Abstract
Molti batteri gram-negativi, tra cui patogeno Yersinia spp. Impiegano tipo III sistemi di secrezione di traslocare le proteine effettrici all'interno delle cellule bersaglio eucariotiche. All'interno della cellula ospite proteine effettrici manipolare funzioni cellulari a beneficio dei batteri. Per meglio comprendere il controllo di tipo III secrezione durante l'interazione cellula ospite, dosaggi precisi e sensibile per misurare la traslocazione sono obbligatori. Abbiamo qui descriviamo l'applicazione di un saggio basato sulla fusione di un frammento di proteina effettore Yersinia enterocolitica (Yersinia proteina esterna; YopE). Con TEM-1 beta-lattamasi di analisi quantitativa di traslocazione Il test si basa sulla scissione di una cella permeante FRET dye (CCF4 / AM) da traslocata fusione di beta-lattamasi. Dopo la scissione del nucleo cefalosporine CCF4 dalla beta-lattamasi, FRET da cumarina a fluoresceina viene interrotto e l'eccitazione della porzione cumarina porta a blu emissione di fluorescenza.Differenti applicazioni di questo metodo sono stati descritti in letteratura evidenziando la sua versatilità. Il metodo consente di analizzare traslocazione in vitro e in vivo anche, ad esempio, in un modello di topo. Rilevazione dei segnali di fluorescenza può essere eseguita utilizzando lettori di piastre, analisi FACS o microscopia a fluorescenza. Nella configurazione descritta qui, in vitro traslocazione di fusioni effettrici in cellule HeLa da diversi mutanti Yersinia è monitorato mediante microscopia a scansione laser. Registrazione conversione intracellulare del reporter FRET dalla beta-lattamasi effettori fusione in tempo reale fornisce risultati quantitativi affidabili. Siamo qui Mostriamo dati esemplificativi, dimostrando una maggiore traslocazione da un Y. enterocolitica YopE mutante rispetto al ceppo selvatico.
Introduction
III sistemi di secrezione di tipo sono macchine proteina-export specializzata utilizzati da diversi generi di batteri gram-negativi per fornire direttamente le proteine effettrici batteri codificate all'interno delle cellule bersaglio eucariotiche. Mentre il meccanismo secretorio stessa è altamente conservata, insiemi specializzati di proteine effettrici sono evoluti tra le diverse specie batteriche per manipolare percorsi di segnalazione cellulare e facilitare specifiche strategie di virulenza batterica 1. In caso di Yersinia, fino a sette proteine effettrici, i cosiddetti (proteine esterne Yersinia) YOPS, sono traslocato al contatto della cellula ospite e agire insieme per sovvertire le risposte delle cellule immunitarie come la fagocitosi e la produzione di citochine, vale a dire, per permettere la sopravvivenza extracellulare dei batteri 2-4. Il processo di traslocazione è strettamente controllata in diverse fasi 5. E 'stabilito che l'attivazione primaria del T3SS è innescata dal suo contatto con il ce bersaglioll 6. Tuttavia, il meccanismo preciso di questa iniziazione deve ancora essere chiarito. In Yersinia un secondo livello di cosiddetta messa a punto di traslocazione si ottiene up- o down-regolare l'attività delle proteine cellulari Rho GTP-binding Rac1 o RhoA. L'attivazione di Rac1 ad esempio invasina o citotossico necrotizzante fattore Y (CNF-Y) porta ad un aumento traslocazione 7-9, mentre la funzione del GAP traslocato YopE (GTPasi attivando proteina) down-regola l'attività Rac1 e diminuisce di conseguenza traslocazione da un tipo di feedback negativo Meccanismo di 10,11.
Metodi validi e precisi sono il presupposto per indagare come traslocazione è regolata durante l'interazione cellula ospite Yersinia. Molti sistemi differenti sono stati utilizzati per questo scopo, ciascuno con vantaggi e svantaggi specifici. Alcuni approcci si basano su lisi delle cellule infette, ma non i batteri da diversi detergenti seguita da western blot. The svantaggio comune di questi metodi è che la lisi batterica minore ma potenzialmente inevitabile contamina il lisato cellulare con batteri associati proteine effettrici. Tuttavia, il trattamento di cellule con proteinasi K per degradare proteine effettrici extracellulari e successivo utilizzo di digitonina per lisi selettiva delle cellule eucariotiche sono state proposte per minimizzare questo problema 12. È importante sottolineare che questi test cruciale dipendono anticorpi anti-effector alta qualità, che non sono per lo più disponibili in commercio. I tentativi di utilizzare fusioni traduzionali delle proteine effettrici e proteine fluorescenti come la GFP per monitorare traslocazione non hanno avuto successo probabilmente a causa della struttura terziaria delle proteine globulari fluorescenti e l'incapacità dell'apparato di secrezione a svolgersi prima secrezione 13. Tuttavia, diverse etichette giornalista diversi, come il cya (calmodulina-dipendente ciclasi) dominio del tossina della pertosse Bordetella cyclolysin 14 o Flashtag sono stati utilizzati con successo per analizzare traslocazione. Nel primo saggio di attività enzimatica di cya viene utilizzato per amplificare il segnale della proteina di fusione intracellulare, mentre il tag Flash, un tag brevissimo tetracysteine (4Cys) motivo, permette per l'etichettatura con il colorante Flash biarsenical senza disturbare il processo della secrezione 15.
L'approccio applicato qui è stato riportato per la prima volta da Charpentier et al. E si basa sulla conversione intracellulare del Förster Resonance Energy Transfer (FRET) dye CCF4 da traslocati effettore TEM-1 beta-lattamasi fusioni 16 (Figura 1A). CCF4 / AM è un composto cellulare permeanti in cui un derivato cumarina (donatore) e un residuo fluoresceina (accettore) sono collegati da un nucleo cefalosporina. All'entrata passivo nella cellula eucariotica, il non fluorescente esterificati composto CCF4 / AM viene elaborato dalle esterasi cellulari per il CCF4 carica e fluorescente e quindi intrappolatoall'interno della cellula. Eccitazione della porzione cumarina a 405 nm risultati in FRET alla frazione fluoresceina, che emette un segnale di fluorescenza verde a 530 nm. Dopo la scissione del nucleo cefalosporina dal FRET beta-lattamasi è interrotto e l'eccitazione della porzione cumarina porta a blu fluorescenza at460 nm. Differenti applicazioni di questo metodo sono stati descritti in letteratura evidenziando la sua versatilità. Il metodo consente di analizzare traslocazione in vitro e in vivo anche, ad esempio, la tecnica è stata utilizzata in un modello di infezione mouse per individuare le popolazioni leucocitarie mirati per traslocazione in vivo 17-19. Lettura dei segnali può essere condotta utilizzando lettori di piastre, FACS o microscopia a fluorescenza. Da notare, il metodo prevede anche la possibilità di monitorare traslocazione in tempo reale mediante microscopia live-cellulare durante il processo di infezione 20,21. Qui microscopia a scansione laser a fluorescenza è stato applicato per readout di segnali di fluorescenza in quanto fornisce massima sensibilità e precisione. In particolare, la capacità di regolare la finestra di emissione con precisione nanometrica in combinazione con rivelatori ad alta sensibili facilita ottimizzato rivelazione a fluorescenza e minimizzato cross-talk. Inoltre questa configurazione microscopia può essere adattato per il monitoraggio in tempo reale di traslocazione e potenzialmente consente per l'analisi simultanea di interazione ospite-patogeno a livello cellulare.
In questo studio i tassi di traslocazione di un Y. enterocolitica ceppo selvatico e una delezione mutante YopE esibendo un fenotipo hypertranslocator 10,11 sono stati analizzati in modo esemplare.
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Protocol
1. picco di emissione e Cross-talk Determinazione (vedi anche figura 2)
- Al fine di determinare i picchi di emissione e la quantità di cross-talk tra il donatore (cumarina derivato V450) e accettore (fluoresceina) coloranti, eseguire scansioni spettrali di cellule marcate con entrambi i fluorofori individuali a 405 nm di eccitazione.
- Determinare un bandwidth 10 nm entro il picco di ogni colorante che verrà utilizzato per i canali donatore e accettore (455-465 nm qui e 525-535 nm). Tracciare l'intensità normalizzata sulla lunghezza d'onda e calcolare la percentuale media di diafonia del colorante donatore nel canale accettore e viceversa (figura 2).
2. Preparazione di Y. enterocolitica ceppi per Cell Culture infezione
- Utilizzare i seguenti ceppi: WA-314 PMK-ovuli (WA-314 trasformato con i plasmidi PMK-bla 17 e PMK-ovuli 17, rispettivamente) e WA-314ΔYopE PMK-bla (WA-314ΔYopE trasformato con il plasmide PMK-bla 17)
- Almeno due giorni prima l'infezione striscia Y. enterocolitica ceppi WA-314 PMK-ovuli, WA-314 PMK-bla e WA-314ΔE PMK-BLA da crio scorte su piastre LB-agar contenenti antibiotici necessari (kanamicina per WA-314 PMK-bla e WA-314 PMK-ovuli , kanamicina e tetraciclina per WA-314ΔE PMK-bla) e crescere O / N a 27 ° C. Successivamente mantenere le piastre fino a una settimana a 4 ° C.
- Un giorno prima dell'infezione inoculare 3 ml di LB-mezzo contenente antibiotici richiesti con una colonia dei rispettivi ceppi e incubare O / N a 27 ° C in un agitatore a 180 rpm.
- Il giorno di infezione inoculare 2 ml della / coltura O N in 40 ml di LB fresco-mezzo senza antibiotici e incubare per 90 min a 37 ° C in un agitatore a 180 rpm per indurre l'espressione del sistema di secrezione di tipo III.
- Trasferire le culture in un tubo adatto e mantenere le culture in ghiaccio oa 4 ° CD `ora in poi. Centrifugare le colture per 10 min a 5000 xg e 4 ° C.
- Risospendere il pellet batterico in 2-3 ml di PBS freddo ghiaccio. Diluire la sospensione batterica ad una concentrazione di 8 x 10 8 UFC / ml utilizzando uno spettrofotometro. Determinare la corrispondente densità ottica individualmente. Mantenere questa sospensione in ghiaccio fino infettare le cellule HeLa.
3. Cellule placcatura HeLa
- Un giorno prima seme infezione 1,5 x 10 4 cellule HeLa in DMEM contenente 200 microlitri di siero 10% inattivato al calore fetale bovino (FCS) in pozzetti di una piastra da 96 pozzetti e coltivate in un incubatore CO 2 5% a 37 ° C. Seed tre pozzi per ogni ceppo (tre diversi tempi di incubazione).
4. L'infezione di cellule HeLa e caricamento con CCF4
- Infect cellule HeLa aggiungendo 3,5 ml di sospensione batterica al mezzo e mescolare pipettando delicatamente il mezzo due volte. Consentire ai batteri di sedimento sulle cellule ad una MOI (frazione di infezione) di circa 100 batteri per cellula. Per un corso di tempo iniziare infezioni a -90 min, -60 e -30 min min e incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 5% fino 0 min per raggiungere un punto finale comune.
- Quando l'incubazione è terminata, aspirare accuratamente il medium senza rimuovere le cellule HeLa e aggiungere 50 ml di PBS contenente 20 mg / ml di cloramfenicolo per fermare espressione di effettori e probenecid 2,5 mm per ridurre l'esportazione di CCF4.
- A questo punto trasferire la piastra a 96 pozzetti in fase di microscopio e definire punti idonei per una successiva analisi in ciascun pozzetto. Terminate questa fase entro 10 minuti (per i dettagli dell'acquisizione vedere paragrafo 5.1).
- Per bene, aggiungere 70 ml di soluzione di CCF4 / AM carico (soluzione 0,24 ml A, 1,2 ml soluzione B, 18,56 ml soluzione C (soluzione A, B, e C fornite entro CCF4 kit / AM carico) e 50 ml di PBS (contenenti 20 ug / ml di cloramfenicolo e probenecid 2,5 mM) usando un multi pipette e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. D'ora in lavoro senza interruzioni.
- Aspirare la soluzione di carico e aggiungere 100 ml di PBS contenente 20 mg / ml cloramfenicolo e probenecid 2,5 mm con una pipetta a più. Poi il trasferimento rapido della piastra 96 bene nella fase di microscopio e iniziare l'acquisizione entro 10 minuti dalla aspirazione della soluzione di carico.
5. Laser Scanning Microscopy e analisi dei dati
- Acquisizione di immagini
- Impostare le condizioni di imaging in modo da massimizzare il numero totale di fotoni e minimizzare fototossicità, photobleaching e cross-eccitazione.
- In un moderno microscopio confocale a scansione laser, usare un numerico alto obiettivo 20X apertura ad immersione, aprire il rilevatore foro stenopeico di 2,5 unità Airy (ad esempio, a livello di sezionamento ottico), scegliere alta sensibilità GaAsP Rivelatori canali donatore e accettore attivi contemporaneamente, profondità 8 bit , ~ 750 nm dimensione dei pixel, 3 volte telaio media e excite con il 10% di un diodo laser 405 nm.
- Per assicurare una corretta quantificazione impostare il guadagno del rivelatore di entrambi i canali sullo stesso valore e per evitare eventuali pixel saturi.
Nota: Qui, i guadagni sono stati fissati al 150%.
- Assicurare immersione continua diffondendo mezzo di immersione al fondo dei pozzetti, per esempio con una siringa da 1 ml, ed evitare l'intrappolamento di bolle d'aria.
- Attivare la luce trasmessa e trovare un campo rappresentativo di vista in ogni pozzetto. Utilizzare una fase automatico tarato correttamente e marcare la posizione nel software.
- Dopo la rimozione della piastra per la colorazione (vedere paragrafo 4.3), reinserire la piastra e aggiungere un peso sopra per evitare spostamenti focale. Rivedere le posizioni salvate con la modalità di scansione laser e regolare il fuoco e posizione laterale correttamente.
- Impostare il lasso di tempo di 2 minuti, la durata di 2 ore e iniziare l'acquisizione.
- Impostare le condizioni di imaging in modo da massimizzare il numero totale di fotoni e minimizzare fototossicità, photobleaching e cross-eccitazione.
- Quantificazione Immagine (esempi sarà dato per Bitplane Softwsono tali da Imaris)
- Importare il set di dati in un software che permette di calcoli aritmetici di matrici di pixel. A tale scopo, trascinando il file di origine che contiene sia il donatore e il canale accettore sull'icona del software.
- Sottrarre il fondo in entrambi i canali con lo stesso offset. Per fare questo, fare clic su Menu e quindi fare clic su Immagine> produzione> Baseline sottrazione. Selezionare un canale e immettere il valore di base.
- Correggere lo sfiato-through del canale donatore (Ch1) nel canale accettore (Ch2) con il predeterminato correzione del fattore f (vedi 1.1), creando un nuovo canale:
Ch2 '= Ch2 - Ch1 * f
NOTA: A spurgo attraverso del accettore nel canale donatore non era rilevabile rispetto al livello di rumore.- Fare clic su Menu> Elaborazione immagini> Canale Aritmetica e inserire abs (CH2- (ch1 * 0.33)). Successivamente eliminare Canale 2 facendo clic su Menu> Modifica> Elimina Canali. Assicurarsi che ilspurgo attraverso il canale accettore corretto rimane come il nuovo canale 2. Opzionale: Modificare il colore del canale dal grigio al colore originale andando su Menu> Proprietà Modifica> Immagine. Selezionare Channel 4> mappata colore> colore di base e modificarlo, ad esempio,, verde.
- Creare un nuovo canale con la seguente operazione per determinare il coefficiente relativo FRET:
Ch3 = Ch2 '/ (Ch1 Ch2 +')- Vai a Menu> Elaborazione immagini> Canale Aritmetica e inserire ch2 ./ (ch1 + ch2)
- Per una corretta visualizzazione del canale FRET in un'immagine a 8 bit, creare un quarto canale:
Ch4 = 255 * Ch3- Vai a Menu> Elaborazione immagini> Canale Aritmetica e immettere 255 * ch3. Cambiare il colore del canale andando su Menu> Proprietà Modifica> Immagine. Selezionare Channel 4> mappata File Table colori> Colore> Jet.
- Applicare un filtro mediano 3x3 ai canali CH3 e CH4 that ridurrà il rumore nelle immagini. Per fare questo, fare clic su Menu> Elaborazione immagini> Smoothing> Filtro mediano. Selezionare entrambi i canali e applicare un formato del filtro "3x3x1".
- Per la quantificazione dei segnali cellulari, rilevare le cellule in Ch4 impostando correttamente l'offset e filtrare le strutture in base alla dimensione di escludere troppo piccole strutture.
- Selezionare il Surpass Visualizza e fare clic sull'icona "Aggiungi nuove superfici". Definire i parametri dell'algoritmo di rilevamento nella finestra di superficie. Per l'elaborazione più veloce, attivare la due caselle di controllo "Segmento solo una regione di interesse" e "Processo intera immagine finalmente". Definire la regione di interesse, modificando le sue dimensioni.
- Selezionare Channel 4 come canale sorgente e impostare la soglia da Thresholding> Sfondo Sottrazione (Contrasto Locale) e impostare un diametro di 10 micron. Impostare la soglia minima intensità manualmente a 0 e la soglia massima al massimo intensity. Filtrare le strutture per area e impostare il valore minimo per esempio, 187 μm². Finire la rilevazione della superficie.
- Estrarre i valori medi per intensità di fluorescenza del donatore (Ch1) e il coefficiente relativo FRET (Ch3) e loro deviazioni standard nell'entità cellulare. Per fare questo, andare alle proprietà di superficie. Modificare l'aspetto delle strutture selezionando Surfaces Style / Qualità> Surface. Selezionare tutte le strutture facendo clic sulla scheda filtri. Unificare le strutture rilevate andando a processo di selezione> Unify. Esportare le statistiche di superficie in MS Excel facendo clic sulla scheda statistica> Esporta tutte le statistiche su file.
- Tracciare questi valori nel tempo. Identificare l'intervallo 10 min di pendenza massima di aumento della fluorescenza canale donatore per ogni condizione come un parametro ragionevole per rappresentare la quantità di effettore traslocato. Calcolare la pendenza come m = Δ intensità di fluorescenza del donatore / tempo Δ (min).
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Representative Results
Per dimostrare la capacità del metodo descritto per analizzare quantitativamente effettrici traslocazione in cellule bersaglio, sono stati studiati due ceppi Yersinia con differenti cinetiche traslocazione: Y. enterocolitica ceppo selvatico WA-314 (sierogruppo O8, l'ospitare il plasmide di virulenza pYVO8 22) e la sua derivata WA-314ΔYopE (WA-314 ospitare pYVO8ΔYopE 23). Lavoro precedente ha mostrato che Y. mutanti enterocolitica privi funzionale mostra YopE un significativamente più alto tasso di Yop traslocazione 10. Entrambi i ceppi sono state trasformate con vettori codifica per fusioni del segnale di secrezione n-terminale di YopE e TEM-1 beta-lattamasi (PMK-bla) 17. WA-314 è stato ulteriormente trasformato con un vettore di codifica per un rispettivo ovalbumina fusione YopE (PMK-ovuli 17) per servire come controllo negativo. I tempi di incubazione di 30, 60 e 90 min sono stati applicati per valutare ulteriormente la portata effettiva un method`snd idoneità per la quantificazione. Due letture differenti sono stati utilizzati per l'analisi dei dati: la fluorescenza del donatore (Ch1) e coefficienti relativi FRET (Ch3 = Ch2 '/ (Ch1 Ch2 +')) (Figura 1B e 1C).
Per il ceppo di controllo negativo WA-314-PMK-ovuli complotto di intensità del canale donatore (Ch1) nel corso del tempo non mostra alcun aumento di emissione di fluorescenza a prescindere dal tempo di incubazione (Figura 1B). Al contrario, nelle cellule WA-314-PMK-bla infettate è stato rilevato un aumento dell'intensità di fluorescenza nel tempo che indica la presenza di beta-lattamasi YopE fusione nel citoplasma delle cellule bersaglio. Come previsto la pendenza massima dell'intensità di fluorescenza è correlata positivamente con la lunghezza di infezione (30 min di infezione: 0.10 / min, 60 min infezione: 0.33 / min, 90 min infezione: 0.76 / min) indica che diverse concentrazioni di beta- traslocato lattamasi può essere distinto. In accordo con gli studi precedenti WA-31Cellule infettate 4ΔYopE-PMK-bla mostrano più rapido aumento di intensità di fluorescenza rispetto al ceppo selvatico (30 min di infezione: 1.28 / min, 60 min infezione: 1.53 / min, 90 min infezione: 1.41 / min). È interessante notare, espandendo infezione per 90 min non accelera ulteriormente l'aumento della fluorescenza del donatore rispetto al 60 min di infezione (Figura 1B). Questo risultato può presumibilmente essere spiegato con l'effetto citotossico progressiva esercitata da WA-314ΔYopE-PMK-bla, che potrebbe o inibire la traslocazione efficiente al di là di 60 minuti di infezione o portare alla perdita di coloranti fluorescenti a causa della disintegrazione della membrana plasmatica. I risultati forniti utilizzando il coefficiente di FRET relativa (CH3) per l'analisi sono in buon accordo con i risultati ottenuti dal canale donatore sola. Tuttavia, in alcune condizioni (WA-314ΔYopE-PMK-bla, 60 e 90 min infezione) rappresentano molto grandi quantità di traslocato fusione di beta-lattamasi, ovviamente il substrato CCF4 eracostantemente trasformati prima di imaging potrebbe essere avviato. Queste condizioni non consentirebbero di calcolare una pendenza negativa massima ragionevole, perché la parte rilevante della curva è mancato in questa rappresentazione dei dati (Figura 1C). Le immagini del relativo canale di coefficiente di FRET forniscono la possibilità di confrontare le differenze tra le singole cellule (Figura 1D).
Figura 1. Analisi quantitativa di effettori traslocazione da fusioni TEM-1 YopE a Y. enterocolitica. (A) idrolisi di CCF4 substrato mediante traslocato TEM-1 beta-lattamasi è stata monitorata mediante microscopia a scansione laser. Eccitazione a 405 nm provocato emissione di fluorescenza verde (530 nm) del substrato intatto e in emissione di fluorescenza blu (460 nm) di idrolisi pr spaccatioduct (cumarina). (B, C) i dati di microscopia sono stati analizzati quantitativamente tracciando l'intensità del canale donatore (Ch1) o al calcolo e la stampa dei coefficienti relativi FRET (Ch3 = Ch2 '/ (Ch1 Ch2 +')). I dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. (D) micrografie dipinte di (FRET canale) sono state prese da film rappresentativi nei punti di tempo indicato. WA-314ΔE-PMK-bla cellule infettate mostrano una più rapida diminuzione dei coefficienti FRET relativi rispetto al tipo selvaggio WA-314-PMK-bla (60 min infezione). Barra della scala, 20 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. determinazione diafonia del V450 fluorofori e FITC.Gli spettri dei due singoli fluorofori sono stati misurati con il microscopio confocale. Sanguinare-through del V450 donatore nel canale accettore nell'intervallo 525-535 nm rilevatore è stato calcolato da una regressione lineare (inserto). La percentuale media di diafonia calcolato da due misure è uguale a 0,33. Bleed-through del CIC accettore nel canale donatore (455-465 nm) non era rilevabile sopra il livello del rumore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Siamo qui applicato con successo un saggio basato TEM-1 beta-lattamasi giornalista per l'analisi quantitativa dei effettori traslocazione di Y. enterocolitica. Molte diverse varianti di questa tecnica sensibile, specifico e relativamente semplice sono state descritte in letteratura. In questo studio microscopia a scansione laser è stato condotto per il rilevamento più sensibile e preciso dei segnali di fluorescenza. Specificamente la correzione per diafonia tra i coloranti donatore e accettore e le larghezze di banda di rilevamento regolabili individualmente consentire precisione superiore di misura rispetto ad altre varianti del metodo. I risultati mostrano chiaramente che il metodo è in grado di analizzare quantitativamente traslocazione. Differenti tempi di incubazione che rappresentano diverse concentrazioni di intracellulare di beta-lattamasi sono positivamente correlati con la pendenza di intensità di fluorescenza del donatore. Anche un tasso significativamente più alto traslocazione del WA-314ΔYopE confrontoal ceppo wild type WA-314 potrebbe essere dimostrata.
Sono stati applicati due opzioni alternative per l'analisi dei dati: le intensità dei canali del donatore e coefficienti FRET relativi. Il vantaggio di utilizzare il canale donatore è che rappresenta direttamente l'accumulo di un prodotto di idrolisi CCF-4 (cumarina). Questo approccio è possibile in una configurazione microscopica, perché non in un lettore di piastre di correzione per le differenze di densità cella utilizzando un rapporto donatore / accettore non è necessario. Tuttavia, l'esportazione del colorante CCF4 o dei suoi prodotti di idrolisi è ancora un possibile fattore confondente in questo approccio. Questo inconveniente può essere superato calcolando il coefficiente relativo FRET.
Negli esperimenti di impostazione descritti sono stati condotti in 96 pozzetti. Questo formato consente la verifica delle varie condizioni in un singolo esperimento e aiuta a risparmiare prodotti chimici costosi (in particolare CCF4 / AM kit carico). Nel flusso di lavoro descritto è fondamentale per iniziare a imacquisizione età in un punto temporale definito poco dopo l'aggiunta della soluzione di caricamento CCF4 / AM per idrolisi CCF4 dalla beta-lattamasi traslocato inizia immediatamente. In caso di trattamento di molte condizioni in una sola volta, la regolazione della messa a fuoco e posizioni laterali (fase 5.1.4) può richiedere troppo tempo e impedire un buon avvio tempestivo di acquisizione delle immagini. Pertanto, il numero massimo di campioni paralleli deve essere determinato singolarmente.
Uno dei principali problemi incontrati con questo metodo è stata la notevole esportazione di substrato CCF4 dalle cellule HeLa a 37 ° C. Questo fenomeno non poteva essere sufficientemente controbilanciata trattando le cellule con probenecid. Abbiamo quindi deciso, invece del monitoraggio traslocazione durante l'infezione continua come descritto in precedenza, per prima infezione completa e caricate poi le cellule con il colorante CCF4 / AM. Con questo approccio è stato possibile controllare il trattamento del substrato CCF4 a RT. In queste condizioni reduè stato osservato esportazione CED di CCF4. La quantità di esportazione di substrato CCF4 sembra linea cellulare specifica; nella configurazione descritta qui consente un'analisi attendibile delle traslocazione anche in linee cellulari, che ha fortemente esportano CCF4 a 37 ° C.
Export di CCF4 non è un problema in alcune altre linee cellulari che consente di adottare la configurazione microscopio per monitorare i processi di infezione e traslocazione simultaneamente in tempo reale. Ciò fornisce la possibilità di analizzare traslocazione in cellule singole e potrebbe essere usato per correlare traslocazione con eventi specifici di interazione cellula ospite come adesione batterica o formazione di micro-colonie 20. Pertanto, questo test è uno strumento prezioso per chiarire ulteriormente i meccanismi di come traslocazione è regolata durante l'interazione di batteri e cellule ospiti.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405 nm diode laser 50 mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
References
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