतिम एकाग्रता: 20%) के रूप में बना है, दांत रोगाणु संस्कृतियों 37 के लिए माध्यम के 50 मिलीलीटर की तैयारी, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2 मिमी एल glutamine, 150 माइक्रोग्राम / एमएल एस्कॉर्बिक एसिड।

2. माउस भ्रूण जनरेशन और विच्छेदन

  1. (योनि प्लग: विकास 0.5, E0.5 की भ्रूण दिन) योनि प्लग के अनुसार भ्रूण उम्र का निर्धारण और रूपात्मक मापदंड के माध्यम से यह पुष्टि करते हैं। इस प्रोटोकॉल के लिए, हम आम तौर पर E14.5-E17.5 माउस भ्रूण का उपयोग करें।
  2. विच्छेदन क्षेत्र और इथेनॉल के 70% के साथ स्टिरियोस्कोप साफ करें।
  3. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से गर्भवती मां बलिदान। एक ग्रिड पर पहली और दूसरी उंगली से माउस की गर्दन ब्लॉक, और निर्णय पूंछ के साथ खींच।
  4. पेट के निचले हिस्से के आसपास की त्वचा काटना, और कैंची का उपयोग पेट खुला। गर्भाशय जानें: गर्भावस्था के ऐसे देर चरणों के दौरान, गर्भाशय बहुतायत से उदर गुहा को भरने के।
  5. बर्फ पर पीबीएस के साथ भरा एक ट्यूब में गर्भाशय और जगह काटना। जब बर्फ पर, ऊतक कई घंटे के लिए छोड़ दिया जा सकता है। संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार मां की लाश त्यागें
    6. <ली> गर्भाशय से भ्रूण काटना और उनके extraembryonic ऊतकों से उन्हें मुक्त। बर्फ पर पीबीएस में भ्रूण रखें।
  6. कैंची का उपयोग भ्रूण सिर काटना, और माइक्रो विच्छेदन कैंची (2A चित्रा) का उपयोग कर सिर के बाकी हिस्सों से निचले जबड़े अलग। त्रिपृष्ठी गैन्ग्लिया को नुकसान पहुँचाए बिना, ठीक निचले जबड़े निकालें; बाद के निचले जबड़े के करीब निकटता में स्थानीय कर रहे हैं, उनके आकस्मिक नुकसान संभव है। बर्फ पर निचले जबड़े और ठंड पीबीएस में सिर के बाकी है, बचाना।
  7. टीजी काटना करने के लिए, सिर लेने के लिए और पहले से ठंड पीबीएस के साथ भरा एक विच्छेदन कांच पेट्री डिश, पर यह जगह। संदंश का प्रयोग, त्वचा और खोपड़ी को हटा दें। फिर telencephalon और telencephalon और लिफ्ट से नीचे संदंश रखकर सेरिबैलम निकालें; telencephalon और सेरिबैलम उजागर खोपड़ी के नीचे छोड़ रहा है, एक साथ फ्लिप जाएगा।
  8. (चित्रा 2B में दिखाया गया है) त्रिपृष्ठी गैन्ग्लिया स्थानीयकरण। संदंश का प्रयोग करेंत्रिपृष्ठी नसों से टीजी अलग करने के लिए। चाकू के रूप में विच्छेदन सुइयों का उपयोग त्रिपृष्ठी अनुमानों के अवशेष को हटा दें। ठंड पीबीएस के साथ भरा एक पेट्री डिश में विच्छेदित टीजी प्लेस और उन्हें बर्फ पर रहते हैं।
  9. ठंड पीबीएस के साथ भर पहले से विच्छेदन कांच पेट्री डिश पर, खोपड़ी से अलग निचले जबड़े,, जगह, भ्रूण दांत काटना। चाकू के रूप में विच्छेदन सुई का प्रयोग, जीभ और जबड़े के आसपास त्वचा को हटा दें। जबड़े के midline के साथ काटने से छोड़ दिया और सही हेमी-जबड़े अलग करें। चित्रा 1C के रूप में दिखाया दांत रोगाणु, आसानी से दिखाई दे रहे हैं। विच्छेदन सुइयों का उपयोग दांत कीटाणुओं को अलग करने और गैर-दंत ऊतकों के अतिरिक्त हटा दें। ठंड पीबीएस के साथ भरा एक पेट्री डिश में विच्छेदित दांत कीटाणुओं प्लेस और उन्हें बर्फ पर रहते हैं।

3. Microfluidic सह संस्कृतियों

  1. विच्छेदन के बाद, microfluidic उपकरणों से laminin हटा दें। Respecti के 200 μl के साथ कक्षों भरेंमीडिया की है।
  2. संदंश के साथ, (चित्रा -1) छिद्रण द्वारा बनाई गई छेद में धीरे विच्छेदित टीजी और दांत कीटाणुओं को हस्तांतरण। दांत कीटाणुओं नाव नहीं है कि सुनिश्चित करें और वे coverslips के संपर्क में जब तक वे सिंक कि।
  3. संस्कृति 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में नमूने, 5% सीओ 2।
  4. संस्कृति के माध्यम से हर 48 घंटा बदलें। पूरी तरह से कक्षों को खाली मत करो, और संस्कृति कक्षों में सीधे पिपेट नहीं है। कक्षों के भीतर हवा के बुलबुले के गठन में परिणाम होगा कक्षों का पूरा खाली; चेंबर में प्रत्यक्ष pipetting के axonal नुकसान में परिणाम होगा। कुओं के बाहरी पक्ष की ओर पिपेट ओर इशारा करते हुए मध्यम हटाने, इन मुद्दों से बचने के लिए; इसी प्रकार, कक्षों के सामने स्थित कुओं के किनारे पर ताजा माध्यम विंदुक।
  5. संस्कृति अवधि के दौरान, सह संस्कृतियों आसानी से समय चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged किया जा सकता है। सह संस्कृतियों पर 10 दिनों के लिए बनाए रखा जा सकता है।
  6. संस्कृति perio के बादविकास, चैम्बर के प्रति एक कुएं में पीबीएस के 150 μl pipetting, और पीबीएस कक्षों के माध्यम से तीन बार प्रवाह की अनुमति देकर कक्षों धो लें।
  7. पीबीएस निकालें और चैम्बर के प्रति एक कुएं में paraformaldehyde के 150 μl (पीबीएस में) 4% pipetting द्वारा नमूने ठीक कर; 15 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  8. 3.6 में वर्णित के रूप में पीबीएस के साथ दो बार कक्षों धो लें।
  9. आगे के विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इन परिणामों से अलग त्रिपृष्ठी गैन्ग्लिया पृथक दांत कीटाणुओं के विकास microfluidic युक्ति के दूसरे डिब्बे में समय की एक लंबी अवधि के लिए निरंतर है कि, के अलावा, microfluidic डिवाइस के एक डिब्बे में वृद्धि और कर सकते हैं। अलग संस्कृति मीडिया के दो डिब्बों में उपयोग किया जाता है, और दो ​​डिब्बों के बीच microgrooves विकासशील दांत कीटाणुओं की ओर त्रिपृष्ठी नाड़ीग्रन्थि से अक्षतंतु के विस्तार की अनुमति है। 3 चित्रा एक माउस के एक सह-संस्कृति में, इम्यूनोफ्लोरेसेंस 37 के माध्यम से neurofilament के एक दृश्य का प्रतिनिधित्व करता है वर्णित microfluidic सह संस्कृति प्रणाली में भ्रूण त्रिपृष्ठी नाड़ीग्रन्थि और माउस भ्रूण छेनी। माउस कृन्तक vivo में विकास के दौरान innervated नहीं कर रहे हैं;। लगातार त्रिपृष्ठी नाड़ीग्रन्थि से एक्सोन के रूप में ज्यादा के रूप में 10 दिनों के लिए संस्कृति में विकसित करने दांत रोगाणु द्वारा निरस्त कर दिया जाता है चित्रा 3A इस में axonal चैंबर के एक सिंहावलोकन से पता चलता है सह संस्कृति प्रणाली। 3B चित्रा और 3C शो axonal कक्षों और सूक्ष्म पेड़ों के भीतर neurites की प्रगतिशील आवर्धन। टूथ रोगाणु (या किसी भी सह संस्कृतियों अंगों या ऊतकों) ऊतकीय stainings के लिए या जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए कार्रवाई की है, आसानी से microfluidic उपकरणों से हटा दिया है और अलग-अलग उदाहरण का विश्लेषण किया जा सकता है।

चित्र 1
चित्रा घुड़सवार microfluidic सह संस्कृति डिवाइस ऊपर से (ए) के 1. दृश्य; । (बी) को आंशिक रूप से पार्श्व संस्कृति कक्षों (सीसी) लाल (eosin) में प्रकाश डाला और नीला (toluidine नीला) कर रहे हैं; (एमजी) microgrooves संस्कृति कक्षों के बीच एक सफेद लाइन के रूप में देखा जा सकता है। Ganglia और सह सुसंस्कृत अंगों / ऊतकों डिवाइस में छिद्रित छेद (पीएच) के माध्यम से उचित संस्कृति कक्ष में रखा जाता है। मीडिया कुओं (मेगावाट) के माध्यम से जोड़ा गया है और हटा रहे हैं। "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/53114/53114fig1large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2 (ए) एक माउस भ्रूण सिर के पार्श्व दृश्य (विकास E14.5 की भ्रूण दिन)। काला लाइन निचले जबड़े दोनों त्रिपृष्ठी ganglia और दांत कीटाणुओं की अखंडता की रक्षा के क्रम में कटौती की जानी चाहिए जहां इंगित करता है। निचले जबड़े, खोपड़ी और telencephalon के हटाने के बाद (बी) माउस भ्रूण सिर (E14.5)। काला तीर त्रिपृष्ठी गैन्ग्लिया (टीजी) से संकेत मिलता है। जीभ को हटाने के बाद (सी) माउस भ्रूण (E14.5) के निचले जबड़े। (:; एफएम छेनी: पहली दाढ़ इंक) काला तीर अलग दांत कीटाणुओं का स्थानीयकरण संकेत मिलता है। (डी) microfluidic सह संस्कृति डिवाइस के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व।p_upload / 53,114 / 53114fig3large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
त्रिपृष्ठी नाड़ीग्रन्थि और जंगली प्रकार E15.5 माउस भ्रूण से छेनी दांत रोगाणु की चित्रा 3. सह संस्कृति। Axonal चैंबर के (ए) अवलोकन (neurofilament, DAPI)। स्केल बार: 300 माइक्रोन। (बी) axonal चेंबर में बढ़ रही microgrooves और neurites की उच्च आवर्धन (neurofilament, DAPI, फ्लोरोसेंट और brightfield छवियों के superposition)। स्केल बार: 150 माइक्रोन। (सी) microgrooves (neurofilament) के भीतर axons की वृद्धि दिखा उच्च बढ़ाई। स्केल बार:। 75 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

दांत विन्यास की इन विट्रो अध्ययन में पिछले त्रिपृष्ठी गैन्ग्लिया और दंत चिकित्सा के ऊतकों या कोशिकाओं 26,28,29 के पारंपरिक सह संस्कृतियों पर आधारित थे। ये अध्ययन मुख्य रूप से संवेदी एक्सोन 38 पर इन कोशिकाओं या ऊतकों की आकर्षक प्रभाव की जांच करने के लिए आयोजित की गई। क्षेत्र में उल्लेखनीय प्रगति लाने हालांकि, कई तकनीकी मुद्दों को उठाया गया। टूथ रोगाणु संस्कृति 37 के कुछ दिनों के बाद पतित होने लगते हैं। इन टिप्पणियों के आधार पर, एक ही संस्कृति की स्थिति में बढ़ न्यूरॉन्स और दांत इन दो ऊतकों के बीच पार बात में शामिल अणुओं के किसी भी अंतिम विश्लेषण ख़राब। इष्टतम संस्कृति की स्थिति त्रिपृष्ठी गैन्ग्लिया और दंत चिकित्सा के ऊतकों की शारीरिक आणविक प्रोफाइल को संरक्षित करने की जरूरत है।

Microfluidics सिस्टम अनुकूलित मीडिया 34,36 में न्यूरॉन्स और विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं-संस्कृति सह करने के लिए अब तक इस्तेमाल किया गया है। इस microfluidics प्रणाली को और अधिक विश्वास प्रतिनिधित्व कर सकते हैंतंत्रिका कोशिका निकायों, axonal टर्मिनलों और लक्ष्य ऊतकों आम तौर पर विभिन्न सेलुलर और आणविक microenvironments के संपर्क में हैं, जहां पूरी तरह से इन विवो स्थिति। हाल ही में, microfluidics उपकरणों पूरे पृष्ठीय रूट ganglia और अस्थिकोरक 36-संस्कृति सह करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हमने हाल ही में त्रिपृष्ठी ganglia और दांत microfluidic उपकरणों 37 में जब सह सुसंस्कृत समय की लंबी अवधि के लिए जीवित करने में सक्षम हैं कि प्रदर्शन किया। इसके अलावा, हम विभिन्न विकास के चरणों से दांत इन में इन विट्रो शर्तों वे विवो 37 में प्रदर्शित कि त्रिपृष्ठी तंत्रिका वितरण पर एक ही प्रतिकारक या आकर्षक प्रभाव में बनाये रखने का प्रदर्शन किया।

वर्णित प्रोटोकॉल त्रिपृष्ठी ganglia और दांत कीटाणुओं के microdissection के लिए विशेष रूप से अभ्यास और मैनुअल निपुणता की आवश्यकता है। त्रिपृष्ठी गैन्ग्लिया आसानी से विच्छेदन के दौरान फाड़ रहे हैं। इसलिए, हम विच्छेदन सुइयों के बजाय विच्छेदन बल के उपयोग का सुझावपी एस, क्रम में गैन्ग्लिया आसपास के ऊतकों को हटाने के लिए। आसपास के mesenchymal ऊतकों से अलग करते हुए दांत उपकला हानिकारक से बचने के क्रम में, दांत कीटाणुओं विदारक इसी प्रकार, जबकि विशेष ध्यान रखा जाना चाहिए। अत्यधिक कंपन संस्कृति coverslip करने के लिए त्रिपृष्ठी नाड़ीग्रन्थि आसंजन ख़राब कर सकते हैं के रूप में इसके अलावा, सह संस्कृति के पहले दिन के दौरान विशेष रूप से ध्यान, इनक्यूबेटर से निपटने में लिया जाना चाहिए। सह संस्कृति अवधि के दौरान, मीडिया हटा दिया जाना चाहिए और संस्कृति कक्षों की ओर विपरीत पर, कुओं में pipetting द्वारा जोड़ा गया। संस्कृति कक्षों की निकटता में इच्छुक या pipetting मीडिया axonal नुकसान में परिणाम होगा।

वर्णित प्रोटोकॉल कई भ्रूण अंगों और भ्रूण या प्रसव के बाद ऊतकों और सेल प्रकार के विन्यास का अध्ययन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। Microfluidics सिस्टम न्यूरॉन्स और बढ़ रहा है टी के बीच बातचीत के अध्ययन के लिए अब संस्कृति अवधि अनुमति देने के लिए एक उपयुक्त मंच का प्रतिनिधित्व कर सकतावें। इसके अलावा, दंत डिब्बे से न्यूरोनल की जुदाई विशिष्ट प्रोटीन स्थानीयकरण और मात्रा का ठहराव 33,37 के प्रभाव का विश्लेषण परमिट। अवरुद्ध एंटीबॉडी या पुनः संयोजक प्रोटीन भी न्यूरोनल और दंत चिकित्सा के ऊतकों पर उनके प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए microfluidics उपकरणों के अलग अलग डिब्बों में जोड़ा जा सकता है। उदाहरण के लिए, NGF साथ त्रिपृष्ठी गैन्ग्लिया के इलाज उनके अस्तित्व का समर्थन करता है और neuronal परिणाम देता है। हालांकि, इस काम बहिर्जात में NGF दांत व्युत्पन्न संकेतों न्यूरोनल आकर्षण या प्रतिकर्षण के लिए ही जिम्मेदार हैं जहां दांत रोगाणु डिब्बे से अनुपस्थित है। इसी तरह, अन्य पुनः संयोजक अणुओं, एंटीबॉडी या दवाओं से नियंत्रित परिस्थितियों में सिस्टम में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल का प्रमुख सीमाओं वाणिज्यिक microfluidic उपकरणों के रिश्तेदार उच्च लागत और अनिवार्य रूप से 2 डी-सेट सह संस्कृति प्रणाली के ऊपर में रहते हैं। वास्तव में, पूरे अंगों किया जा सकता है, हालांकि संस्कृतिविकास, अंगों और एक्सोन दोनों एक गिलास coverslip पर 2 डी-पक्षपाती संस्कृति की स्थिति में हो जाना; प्रणाली के अनुकूलन विन्यास के निरीक्षण, यथार्थवादी प्रतिनिधित्व प्राप्त करने के क्रम में की जरूरत होगी।

अंत में, microfluidic उपकरणों अंगों के विकास या regenerating में तंत्रिका वितरण की भूमिका की जांच के लिए अधिक उपयोगी हैं और इष्टतम संस्कृति की स्थिति में neuronal और लक्ष्य ऊतकों के बीच बातचीत के अध्ययन की अनुमति है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AXIS Axon Isolation Devices Millipore AX15010-TC Microchannels of different lenght are available
Laminin Sigma Aldrich L2020
Neurobasal Gibco 21103-049
B27 Gibco 17504
Recombinant Mouse beta-NGF R&D Systems 1156-NG-100 Human and Rat beta-NGF (R&D Systems) are equivalent
DMEM-F12 Gibco 11320-033

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pagella, P., Jiménez-Rojo, L., Mitsiadis, T. A. Roles of innervation in developing and regenerating orofacial tissues. Cellular and molecular life sciences : CMLS. 71, 2241-2251 (2014).
  2. Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
  3. Brownell, I., Guevara, E., Bai, C. B., Loomis, C. A., Joyner, A. L. Nerve-derived sonic hedgehog defines a niche for hair follicle stem cells capable of becoming epidermal stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 552-565 (2011).
  4. Katayama, Y., Battista, M., et al. Signals from the sympathetic nervous system regulate hematopoietic stem cell egress from bone marrow. Cell. 124 (2), 407-421 (2006).
  5. Fitch, S. R., Kimber, G. M., et al. Signaling from the sympathetic nervous system regulates hematopoietic stem cell emergence during embryogenesis. Cell stem cell. 11 (4), 554-566 (2012).
  6. Knox, S. M., Lombaert, I. M. a, Reed, X., Vitale-Cross, L., Gutkind, J. S., Hoffman, M. P. Parasympathetic innervation maintains epithelial progenitor cells during salivary organogenesis. Science(New York, N.Y.). 329 (5999), 1645-1647 (2010).
  7. Knox, S. M., Lombaert, I. M. A., et al. Parasympathetic stimulation improves epithelial organ regeneration. Nature communications. 4, 1494 (2013).
  8. Oakley, B., Witt, M. Building sensory receptors on the tongue. Journal of neurocytology. 33 (6), 631-646 (2004).
  9. Oakley, B., Brandemihl, A., Cooper, D., Lau, D., Lawton, A., Zhang, C. The morphogenesis of mouse vallate gustatory epithelium and taste buds requires BDNF-dependent taste neurons. Brain research. Developmental brain research. 105 (1), 85-96 (1998).
  10. Sun, H., Oakley, B. Development of anterior gustatory epithelia in the palate and tongue requires epidermal growth factor receptor. Developmental biology. 242 (1), 31-43 (2002).
  11. Mistretta, C. M., Goosens, K. a, Farinas, I., Reichardt, L. F. Alterations in size, number, and morphology of gustatory papillae and taste buds in BDNF null mutant mice demonstrate neural dependence of developing taste organs. The Journal of comparative neurology. 409 (1), 13-24 (1999).
  12. Mitsiadis, T. a, Graf, D. Cell fate determination during tooth development and regeneration. Birth defects research. Part C, Embryo today reviews. 87 (3), 199-211 (2009).
  13. Mohamed, S. S., Atkinson, M. E. A histological study of the innervation of developing mouse teeth. Journal of anatomy. 136 (Pt 4), 735-749 (1983).
  14. Luukko, K. Immunohistochemical localization of nerve fibres during development of embryonic rat molar using peripherin and protein gene product 9.5 antibodies. Archives of oral biology. 42 (3), 189-195 (1997).
  15. Johnsen, D. Innervation of teeth: qualitative, quantitative, and developmental assessment. Journal of dental research. 64, 555-563 (1985).
  16. Mitsiadis, T. a, Dicou, E., Joffre, A., Magloire, H. Immunohistochemical localization of nerve growth factor (NGF) and NGF receptor (NGF-R) in the developing first molar tooth of the rat. Differentiation; research in biological diversity. 49 (1), 47-61 (1992).
  17. Mitsiadis, T. a, Luukko, K. Neurotrophins in odontogenesis. The International journal of developmental biology. 39 (1), 0214-6282 (1995).
  18. Moe, K., Sijaona, A., Shrestha, A., Kettunen, P., Taniguchi, M., Luukko, K. Semaphorin 3A controls timing and patterning of the dental pulp innervation. Differentiation; research in biological diversity. 84 (5), 371-379 (2012).
  19. Kettunen, P., Løes, S., et al. Coordination of trigeminal axon navigation and patterning with tooth organ formation: epithelial-mesenchymal interactions and epithelial Wnt4 and Tgfbeta1 regulate semaphorin 3a expression in the dental mesenchyme. Development (Cambridge, England). 132 (2), 323-334 (2005).
  20. Tuisku, F., Hildebrand, C. Evidence for a neural influence on tooth germ generation in a polyphyodont species. Developmental biology. 165, 1-9 (1994).
  21. Zhao, H., Feng, J., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell stem cell. 14 (2), 160-173 (2014).
  22. Kettunen, P., Kvinnsland, H., Luukko, K. Mouse rudimentary diastema tooth primordia are devoid of peripheral nerve fibers. Anatomy and embryology. 205 (3), 187-191 (2002).
  23. Lumsend, A., Buchanan, J. An experimental study of timing and topography of early tooth development in the mouse embryo. Archives of oral biology. , 301-311 (1986).
  24. Kollar, E., Lumsend, A. Tooth morphogenesis: the role of the innervation during induction and pattern formation. Journal de Biologia Buccale. 7 (1), 49-60 (1979).
  25. Luukko, K., Kettunen, P. Coordination of tooth morphogenesis and neuronal development through tissue interactions: lessons from mouse models. Experimental cell research. 325 (2), 72-77 (2014).
  26. Lillesaar, C., Eriksson, C., Johansson, C. S., Fried, K., Hildebrand, C. Tooth pulp tissue promotes neurite outgrowth from rat trigeminal ganglia in vitro. Journal of neurocytology. 28 (8), 663-670 (1999).
  27. Lumsend, A., Davies, A. M. Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system. Nature. 323 (9), 538-539 (1986).
  28. Lillesaar, C., Fried, K. Neurites from trigeminal ganglion explants grown in vitro are repelled or attracted by tooth-related tissues depending on developmental stage. Neuroscience. 125 (1), 149-161 (2004).
  29. Lillesaar, C., Eriksson, C., Fried, K. Rat tooth pulp cells elicit neurite growth from trigeminal neurones and express mRNAs for neurotrophic factors in vitro. Neuroscience letters. 308 (3), 161-164 (2001).
  30. Petrinovic, M. M., Duncan, C. S., et al. Neuronal Nogo-A regulates neurite fasciculation, branching and extension in the developing nervous system. Development(Cambridge, England). 137 (15), 2539-2550 (2010).
  31. Otsu, K., Fujiwara, N., Harada, H. Odontogenesis. Methods in Molecular Biology. 887, (2012).
  32. Mitsiadis, T. a, Drouin, J. Deletion of the Pitx1 genomic locus affects mandibular tooth morphogenesis and expression of the Barx1 and Tbx1 genes. Developmental biology. 313 (2), 887-896 (2008).
  33. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature protocols. 1 (4), 2128-2136 (2006).
  34. Hosmane, S., Tegenge, M. A., et al. Toll/interleukin-1 receptor domain-containing adapter inducing interferon-β mediates microglial phagocytosis of degenerating axons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 32 (22), 7745-7757 (2012).
  35. Delamarche, E., Tonna, N., Lovchik, R. D., Bianco, F., Matteoli, M. Pharmacology on microfluidics: multimodal analysis for studying celll-cell interaction. Current opinion in pharmacology. 13 (5), 821-828 (2013).
  36. Neto, E., Alves, C. J., et al. Sensory neurons and osteoblasts: close partners in a microfluidic environment. Integrative Biology. , (2014).
  37. Pagella, P., Neto, E., Jiménez-Rojo, L., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Microfluidics co-culture systems for studying tooth innervation. Frontiers in physiology. 5 (August), (2014).
  38. Connor, R., Tessier-Lavigne, M. Identification of maxillary factor, a maxillary process-derived chemoattractant for developing trigeminal sensory axons. Neuron. 24, 165-178 (1999).

Tags

तंत्रिका विज्ञान अंक 102 विकासात्मक जीव विज्ञान orofacial विकास दांत विन्यास त्रिपृष्ठी नाड़ीग्रन्थि microfluidics सह संस्कृति प्रणालियों
Microfluidic सह संस्कृति उपकरणों का प्रयोग करना टूथ रोगाणु INNERVATION विकास का विश्लेषण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis,… More

Pagella, P., Miran, S., Mitsiadis, T. Analysis of Developing Tooth Germ Innervation Using Microfluidic Co-culture Devices. J. Vis. Exp. (102), e53114, doi:10.3791/53114 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter