Abstract
Många gramnegativa bakterier inklusive patogena Yersinia spp. Anställa typ Ill-sekretionssystem att translokera effektorproteiner in i eukaryotiska målceller. Inne i värdcellen de effektorproteiner manipulera cellulära funktioner till förmån för bakterierna. För att bättre förstå kontrollen av typen III-sekre under värdcellinteraktion, känslig och exakt analys för att mäta transloka krävs. Vi här beskriva tillämpningen av en analys baserad på fusionen av en Yersinia enterocolitica effektorprotein fragment (Yersinia yttre protein, YopE). Med TEM-1 p-laktamas för kvantitativ analys av transloka Analysen förlitar sig på klyvning av en cell permeant FRET färgämne (CCF4 / AM) genom translokerade betalaktamas fusion. Efter klyvning av cefalosporinet kärna CCF4 av beta-laktamas, FRET från kumarin till fluorescein störs och excitation av kumarin-delen leder till blå fluorescensemission.Olika tillämpningar av denna metod har beskrivits i litteraturen som markerar dess mångsidighet. Metoden medger för analys av translokation in vitro och även i in vivo, t ex, i en musmodell. Detektering av de fluorescenssignaler kan utföras med användning plattläsare, FACS-analys eller fluorescensmikroskopi. I inställningarna som beskrivs här, in vitro translokation av effektorceller fusioner i HeLa-celler av olika Yersinia mutanter övervakas av laserskanning mikroskopi. Inspelning intracellulär omvandling av FRET reportern genom beta-laktamas effektor fusion i realtid ger robusta kvantitativa resultat. Vi visar här exempel uppgifter, som visar ökad translokation av en Y. enterocolitica YopE mutanten jämfört med vildtypstammen.
Introduction
Typ III-sekretionssystem är specialiserade proteinexport maskiner som används av olika släkten av gramnegativa bakterier för att direkt leverera bakteriellt kodade effektorproteiner in i eukaryotiska målceller. Medan utsöndringen maskinen själv är mycket konserverad, har specialiserade uppsättningar effektorproteiner utvecklats mellan de olika bakteriearter för att manipulera cellulära signaleringsvägar och underlätta specifika bakteriella virulens strategier 1. Vid Yersinia, upp till sju effektorproteiner, så kallade Yops (Yersinia yttre proteiner), translokeras på värdcellkontakt och agera tillsammans för att undergräva immuncellsvar såsom fagocytos och cytokinproduktion, det vill säga att tillåta extracellulära bakteriernas överlevnad 2-4. Processen för translokation är hårt kontrollerad i olika skeden 5. Det är klarlagt att det primära aktivering av T3SS triggas av sin kontakt med målet cell 6. Emellertid är den exakta mekanismen för denna initiering ännu att klarlägga. I Yersinia en andra nivå av sk finjustering av translokation uppnås genom upp- eller nedreglera aktiviteten hos de cellulära Rho GTP-bindande proteiner RAC1 eller RhoA. Aktivering av RAC1 t.ex. genom invasindomän eller cytotoxiska nekrotiserande faktor Y (CNF-Y) leder till ökad translokation 7-9, medan GAP (GTPas aktiverande protein) funktion translokeras YopE nedreglerar RAC1 aktivitet och därmed minskar translokation av en negativ feedback typ mekanism 10,11.
Giltiga och exakta metoder är en förutsättning för att undersöka hur transloka regleras under Yersinia värdcellinteraktion. Många olika system har använts för detta ändamål, var och en med särskilda fördelar och nackdelar. Vissa metoder förlitar sig på lys av infekterade celler men inte bakterier av olika rengöringsmedel följt av Western blot-analys. The gemensamma nackdel med dessa metoder är att mindre men oundvikligt bakteriell lys förorenar potentiellt cellysatet med bakterie tillhörande effektorproteiner. Emellertid var behandlingen av celler med proteinas K för att bryta ned extracellulära effektorproteiner och efterföljande användning av digitonin för selektiv lys av eukaryota celler föreslagits för att minimera detta problem 12. Det är viktigt att dessa analyser avgörande beroende av högkvalitativa anti-effektor-antikroppar, som oftast inte är kommersiellt tillgängliga. Försök att använda translationella fusioner av effektorproteiner och fluorescerande proteiner som GFP att övervaka sloka var inte framgångsrika förmodligen på grund av den klotformiga tertiärstrukturen för de fluorescerande proteinerna och oförmågan av utsöndringsapparaten att veckla dem innan utsöndring 13. Men flera olika reporter taggar såsom cya (kalmodulinberoende adenylatcyklas) domänen av Bordetella pertussis toxin cyclolysin 14 eller Flashtag har framgångsrikt använts för att analysera translokation. I det förra analysen den enzymatiska aktiviteten hos CyA används för att förstärka signalen av det intracellulära fusionsproteinet, medan Flash tagg, en mycket kort tetracysteine (4Cys) motiv tagg, möjliggör märkning med biarsenical färgämnet Flash utan att störa processen för utsöndring 15.
Tillvägagångssättet tillämpas här rapporterades för första gången av Charpentier et al. Och är baserad på den intracellulära omvandlingen av Förster resonansenergiöverföring (FRET) färgämne CCF4 av translokerade effektor TEM-1 betalaktamas fusioner 16 (Figur 1A). CCF4 / AM är en cell-genomtränglig förening där en kumarin derivat (donator) och en fluorescein enhet (acceptor) är förbundna med en cefalosporin kärna. Vid passiv inträde i eukaryota cellen är den icke-fluorescerande förestrad CCF4 / AM förening behandlas av cellulära esteraser till den laddade och fluorescerande CCF4 och därigenom instängdinom cellen. Excitation av kumarin-delen vid 405 nm resulterar i FRET till fluorescein-del, som avger ett grönt fluorescenssignal vid 530 nm. Efter klyvning av cefalosporinet kärnan genom beta-laktamas FRET avbryts och excitation av kumarin-delen leder till blå fluorescensemission at460 nm. Olika tillämpningar av denna metod har beskrivits i litteraturen som markerar dess mångsidighet. Metoden möjliggör analys av translokation in vitro och även in vivo, till exempel, var den teknik som används i en infektion musmodell för att identifiera leukocytpopulationer riktade för translokation in vivo 17-19. Avläsning av signalerna kan utföras med användning plattläsare, FACS-analys eller fluorescensmikroskopi. Notera, ger metoden också möjligheten att övervaka translokation i realtid genom live-cell mikroskopi under infektionsprocessen 20,21. Här laserskanning fluorescensmikroskopi söktes readout av fluorescens signaler eftersom det ger högsta känslighet och noggrannhet. I synnerhet förmågan justera emissionsfönstret med nanometer precision i kombination med hög känsliga detektorer underlättar optimerad fluorescensdetektion och minimerad överhörning. Dessutom denna mikroskopi inställning kan anpassas för realtidsövervakning av sloka och potentiellt medger samtidig analys av värdpatogen interaktion på cellnivå.
I denna studie slokahastigheter en Y. enterocolitica vildtypstammen och YopE deletionsmutant uppvisar en hypertranslocator fenotyp 10,11 var exemplariskt analyseras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Peak Emission och Cross-talk Fastställande (Se även figur 2)
- För att bestämma utsläppstoppar och mängden överhörning mellan givaren (kumarin derivat V450) och acceptor (fluorescein) färgämnen, utföra spektrala genomsökningar av celler märkta med både enskilda fluoroforer vid 405 nm excitation.
- Bestäm en 10 nm bandbredd i toppen av varje färg som kommer att användas för givaren och mottagaren kanaler (här 455-465 nm och 525-535 nm). Rita den normaliserade intensitet över våglängden och beräkna den genomsnittliga andelen överhörning av donator-färgämnet i acceptorn kanalen och vice versa (Figur 2).
2. Framställning av Y. enterocolitica Stammar för Cell Culture Infektion
- Använd följande stammar: WA-314 PMK-ägg (WA-314 transformerades med plasmiderna PMK-bla 17 och PMK-ägg 17, respektive) och WA-314ΔYopE PMK-bla (vattendrag314ΔYopE transformerad med plasmiden PMK-bla-17)
- Minst två dagar före infektion strimma Y. enterocolitica-stammar WA-314 PMK-ägg, WA-314 PMK-bla och WA-314ΔE PMK-Bla från Cryo aktier på LB-agarplattor innehållande de nödvändiga antibiotika (kanamycin för WA-314 PMK-bla och WA-314 PMK-ägg , kanamycin och tetracyklin för WA-314ΔE PMK-bla) och växa O / N vid 27 ° C. Efteråt hålla plattorna i upp till en vecka vid 4 ° C.
- En dag före infektion ympa 3 ml LB-medium innehållande de erforderliga antibiotika med en koloni av de respektive stammarna och inkubera O / N vid 27 ° C i en skakanordning vid 180 rpm.
- På dagen för infektion ympa 2 ml av O / N-kulturen till 40 ml färskt LB-medium utan antibiotika och inkubera i 90 minuter vid 37 ° C i en skakanordning vid 180 rpm för att inducera expression av typ III-sekretionssystemet.
- Överför kulturerna i en lämplig slang och hålla odlingarna på is eller vid 4 ° Cfrån och med nu. Centrifugera odlingarna för 10 min vid 5000 x g och 4 ° C.
- Resuspendera den bakteriella pelleten i 2-3 ml iskall PBS. Späd bakteriesuspensionen till en koncentration av 8 x 10 8 cfu / ml med användning av en spektrofotometer. Bestäm den motsvarande optiska densiteten individuellt. Håll denna suspension på is tills infektera HeLa-celler.
3. Plätering HeLa-celler
- En dag före infektion frö 1,5 x 10 4 celler HeLa-celler i 200 | j, l DMEM innehållande 10% värmeinaktiverat fetalt kalvserum (FCS) i brunnar på en 96-brunnsplatta och odla i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° C. Seed tre brunnar för varje stam (tre olika inkubationstider).
4. Infektion av HeLa-celler och ladda med CCF4
- Infect HeLa-celler genom att tillsätta 3,5 | il av den bakteriella suspensionen till mediet och blanda genom att försiktigt pipettera mediet två gånger. Låt bakterierna att sedimentera påtill cellerna vid en MOI (del med infektion) av omkring 100 bakterier per cell. För en tid kursstart infektioner vid -90 min, -60 min och -30 min och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator tills 0 min för att uppnå en gemensam slutpunkt.
- När inkubationen är avslutad, försiktigt aspirera mediet utan att ta bort HeLa-celler och tillsätt 50 | il av PBS innehållande 20 ^ g / ml kloramfenikol för att stoppa uttrycket av effektorer och 2,5 mM probenecid för att minska exporten av CCF4.
- Vid denna punkt överföra 96-brunnar i mikroskopställningen och definiera lämpliga ställen för senare analys i varje brunn. Avsluta detta steg inom 10 minuter (för mer information om förvärvet, se avsnitt 5.1).
- Per väl, tillsätt 70 pl av CCF4 / AM laddningslösning (0,24 pl lösning A, 1,2 pl lösning B, 18,56 il lösning C (lösning A, B och C enligt inom CCF4 / AM lastning kit) och 50 pl PBS (innehållande 20 pg / ml kloramfenikol och 2,5 mM probenecid) användning av en fler pipette och inkubera under 5 min vid RT. Från och med nu på arbete utan avbrott.
- Aspirera laddningslösningen och tillsätt 100 ul PBS innehållande 20 | j, g / ml kloramfenikol och 2,5 mM probenecid under användning av en fler pipett. Sedan snabbt överföra 96 brunnars platta i mikroskop scenen och börja förvärv inom 10 min från aspiration av laddningslösningen.
5. Laser Scanning Microscopy och analys av data
- Bildinsamlande
- Ställ bildförhållanden på ett sätt att maximera den totala fotonräkning och minimera fototoxicitet, fotoblekning och tvär excitation.
- I en modern konfokala laserskanning mikroskop, använder en 20X hög numerisk bländare immersionsobjektiv, öppna detektor hål till 2,5 Airy enheter (dvs optisk vidvinkelsektione), välj hög känslighet Gaasp-detektorer med samtidigt aktiva givar- och acceptor kanaler, 8 bit djup , ~ 750 nm pixelstorlek, 3-faldig ram medelvärdes och EXCITe med 10% av en 405 nm diodlaser.
- För att säkerställa korrekt kvantifiering ställa detektor vinst på båda kanalerna till samma värde och för att undvika mättade pixlar.
Obs: Här var de vinster satt till 150%.
- Säkerställa kontinuerlig nedsänkning genom att sprida nedsänkning medium till botten av brunnarna, t ex med en 1 ml spruta, och undvika infångning av eventuella luftbubblor.
- Aktivera det transmitterade ljuset och hitta en representativ synfält i varje brunn. Använd en korrekt kalibrerad automatisk scenen och markera positionen i programvaran.
- Efter avlägsnande av plattan för färgning (se avsnitt 4.3), sätt tillbaka plattan och lägg en vikt på toppen för att undvika bränn drift. Gå igenom sparade positioner med laserskanning läge och justera fokus och sidoläge ordentligt.
- Ställ in time lapse till 2 min, varaktighet till 2 timmar och börja förvärv.
- Ställ bildförhållanden på ett sätt att maximera den totala fotonräkning och minimera fototoxicitet, fotoblekning och tvär excitation.
- Bild kvantifiering (exempel ges för Bitplane Softwär sådana Imaris)
- Importera dataset till programvara som gör aritmetiska beräkningar av pixel matriser. Gör detta genom att dra och släppa källfilen innehåller både givaren och acceptor kanal på ikonen programvara.
- Subtrahera bakgrunden i båda kanalerna använder samma offset. För att göra detta, klicka på Meny och sedan på Bild> Bearbetning> baslinjesubtraktion. Välj varje kanal och ange utgångsvärdet.
- Rätta genomblödning av donatorkanalen (Ch1) i acceptor kanalen (Ch2) med den förutbestämda korrektionsfaktor f (se 1.1), vilket skapar en ny kanal:
Ch2 '= Ch2 - Ch1 * f
OBS: En genomblödning av acceptorn i donator kanalen var inte detekterbar över ljudnivån.- Klicka på Meny> bildbehandling> Kanal aritmetik och ange abs (CH2- (ch1 * 0,33)). Efteråt bort Kanal 2 genom att klicka på Meny> Redigera> Ta bort kanaler. Säkerställ attgenomblödning korrigerade acceptor kanal kvarstår som ny kanal 2. Valfritt: Byt kanal färg från grå till den ursprungliga färgen genom att gå till Meny> Redigera> Bildegenskaper. Välj Channel 4> Mapped Färga> Base Färg och ändra det till exempel, grön.
- Skapa en ny kanal med följande operation för att bestämma den relativa FRET koefficienten:
Ch3 = Ch2 '/ (Ch1 + Ch2)- Gå till Meny> bildbehandling> Kanal aritmetik och ange ch2 ./ (ch1 + ch2)
- För korrekt visualisering av FRET-kanalen i en 8 bitars bild, skapa en fjärde kanal:
Ch4 = 255 * Ch3- Gå till Meny> bildbehandling> Kanal aritmetik och ange 255 * ch3. Ändra kanalfärg genom att gå till Meny> Redigera> Bildegenskaper. Välj Channel 4> Mapped Färga> Färgtabell Arkiv> Jet.
- Applicera en 3x3 medianfilter till kanaler Ch3 och CH4 that kommer att minska bruset i bilderna. För att göra detta, klicka på Meny> bildbehandling> Utjämning> Median Filter. Välj båda kanalerna och använda ett filter storlek "3x3x1".
- För kvantifiering av cellulära signaler, upptäcka cellerna i Ch4 genom korrekt inställning av offset och filtrera strukturerna efter storlek för att utesluta alltför små strukturer.
- Välj Surpass Visa och klicka på ikonen "Lägg till nya ytor". Definiera detekteringsalgoritmparametrarna i ytan fönstret. För snabbare behandling, aktiverar två kryssrutorna "Segment endast region of Interest" och "Process hela Image slutligen". Definiera regionen av intresse genom att redigera dess dimensioner.
- Välj Channel 4 som källa kanal och ställ tröskeln med Tröskling> bakgrundssubtraktion (lokal kontrast) och ställ in diameter till 10 um. Ställ in minsta intensitetströskel manuellt till 0 och övre gräns för den maximala intensity. Filtrera strukturerna efter område och ställ in minimivärdet till exempel 187 μm². Avsluta ytan upptäckt.
- Extrahera de medelvärden för donator fluorescensintensitet (Ch1) och relativ FRET koefficient (CH3) och standardavvikelser i den cellulära enheten. För att göra detta, gå till ytegenskaper. Ändra utseendet på de strukturer genom att välja Ytor Style / kvalitet> Surface. Välj alla strukturer genom att klicka på fliken filter. Förena de upptäckta strukturer genom att gå till Process Selection> Unify. Exportera ytan statistik till MS Excel genom att klicka på fliken statistik> Exportera all statistik till fil.
- Rita dessa värden över tiden. Identifiera 10 minuters intervall med maximal lutning givarkanal fluorescens ökar för varje tillstånd som en rimlig parameter att representera mängden flyttad effektor. Beräkna lutning som m = Δ donator fluorescensintensitet / Δ (min).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att visa förmågan hos den beskrivna metoden för att kvantitativt analysera effektor sloka i målceller framställdes två Yersinia stammar med olika transloka kinetik studeras: Y. enterocolitica vildtypstammen WA-314 (serogrupp O8, hyser virulensplasmiden pYVO8 22) och dess derivat WA-314ΔYopE (WA-314 hyser pYVO8ΔYopE 23). Tidigare arbete visade att Y. enterocolitica mutanter som saknar funktionell YopE uppvisar en signifikant högre Yop slokahastighet 10. Båda stammarna transformerades med vektorer som kodar för fusioner av den N-terminala utsöndringssignalen av YopE och TEM-1 beta-laktamas (PMK-bla) 17. WA-314 var dessutom transformeras med en vektor som kodar för en respektive YopE ovalbumin fusion (PMK-ägg 17) för att fungera som en negativ kontroll. Inkubationstider av 30, 60 och 90 minuter tillfördes i syfte att ytterligare bedöma method`s effektiva räckvidden and lämplighet för kvantifiering. Två olika avläsningar användes för dataanalys: donatorfluorescensen (Ch1) och relativa FRET koefficienter (Ch3 = Ch2 '/ (Ch1 + Ch2)) (Figur 1B och 1C).
För den negativa kontrollstammen WA-314-PMK-ägg plottning av donatorkanalnivåer (Ch1) över tiden visar ingen ökning av fluorescensemission oberoende av inkubationstiden (Figur 1B). Däremot i WA-314-PMK-bla-infekterade celler en ökning av fluorescensintensiteten över tiden upptäcktes som indikerar närvaron av YopE betalaktamas fusion i målcellen cytoplasman. Som väntat den maximala lutningen av fluorescensintensiteten är positivt korrelerad med längden på infektion (30 min av infektion: 0,10 / min, 60 min infektion: 0,33 / min, 90 min infektion: 0,76 / min) indikerar att olika koncentrationer av flyttad beta- laktamas kan urskiljas. I enlighet med tidigare studier WA-314ΔYopE-PMK-bla-infekterade celler uppvisar snabbare ökning av fluorescensintensiteten jämfört med vildtyp-stammen (30 min av infektion: 1,28 / min, 60 min infektion: 1,53 / min, 90 min infektion: 1,41 / min). Intressant, expanderande infektion till 90 minuter inte ytterligare påskynda ökningen av donatorfluorescensen jämfört med 60 min av infektion (Figur 1B). Detta konstaterande kan förmodligen förklaras av den gradvisa cytotoxiska effekten utövas av WA-314ΔYopE-PMK-bla, som antingen kan hämma en effektiv translokation efter 60 minuter av infektion eller leda till förlust av fluorescens färgämnen grund av avbrott i plasmamembranet integritet. De resultat som med hjälp av den relativa FRET koefficienten (Ch3) för analys är i gott överensstämmelse med de resultat som uppnåtts av givarkanalen ensam. Men under vissa förhållanden (WA-314ΔYopE-PMK-bla, 60 och 90 min infektion) representerar mycket stora mängder av flyttad betalaktamas fusion, uppenbarligen CCF4 substratet var iständigt bearbetas innan avbildning kunde startas. Dessa villkor skulle inte tillåta för att beräkna en rimlig maximal negativ lutning eftersom den relevanta delen av kurvan missas i detta datarepresentation (Figur 1C). Bilder av den relativa FRET koefficienten kanal ger möjlighet att jämföra skillnader mellan enskilda celler (Figur 1D).
Figur 1. Kvantitativ analys av effektor translokation av TEM-1 YopE fusioner i Y. enterocolitica. (A) Hydrolys av CCF4 substrat genom flyttad TEM-1 beta-läktarnas övervakades av laserskanning mikroskopi. Excitation vid 405 nm resulterade i grönt fluorescensemission (530 nm) av den intakta substratet och blå fluorescensemissionen (460 nm) av den kluvna hydrolys product (kumarin). (B, C) Mikroskopi uppgifter analyserades kvantitativt genom att plotta donatorkanalintensitet (Ch1) eller beräkning och plottning av de relativa FRET koefficient (CH3 = Ch2 '/ (Ch1 + Ch2')). Data är representativa för tre oberoende experiment. (D) avbildas micrographs (FRET kanal) togs från representativa filmer på de angivna tidpunkterna. WA-314ΔE-PMK-bla-infekterade celler visar en snabbare minskning av de relativa FRET koefficienter jämfört med vildtyp WA-314-PMK-bla (60 min infektion). Skala bar, 20 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Överhörning bestämning av fluoroforer V450 och FITC.Spektra för både enskilda fluoroforema mättes med konfokalmikroskop. Genomblödning av donator V450 i acceptor kanal inom 525-535 nm detektorn intervall beräknades från en linjär regression (insert). Den genomsnittliga andelen överhörning räknat från två mätningar är lika med 0,33. Genomblödning av acceptor FITC i givarkanalen (455-465 nm) var inte detekterbar över ljudnivån. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi här framgångsrikt tillämpats en TEM-1 betalaktamas reporter baserad analys för kvantitativ analys av effektor translokation av Y. enterocolitica. Många olika varianter av detta känsliga, specifika och relativt okomplicerad teknik har beskrivits i litteraturen. I denna studie laserskanning mikroskopi utfördes under mest känslig och exakt detektering av fluorescenssignaler. Specifikt korrigeringen för överhörning mellan donator- och acceptor-färgämnen och de individuellt justerbara detektionsbandbredder tillåter överlägsen mätnoggrannheten jämfört med andra variationer av metoden. Resultaten visar tydligt att metoden är i stånd att kvantitativt analysera translokation. Olika inkubationstider som representerar olika koncentrationer av intracellulär beta-laktamas positivt korrelerad med lutningen på givarfluorescensintensitet. Också en betydligt högre translokahastigheten hos WA-314ΔYopE jämförttill vildtypstammen WA-314 kunde påvisas.
Två alternativ för dataanalys tillämpades: Donor kanalnivåer och relativa FRET koefficienter. Fördelen med att använda donator kanal är att det direkt representerar ackumulationen av ett CCF-4 hydrolysprodukt (kumarin). Detta tillvägagångssätt är möjligt i en mikroskopisk installation, eftersom andra än i en plattläsare korrigering för skillnader i celltätheter genom att använda ett förhållande av donator / acceptor är inte nödvändigt. Emellertid är exporten av CCF4 färgämnet eller dess hydrolysprodukter fortfarande en möjlig confounder i detta tillvägagångssätt. Denna nackdel kan övervinnas genom att beräkna den relativa FRET koefficienten.
I de beskrivna inställnings experiment genomfördes i plattor med 96 brunnar. Detta format medger provning av flera villkor i ett enda experiment och hjälper till att spara dyra kemikalier (specifikt CCF4 / AM-lastning kit). I den beskrivna arbetsflödet är det kritiskt att påbörja imålder förvärv vid en definierad tidpunkt kort efter tillsats av CCF4 / AM lastning lösning eftersom hydrolys av CCF4 av flyttad betalaktamas startar omedelbart. Vid behandling för att många villkor på en gång, kan justering av fokus och sidolägen (steg 5.1.4) tar för lång tid och hindrar en snabb start av bildtagning. Därför det maximala antalet parallella prov måste bestämmas individuellt.
Ett av de största problemen med användning av denna metod var den betydande exporten av CCF4 substrat genom HeLa-cellerna vid 37 ° C. Detta fenomen kan inte i tillräcklig utsträckning motverkas genom behandling av cellerna med probenecid. Vi beslöt därför, i stället för övervakning translokering under pågående infektion såsom beskrivits tidigare, för att första kompletta infektion och därefter ladda cellerna med CCF4 / AM-färgämne. Med detta tillvägagångssätt var det möjligt att övervaka behandlingen av CCF4 substratet vid RT. Under dessa betingelser reduced export av CCF4 observerades. Mängden export av CCF4 substrat verkar vara cellinje specifik; installationen som beskrivs här medger tillförlitlig analys av transloka också i cellinjer, som starkt exportera CCF4 vid 37 ° C.
Export av CCF4 är inte ett problem i en del andra cellinjer gör det möjligt att anta det mikroskopi setup för att övervaka processerna för infektion och transloka samtidigt i realtid. Detta ger möjligheten att analysera sloka i individuella celler och skulle kunna användas för att korrelera sloka med speciella händelser av interaktionsvärdcell såsom bakteriell vidhäftning eller bildning av mikrokolonier 20. Därför är denna analys ett värdefullt verktyg för att ytterligare belysa mekanismerna för hur sloka regleras under samspelet mellan bakterier och värdceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB-Agar | Roth | X969.2 | |
| LB-Medium | Roth | X968.2 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | |
| 96-well plate (black, clear bottom) | Greiner Bio One | 655087 | |
| DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco/Life Technologies | 31966-047 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761-25G | |
| LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM | Life Technologies | K1095 | |
| Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate | Sigma-Aldrich | L4895 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| V450 Rat anti-Mouse CD8a | BD Bioscience | 560469 | Used for peak emission and cross-talk determination |
| Immersol W immersion oil | Zeiss | 444969-0000-000 | Refractive index = 1.3339 @ 23 °C |
| TCS SP5 II confocal laser scanning microscope | Leica microsystems | 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405 nm diode laser 50 mW | |
| Imaris 7.6 software | Bitplane | Plugins included ImarisXT and MeasurementPro | |
| MatLab compiler runtime | MathWorks | ||
| Prism 5 | GraphPad software |
References
- Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial Type III Secretion Systems: Specialized Nanomachines for Protein Delivery into Target Cells. Annu Rev Microbiol. 68, 415-438 (2014).
- Aepfelbacher, M., Trasak, C., Ruckdeschel, K. Effector functions of pathogenic Yersinia species. Thromb Haemost. 98 (3), 521-529 (2007).
- Heesemann, J., Sing, A., Trulzsch, K. Yersinia's stratagem: targeting innate and adaptive immune defense. Curr Opin Microbiol. 9 (1), 55-61 (2006).
- Viboud, G. I., Bliska, J. B. Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis. Annu Rev Microbiol. 59, 69-89 (2005).
- Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 10-3389 (2013).
- Pettersson, J., et al. Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact. Science. 273 (5279), 1231-1233 (1996).
- Schweer, J., et al. The cytotoxic necrotizing factor of Yersinia pseudotuberculosis (CNFY) enhances inflammation and Yop delivery during infection by activation of Rho GTPases. PLoS Pathog. 9 (11), e1003746 (2013).
- Wolters, M., et al. Cytotoxic necrotizing factor-Y boosts Yersinia effector translocation by activating Rac protein. J Biol Chem. 288 (32), 23543-23553 (2013).
- Mejia, E., Bliska, J. B., Viboud, G. I. Yersinia controls type III effector delivery into host cells by modulating Rho activity. PLoS Pathog. 4 (1), e3 (2008).
- Aili, M., et al. Regulation of Yersinia Yop-effector delivery by translocated YopE. Int J Med Microbiol. 298 (3-4), 183-192 (2008).
- Gaus, K., et al. Destabilization of YopE by the ubiquitin-proteasome pathway fine-tunes Yop delivery into host cells and facilitates systemic spread of Yersinia enterocolitica in host lymphoid tissue. Infect Immun. 79 (3), 1166-1175 (2011).
- Nordfelth, R., Wolf-Watz, H. YopB of Yersinia enterocolitica is essential for YopE translocation. Infect Immun. 69 (5), 3516-3518 (2001).
- Radics, J., Konigsmaier, L., Marlovits, T. C. Structure of a pathogenic type 3 secretion system in action. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 82-87 (2014).
- Sory, M. P., Cornelis, G. R. Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol. 14 (3), 583-594 (1994).
- Schlumberger, M. C., et al. Real-time imaging of type III secretion: Salmonella SipA injection into host cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (35), 12548-12553 (2005).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186 (16), 5486-5495 (2004).
- Koberle, M., et al. Yersinia enterocolitica targets cells of the innate and adaptive immune system by injection of Yops in a mouse infection model. PLoS Pathog. 5 (8), e1000551 (2009).
- Geddes, K., Cruz, F., Heffron, F. Analysis of cells targeted by Salmonella type III secretion in vivo. PLoS Pathog. 3 (12), e196 (2007).
- Marketon, M. M., DePaolo, R. W., DeBord, K. L., Jabri, B., Schneewind, O. Plague bacteria target immune cells during infection. Science. 309 (5741), 1739-1741 (2005).
- Mills, E., Baruch, K., Aviv, G., Nitzan, M., Rosenshine, I. Dynamics of the type III secretion system activity of enteropathogenic Escherichia coli. MBio. 4 (4), (2013).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3 (2), 104-113 (2008).
- Heesemann, J., Laufs, R. Construction of a mobilizable Yersinia enterocolitica virulence plasmid. J Bacteriol. 155 (2), 761-767 (1983).
- Zumbihl, R., et al. The cytotoxin YopT of Yersinia enterocolitica induces modification and cellular redistribution of the small GTP-binding protein RhoA. J Biol Chem. 274 (41), 29289-29293 (1999).
