Abstract
Mange gramnegative bakterier, herunder patogene Yersinia spp. Beskæftiger type III sekretionssystemer til at translokere effektorproteiner i eukaryote målceller. Inde i værtscellen effektor proteiner manipulere cellulære funktioner til gavn for bakterierne. For bedre at forstå kontrollen af type III sekretion under værtscelle interaktion, følsomme og nøjagtige analyser til måling af translokation er påkrævet. Vi her beskriver anvendelsen af et assay baseret på fusionen af et Yersinia enterocolitica effektor proteinfragment (Yersinia ydre protein; YopE). Ved hjælp af TEM-1-beta-lactamase til kvantitativ analyse af translokation Assayet bygger på spaltning af et celleindtrængende FRET-farvestof (CCF4 / AM) ved omplantet beta-lactamase fusion. Efter spaltning af cephalosporin kerne CCF4 af beta-lactamase, FRET fra cumarin til fluorescein er afbrudt, og excitation af cumarin delen fører til blå fluorescensemission.Forskellige anvendelser af denne fremgangsmåde er blevet beskrevet i litteraturen synliggøre dens alsidighed. Fremgangsmåden giver mulighed for analyse af translokation in vitro og også in vivo, fx i en musemodel. Påvisning af fluorescenssignalerne kan udføres under anvendelse pladeaflæsere, FACS-analyse eller fluorescensmikroskopi. I setup beskrives her, in vitro translokation af effektorceller fusioner ind i HeLa-celler ved forskellige Yersinia mutanter overvåges ved laser scanning mikroskopi. Optagelse intracellulær omdannelse af FRET af reporteren beta-lactamase effektor fusion i realtid giver robust kvantitative resultater. Vi viser her eksempler på data, der viser øget translokation af et Y. enterocolitica YopE mutant sammenlignet med vildtypestammen.
Introduction
Type III sekretion systemer er specialiserede protein-eksport maskiner kan anvendes af forskellige slægter af gramnegative bakterier direkte leverer bakterielt kodede effektorproteiner i eukaryote målceller. Mens sekretionsmaskineriet selv er stærkt bevaret, har specialiseret sæt effektor proteiner udviklet sig mellem de forskellige bakteriearter at manipulere cellulære signalveje og fremme specifikke bakterielle virulens strategier 1. I tilfælde af Yersinia, op til syv effektor proteiner, såkaldte Yops (Yersinia ydre proteiner), translokeres på værtscelle kontakt og handle sammen for at nedbryde immuncellepopulationer reaktioner såsom fagocytose og cytokinproduktion, dvs at muliggøre ekstracellulær bakteriernes overlevelse 2-4. Processen med translokation tæt kontrolleret på forskellige stadier 5. Det er fastslået, at den primære aktivering af T3SS udløses ved sin kontakt til målet cell 6. Den præcise mekanisme af denne indledning er endnu ikke belyst. I Yersinia et andet niveau af såkaldt finjustering af translokation opnås ved op- eller nedregulere aktivitet af de trådløse Rho GTP-bindende proteiner Rac1 eller RhoA. Aktivering af Rac1 f.eks invasin eller cytotoksisk nekrotiserende faktor Y (CNF-Y) fører til øget translokation 7-9, mens GAP (GTPase aktiverende protein) funktion translokeres YopE nedregulerer Rac1 aktivitet og følgelig falder translokation af en negativ feedback typen af mekanismen 10,11.
Gyldige og præcise metoder er en forudsætning for at undersøge, hvordan translokation reguleres under Yersinia værtscelle interaktion. Mange forskellige systemer har været anvendt til dette formål, hver med særlige fordele og ulemper. Nogle metoder er afhængige af lysis af inficerede celler, men ikke bakterier ved forskellige detergenter efterfulgt af Western blot-analyse. The fælles ulempe ved disse fremgangsmåder er, at mindre, men uundgåelige bakteriel lysis potentielt forurener cellelysatet med bakterier-associerede effektor proteiner. Der blev imidlertid behandling af celler med proteinase K for at nedbryde ekstracellulære effektor proteiner og efterfølgende anvendelse af digitonin til selektiv lyse af de eukaryote celler foreslået at minimere dette problem 12. Vigtigt er det, disse analyser afgørende afhængige af høj kvalitet anti-effektor antistoffer, som for det meste ikke er kommercielt tilgængelige. Forsøg på at anvende translationelle fusioner af effektor proteiner og fluorescerende proteiner som GFP at overvåge translokation ikke var vellykket sandsynligvis på grund af det kugleformede tertiære struktur af de fluorescerende proteiner og manglende evne til sekretion apparatet at udfolde dem før sekretion 13. Men flere forskellige reporter tags som den cya (calmodulin-afhængig adenylatcyclase) domæne af Bordetella pertussis toxin cyclolysin 14 eller Flashtag lykkedes anvendes til at analysere translokation. I førstnævnte assay den enzymatiske aktivitet af cya anvendes til at forstærke signalet af det intracellulære fusionsproteinet, mens Flash tag, en meget kort tetracysteine (4Cys) motiv tag, giver mulighed for mærkning med biarsenical farvestof Flash uden at forstyrre processen med sekretion 15.
Den tilgang, anvendes her blev rapporteret for første gang af Charpentier et al., Og er baseret på den intracellulære omdannelse af Forster resonans (FRET) farvestof CCF4 af omplantede effektor TEM-1 beta-lactamase fusioner 16 (figur 1A). CCF4 / AM er en celle-permeant forbindelse, hvori en coumarin-derivat (donor) og en fluorescein del (acceptor) er forbundet af en cephalosporin kerne. Ved passiv post i den eukaryote celle, ikke-fluorescerende esterificeret CCF4 / AM forbindelse behandles af cellulære esteraser, til den ladede og fluorescerende CCF4 og derved fangeti cellen. Excitation af coumarin-delen ved 405 nm resulterer i FRET til fluoresceindelen, der udsender et grønt fluorescenssignal ved 530 nm. Efter spaltning af cephalosporin kernen af beta-lactamase FRET er afbrudt og excitation af cumarin delen fører til blå fluorescensemission at460 nm. Forskellige anvendelser af denne fremgangsmåde er blevet beskrevet i litteraturen synliggøre dens alsidighed. Fremgangsmåden giver mulighed for analyse af translokation in vitro og også in vivo, fx blev den anvendte teknik i en mus infektion model til at identificere leukocytpopulationer målrettet til translokation in vivo 17-19. Kan udføres udlæsning af signaler ved hjælp af pladeaflæsere, FACS-analyse eller fluorescensmikroskopi. Af note, metoden giver også mulighed for at overvåge translokation i realtid af live-cell mikroskopi under infektionen processen 20,21. Her laserscanning fluorescens mikroskopi blev ansøgt om readout fluorescenssignaler da det giver højeste sensitivitet og nøjagtighed. Navnlig skal muligheden for at justere emission vindue med nanometer præcision i kombination med høj følsomme detektorer letter optimeret fluorescens detektion og minimeret krydstale. Derudover kan tilpasses denne mikroskopi setup for real-time overvågning af translokation og potentielt tillader til samtidig analyse af host-patogen interaktion på celleniveau.
I denne undersøgelse translokation satser af et Y. enterocolitica vildtypestamme og en YopE deletionsmutant udviser en fænotype hypertranslocator 10,11 blev eksemplarisk analyseret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Peak Emission og Cross-talk Bestemmelse (se også figur 2)
- For at bestemme de emissionsniveauer toppe og mængden af krydstale mellem donor (coumarin derivat V450) og acceptor (fluorescein) farvestoffer, udføre spektrale scanninger af celler mærket med både individuelle fluoroforer ved 405 nm excitation.
- Bestemme en 10 nm båndbredde i toppen af hvert farvestof, der vil blive anvendt til donor- og acceptor-kanaler (her 455-465 nm og 525-535 nm). Plot den normaliserede intensitet over bølgelængde og beregne den gennemsnitlige procentdel af krydstale af donor farvestoffet i acceptor kanal og omvendt (figur 2).
2. Fremstilling af Y. enterocolitica Stammer for Cell Culture Infektion
- Brug følgende stammer: WA-314 PMK-æg (WA-314 transformeret med plasmiderne PMK-bla 17 og PMK-æg 17, henholdsvis) og WA-314ΔYopE PMK-bla (VAND314ΔYopE transformeret med plasmidet PMK-bla 17)
- Mindst to dage før infektion stribe Y. enterocolitica stammerne WA-314 PMK-æg, WA-314 PMK-bla og WA-314ΔE PMK-bla fra kryo lagre på LB-agarplader indeholdende de krævede antibiotika (kanamycin for WA-314 PMK-bla og WA-314 PMK-æg ; kanamycin og tetracyclin for WA-314ΔE PMK-bla) og vokse O / N ved 27 ° C. Bagefter holde pladerne i op til én uge ved 4 ° C.
- En dag før infektion pode 3 ml LB-medium indeholdende de nødvendige antibiotika med en koloni af de respektive stammer og inkuberes O / N ved 27 ° C i et rysteapparat ved 180 rpm.
- På dagen for infektion pode 2 ml af O / N-kulturen i 40 ml frisk LB-medium uden antibiotika og inkuberes i 90 minutter ved 37 ° C i et rysteapparat ved 180 rpm for at inducere ekspression af type III sekretion system.
- Overfør kulturerne i en egnet rør og holde kulturerne på is eller ved 4 ° Cfra nu af. Centrifugeres kulturerne i 10 min ved 5000 xg og 4 ° C.
- Resuspender den bakterielle pellet i 2-3 ml iskold PBS. Bakteriesuspensionen til en koncentration på 8 x 10 8 cfu / ml fortyndet ved anvendelse af et spektrofotometer. Bestem den tilsvarende optisk densitet individuelt. Denne suspension på is holde indtil inficere HeLa-cellerne.
3. Belægning HeLa-celler
- En dag før infektion frø 1,5 x 10 4 celler HeLa-celler i 200 pi DMEM indeholdende 10% varmeinaktiveret føtalt kalveserum (FCS) i brønde i en plade med 96 brønde og dyrke i en 5% CO2-inkubator ved 37 ° C. Frø tre brønde for hver stamme (tre forskellige inkubationstider).
4. Infektion af HeLa-celler og Loading med CCF4
- Inficere HeLa-celler ved at tilsætte 3,5 pi af bakteriesuspensionen til mediet og bland ved forsigtigt at pipettere mediet to gange. Lad bakterier til sediment påtil cellerne ved en MOI (del af infektion) på ca. 100 bakterier per celle. For et tidsforløb starter infektioner ved -90 min, -60 min og -30 minutter og inkuberes ved 37 ° C i en 5% CO2-inkubator indtil 0 min for at opnå et fælles endepunkt.
- Når inkubationen er afsluttet, forsigtigt aspireres mediet uden at fjerne HeLa-celler, og der tilsættes 50 pi PBS indeholdende 20 pg / ml chloramphenicol at stoppe udtryk for effektorer og 2,5 mM probenecid at reducere eksport af CCF4.
- På dette tidspunkt overføre 96-brønds plade i mikroskopbordet og definere egnede steder til senere analyse i hver brønd. Afslut dette trin inden for 10 min (for oplysninger om erhvervelse se afsnit 5.1).
- Per godt, tilsættes 70 pi CCF4 / AM loading opløsning (0,24 pi opløsning A, 1,2 pi opløsning B, 18.56 pi opløsning C (opløsning A, B og C leveres inden CCF4 / AM loading kit) og 50 pi PBS (indeholdende 20 ug / ml chloramphenicol og 2,5 mM probenecid) under anvendelse af en multi pipette og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur. Fra nu af arbejde uden afbrydelser.
- Aspirer loading og der tilsættes 100 pi PBS indeholdende 20 ug / ml chloramphenicol og 2,5 mM probenecid ved hjælp af en multi pipette. Derefter hurtigt overføre 96-brønds plade i mikroskopbordet og begynde erhvervelse inden for 10 minutter fra opsugning af fyldningsopløsningen.
5. Laser Scanning Microscopy og analyse af data
- Billede erhvervelse
- Sæt de billeddannende betingelser på en sådan måde at maksimere den samlede fotontælling og minimere fototoksicitet, fotoblegning og cross-excitation.
- I en moderne konfokal laser scanning mikroskop, brug en 20X høj numerisk apertur nedsænkning objektiv, åben detektoren pinhole til 2,5 Airy enheder (dvs. bred optisk sektionsopdelingen), skal du vælge høj følsomhed Gaasp-detektorer med samtidigt aktive donor- og acceptor-kanaler, 8 bit dybde , ~ 750 nm pixelstørrelse, 3 gange ramme udjævning og Excite med 10% af en 405 nm laser diode.
- For at sikre korrekt kvantificering indstille detektoren gevinst på begge kanaler til den samme værdi og undgå mættede pixels.
Bemærk: Her blev de gevinster sat til 150%.
- Sikre løbende nedsænkning ved at sprede immersionsmedium til bunden af brøndene, for eksempel med en 1 ml sprøjte og undgå indfangning af luftbobler.
- Aktiver det transmitterede lys og finde en repræsentativ synsfelt i hver brønd. Brug en korrekt kalibreret automatisk scenen og markere positionen i softwaren.
- Efter fjernelse af plade til farvning (se afsnit 4.3), genindsætte pladen og tilføje en vægt på toppen for at undgå omdrejningspunkt afdrift. Gennemgå de gemte positioner med laser scanning mode og justere fokus og laterale position korrekt.
- Indstil tiden bortfalder til 2 min, varigheden til 2 timer og begynde erhvervelse.
- Sæt de billeddannende betingelser på en sådan måde at maksimere den samlede fotontælling og minimere fototoksicitet, fotoblegning og cross-excitation.
- Billede kvantificering (vil blive givet eksempler på Bitplane Softwer f.eks Imaris)
- Importer datasættet i software, der giver aritmetiske beregninger af pixel matricer. Gør dette ved at trække og slippe kilde fil, der indeholder både donor og acceptor kanal på ikonet software.
- Fratræk baggrunden i begge kanaler ved hjælp af den samme offset. For at gøre dette, klik på Menu og derefter på Billede> Processing> Baseline subtraktion. Vælg hver kanal og indtast baseline værdi.
- Korrigere gennemblødning af donor-kanal (CH1) i acceptor-kanal (CH2) med forudbestemt korrektionsfaktor f (se punkt 1.1), hvilket skaber en ny kanal:
Ch2 '= CH2 - Ch1 * f
BEMÆRK: En gennemblødning af acceptoren i donor kanalen ikke var påviseligt i forhold til niveauet af støj.- Klik på Menu> Billedbehandling> Kanal aritmetik og indtast abs (CH2- (CH1 * 0,33)). Bagefter slette Kanal 2, ved at klikke på Menu> Rediger> Slet Kanaler. Sørg for, atbløder-through korrigeret acceptor kanal forbliver som den nye kanal 2. Valgfrit: Skift kanal farve fra grå til den oprindelige farve ved at gå til Menu> Egenskaber Rediger> billede. Vælg Channel 4> kortlagt Farve> Base farve og ændre det til fx, grøn.
- Opret en ny kanal med følgende operation for at bestemme den relative FRET koefficient:
Ch3 = Ch2 '/ (CH1 + Ch2')- Gå til Menu> Billedbehandling> Kanal aritmetik og indtast ch2 ./ (CH1 + CH2)
- For korrekt visualisering af FRET kanal i et 8 bit billede, skal du oprette en fjerde kanal:
CH4 = 255 * Ch3- Gå til Menu> Billedbehandling> Kanal aritmetik og indtast 255 * CH3. Skift kanal farve ved at gå til Menu> Egenskaber Rediger> billede. Vælg Channel 4> kortlagt Farve> Farve Tabel Filer> Jet.
- Påfør et 3x3 median filter til at kanaler Ch3 og CH4 that vil reducere støjen i billederne. For at gøre dette, skal du klikke på Menu> Billedbehandling> Smoothing> Median filter. Vælg begge kanaler og anvende et filter størrelse "3x3x1".
- Til kvantificering af cellulære signaler, opdage cellerne i CH4 korrekt indstilling af offset og filtrere strukturer efter størrelse at udelukke for små strukturer.
- Vælg overgå Vis, og klik på ikonet "Tilføj nye Surfaces". Definer detektionsalgoritmen parametre i Surface vinduet. For hurtigere behandling, aktiveres to afkrydsningsfelter "Segment kun et område af interesse" og "Proces hele billedet til sidst". Definer området af interesse ved at redigere dens dimensioner.
- Vælg Channel 4 som kilde kanal og sætte tærsklen ved Thresholding> baggrundssubtraktion (Local Contrast) og indstille en diameter på 10 um. Indstil den minimale intensitet tærskel manuelt til 0 og den maksimale grænse til den maksimale intensiveretty. Filtrer strukturerne efter område og indstille den mindste værdi til fx 187 μm². Afslut afsløring overflade.
- Uddrag middelværdierne for donor fluorescensintensitet (CH1) og relativ FRET koefficient (CH3) og deres standardafvigelser i den cellulære enhed. For at gøre dette, gå til overfladen egenskaber. Ændre udseendet af strukturerne ved at vælge Overflader Style / Kvalitet> Overflade. Vælg alle strukturer ved at klikke på fanebladet filtre. Forene de fundne strukturer ved at gå til Process Selection> Unify. Eksporter statistikken overflade til MS Excel ved at klikke på fanen statistik> Eksporter al statistik til fil.
- Plot disse værdier over tid. Identificer 10 min interval på maksimalt hældning donor kanal fluorescens stigning for hver tilstand som en rimelig parameter til at repræsentere den mængde translokeret effektor. Beregn hældningen som m = Δ donor fluorescensintensitet / Δ (min).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at demonstrere evnen af den beskrevne metode til kvantitativt analysere effektor translokation i målceller blev to Yersinia stammer med forskellige translokation kinetik studeret: Y. enterocolitica vildtypestamme WA-314 (serogruppe O8, huser virulensplasmidet pYVO8 22) og dens afledte WA-314ΔYopE (WA-314 huser pYVO8ΔYopE 23). Tidligere arbejde viste, at Y. enterocolitica mutanter mangler funktionelle YopE udviser en signifikant højere Yop translokation på 10. Begge stammer blev transformeret med vektorer, der koder for fusioner af den N-terminale udskillelsessignalsekvensen YopE og TEM-1-beta-lactamase (bla-PMK) 17. WA-314 blev yderligere transformeret med en vektor, der koder for en respektiv YopE ovalbumin fusion (PMK-æg 17) for at tjene som en negativ kontrol. Inkubationstider på 30, 60 og 90 min blev anvendt med henblik på yderligere vurdering af method`s effektive rækkevidde and egnethed til kvantificering. To forskellige udlæsninger blev anvendt til dataanalyse: donorfluorescens (CH1) og relative FRET koefficienter (CH3 = CH2 '/ (CH1 + K2)) (figur 1B og 1C).
For den negative kontrol stamme WA-314-PMK-æg plotning af donor kanal intensiteter (CH1) over tid viser ingen stigning i fluorescensemission uanset inkubationstiden (figur 1B). I modsætning hertil blev i WA-314-PMK-bla inficerede celler påvises en stigning i fluorescensintensitet med tiden indikerer tilstedeværelsen af YopE beta-lactamase fusion i målcellen cytoplasma. Som forventet maksimal hældning af fluorescens intensitet er positivt korreleret med længden af infektion (30 min for infektion: 0,10 / min, 60 min infektion: 0,33 / min, 90 min infektion: 0,76 / min), hvilket indikerer, at forskellige koncentrationer af translokeres beta- lactamase kan skelnes. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser WA-314ΔYopE-PMK-bla-inficerede celler udviser hurtigere stigning i fluorescensintensitet sammenlignet med vildtypestammen (30 min for infektion: 1,28 / min, 60 min infektion: 1.53 / min, 90 min infektion: 1.41 / min). Interessant, udvide infektion til 90 min ikke yderligere at fremskynde stigningen i donorfluorescens sammenlignet med 60 min på infektion (figur 1B). Denne konstatering kan formentlig forklares ved den gradvise cytotoksiske virkning udøves af WA-314ΔYopE-PMK-bla, som enten vil kunne hæmme effektiv translokation over 60 min for infektion eller føre til tab af fluorescens farvestoffer følge af forstyrrelserne i plasmamembranintegritet. De ved hjælp af den relative FRET koefficient (CH3) til analyse resultater er i god overensstemmelse med resultaterne opnået ved donor kanalen alene. Men i nogle forhold (WA-314ΔYopE-PMK-bla, 60 og 90 min infektion), der repræsenterer meget store mængder af translokeret beta-lactamase fusion, naturligvis CCF4 substrat var ikonstant bearbejdes før billeddannelse kunne startes. Disse betingelser giver ikke mulighed for at beregne et rimeligt maksimum negativ hældning, fordi den relevante del af kurven er savnet i disse data repræsentation (figur 1C). Billeder af den relative FRET koefficienten kanal giver mulighed for at sammenligne forskelle mellem de enkelte celler (Figur 1D).
Figur 1. Kvantitativ analyse af effektor translokation af TEM-1 YopE fusioner i Y. enterocolitica. (A) Hydrolyse af CCF4 substrat ved omplantet TEM-1 beta-lactamase blev overvåget ved laser scanning mikroskopi. Excitation ved 405 nm resulterede i grøn fluorescens emission (530 nm) af det intakte substrat og blå fluorescensemission (460 nm) af det spaltede hydrolyse product (coumarin). (B, C) Mikroskopi data blev analyseret kvantitativt ved at afbilde donor kanal intensitet (CH1) eller beregning og afbildning af de relative FRET koefficienter (CH3 = CH2 '/ (CH1 + K2)). Data er repræsentative for tre uafhængige forsøg. (D) afbildet mikrofotografier (FRET kanal) blev taget fra repræsentative film på de angivne tidspunkter. WA-314ΔE-PMK-bla-inficerede celler viser hurtigere fald i de relative FRET koefficienter i forhold til vildtype WA-314-PMK-bla (60 min infektion). Scale bar, 20 pm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. krydstale bestemmelse af fluoroforer V450 og FITC.Spektre af både individuelle fluorophorer blev målt med konfokal mikroskop. Gennemblødning af donor V450 i acceptor kanal inden for 525-535 nm detektor området blev beregnet ud fra en lineær regression (indsæt). Den gennemsnitlige procentdel af krydstale beregnes ud fra to målinger er lig 0,33. Bleed-through af acceptor FITC i donor-kanal (455-465 nm) var ikke påvises over støjniveauet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi her anvendt med succes en TEM-1 beta-lactamase reporter assay til kvantitativ analyse af effektor translokation af Y. enterocolitica. Mange forskellige variationer af dette følsomme, specifikke og relativt ligetil teknik er blevet beskrevet i litteraturen. I denne undersøgelse laserscanning mikroskopi blev udført for mest følsomme og nøjagtige detektion af fluorescenssignaler. Specifikt korrektionen for krydstale mellem donor- og acceptor farvestoffer og de individuelt justerbare afsløring båndbredder muliggøre overlegen målenøjagtighed sammenlignet med andre variationer af fremgangsmåden. Resultaterne viser tydeligt, at fremgangsmåden er i stand til kvantitativ analyse translokation. Forskellige inkubationstider repræsenterer forskellige koncentrationer af intracellulær beta-lactamase var positivt korreleret med hældningen af donor fluorescensintensitet. Også en signifikant højere translokationshastighed af WA-314ΔYopE sammenlignettil vildtypestammen WA-314 kunne påvises.
To alternative muligheder for dataanalyse blev anvendt: Donor kanal intensiteter og relative FRET koefficienter. Fordelen ved at anvende donor-kanalen er, at det direkte repræsenterer akkumulering af en CCF-4 hydrolyseprodukt (coumarin). Denne fremgangsmåde er muligt i en mikroskopisk opsætning, fordi andre end i en pladelæser korrektion for forskelle i celledensiteter ved anvendelse af et forhold af donor / acceptor er ikke nødvendig. Imidlertid eksport af CCF4 farvestof eller dets hydrolyseprodukter er stadig en mulig confounder i denne fremgangsmåde. Denne ulempe kan overvindes ved at beregne den relative FRET koefficient.
I de beskrevne setup forsøg blev udført i plader med 96 brønde. Dette format giver mulighed for afprøvning af flere betingelser i et enkelt eksperiment, og hjælper med at spare dyre kemikalier (specifikt CCF4 / AM lastning kit). I den beskrevne arbejdsgang er det kritisk at begynde imerhvervelse alder på et defineret tidspunkt kort efter tilsætning af CCF4 / AM loading løsning, fordi hydrolyse af CCF4 af omplantet beta-lactamase starter straks. I tilfælde af behandling for at mange betingelser på én gang, kan justering af fokus og laterale positioner (trin 5.1.4) tage for lang tid og hæmme en rettidig start på billedet købet. Derfor er den maksimale antal parallelle prøver skal fastsættes individuelt.
Et af de største problemer ved anvendelse af denne metode blev den betydelige eksport af CCF4 substrat af HeLa-celler ved 37 ° C. Dette fænomen kunne ikke i tilstrækkelig grad modvirkes ved behandling af cellerne med probenecid. Derfor besluttede vi, i stedet for overvågning translokation under den igangværende infektion som tidligere beskrevet, at første komplette infektion og efterfølgende indlæse cellerne med CCF4 / AM farvestof. Med denne fremgangsmåde var det muligt at overvåge behandlingen af CCF4 substrat ved stuetemperatur. Under disse betingelser Reduced eksport af CCF4 blev observeret. Mængden af eksport af CCF4 substrat synes at være cellelinje specifik; opsætningen beskrevet her tillader pålidelig analyse af translokation også cellelinier, som i høj grad eksportere CCF4 ved 37 ° C.
Eksport af CCF4 er ikke et problem i nogle andre cellelinjer gør det muligt at vedtage mikroskopi setup for overvågning af processerne i infektion og translokation samtidigt i realtid. Dette giver mulighed for at analysere translokation i individuelle celler og kan anvendes til at korrelere translokation med specifikke begivenheder af værtscelle interaktion som bakteriel adhæsion eller dannelse af mikro-kolonier 20. Derfor er dette assay er et værdifuldt redskab til yderligere at belyse de mekanismer, hvordan translokation reguleres under samspillet mellem bakterier og værtsceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405 nm diode laser 50 mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
References
- Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial Type III Secretion Systems: Specialized Nanomachines for Protein Delivery into Target Cells. Annu Rev Microbiol. 68, 415-438 (2014).
- Aepfelbacher, M., Trasak, C., Ruckdeschel, K. Effector functions of pathogenic Yersinia species. Thromb Haemost. 98 (3), 521-529 (2007).
- Heesemann, J., Sing, A., Trulzsch, K. Yersinia's stratagem: targeting innate and adaptive immune defense. Curr Opin Microbiol. 9 (1), 55-61 (2006).
- Viboud, G. I., Bliska, J. B. Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis. Annu Rev Microbiol. 59, 69-89 (2005).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 10-3389 (2013).
- Pettersson, J., et al. Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact. Science. 273 (5279), 1231-1233 (1996).
- Schweer, J., et al. The cytotoxic necrotizing factor of Yersinia pseudotuberculosis (CNFY) enhances inflammation and Yop delivery during infection by activation of Rho GTPases. PLoS Pathog. 9 (11), e1003746 (2013).
- Wolters, M., et al. Cytotoxic necrotizing factor-Y boosts Yersinia effector translocation by activating Rac protein. J Biol Chem. 288 (32), 23543-23553 (2013).
- Mejia, E., Bliska, J. B., Viboud, G. I. Yersinia controls type III effector delivery into host cells by modulating Rho activity. PLoS Pathog. 4 (1), e3 (2008).
- Aili, M., et al. Regulation of Yersinia Yop-effector delivery by translocated YopE. Int J Med Microbiol. 298 (3-4), 183-192 (2008).
- Gaus, K., et al. Destabilization of YopE by the ubiquitin-proteasome pathway fine-tunes Yop delivery into host cells and facilitates systemic spread of Yersinia enterocolitica in host lymphoid tissue. Infect Immun. 79 (3), 1166-1175 (2011).
- Nordfelth, R., Wolf-Watz, H. YopB of Yersinia enterocolitica is essential for YopE translocation. Infect Immun. 69 (5), 3516-3518 (2001).
- Radics, J., Konigsmaier, L., Marlovits, T. C. Structure of a pathogenic type 3 secretion system in action. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 82-87 (2014).
- Sory, M. P., Cornelis, G. R. Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol. 14 (3), 583-594 (1994).
- Schlumberger, M. C., et al. Real-time imaging of type III secretion: Salmonella SipA injection into host cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (35), 12548-12553 (2005).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186 (16), 5486-5495 (2004).
- Koberle, M., et al. Yersinia enterocolitica targets cells of the innate and adaptive immune system by injection of Yops in a mouse infection model. PLoS Pathog. 5 (8), e1000551 (2009).
- Geddes, K., Cruz, F., Heffron, F. Analysis of cells targeted by Salmonella type III secretion in vivo. PLoS Pathog. 3 (12), e196 (2007).
- Marketon, M. M., DePaolo, R. W., DeBord, K. L., Jabri, B., Schneewind, O. Plague bacteria target immune cells during infection. Science. 309 (5741), 1739-1741 (2005).
- Mills, E., Baruch, K., Aviv, G., Nitzan, M., Rosenshine, I. Dynamics of the type III secretion system activity of enteropathogenic Escherichia coli. MBio. 4 (4), (2013).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3 (2), 104-113 (2008).
- Heesemann, J., Laufs, R. Construction of a mobilizable Yersinia enterocolitica virulence plasmid. J Bacteriol. 155 (2), 761-767 (1983).
- Zumbihl, R., et al. The cytotoxin YopT of Yersinia enterocolitica induces modification and cellular redistribution of the small GTP-binding protein RhoA. J Biol Chem. 274 (41), 29289-29293 (1999).
