Abstract
De nombreuses bactéries gram-négatives, y compris pathogène Yersinia spp. Emploient de type III systèmes de sécrétion de translocation des protéines effectrices dans des cellules cibles eucaryotes. A l'intérieur de la cellule hôte les protéines effectrices de manipuler les fonctions cellulaires au profit des bactéries. Pour mieux comprendre le contrôle de sécrétion de type III lors de l'interaction de la cellule hôte, sensible et dosages précis pour mesurer la translocation sont obligatoires. Nous décrivons ici l'application d'un dosage basé sur la fusion d'un fragment de protéine effectrice Yersinia enterocolitica (protéine extérieur Yersinia; YopE). Avec TEM-1 ß-lactamase pour l'analyse quantitative de translocation Le test repose sur le clivage d'une cellule de permeation FRET colorant (CCF4 / AM) par une translocation fusion bêta-lactamase. Après avoir clivé le noyau de Cephalosporine de CCF4 par la bêta-lactamase, de la coumarine FRET est perturbé à la fluorescéine et l'excitation de la fraction de coumarine conduit à l'émission de fluorescence bleue.Différentes applications de cette méthode ont été décrites dans la littérature en soulignant sa polyvalence. Le procédé permet l'analyse de la translocation in vitro et également in vivo, par exemple, dans un modèle de souris. La détection des signaux de fluorescence peut être effectuée en utilisant des lecteurs de plaques, une analyse FACS ou la microscopie par fluorescence. Dans l'installation décrite ici, à la translocation in vitro de fusions effectrices dans des cellules HeLa par des mutants de Yersinia différents est contrôlée par microscopie à balayage laser. Enregistrement conversion intracellulaire de la journaliste de FRET par la bêta-lactamase effecteur fusion en temps réel fournit des résultats quantitatifs robustes. Nous montrons ici des exemples de données, ce qui démontre la translocation accrue par un Y. enterocolitica YopE mutant par rapport à la souche de type sauvage.
Introduction
III systèmes de sécrétion de type sont spécialisés machines protéines exportation utilisées par les différents genres de bactéries gram-négatives de livrer directement des protéines effectrices codées par des bactéries dans les cellules cibles eucaryotes. Bien que la machinerie de sécrétion lui-même est hautement conservée, des ensembles spécialisés de protéines effectrices ont évolué entre les différentes espèces bactériennes à manipuler voies de signalisation cellulaire et faciliter les stratégies de virulence bactériennes spécifiques 1. En cas de Yersinia, jusqu'à sept protéines effectrices, que l'on appelle (protéines extérieures Yersinia) Yops, sont transportés au moment du contact de la cellule hôte et d'agir de concert pour renverser les réponses des cellules immunitaires telles que la phagocytose et la production de cytokines, à savoir, pour permettre la survie extracellulaire des bactéries 2-4. Le processus de translocation est étroitement contrôlée à différents stades 5. Il est établi que l'activation de la SST3 primaire est déclenchée par le contact de la cible thisll 6. Cependant, le mécanisme précis de cette ouverture n'a pas encore été élucidé. Dans Yersinia un deuxième niveau de ce qu'on appelle de réglage fin de la translocation est réalisé par haut ou bas-régulation de l'activité des protéines cellulaires Rho GTP Rac1 ou RhoA. L'activation de Rac1 par exemple invasine ou cytotoxique facteur nécrosante Y (CNF-Y) entraîne une augmentation de la translocation 7-9, tandis que le GAP (GTPase activating protein) fonction de translocation YopE down-régule l'activité Rac1 et diminue en conséquence la translocation par un type de rétroaction négative mécanisme de 10,11.
Méthodes valides et précises sont la condition préalable pour étudier comment la translocation est régulée au cours Yersinia interaction de la cellule hôte. De nombreux systèmes différents ont été utilisés à cet effet, chacune des avantages et des inconvénients spécifiques. Certaines approches reposent sur la lyse de cellules infectées par des bactéries, mais pas différents détergents suivie d'une analyse par transfert de Western. The inconvénient commun de ces méthodes est que la lyse bactérienne mineure mais inévitable contamine éventuellement le lysat cellulaire avec des protéines effectrices bactéries associées. Cependant, le traitement des cellules avec de la protéinase K pour dégrader les protéines effectrices extracellulaires et l'utilisation ultérieure de la digitonine pour la lyse sélective des cellules eucaryotes ont été proposés pour 12 minimiser ce problème. Surtout, ces essais dépendent de façon cruciale sur les anticorps anti-effectrices de haute qualité, qui ne sont généralement pas disponibles dans le commerce. Les tentatives d'utilisation de fusions traductionnelles des protéines effectrices et les protéines fluorescentes comme la GFP pour suivre la translocation ont échoué probablement dû à la structure tertiaire des protéines globulaires fluorescents et l'incapacité de l'appareil de sécrétion de les déplier avant 13 sécrétion. Cependant, plusieurs mots-clés différents rapporteurs comme le cya (calmoduline-dépendante l'adénylate cyclase) domaine de la toxine de Bordetella pertussis cyclolysin 14 ou Flashtag ont été utilisés avec succès pour analyser translocation. Dans le premier essai de l'activité enzymatique de cya est utilisé pour amplifier le signal de la protéine de fusion intracellulaire, tandis que la balise de Flash, une étiquette de motif très court tétracystéine (4Cys), permet pour l'étiquetage avec le colorant de Flash biarsénicale sans perturber le processus de sécrétion 15.
L'approche appliquée ici a été signalé pour la première fois par Charpentier et al., Et est basé sur la conversion intracellulaire de la Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) colorant CCF4 par translocation effecteur TEM-1 bêta-lactamase fusions 16 (figure 1A). CCF4 / AM est un composé de cellules infiltrant dans laquelle un dérivé de la coumarine (donneur) et une fraction de fluorescéine (accepteur) sont reliées par un noyau de céphalosporine. Lors de l'entrée passive dans la cellule eucaryote, la non-estérifié composé fluorescent CCF4 / AM est traitée par les estérases cellulaires au CCF4 chargé et fluorescent et ainsi piégédans la cellule. Excitation de la fraction de coumarine à 405 nm de résultats FRET à la fraction de fluorescéine, qui émet un signal de fluorescence verte à 530 nm. Après clivage du noyau de céphalosporine par la bêta-lactamase FRET est perturbé et l'excitation de la fraction de coumarine conduit à l'émission de fluorescence bleue at460 nm. Différentes applications de cette méthode ont été décrites dans la littérature en soulignant sa polyvalence. Le procédé permet l'analyse de la translocation in vitro et également in vivo, par exemple, la technique a été utilisée dans un modèle d'infection de la souris pour identifier les populations de leucocytes ciblées pour la translocation in vivo 17-19. Compteur de signaux peut être effectuée en utilisant des lecteurs de plaques, une analyse FACS ou la microscopie par fluorescence. Il faut noter que le procédé prévoit également la possibilité de contrôler la translocation en temps réel par microscopie des cellules vivantes au cours de la 20,21 processus de l'infection. Ici, la microscopie par fluorescence à balayage laser a été appliquée pour readout des signaux de fluorescence comme il offre la plus élevée sensibilité et la précision. En particulier, la capacité d'ajuster la fenêtre d'émission avec une précision nanométrique en combinaison avec des détecteurs de haute sensibles facilite optimisé détection par fluorescence et minimisé la diaphonie. En outre, cette configuration de microscopie peut être adapté pour la surveillance en temps réel de la translocation et permet potentiellement pour l'analyse simultanée de interaction hôte-pathogène au niveau cellulaire.
Dans cette étude, les taux d'un Y. de translocation enterocolitica souche de type sauvage et un mutant de deletion YopE présentant un phénotype de hypertranslocator 10,11 ont été analysés de manière exemplaire.
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Protocol
1. pic d'émission et de la Croix-talk Détermination (voir également la figure 2)
- Afin de déterminer les pics d'émission et le montant de la diaphonie entre le donneur (coumarine dérivé V450) et l'accepteur (fluorescéine) colorants, effectuer des analyses spectrales de cellules marquées par deux fluorophores individuelles à 405 nm excitation.
- Déterminer une largeur de bande de 10 nm à l'intérieur de la pointe de chaque colorant qui sera utilisée pour les canaux de donneur et d'accepteur (455 à 465 nm et ici de 525 à 535 nm). Tracer l'intensité normalisée plus la longueur d'onde et calculer le pourcentage moyen de diaphonie du donneur de colorant dans le canal de l'accepteur et vice versa (Figure 2).
2. Préparation de Y. enterocolitica souches pour la culture cellulaire Infection
- Utilisez les souches suivantes: WA-314-pMK ovules (WA-314 transformé avec les plasmides pMK-bla 17 et PMK-ovules 17, respectivement) et WA-314ΔYopE pMK-bla (WA-314ΔYopE transformé avec le plasmide pMK-bla 17)
- Au moins deux jours avant l'infection série Y. enterocolitica souches WA-314 pMK-ovules, WA-314 pMK-bla et WA-314ΔE pMK-bla de cryo des stocks sur des plaques d'agar-LB contenant les antibiotiques nécessaires (kanamycine pour WA-314 pMK-bla et WA-314 pMK-ova ; kanamycine et la tétracycline pour WA-314ΔE pMK-bla) et de grandir O / N à 27 ° C. Garder ensuite les plaques pendant jusqu'à une semaine à 4 ° C.
- Un jour avant l'infection inoculer 3 ml de milieu LB contenant les antibiotiques nécessaires avec une colonie des souches respectives et incuber O / N à 27 ° C dans un agitateur à 180 rpm.
- Le jour de l'infection inoculer 2 ml de la culture O / N dans 40 ml de milieu LB frais sans antibiotiques et incuber pendant 90 min à 37 ° C dans un agitateur à 180 tours par minute pour induire l'expression du système de sécrétion de type III.
- Transférer les cultures dans un tube approprié et garder les cultures sur de la glace ou à 4 ° Cà partir de maintenant. Centrifuger les cultures pendant 10 min à 5000 xg et 4 ° C.
- Reprendre le culot bactérien dans 2-3 ml de PBS glacé. Diluer la suspension bactérienne à une concentration de 8 x 10 8 cfu / ml en utilisant un spectrophotomètre. Déterminer la densité optique correspondant individuellement. Gardez cette suspension sur la glace jusqu'à ce que l'infection des cellules HeLa.
3. Les cellules HeLa Placage
- Un jour avant la graine de l'infection de 1,5 x 10 4 cellules des cellules HeLa dans du DMEM 200 ul contenant inactivé sérum de veau foetal 10% de la chaleur (FCS) dans les puits d'une plaque de 96 puits et de cultiver dans un incubateur à CO 2 de 5% à 37 ° C. Ensemencer trois puits pour chaque souche (trois temps d'incubation différents).
4. Infection des cellules HeLa et chargement avec CCF4
- Infecter des cellules HeLa en ajoutant 3,5 ul de la suspension bactérienne dans le milieu et le mélanger doucement par pipetage du milieu deux fois. Permettre aux bactéries de sédimentspour les cellules à une MOI (fragment d'infection) d'environ 100 bactéries par cellule. Pour un cours de temps de démarrage infections à -90 min -60 min -30 min et et incuber à 37 ° C dans un incubateur à CO 2 de 5% jusqu'à 0 min pour atteindre un point final commun.
- Quand l'incubation est terminée, aspirer soigneusement le moyen sans enlever les cellules HeLa et ajouter 50 pi de PBS contenant 20 pg / ml de chloramphenicol pour arrêter l'expression des effecteurs et 2,5 mM de probénécide pour réduire l'exportation de CCF4.
- A ce point de transférer la plaque de 96 puits dans la platine du microscope et de définir des points appropriés pour une analyse ultérieure dans chaque puits. Terminer cette étape en 10 min (pour plus de détails de l'acquisition voir rubrique 5.1).
- Par puits, ajouter 70 pi de solution CCF4 / AM de chargement (solution 0,24 pi A, 1,2 ul solution B, 18,56 ul solution C (solution A, B, et C fourni dans le kit / AM de chargement CCF4) et 50 pi de PBS (contenant 20 ug / ml de chloramphenicol et 2,5 mM de probénécide) à l'aide d'un multiple pipette et incuber pendant 5 min à température ambiante. A partir de maintenant sur le travail sans interruption.
- Aspirer la solution de charge et ajouter 100 ul de PBS contenant 20 ug / ml de chloramphenicol et 2,5 mM de probénécide en utilisant une pipette multiple. Puis transférer rapidement la plaque à 96 puits dans la platine du microscope et de démarrer l'acquisition à 10 min de l'aspiration de la solution de chargement.
5. balayage laser et analyse des données
- L'acquisition des images
- Définissez les conditions d'imagerie de manière à maximiser le nombre de photons totale et de réduire la phototoxicité, photoblanchiment et de contre-excitation.
- Dans un laser microscope confocal à balayage moderne, utiliser un objectif ambitieux de l'ouverture d'immersion numérique 20X, ouvrir le trou de détection à 2,5 unités Airy (c.-à-large sectionnement optique), choisissez haute sensibilité GaAsP-détecteurs avec donneur et accepteur canaux actifs simultanément, profondeur de 8 bits , ~ 750 nm taille de pixel, 3 fois trame moyenne et EXCITe avec 10% d'une diode laser à 405 nm.
- Pour assurer la bonne quantification régler le gain du détecteur des deux canaux sur la même valeur et d'éviter toute pixels saturés.
Remarque: Ici, les gains ont été fixés à 150%.
- Assurer une immersion continue par diffusion milieu d'immersion au fond des puits, par exemple avec une seringue de 1 ml, et d'éviter le piégeage de bulles d'air.
- Activer la lumière transmise et de trouver un champ de vue représentatif dans chaque puits. Utilisez une étape automatique correctement calibré et marquer la position dans le logiciel.
- Après le retrait de la plaque pour la coloration (voir rubrique 4.3), remettre la plaque et ajouter un poids sur le dessus pour éviter la dérive focale. Passez en revue les positions enregistrées avec le mode de balayage laser et la mise au point et la position latérale correctement.
- Régler le laps de temps de 2 min, la durée de 2 heures et commencer à l'acquisition.
- Définissez les conditions d'imagerie de manière à maximiser le nombre de photons totale et de réduire la phototoxicité, photoblanchiment et de contre-excitation.
- Image quantification (exemples seront donnés pour Bitplane Logicielssont tels que Imaris)
- Importer l'ensemble de données dans un logiciel qui permet des calculs arithmétiques de matrices de pixels. Pour ce faire, par glisser-déposer le fichier source contenant à la fois le donneur et le canal de l'accepteur sur l'icône du logiciel.
- Soustraire le fond dans les deux canaux en utilisant le même décalage. Pour ce faire, cliquez sur Menu, puis cliquez sur Image> Traitement> Baseline soustraction. Sélectionnez chaque canal et entrez la valeur de référence.
- Corrigez la purge par le biais du canal des bailleurs de fonds (K1) dans le canal de l'accepteur (CH2) avec le facteur de correction f pré-déterminé (voir 1.1), la création d'une nouvelle chaîne:
Ch2 '= CH2 - K1 * f
REMARQUE: une purge par de l'accepteur dans le canal de donneur était non détectable sur le niveau de bruit.- Cliquez sur Menu> Traitement d'image> Canal Arithmétique et entrez abs (CH2- (CH1 * 0,33)). Ensuite supprimer Channel 2 en cliquant sur Menu> Modifier> Supprimer des chaînes. Veiller à ce que lasaigner à travers le canal-accepteur corrigée reste comme le nouveau canal 2. Facultatif: Changez la couleur de canal du gris à la couleur originale en allant à Menu> Édition> Propriétés de l'image. Sélectionnez Channel 4> mappé Couleur> Couleur de base et changer pour par exemple, vert.
- Créer une nouvelle chaîne avec l'opération suivante pour déterminer le coefficient relatif FRET:
Ch3 = CH2 '/ (Ch1 + Ch2')- Allez dans Menu> Image Processing> Canal Arithmétique et entrez CH2 ./ (CH1 + CH2)
- Pour visualisation correcte du canal FRET dans une image de 8 bits, de créer un quatrième canal:
CH4 = 255 * Ch3- Allez dans Menu> Image Processing> Canal Arithmétique et entrez 255 * CH3. Changez la couleur de canal en allant à Menu> Propriétés Modifier> Image. Sélectionnez Channel 4> fichier mappé Table Couleur> Couleur> Jet.
- Appliquer un filtre médian 3x3 aux canaux CH3 et CH4 that permettra de réduire le bruit dans les images. Pour ce faire, cliquez sur Menu> Traitement d'image> Lissage> filtre médian. Sélectionnez les deux canaux et d'appliquer une taille de filtre "3x3x1".
- Pour la quantification des signaux cellulaires, de détecter les cellules de CH4 configuré correctement le décalage et de filtrer les structures de la taille d'exclure trop petites structures.
- Sélectionnez la vue Surpass et cliquez sur l'icône "Ajouter de nouvelles surfaces". Définir les paramètres de l'algorithme de détection dans la fenêtre de la surface. Pour un traitement plus rapide, activer le deux cases à cocher "Segment seulement une région d'intérêt» et «toute image de process enfin". Définir la région d'intérêt en modifiant ses dimensions.
- Sélectionnez Channel 4 que le canal de source et régler le seuil par seuillage> soustraction de fond (contraste local) et définir un diamètre de 10 um. Réglez le seuil d'intensité moins manuellement à 0 et le seuil maximal à l'intensification maximaleTy. Filtrer les structures par zone et définir la valeur minimum par exemple, 187 μm². Terminez la détection de surface.
- Extraire les valeurs moyennes de l'intensité de la fluorescence du donneur (CH1) et le coefficient de FRET relatif (CH3) et leurs écarts-types de l'entité cellulaire. Pour ce faire, allez dans les propriétés de surface. Changer l'apparence des structures en sélectionnant Surfaces Style / Qualité> Surface. Sélectionnez toutes les structures en cliquant sur l'onglet Filtres. Unifier les structures détectées en allant à Processus de sélection> Unify. Exporter les statistiques de production en surface vers MS Excel en cliquant sur l'onglet Statistiques> Exporter toutes les statistiques de fichier.
- Tracer ces valeurs au fil du temps. Identifier l'intervalle de pente maximale d'augmentation de fluorescence de canal des donateurs pour chaque condition comme un paramètre raisonnable pour représenter la quantité d'effecteur une translocation 10 min. Calculer la pente comme Δ m = intensité de fluorescence du donneur / Δ temps (min).
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Representative Results
Pour démontrer la capacité de la méthode décrite pour analyser quantitativement effecteur translocation dans les cellules cibles, deux souches de Yersinia avec des cinétiques différentes de translocation ont été étudiés: Y. enterocolitica souche de type sauvage WA-314 (sérogroupe O8, hébergeant le plasmide de virulence pYVO8 22) et son dérivé WA-314ΔYopE (WA-314 hébergeant pYVO8ΔYopE 23). Des travaux antérieurs ont montré que Y. mutants dépourvus enterocolitica fonctionnelle YopE présentent un Yop taux significativement plus élevé de translocation 10. Les deux souches ont été transformées avec des vecteurs codant pour des fusions du signal de sécrétion N-terminale de YopE et TEM-1 ß-lactamase (bla PMK-) 17. WA-314 a en outre été transformée avec un vecteur codant pour une fusion respective YopE ovalbumine (OVA pMK 17) pour servir de témoin négatif. Des durées d'incubation de 30, 60 et 90 min ont été appliquées afin de mieux évaluer l'efficacité d'un éventail method`snd aptitude à la quantification. Deux affichages différents ont été utilisés pour l'analyse des données: fluorescence du donneur (CH1) et coefficients relatifs FRET (CH3 = CH2 '/ (Ch1 + Ch2')) (figure 1B et 1C).
Pour la souche de contrôle négative WA-314-pMK-ovules tracé des intensités des circuits de donneur (K1) au fil du temps montre pas d'augmentation de l'émission de fluorescence quel que soit le temps d'incubation (figure 1B). En revanche, dans les cellules WA-314-PMK-bla infectées a été détecté une augmentation de l'intensité de fluorescence au cours du temps indiquant la présence de bêta-lactamase YopE fusion dans le cytoplasme de la cellule cible. Comme prévu, la pente maximale de l'intensité de la fluorescence est corrélée positivement avec la durée de l'infection (30 min de l'infection: 0,10 / min, une infection 60 min: 0,33 / min, une infection 90 min: 0,76 / min) ce qui indique que différentes concentrations de bêta translocation lactamase peut être distingué. En accord avec des études précédentes WA-31Les cellules infectées 4ΔYopE-PMK-bla présentent une augmentation plus rapide de l'intensité de fluorescence par rapport à la souche de type sauvage (30 min de l'infection: 1,28 / min, 60 infection min: 1,53 / min, 90 infection min: 1,41 / min). Fait intéressant, l'expansion de l'infection à 90 min n'a pas accéléré en outre l'augmentation de la fluorescence du donneur par rapport à 60 min de l'infection (figure 1B). Cette constatation peut vraisemblablement être expliquée par l'effet cytotoxique progressive exercée par WA-314ΔYopE-pMK-bla, qui pourraient soit inhibent la translocation efficace au-delà de 60 minutes d'infection ou de conduire à la perte de colorants de fluorescence due à la perturbation de l'intégrité de la membrane plasmique. Les résultats fournis par utilisant le coefficient de FRET relatif (CH3) aux fins d'analyse sont en bon accord avec les résultats obtenus par le canal de donneur seul. Cependant, dans certaines conditions (WA-314ΔYopE-PMK-bla, l'infection 60 et 90 min) représentant les très grandes quantités de translocation fusion bêta-lactamase, de toute évidence, le substrat est en CCF4constamment traitée avant imagerie pu être démarré. Ces conditions ne seraient pas permettre le calcul d'une pente négative maximum raisonnable parce que la partie pertinente de la courbe est manqué dans cette représentation de données (figure 1C). Images de la chaîne par rapport coefficient FRET offrent la possibilité de comparer les différences entre les cellules individuelles (figure 1D).
Figure 1. L'analyse quantitative des effecteur translocation par fusions TEM-1 YopE en Y. enterocolitica. (A) L'hydrolyse du substrat par une translocation CCF4 TEM-1 ß-lactamase a été contrôlée par microscopie à balayage laser. L'excitation à 405 nm a donné lieu à l'émission de fluorescence verte (530 nm) du substrat intact et à l'émission de fluorescence bleue (460 nm) de l'hydrolyse pr clivéoduits (coumarine). (B, C) des données de microscopie ont été analysé quantitativement en traçant l'intensité du canal de donneur (K1) ou le calcul et le tracé des coefficients relatifs FRET (CH3 = CH2 '/ (Ch1 + Ch2')). Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes. (D) figurant sur l'micrographies (FRET canal) ont été prises à partir de films représentatifs au niveau des points de temps indiqués. WA-314ΔE-pMK-bla cellules infectées montrent diminution plus rapide des coefficients relatifs FRET par rapport au type sauvage WA-314-pMK-bla (60 infection min). La barre d'échelle, 20 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. détermination de la Croix-talk de l'fluorophores V450 et FITC.Les spectres des deux fluorophores individuelles ont été mesurées avec le microscope confocal. Purge à travers le V450 de donneur dans le canal d'accepteur dans la plage de 525 à 535 nm détecteur est calculée à partir d'une régression linéaire (insert). Le pourcentage moyen de diaphonie calculé à partir de deux mesures est égale à 0,33. Purger-travers de la FITC accepteur dans le canal de donneur (455-465 nm) était non détectable sur le niveau de bruit. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nous ici appliqué avec succès un essai à base TEM-1 bêta-lactamase reporter pour l'analyse quantitative des effecteur translocation par Y. enterocolitica. De nombreuses variantes de cette technique sensible, spécifique et relativement simple ont été décrits dans la littérature. Dans cette étude, la microscopie à balayage laser a été réalisée pour la détection plus sensible et précise de signaux de fluorescence. Plus précisément, la correction de diaphonie entre les colorants donneur et accepteur et les largeurs de bande de détection réglables individuellement pour permettre une précision de mesure supérieure par rapport à d'autres variantes de la méthode. Les résultats montrent clairement que le procédé est capable d'analyser quantitativement la translocation. Temps d'incubation différentes représentant différentes concentrations de bêta-lactamase intracellulaire étaient positivement corrélés avec la pente de l'intensité de fluorescence du donneur. Également un taux de translocation significativement plus élevé de la WA-314ΔYopE comparéeà la souche de type sauvage WA-314 a pu être démontrée.
Deux options alternatives pour l'analyse des données ont été appliquées: intensités des circuits des bailleurs de fonds et les coefficients relatifs FRET. L'avantage d'utiliser le canal de donneur est qu'il représente directement l'accumulation d'un produit d'hydrolyse CCF-4 (coumarine). Cette approche est possible dans une installation microscopique, parce que dans une autre correction de lecteur de plaque de différences de densités de cellules en utilisant un rapport de donneur / accepteur est pas nécessaire. Cependant, l'exportation du colorant CCF4 ou de ses produits d'hydrolyse est encore un facteur de confusion possible dans cette approche. Cet inconvénient peut être surmonté en calculant le coefficient de FRET relatif.
Dans les expériences de configuration décrites ont été menées dans des plaques à 96 puits. Ce format permet de tester plusieurs conditions en une seule expérience et contribue à économiser les produits coûteux (en particulier du kit de chargement CCF4 / AM). Dans le flux de travail décrit, il est essentiel de commencer imacquisition d'âge à un point de temps défini peu après addition de la solution de chargement CCF4 / AM parce hydrolyse de CCF4 par la bêta-lactamase translocation commence immédiatement. En cas de traitement à de nombreuses conditions à la fois, le réglage de mise au point et de positions latérales (étape 5.1.4) peut prendre trop de temps et d'entraver un démarrage rapide de l'acquisition de l'image. Par conséquent, le nombre maximum d'échantillons parallèles doit être déterminé individuellement.
L'un des principaux problèmes rencontrés en utilisant cette méthode était l'exportation considérable de substrat CCF4 par les cellules HeLa à 37 ° C. Ce phénomène ne peut pas être neutralisé suffisamment en traitant les cellules avec du probénécide. Nous avons donc décidé, à la place de la translocation de surveillance au cours de l'infection en cours, comme décrit précédemment, à la première infection complète et chargeons ensuite les cellules avec le colorant CCF4 / AM. Avec cette approche, il était possible de contrôler le traitement du substrat de CCF4 à température ambiante. Dans ces conditions, Reduced exportation de CCF4 a été observée. Le montant de l'exportation de substrat CCF4 semble être lignée cellulaire spécifique; la configuration décrite ici permet une analyse fiable de translocation aussi dans des lignées cellulaires, qui exportent fortement CCF4 à 37 ° C.
L'exportation de CCF4 constitue pas un problème dans d'autres lignées cellulaires permettant d'adopter la configuration de microscopie pour la surveillance des processus d'infection et de translocation simultanément en temps réel. Ceci permet d'obtenir la possibilité d'analyser la translocation dans les cellules individuelles et pourrait être utilisé pour mettre en corrélation avec la translocation des événements spécifiques d'interaction de la cellule hôte tels que l'adhérence bactérienne ou à la formation de micro-colonies 20. Par conséquent, cet essai est un outil précieux pour élucider les mécanismes de la façon dont la translocation est régulée pendant l'interaction des bactéries et des cellules hôtes.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405 nm diode laser 50 mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
References
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