Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Analizi Published: October 13, 2015 doi: 10.3791/53115
Automatic Translation
1, 2, 1, 1
1Institute for Medical Microbiology, Virology and Hygiene, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, 2UKE Microscopy Imaging Facility, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

Abstract

Patojenik Yersinia spp dahil olmak üzere birçok gram-negatif bakteriler. Ökaryotik hedef hücrelere efektör proteinleri yerini değiştirmek için tip III salgı sistemlerini kullanır. Konak hücre içinde efektör proteinler bakteriler yararına hücresel fonksiyonları manipüle. Daha iyi translokasyon ölçmek için konak hücre etkileşimi, hassas ve doğru deneyleri sırasında tip III sekresyon kontrolünü anlamak için gereklidir. Burada Yersinia enterocolitica efektör proteini fragmanı füzyon göre bir deneyde (Yersinia dış proteini; YopE) uygulanmasını tarif eder. Translokasyon kantitatif analiz için TEM-1, beta-laktamaz olan deney bir hücre bölünmesinden dayanır geçirgen FRET boyası transloke beta-laktamaz füzyonu (CCF4 / AM). Floresein bozulur ve kumarin yarımının uyarım mavi flüoresans emisyonlarına neden olan beta-laktamaz göre CCF4 sefalosporin çekirdeğin ayrılmasından sonra, kumarin gelen FRET.Bu yöntemin farklı uygulamalar çok yönlülüğünü vurgulama literatürde tarif edilmiştir. Yöntem, bir fare modelinde in vitro translokasyon analizi için ve aynı zamanda in vivo, örn sağlar. Floresan sinyalleri tespit levhası okuyucu, FACS analizi ya da floresan mikroskopi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Farklı Yersinia mutantlar tarafından HeLa hücrelerine efektör füzyonlarının nitro translokasyon, burada açıklanan kurulum lazer tarama mikroskobu ile izlenir. Gerçek zamanlı olarak beta-laktamaz efektör füzyon ile FRET raportör hücre içi dönüşümünü kayıt sağlam bir nicel sonuçlar sağlar. Biz burada bir Y. tarafından artan translokasyon gösteren, örnek verileri göstermek vahşi tip suş ile karşılaştırıldığında enterocolitica YopE mutant.

Introduction

Tip III salgılama sistemleri, doğrudan ökaryotik hedef hücrelere bakterisel olarak kodlanmış proteinlerin efektör sağlamak için gram negatif bakterilerin farklı cins tarafından kullanılan özel bir protein ihracatı makinelerdir. Salgılanması mekanizmasının kendisi yüksek ölçüde korunmuş olsa da, efektör proteinler uzman setleri hücresel sinyal yolları değiştirmek ve belirli bir bakteriyel hastalık stratejileri 1 kolaylaştırmak için farklı bakteri türleri arasında gelişmiştir. Yersinia durumunda, yedi efektör proteinler olarak adlandırılan Yops (Yersinia dış proteinler) 'ye kadar, konakçı hücre temas üzerine transloke ve örneğin, fagositoz ve sitokin üretimi, immün hücresi tepkilerini bozmak için birlikte hareket edilir, bakterilerin hücre dışı sürdüreceği 2-4. Translokasyon süreci sıkı farklı aşamalarında 5 kontrol edilir. Bu T3SS birincil aktivasyon hedef ce onun temas ile tetiklenen olduğunun tespit edilmesill 6. Ancak, bu inisiyasyon kesin mekanizması henüz aydınlatılamamıştır olmaktır. Yersinia ise translokasyon sözde ince ayar bir ikinci düzey Up-by veya aşağı-düzenleyen hücresel Rho GTP-bağlayıcı proteinlerin Rac1 veya RhoA aktivitesini elde edilir. Invazın veya sitotoksik nekrotizan faktör Y (CNF-Y) örneğin Rac1 Aktivasyon GAP transloke YopE işlevini (GTPaz protein aktive) ise Rac1 aktivitesini aşağı düzenler ve buna göre bir negatif geribildirim türü translokasyonu azaltır, artan translokasyon 7-9 yol açar mekanizması 10,11.

Geçerli ve hassas yöntemler translokasyon Yersinia konak hücre etkileşim sırasında nasıl düzenlendiği araştırmak için önkoşuldur. Birçok farklı sistemleri özel avantajları ve sakıncaları ile birlikte, her biri bu amaç için kullanılmaktadır. Bazı yaklaşımlar western blot analizi ile, ardından farklı bir deterjan enfekte hücrelerin parçalanması değil, bakteri dayanmaktadır. ThBu yöntemlerin e ortak dezavantajı küçük ama kaçınılmaz bakteriyel lizis potansiyel bakteri ilişkili efektör proteinleri ile hücre lizat kirletir olmasıdır. Ancak, hücre dışı proteinler ve efektör ökaryotik hücrelerde seçici parçalanması digitonin sonraki kullanımının indirgemek için proteinaz K ile hücrelerinin tedavi, bu sorunu 12 en aza indirmek için önerilmiştir. Önemli olarak, bu deneyler, en önemlisi, çoğunlukla, ticari olarak mevcut değildir, yüksek kaliteli, anti-efektör antikorları bağlıdır. Girişimleri floresan proteinleri küresel üçüncül yapısı ve sekresyon 13 önce onları açılmak için salgılama aygıtının yetersizlik muhtemelen başarılı nedeniyle değildi translokasyon izlemek için GFP gibi efektör proteinlerin çeviri füzyonlarının ve floresan proteinleri kullanmak için. 14 ya da Flash cyclolysin Bordetella pertussis toksin Ancak, CYA gibi birçok farklı raportör etiketleri (kalmodulin-bağımlı adenilat siklaz) etki alanıetiketi başarıyla translokasyon analiz etmek için kullanılmıştır. Flash etiket, çok kısa bir Tetracysteine ​​(4Cys) motifi etiketi, sekresyon işlemi bozmadan biarsenical boya Flash ile etiketlenmesi için izin verirken, eski deneyinde CYA enzimatik aktivitesi, hücre içi füzyon proteininin sinyal yükseltmek için kullanılır 15.

Burada uygulanan yaklaşım, Charpentier vd., Ilk kez bildirilmiştir transloke efektör TEM-1 beta-laktamaz füzyonları 16 (Şekil 1 A) Förster rezonans enerji transferi (FRET) boya CCF4 hücre içi dönüşüm dayanır. CCF4 / AM kumarin türevi (donör) ve flöresan kısmı (akseptör) bir cephalosporin çekirdek ile birbirine takılmış olduğu, bir hücre nüfuz edici bileşiktir. Ökaryot hücreye pasif girmesinden sonra, CCF4 / AM bileşik esterlenmiş floresan olmayan ücret ve floresan CCF4 hücresel esterazlarla işlenir ve bu sayede tuzakhücre içinde. 530 nm'de bir yeşil floresan sinyali yayan floresein kısım için FRET 405 nm sonuçlara kumarin parçasının Uyarım. Beta-laktamaz FRET tarafından sefalosporin çekirdek ayrılmasından sonra bozulur ve kumarin kısmının uyarma nm AR460 mavi floresan emisyonuna yol açar. Bu yöntemin farklı uygulamalar çok yönlülüğünü vurgulama literatürde tarif edilmiştir. Yöntem, in vitro olarak translokasyonu analizi sağlar ve aynı zamanda in vivo, örneğin, bu teknik, in vivo 17-19 translokasyon için hedeflenen lökosit popülasyonları tanımlamak için, bir fare enfeksiyon modelinde kullanılmıştır. Sinyallerin okunması plaka okuyucusu, FACS analizi ya da floresan mikroskopi kullanılarak yapılabilir. Unutmayın ki, yöntem aynı zamanda enfeksiyon süreci 20,21 sırasında canlı hücre mikroskopi gerçek zamanlı translokasyonu izlemek için imkanı sağlar. Burada lazer tarama mikroskobu readou floresan uygulanmıştırfloresan sinyalleri t en yüksek hassasiyet ve doğruluk sağlar olarak. Özellikle, yetenek yüksek duyarlı dedektörler ile birlikte nanometre hassasiyetle emisyon penceresini floresens optimize edilmiş ve çapraz konuşma minimize kolaylaştırır ayarlamak için. Buna ek olarak, bu mikroskopi kurulum translokasyonun gerçek zamanlı izleme için uyarlanabilir ve potansiyel olarak hücresel düzeyde-konak etkileşim aynı anda analiz için izin verir.

Bir Y. Bu çalışmada translokasyon oranları enterocolitica vahşi tip suş ve hypertranslocator fenotip 10,11 sergileyen YopE silme mutant örnek bir analiz edildi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tepe Emisyon ve Çapraz-talk Tayini (Ayrıca Bakınız Şekil 2)

  1. Emisyon tepe ve verici arasındaki çapraz konuşma (kumarin türevi V450) ve akseptör (fluorescein), boyalar miktarını belirlemek 405 nm eksitasyon bireysel fluorophores hem ile etiketlenmiş hücrelerin spektral tarama işlemi gerçekleştirmek için.
  2. Verici ve alıcı kanalları (buradan 455-465 nm ve 525-535 nm) için kullanılacak olan her bir boyadaki zirve içinde 10 nm bant genişliği belirler. Dalga boyu üzerinde normalleştirilmiş yoğunluğu arsa ve alıcı kanalı ve tersi (Şekil 2) donör boya çapraz konuşma ortalama yüzdesini hesaplamak.

Y'nin 2. Hazırlık Hücre Kültürü Enfeksiyon için enterocolitica Suşları

  1. Aşağıdaki suşları kullanın: WA-314 PMK-ova ve (WA-314 17 PMK-bla ve PMK-ova 17, sırasıyla plazmidler ile transforme) WA-314ΔYopE PMK-bla (WA-) 17 314ΔYopE plazmid ile transforme PMK'yi-bla
  2. Enfeksiyon çizgi Y. önce en az iki gün enterocolitica suşları WA-314 PMK-ova, WA-314 PMK-bla ve WA-314ΔE WA-314 PMK-bla ve WA-314 PMK-ova için (kanamisin gerekli antibiyotikleri içeren LB-agar plakaları üzerinde hisse senedi kriyo gelen PMK-bla ; kanamisin ve WA-314ΔE PMK-bla için tetrasiklin) ve 27 ° C'de O / N büyür. Daha sonra bir haftaya kadar 4 ° C plakaları tutun.
  3. Enfeksiyondan bir gün önce, ilgili suşlarının bir koloni ile istenen antibiyotik içeren LB-ortamı içinde 3 ml inoküle ve 180 rpm'de bir çalkalama 27 ° C 'de O / N inkübe edin.
  4. Enfeksiyonun günde antibiyotikler olmadan, taze LB-ortamı içinde 40 ml O / N kültürünün 2 ml'sini aşılamak ve tip III sekresyon sisteminde ekspresyonunu indüklemek için 180 rpm'de bir çalkalayıcıda olmak üzere 37 ° C 'de 90 dakika boyunca inkübe edin.
  5. Uygun bir tüp içine kültürleri aktarın ve C buz üzerinde veya 4 ° kültürleri tutmakbundan sonra. 5000 xg ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca kültürler santrifüj.
  6. Buz 2-3 ml soğuk PBS bakteriyel pelletini. Bir spektrofotometre kullanılarak, 8 x 10 8 cfu / ml'lik bir konsantrasyona kadar bakteri süspansiyonu ile seyreltilir. Ayrı ayrı ilgili optik yoğunluk belirlenir. HeLa hücrelerini enfekte kadar buz üzerinde bu süspansiyon tutun.

3. Kaplama HeLa Hücreleri

  1. 96 gözlü bir levhanın gözleri içinde% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal dana serumu (FCS) ihtiva eden ve 37 ° C'de bir% 5 CO2 inkübatörü içinde yetiştirmek 200 ul DMEM içinde bir gün enfeksiyon tohum önce 1.5 x 10 4 hücre HeLa hücreleri. Her bir suş (üç farklı inkübasyon kez) üç kuyu Seed.

4. HeLa Hücreleri Enfeksiyon ve CCF4 ile yükleme

  1. Orta bakteriyel süspansiyon 3.5 ul ekleyerek HeLa hücreleri enfekte ve nazikçe orta kez pipetleme karıştırın. Bakteriler üzerinde çökelmesi için izin verHücre başına yaklaşık olarak 100 bakteri MOI (enfeksiyon kısmı) hücrelere. Bir zaman süreci için -90 dakikada, -60 dakika ve -30 dakikada enfeksiyonları başlatmak ve ortak bir uç noktası elde etmek için 0 dakika kadar bir% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de inkübe edin.
  2. İnkübasyon tamamlandıktan sonra, dikkatli bir şekilde HeLa hücreleri çıkarmadan orta aspire ve CCF4 ihracat azaltmak için efektör ve 2.5 mM probenesid ekspresyonunu durdurmak için 20 ug / ml kloramfenikol içeren PBS 50 ul ekle.
  3. Bu noktada, bir mikroskop kademesine 96 oyuklu plaka transfer ve de her biri daha sonraki analizler için uygun noktalar tanımlar. 10 dakika içinde bu adımı tamamlayın (edinim ayrıntıları için bakınız bölüm 5.1).
  4. Ortalama de, 20 içeren CCF4 / AM yükleme çözeltisi (0.24 ul çözelti A, 1.2 ul çözelti B, 70 ul, 18.56 ul çözelti C (çözelti A, B, ve C CCF4 / AM yükleme kiti içinde temin) ve 50 ul PBS (ekleme Çok p kullanılarak ug / ml kloramfenikol ve 2.5 mM probenesid)ipette oda sıcaklığında 5 dakika inkübe vb. Şimdi çalışma kesintisiz itibaren.
  5. Yükleme solüsyonu aspire ve çok pipet kullanılarak 20 ug / ml kloramfenikol ve 2.5 mM probenesit içeren 100 ul PBS ilave edin. Sonra hızla mikroskop aşamaya 96 plaka aktarmak ve yükleme çözümünün aspirasyonu 10 dakika içinde alımı başlatabilirsiniz.

5. Lazer Tarama Mikroskopi ve Veri Analizi

  1. Görüntü edinimi
    1. Fototoksisite, Photobleaching ve çapraz uyarma toplam foton sayısını en üst düzeye çıkarmak ve en aza indirmek için bir şekilde görüntüleme koşullarını ayarlayın.
      1. Modern bir konfokal lazer tarama mikroskobu, aynı anda aktif donör ve alıcı kanalları, 8 bit derinliği ile yüksek hassasiyet GaAsP-dedektörleri seçin 2.5 Airy birimlerinin (yani, geniş optik kesit) detektör iğne deliği açmak, 20X yüksek sayısal açıklık daldırma objektif kullanın ~ 750 nm piksel boyutu, 3 kat çerçeve ortalama ve Excit405 nm diyot lazer% 10 e.
      2. Doğru miktar aynı değere her iki kanal dedektör kazancını ayarlamak sağlamak ve herhangi doymuş piksel önlemek için.
        Not: Burada kazançları% 150 kuruldu.
    2. 1 ml şırınga ile, örneğin kuyu dibine batırma orta yayarak sürekli daldırma emin olun ve herhangi bir hava kabarcığı yakalama kaçının.
    3. Iletilen ışık etkinleştirin ve her kuyuda bir görüş temsilcisi alanını bulmak. Bir doğru kalibre otomatik sahne kullanın ve yazılımı konumunu işaretleyin.
    4. Boyama için plakasının sökülmesinden sonra, (bölüm 4.3) plaka takın ve fokal sürüklenme önlemek için üst kısmında bir ağırlık ilave. Lazer tarama modu ile kaydedilen pozisyonları gözden geçirin ve düzgün odaklama ve yanal konumunu ayarlamak.
    5. 2 saat kadar, 2 dakika süre zaman atlamalı ayarlayın ve alımı başlatabilirsiniz.
  2. Resim miktar (örneğin Bitplane Y verilecek) bu tür IMARIS gibidir
    1. Piksel matrislerin aritmetik hesaplamaları izin veren yazılım içine veri kümesi aktarın. Sürükleyip bağışçı ve yazılım simgesine alıcı kanalı hem de içeren kaynak dosya bırakarak bunu yapın.
    2. Aynı ofset kullanarak her iki kanallarda arka plan çıkarın. Bunu yapmak için, Menü'yü tıklatın ve sonra Görüntü tıklayın> İşleme> Baseline Çıkarma. Her kanalı seçin ve bazal değeri girin.
    3. Yeni bir kanal oluşturarak, önceden belirlenmiş düzeltme faktörü f (1.1 bakınız) ile alıcı kanalı (CH2) içine donör kanalı (Ch1) ve boşaltma-through düzeltin:
      Ch2 '= CH2 - Ch1 * f
      Not: verici kanalı içine alıcı bir boşaltma yoluyla gürültü seviyesi üzerinde tespit edilememiştir.
      1. Menü> Görüntü İşleme> Kanal Arithmetics tıklayın ve butonu abs (CH2- (ch1 * 0.33)). Daha sonra Menü> Düzenle> Kanallar Sil'i tıklatarak Kanal 2 silin. Emin olunkanamaya-yoluyla düzeltilmiş alıcı kanalı olarak kalır yeni Kanal 2. İsteğe bağlı: Menü> Düzenle> Görüntü Özellikleri giderek orijinal rengine gri kanal rengini değiştirin. Channel 4> Haritalı Renk> Temel Rengi seçip yeşil, örneğin değiştirin.
    4. Göreceli FRET katsayısını belirlemek için aşağıdaki işlemi ile yeni bir kanal oluşturun:
      = CH3 Ch2 '/ (Ch1 + CH2'),
      1. Menü> Görüntü İşleme> Kanal Aritmetik gidin ve ./ (CH1 + CH2) CH2 girin
    5. 8 bit görüntüde FRET kanalının uygun görünüm için, dördüncü kanal oluşturmak:
      Ch4 = 255 * Ch3
      1. Menü> Görüntü İşleme> Kanal Aritmetik gidin ve 255 * CH3 girin. Menü> Düzenle> Görüntü Özellikleri giderek kanal rengini değiştirin. Channel 4> Haritalı Renk> Renk Tablosu Dosya> Jet seçin.
    6. Kanallar CH3 ve Ch4 tha bir 3x3 medyan filtre uygulamakt görüntüler gürültüyü azaltır. Bunu yapmak için, Menü> Görüntü İşleme> Düzleştirici> Medyan Filtre tıklayın. Her iki kanal seçin ve bir filtre boyutu "3x3x1" uygulanacaktır.
    7. Hücresel sinyal ölçümü için doğru ofset ayarlayarak Ch4 hücrelerin tespit etmek ve çok küçük yapılar dahil büyüklük olarak yapı filtre.
      1. Seçin Görünüm Aşan ve simgesi "Yeni Yüzey Ekle" düğmesine tıklayın. Yüzey penceresinde algılama algoritma parametreleri tanımlayın. Daha hızlı işlem için, iki onay kutularını "Segment İlgi sadece Bölge" ve "nihayet Süreç tüm Image" etkinleştirin. Boyutlarını düzenleyerek ilgi bölgeyi tanımlamak.
      2. Kaynak kanalı olarak Kanal 4 seçip eşik> Arka Plan Çıkarma (Yerel Kontrast) tarafından eşiğini ayarlamak ve 10 um çapı ayarlayın. Maksimum intensi elle 0'a asgari yoğunluk eşiğini ve maksimum eşik ayarlamakty. Alana göre yapılarını Filtre ve örneğin, 187 μm² minimum değeri ayarlayın. Yüzey algılama bitirin.
    8. Donör floresan yoğunluğu (Ch1) ve bağıl FRET katsayısı (Ch3) ve hücresel varlık kendi standart sapmaları için ortalama değerler ayıklayın. Bunu yapmak için, Yüzey özelliklerine gidin. Yüzeyler Stil / Kalite> Yüzey seçerek yapıların görünümünü değiştirin. Filtreler sekmesini tıklayarak bütün yapıları seçiniz. Seçimi> birleştirmek Süreç giderek tespit yapıları birleştirin. Istatistik sekmesini tıklayarak MS Excel yüzey istatistiklerini İhracat> İhracat Tüm istatistikleri Dosyaya.
    9. Zaman içinde bu değerler çizilir. Transloke efektör miktarını temsil ettiği uygun bir parametre olarak her bir durum için donör kanalı floresan artış maksimum eğim 10 dakika aralığını belirlemek. M = Δ donör floresan yoğunluğu / Δ süresi (min) olarak eğimi hesaplayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kantitatif hedef hücrelere efektör translokasyon analiz etmek için tarif edilen yönteme kapasitesini göstermek için, farklı bir translokasyon kinetiği iki Yersinia suşlar üzerine çalışıldı: Y. ve onun türevi WA-314ΔYopE (pYVO8ΔYopE 23 barındıran WA-314) (virülans plazmid pYVO8 22 barındıran serogrup O8) enterocolitica vahşi tip suş WA-314. Daha önce iş olduğunu gösterdi Y. Fonksiyonel YopE sergilediğini anlamlı olarak yüksek Yop translokasyon oranı 10 eksik enterocolitica mutantlar. Her iki suş da YopE ve TEM-1, beta-laktamaz (bla PMK-) 17 N-terminal salgılama sinyalinin füzyonlar için vektörler kodlama ile dönüştürülmüştür. WA-314 ek olarak bir negatif kontrol olarak hizmet etmek üzere bir ilgili YopE ovalbümin füzyon (PMK-ova 17) bir vektör ile transforme edildi. 30, 60 ve 90 dakika inkübasyon süreleri daha method`s etkili menzili a değerlendirmek için uygulandıölçümü için nd uygunluk. İki farklı okuma veri analizi için kullanılmıştır: donör floresan (Ch1) ve bağıl FRET katsayıları (Şekil 1B ve 1C) (Ch3 CH2 '/ (Ch1 + Ch2') =).

Zamanla negatif kontrol suşu (Ch1) donör kanal şiddetlerinin WA-314-PMK-ova çizimi için bakılmaksızın inkübasyon süresi (Şekil 1B) floresan emisyon hiçbir artış göstermektedir. Bunun aksine, WA-314-PMK'yi-bla enfekte olmuş hücrelerde zamanla floresan yoğunluğunun artışı, hedef hücre sitoplazmasında YopE beta-laktamaz füzyon varlığına işaret tespit edilmiştir. Beklendiği gibi floresan yoğunluğunun maksimum eğim pozitif enfeksiyon (0.10 / dakika, 60 dakika enfeksiyonu: 0.33 / dakika, 90 dakika enfeksiyonu: enfeksiyon 30 dakika 0,76 / dakika) uzunluğu ile ilişkilidir belirten transloke beta- farklı konsantrasyonlarda laktamaz ayırt edilebilir. Önceki çalışmalar WA-31 uyarınca(: 1.28 / dakika, 60 dakika enfeksiyonu: 1.53 / dakika, 90 dakika enfeksiyonu: 1,41 / dakika enfeksiyonun 30 dakika) 4ΔYopE-PMK'yi-bla enfekte edilmiş hücreler daha hızlı olarak vahşi tip suş ile karşılaştırıldığında floresan yoğunluğunun artışı sergiler. İlginç bir şekilde, 90 dakika enfeksiyonu daha fazla genişlemek enfeksiyonun 60 dakika boyunca (Şekil 1B) ile karşılaştırıldığında donör floresan artışı etmeyi hızlandırmamıştır. Bu bulgu, bunun nedeni, muhtemelen plazma zarı bütünlüğünün bozulmasına enfeksiyonun 60 dakika ötesine etkin translokasyon inhibe veya floresan boyaların kaybına neden olabilir, ya WA-314ΔYopE-PMK-bla, uyguladığı artan sitotoksik etkisi ile açıklanabilmektedir. Analiz için görece FRET katsayısı (CH3) kullanılarak sağlanan sonuçlar, tek başına donör kanal ile elde edilen sonuçları ile uyum içindedir. Bununla birlikte, transloke beta-laktamaz füzyon çok büyük miktarlarda temsil eden bazı koşullar altında (WA-314ΔYopE-PMK-bla, 60 ve 90 dakika enfeksiyonu), tabii ki CCF4 substrat olduğuGörüntüleme başlamış olabilir önce parametreler sürekli işlenir. Bu koşullar eğrisinin ilgili kısmı bu veri gösterimi (Şekil 1C) cevapsız çünkü makul bir maksimum negatif eğiminin hesaplanması için izin vermez. Göreceli FRET katsayısı kanalının görüntüleri tek tek hücrelerin (Şekil 1D) arasındaki farklılıkları karşılaştırma olanağı sağlamaktadır.

figür 1
Y. TEM-1 YopE füzyonları tarafından efektör translokasyon Şekil 1. kantitatif analizi enterocolitica. Transloke TEM-1, beta-laktamaz göre CCF4 alt-tabaka (A) hidrolizi lazer tarama mikroskobu ile kontrol edilmiştir. Sağlam alt tabakanın yeşil floresan emisyon (530 nm) ve bölünmüş hidroliz pr mavi floresans emisyon (460 nm) sonuçlandı nm 405 uyarmaoduct (kumarin). (B, C) ​​Mikroskopi verileri nicel göreceli FRET katsayılarının verici kanal yoğunluğunu (Ch1) ya da hesaplama ve komplo (Ch3 Ch2 '/ (Ch1 + CH2' =)) komplo tarafından analiz edilmiştir. Veriler, üç bağımsız deneyi temsil etmektedir. (D) tasvir mikrograflan (kanal FRET) belirtilen zaman noktalarında temsili film alınmıştır. WA-314ΔE-PMK-bla enfekte hücreler yabani tip WA-314-PMK-bla (60 dk enfeksiyonu) ile karşılaştırıldığında göreceli FRET katsayılarının daha hızlı bir düşüş göstermektedir. Ölçek çubuğu, 20 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Fluorophores V450 ve FITC Şekil 2. Çapraz konuşma belirlenmesi.Her iki münferit fluorophores spektrumları konfokal mikroskop ile ölçüldü. Akmalarını donör V450 arasında 525-535 nm dedektör aralığında alıcı kanalına bir lineer regresyon (insert) hesaplandı. İki ölçümlerinden hesaplanan çapraz-karışma ortalama yüzdesi 0.33 eşittir. Bleed-through alıcı FITC verici kanalı (455-465 nm) içine gürültü seviyesi üzerinde saptanabilir değildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Biz burada başarılı Y. tarafından efektör translokasyon kantitatif analizi için bir TEM-1 beta-laktamaz muhabiri bazlı analiz uygulamalı enterocolitica. Bu, hassas bir özel ve oldukça basit bir tekniğin bir çok farklı varyasyonlar literatürde tarif edilmiştir. Bu çalışmada, lazer tarama mikroskobu floresan sinyalleri en hassas ve kesin tespiti için yürütülmüştür. Özellikle, verici ve alıcı boyalar ve bağımsız olarak ayarlanabilen tespit bant genişlikleri arasında çapraz konuşma için düzeltme yönteminin diğer varyasyonları ile karşılaştırıldığında ölçüm yüksek hassasiyet için izin verir. Sonuçlar açıkça yöntem kantitatif translokasyon analiz yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir. Hücre içi beta-laktamaz farklı konsantrasyonlarda temsil farklı inkübasyon süreleri olumlu donör floresan yoğunluğu eğimi ile korelasyon göstermekteydi. Ayrıca WA-314ΔYopE bir anlamlı olarak daha yüksek translokasyon oranı karşılaştırıldığındavahşi tip suş WA-314 gösterdi olabilir.

Veri analizi için iki alternatif seçenekler uygulanmıştır: Donör kanal şiddetleri ve bağıl FRET katsayıları. Verici kanalı kullanan avantajı doğrudan CCF-4 hidroliz ürünü (kumarin) birikimini temsil etmesidir. / Alıcı gerekli verici bir oran kullanılarak hücre yoğunlukları farklılıkları, bir plaka okuyucusu düzeltme dışında değildir, çünkü bu yaklaşım, mikroskobik kurulum mümkündür. Ancak, CCF4 boya veya hidroliz ürünleri ihracatı hala bu yaklaşımın olası karıştırıcı olduğunu. Bu dezavantaj göreceli FRET katsayısı hesaplanarak aşılabilir.

Tarif edilen kurulum deneylerde 96 yuvalı plakalar içinde gerçekleştirilmiştir. Bu biçim, tek bir deneyde birden koşulların test için izin verir ve pahalı kimyasallar (özellikle CCF4 / AM yükleme kiti) kurtarmak için yardımcı olur. Açıklanan iş akışında bu im başlatmak için önemlidirkısa bir süre transloke beta-laktamaz göre CCF4 hidroliz nedeniyle CCF4 / AM yükleme çözeltisi ilave edildikten sonra belirli bir zaman noktasında Yaş alıcı hemen başlar. Aynı anda birçok şartlara işleme durumunda, odak ve lateral pozisyonları (adım 5.1.4) ayarı çok uzun zaman alır ve görüntü elde etme zamanında başlangıç ​​engel olabilir. Bu nedenle, paralel numune sayısı tek tek tespit edilmesi gerekmektedir.

Bu yöntemi kullanarak karşılaşılan temel sorunlardan biri 37 ° C'de HeLa hücreleri tarafından CCF4 substrat önemli ihracat oldu. Bu olgu yeterince probenesid ile hücrelerin tedavi ederek etkisiz edilememiştir. Daha önce açıklandığı gibi, bu nedenle ilk tam enfeksiyon için, sürekli enfeksiyon sırasında yerine izleme translokasyon, karar ve sonrasında CCF4 / AM boya ile hücrelerin yükleyin. Bu yaklaşımla, bu alt-tabakanın oda sıcaklığında CCF4 işlenmesini takip edilmesi mümkün olmuştur. Bu koşullar altında, ReduCCF4 ve ced ihracat gözlendi. CCF4 substrat ihracat miktarı hücre çizgisi belli gibi görünüyor; Burada tarif edilen kurulum güçlü 37 ° C'de CCF4 dışa hücre çizgileri de translokasyon güvenilir bir analiz, sağlar.

CCF4 İhracat gerçek zamanlı eş zamanlı enfeksiyon ve translokasyon proseslerin izlenmesi için mikroskop kurulum benimsemeye izin diğer bazı hücre hatlarında bir sorun değildir. Bu, bireysel hücre içine translokasyonu analiz imkanı sağlar ve bakteriyel yapışma ya da mikro-koloniler 20 oluşumu gibi konakçı hücre etkileşimi spesifik olaylar ile translokasyon ilişkilendirmek için kullanılabilir. Bu nedenle, bu testte daha translokasyon bakteri ve konak hücrelerin etkileşimi sırasında nasıl düzenlendiği mekanizmalarını aydınlatmak için değerli bir araçtır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB-Agar Roth X969.2
LB-Medium Roth X968.2
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8662-500ML
96-well plate (black, clear bottom) Greiner Bio One 655087
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate Gibco/Life Technologies 31966-047
Probenecid Sigma-Aldrich P8761-25G
LiveBLAzer FRET-B/G Loading Kit with CCF4-AM Life Technologies K1095
Lectin from Triticum vulgaris (wheat) FITC conjugate Sigma-Aldrich L4895 Used for peak emission and cross-talk determination
V450 Rat anti-Mouse CD8a BD Bioscience 560469 Used for peak emission and cross-talk determination
Immersol W immersion oil  Zeiss 444969-0000-000 Refractive index = 1.3339 @ 23 °C
TCS SP5 II confocal laser scanning microscope Leica microsystems 2x GaAsP-Hybrid detectors, 4 channel spectrometer, acusto optical beam spliter, motorized XY stage, adjustable pinhole, objective 20X HC PL APO CS IMM/CORR, 405 nm diode laser 50 mW
Imaris 7.6 software Bitplane Plugins included ImarisXT and MeasurementPro
MatLab compiler runtime MathWorks
Prism 5 GraphPad software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. Bacterial Type III Secretion Systems: Specialized Nanomachines for Protein Delivery into Target Cells. Annu Rev Microbiol. 68, 415-438 (2014).
  2. Aepfelbacher, M., Trasak, C., Ruckdeschel, K. Effector functions of pathogenic Yersinia species. Thromb Haemost. 98 (3), 521-529 (2007).
  3. Heesemann, J., Sing, A., Trulzsch, K. Yersinia's stratagem: targeting innate and adaptive immune defense. Curr Opin Microbiol. 9 (1), 55-61 (2006).
  4. Viboud, G. I., Bliska, J. B. Yersinia outer proteins: role in modulation of host cell signaling responses and pathogenesis. Annu Rev Microbiol. 59, 69-89 (2005).
  5. Dewoody, R. S., Merritt, P. M., Marketon, M. M. Regulation of the Yersinia type III secretion system: traffic control. Front Cell Infect Microbiol. 3, 10-3389 (2013).
  6. Pettersson, J., et al. Modulation of virulence factor expression by pathogen target cell contact. Science. 273 (5279), 1231-1233 (1996).
  7. Schweer, J., et al. The cytotoxic necrotizing factor of Yersinia pseudotuberculosis (CNFY) enhances inflammation and Yop delivery during infection by activation of Rho GTPases. PLoS Pathog. 9 (11), e1003746 (2013).
  8. Wolters, M., et al. Cytotoxic necrotizing factor-Y boosts Yersinia effector translocation by activating Rac protein. J Biol Chem. 288 (32), 23543-23553 (2013).
  9. Mejia, E., Bliska, J. B., Viboud, G. I. Yersinia controls type III effector delivery into host cells by modulating Rho activity. PLoS Pathog. 4 (1), e3 (2008).
  10. Aili, M., et al. Regulation of Yersinia Yop-effector delivery by translocated YopE. Int J Med Microbiol. 298 (3-4), 183-192 (2008).
  11. Gaus, K., et al. Destabilization of YopE by the ubiquitin-proteasome pathway fine-tunes Yop delivery into host cells and facilitates systemic spread of Yersinia enterocolitica in host lymphoid tissue. Infect Immun. 79 (3), 1166-1175 (2011).
  12. Nordfelth, R., Wolf-Watz, H. YopB of Yersinia enterocolitica is essential for YopE translocation. Infect Immun. 69 (5), 3516-3518 (2001).
  13. Radics, J., Konigsmaier, L., Marlovits, T. C. Structure of a pathogenic type 3 secretion system in action. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 82-87 (2014).
  14. Sory, M. P., Cornelis, G. R. Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enterocolitica into HeLa cells. Mol Microbiol. 14 (3), 583-594 (1994).
  15. Schlumberger, M. C., et al. Real-time imaging of type III secretion: Salmonella SipA injection into host cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (35), 12548-12553 (2005).
  16. Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J Bacteriol. 186 (16), 5486-5495 (2004).
  17. Koberle, M., et al. Yersinia enterocolitica targets cells of the innate and adaptive immune system by injection of Yops in a mouse infection model. PLoS Pathog. 5 (8), e1000551 (2009).
  18. Geddes, K., Cruz, F., Heffron, F. Analysis of cells targeted by Salmonella type III secretion in vivo. PLoS Pathog. 3 (12), e196 (2007).
  19. Marketon, M. M., DePaolo, R. W., DeBord, K. L., Jabri, B., Schneewind, O. Plague bacteria target immune cells during infection. Science. 309 (5741), 1739-1741 (2005).
  20. Mills, E., Baruch, K., Aviv, G., Nitzan, M., Rosenshine, I. Dynamics of the type III secretion system activity of enteropathogenic Escherichia coli. MBio. 4 (4), (2013).
  21. Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3 (2), 104-113 (2008).
  22. Heesemann, J., Laufs, R. Construction of a mobilizable Yersinia enterocolitica virulence plasmid. J Bacteriol. 155 (2), 761-767 (1983).
  23. Zumbihl, R., et al. The cytotoxin YopT of Yersinia enterocolitica induces modification and cellular redistribution of the small GTP-binding protein RhoA. J Biol Chem. 274 (41), 29289-29293 (1999).

Tags

Enfeksiyon Sayı 104 Tip III sekresyon sistemi translokasyon Yersinia enterocolitica beta-laktamaz efektör protein Yersinia dış protein Yop YopE FRET
Analizi<em&gt; Yersinia enterocolitica</emAna Hücreleri içine&gt; Efektör Translokasyon Beta-laktamaz Effector Fusions kullanma
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wolters, M., Zobiak, B., Nauth, T.,… More

Wolters, M., Zobiak, B., Nauth, T., Aepfelbacher, M. Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions. J. Vis. Exp. (104), e53115, doi:10.3791/53115 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter