Summary
Her præsenterer vi en protokol, der er baseret på rygmarv skiver dyrket på multi-elektrodesæt at studere funktionelle regenerering af propriospinal forbindelser in vitro.
Introduction
Organotypiske skive kulturer af centralnervesystemet (CNS) har været anvendt i vid udstrækning til undersøge forskellige fysiologiske og patologiske fænomener nå fra neuronal udvikling til neurodegeneration. Sammenlignet med dissocierede cellekulturer, organotypiske skiver har den fordel mere kompliceret med en intakt cytoarchitecture og lokalt synaptiske kredsløb. Samtidig kan vævet analyseres i en isoleret måde uden behov for at indblande forviklinger af hele in vivo sammenhæng. Desuden er let og gentagne adgang til cellerne af valg berettiget, det ekstracellulære miljø kan styres præcist og sædvanligvis in vitro modeller er billigere end deres in vivo modstykker. I de senere år forskellige undersøgelser, præsenterede slående ligheder mellem de udviklingsmæssige profiler af langsigtede kulturer versus tilsvarende levende dyr 1,2. Det er blevet vist, at neuronale kredsløb af forskellige CNS regions udtrykker spontan netværk aktivitet under udvikling, og at organotypiske skiver delvist opretholde dette fænomen 3 -7. Isolerede rygmarv forberedelser er især anvendt til at undersøge rytme generation 6 og dannelsen af neuronale kredsløb 1.
En måde at optage den spontane aktivitet af organotypiske skiver er at kulturen dem oven på multi-elektrodesæt (MEA). Disse enheder indeholde flere elektroder, der kan overvåge de ekstracellulære potentialer genereres af aktionspotentialer fra mange celler samtidigt (multi-enhed optagelse). Den høje tidsopløsning af MEA optagelser kan anvendes til at rekonstruere de præcise aktivitet dynamik inden for en given neuronal kredsløb. Derudover er der i modsætning til patch-fastspænding teknikken er non-invasiv, der tillader langsigtede målinger og resultater i, at neuroner ikke påvirkes i deres adfærd.
Feller formålet med denne undersøgelse blev kombinationen af organotypiske rygmarven co-kulturer og multisite optagelser bruges til at undersøge funktionel regenerering inden rygmarven. Da voksne højere hvirveldyr har begrænset potentiale til at komme sig skader på rygmarven, har forskellige strategier blevet undersøgt for at fremme regenerering efter rygmarvsskade. Hidtil har det corticospinal tarmkanalen normalt været model foretrukne system for sådanne undersøgelser. Disse eksperimenter er typisk tidskrævende, dyrt og kræver store dyr kohorter grund af høj variabilitet inden for enkelte grupper. Desuden tyder på, at propriospinal forbindelser (neuroner, der er helt indesluttet i rygmarven) kan spille en central rolle i helbredelsesprocessen efter rygmarvslæsioner 8. Disse fibre er vanskelige at studere in vivo uden indblanding fra stigende og faldende fiber skrifter. Bonnici og Kapfhammer 9 brugte langsgående rygmarvskive kulturer af postnatal mus som en alternativ tilgang. Efter at have udført mekaniske læsioner analyserede de semi-kvantitativt den morfologiske regenerering af axoner mellem rygmarv segmenter. De observerede mindre, men ikke ingen axoner krydser læsionsstedet i kulturer skåret i en moden alder. I modsætning hertil kulturer, der blev læderede i en yngre tidspunkt viste en stor mængde af axonal regenerering 5 - 7 dage efter skaden. Blev dog bevis for funktionelle forbindelser ikke præsenteret.
Derfor kan udviklingen af en repræsentant in vitro model af propriospinal fibre, der tillader undersøgelse af funktionelle regenerering være et værdifuldt redskab til at udvide vores viden om regenerative processer i rygmarven.
Protocol
Animal Care var i overensstemmelse med retningslinjer, der er godkendt af schweiziske kommuner (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, Veterinärdienst, Sekretariat Tierversuche, godkendelse NRS. 52/11 og 35/14). Disse retningslinjer er i overensstemmelse med Det Europæiske Fællesskab direktiv 2010/63 / EU.
Bemærk: Arbejde i en laminar flow hætte med sterile instrumenter og løsninger til alle trin 1 - 5, herunder sub-trin.
1. Udarbejdelse af multilaterale miljøaftaler
Bemærk: MEA består af et glassubstrat, mikro-metal elektroder og en SU-8 polymer isoleringslag (se også Tscherter et al. 3). Med henblik på denne undersøgelse blev kommercielt tilgængelige MEA bestilt med en tilpasset elektrodesæt layout (Figur 1 A & B). De 68 elektroder er anbragt i et rektangulært gitter, som er opdelt i to zoner ved en 300 um bred rille fri for elektroder, elektriskiCal kundeemner og isolering. Hver elektrode er 40 x 40 um i størrelse, og de er adskilt med 200 um fra center til center. Fire store jordelektroder er anbragt omkring optagestedet. De adskiller sig fra andre kommercielt tilgængelige standard multilaterale miljøaftaler i deres størrelse (21 mm x 21 mm), og de har ingen fast optagelse kammer.
- Til desinfektion skyl MEA i 100% ethanol (2x), 70% ethanol (1 x) og destilleret vand (2x) i mindst 30 sek hver. Lad tørre. Put 10 - 12 MEA'er i et rent glas petriskål (150 mm x 25 mm) og lukke låget.
- Autoklave MEA i 20 minutter ved 120 ° C. Opbevar ved stuetemperatur.
- Forbered coatingopløsningen (se materialer listen) for MEA og gemme alikvoter ved -20 ° C.
- Sætte hver MEA i en individuel steril petriskål (35 mm x 10 mm).
- Brug en afkølet pipette til at sætte 150 pl kølet coatingopløsning på toppen af elektroderne og lukker låget på petriskålen. Efter omkring 10 min, så tjek for luftbobler på toppen afelektroderne og forsigtigt fjerne dem med en gummi-dækket spatel om nødvendigt. Lad hvile i 1 time ved stuetemperatur.
- Aspirer belægning løsning rester, vask 1x med medium optimeret til prænatal og embryonale neuroner og 2x med destilleret, sterilt vand. Hvis MEA ikke anvendes indtil den næste dag, holde dem i destilleret, sterilt vand ved 37 ° C i inkubatoren O / N. Ellers lad direkte tørre ved stuetemperatur.
2. Ingredienser Nødvendige for udarbejdelse og vækst af Organotypiske kulturer
- Forbered calcium-fri vask opløsning (se materialer liste).
- Rekonstituer kylling plasma i vaskeopløsning (1: 1, rystes forsigtigt, undgå dannelse af bobler), centrifugeres ved 3.000 x g i ca. 20 minutter og dekanteres den klare indholdet i en sterilt rør. Portion 200 pi i kryorør og opbevares ved -20 ° C.
- Rekonstituer thrombin fra bovin plasma i overensstemmelse hermed (200 U / ml) og sterilt filter (0,2 um porestørrelse filter). Alikvote 200 pi i crytotubes og opbevares ved -20 ° C.
- For 30 kulturer fremstilling af 100 ml næringsmedium (se materialer listen).
3. rygmarvsvæv Dissection
Bemærk: Procedure udbytter, afhængigt af antallet af embryoner, rygmarv skiver til omkring 25 - 35 co-kulturer og fremstilles i en laminær strømning under sterile betingelser.
- Anvend en dødelig dosis af pentobarbital (0,4 ml) til moderdyret ved intramuskulær injektion. Bekræft dyb anæstesi ved at kontrollere tilbagetrækningen pedal refleks. Lever E14 rotteembryoer ved kejsersnit og ofre ved halshugning.
- Overfør ligene af fostrene i en petriskål fyldt med sterilt, kølet, vaskeopløsning.
- Udfør en komplet tværgående snit med en skalpel over bagben og en anden over forlemmerne og fjern lemmerne fra kroppen. Dernæst lave et snit i det frontale plan for at adskille indvoldene fra bagstykket indeholder spinal cord.
- Til udskæring, overføre rygstk indeholder rygmarven en ad gangen på en monteringsplade og skåret i en tykkelse på 225 - 250 um med en vævshakker. Put en dråbe vask løsning på hakkede væv og overføre skiver med en spatel i 35 mm x 10 mm petriskåle fyldt med sterilt, kølet, vaskeopløsning.
- For hver skive separat, dissekere rygmarv fra resterende væv. Lad dorsalrodsganglier vedlagt.
- Lad skiverne hvile i 1 time ved 4 ° C.
4. Montering rygmarvsvæv skiver på multilaterale miljøaftaler
- Varm op sterilt næringsmedium i inkubatoren (37 ° C, let skrues låget til iltning).
- Position MEA med sterile pincetter med gummi-dækket tips ved stuetemperatur i petriskålen under et stereomikroskop med elektroden array i fokus. Centrer en 6 pi dråbe af kylling plasma på det rene, støvfri, og sterilt elektrode array. Ved hjælp af en lille spatel, omhyggeligt slideto rygmarv sektioner med ventrale sider vender mod hinanden ind i plasmaet dråbe. Undgå at røre ved de elektroder med spatel.
- Tilføj 8 pi thrombin omkring kylling plasma dråbe. Brug af thrombin pipettespidsen forsigtigt blande og sprede kylling plasma / thrombin blanding omkring de to skiver. Igen, ikke røre den sprøde elektrodesættet direkte. Lige før koagulering, suge overskydende kylling plasma / thrombin.
- Cap petriskålen at bevare høj luftfugtighed, mens MEA / dyrkningsmontering sidder i ca. 1 time i et fugtigt kammer inde i inkubator ved 37 ° C.
- Derefter tilsættes forsigtigt 10 pi næringsmedium til kulturen kammeret, cap petriskålen og sat tilbage i inkubatoren i ca. 30 min.
- Placer hver MEA / kultur forsamling med sterile, gummi-dækket tip i en rulle rør, tilsættes 3 ml næringssubstrat og stramt tæt låget. Placer rullerøret i rulletromle roterer med 1 - 2 rpm i inkubatoren i en 5% CO
- Skift halvdelen af næringsstofmediet efter 7 dage in vitro (DIV), og bagefter 1 - 2 gange om ugen.
5. Mekaniske Læsioner
- Tag MEA / dyrkningsmontering med sterile, gummi-dækket tips ud af rullerøret og anbringes i en petriskål uden næringsmedium under en stereomikroskop med vævet i fokus. Visuelt kontrollere, at de to skiver er smeltet.
- Hold MEA / kultur samling stabil ved at placere pincet med gummi-dækket tips om MEA.
- Placer en skalpel i rillen af MEA tæt på vævssnit. Hold skalpel snarere vandret.
- Løft skalpel håndtere op men lad skalpelbladets forblive i rillen i MEA på en sådan måde, at bladet "ruller" fra bunden til spidsen og derved skærer gennem væv, der dækker rillen.
- Alvorlige eventuelle resterende væv forbindelser med en 25 G nål tip Hvis necessAry. Arbejd kun i området i rillen og ikke røre udbudsmaterialet kanter.
- Sætte MEA / dyrkningsmontering tilbage i rullerøret. Give 3 ml frisk næringsmedium til kulturerne og placere dem tilbage i rulletromle i inkubatoren.
6. Elektrofysiologisk Optagelser af spontane aktivitet
- For at undersøge funktionel regenerering blandt de to rygmarv skiver efter det valgte antal DIV, montere MEA / dyrkningsmontering i en optagelse kammer på et mikroskop og anvende ca. 500 pi ekstracellulær opløsning (se materialer listen).
- Vent 10 minutter, før den første optagelse, så systemet til at stabilisere sig.
- Optag basale spontane aktivitet 2x for omkring 10 min fra hver aktivitet-afsløring elektrode af MEA ved RT.
- For at sikre stabile ekstracellulære betingelser, udveksle ekstracellulær løsning efter hver optagelsen session.
- At disinhibit netværket, anvende ekstracellulær løsning containing stryknin (1 uM) og gabazine (10 uM). Vent i mindst 2 minutter, før du starter optagelsen.
7. Dataanalyse
Bemærk: Til påvisning af de ekstracellulært indspillet handling potentialer bruger til hver elektrode en detektor baseret på standardafvigelser og en efterfølgende diskriminator. Denne procedure er beskrevet i detaljer i Tscherter et al. 3.
- Vise den detekterede neuronal aktivitet af hver elektrode i en raster plot ifølge standardprocedurer 3 (figur 1F).
- Bestemme og vise den samlede netværk aktivitet for hver skive ved at summere antallet af arrangementer i henhold kanaler inden en glidende vindue på 10 msek, flyttet med 1 ms trin (figur 1G og se Tscherter et al. 3).
- Detect i hver skive enkelte byger (klynger af aktiviteter, der vises på flere elektroder). Derfor, Sæt en minimal top aktivitet tærskel i den tilsvarende samlede netværksaktivitet og definere hver burst start og brast ende. For eksempel er en passende tærskel er 25% af den gennemsnitlige burst amplitude og en burst starten kan defineres ved at være den første begivenhed i et tidsvindue på mindst 5 msek, en burst ende ved at være den sidste hændelse i et tidsvindue på mindst 25 msek (se Heidemann et al. 10).
- For at kvantificere funktionel regenerering beregne procentdelen af synkroniserede brister mellem de to skiver. For at gøre dette, beregne ventetid mellem en byge i den ene skive og følgende brast i den anden skive.
Bemærk: En burst par betegnes "synkroniseret", når latensen er mindre end den gennemsnitlige burst-længden. Især i co-kulturer med en masse aktivitet, for, at begge parter tilfældigvis indlede en byge i den valgte latenstid vinduet mulighed. Dette faktum skal der tages hensyn til kvantificering af den procentdel af synchronized brister. For en detaljeret beskrivelse af beregningerne se Heidemann et al. 10.
8. Fiksering af kulturer og Immunohistokemi
- For alle trin, der omfatter vask eller inkubation sørg for at sætte kulturerne på et vippe bord for at sikre korrekt diffusion af opløsningen gennem vævet.
- Umiddelbart efter indspilningen er færdig tager MEA / kultur samling ud af opsætningen, sætte det i en petriskål (35 mm x 10 mm), og der tilsættes ca. 2 ml ekstracellulær løsning.
- For at adskille skiverne fra de omgivende cellelag, der har dannet i den tid in vitro, tage en 10 pi pipettespids og cirkel skiverne. Vær opmærksom på ikke at beskadige kulturer. Det er muligt at udelade dette trin, men senere indlejring er lettere, når det udføres.
- Brug en tynd nonmetallic sprøjte nål (se materialer liste) i kombination med en 1 ml sprøjte fyldt med ekstracellulær solutipå at forsigtigt blæse kulturen fra MEA.
- Fjern spidsen af en Pasteur-pipette og monter gummi pære på slivered ende. Brug bagenden til at overføre kulturen i fiksativ (4% paraformaldehyd med phosphatbufret saltvand (PBS, 0,1 M)). Brug ikke standard spids af Pasteur-pipette for overførsel, fordi den er for lille, og kulturerne ville blive foldet og sandsynligvis beskadiget. Fix til 1 - 2 timer ved 4 ° C. Skyl MEA med destilleret vand og fjern væv rester med fingerspidserne, men ikke ridse med neglen. Store MEA i destilleret vand ved 4 ° C.
- Vask kulturerne 3x i PBS i mindst 10 minutter hver. Opbevar i PBS ved 4 ° C eller direkte starte med farvningsprocedure.
- Inkuber kulturerne i mindst 90 min i blokeringsopløsning (5% gedeserum, 1% bovint serumalbumin, 0,3% detergent i PBS).
- Tilsæt første antistof fortyndet i blokeringsopløsning og inkuberes i 3 nætter ved 4 ° C.
- Vask 3x i PBS i løst 30 minutter hver.
- Tilsæt andet antistof fortyndet i PBS i 2 timer ved stuetemperatur.
- Wash 3x i PBS i mindst 30 minutter hver.
- Overfør skiverne med en Pasteur-pipette med fjernet tip på et objekt dias. Fjern overskydende PBS og integrere med montering medium.
Representative Results
For at undersøge potentialet for funktionel genopretning af co-kulturer afledt af rygmarv fra E14 rotteembryoer blev læsioner udført i et tidsvindue på 8-28 DIV. 2 til 3 uger senere blev spontan neuronal aktivitet registreres med MEA (Figur 1 C & D). De ekstracellulært indspillet aktionspotentialer blev identificeret offline for hver enkelt elektrode (figur 1E). Ud fra disse data raster parceller blev genereret (Fig 1F), efterfulgt af netværksaktivitet grunde til at visualisere den samlede aktivitet for sig på hver side (fig 1G). I hver skive den spontane aktivitet sædvanligvis organiseret i serier. Hvis skiverne funktionelt er tilsluttet, kan disse bursts udbrede fra den ene skive til den anden. Derfor blev mængden af synkroniserede brister mellem de to skiver beregnet til kvantitativ måling funktionel regenerering. For en detaljeret beskrivelse af, hvordan omdannelsen into de forskellige plots udføres, og hvordan formlen for beregning af procentdelen af synkroniseret aktivitet blev afledt, se Heidemann et al. 10.
I alle eksperimenter blev aktiviteten først registreres under standardbetingelser. I et andet trin blev synaptisk hæmning blokeret ved tilsætning af stryknin (1 uM) og gabazine (10 uM) til ekstracellulære badopløsning. Denne hæmninger fører som regel til en mere regelmæssig aktivitetsmønster med forlængede brister og burst intervaller, hvilket letter definitionen af byger og dermed bestemmelse af burst synkronisering mellem skiverne.
Kulturer læderede i en ung alder (7-9 DIV) udviste en stor mængde synkroniseret aktivitet 2-3 uger efter læsion henviser kulturer læderede på et senere tidspunkt (> 19 DIV) viste en tydelig reduktion i evnen til at regenerere (figur 2 A - F). Disse resultater viser, at regenerering evneaf funktionelle forbindelser i rygmarven skive kulturer falder fra et højt niveau, som repræsenterer den embryoniske tilstand in vivo, til et lavt niveau, som repræsenterer den forbedrede tilstand in vivo, inden for tre uger i kultur.
Hvilke typer af tilslutninger er faktisk involveret i burst synkronisering mellem de to skiver? Udover propriospinal forbindelser, kunne fibrene også opstå motorneuroner eller dorsale rodganglieneuroner. Det er blevet vist tidligere, at dorsale rodganglieneuroner er ikke relevante for den funktionelle forbindelse mellem rygmarven skiver 10. Men inddragelse af motoriske neuroner forblev en mulighed. Da er kendt motoriske neuroner til dannelse cholinerge forbindelser til rygmarvsneuroner gennem nikotinreceptorer 13, blev aktiviteten af rygmarv co-kulturer registreret ved 8 DIV, et tidspunkt, hvor kulturerne viser stærkt synkroniseret aktivitet 10, og nikotinsyre antagonist Mecamylamin (MEC, 100 pM) blev tilsat til den ekstracellulære badopløsning. En deltagelse motorneuroner i forbindelsen mellem de to skiver ville resultere i en nedsat procentdel af synkroniseret aktivitet. Men dette var ikke tilfældet (MEC: 91,0 ± 4,5%, n = 7; kontrol: 93,6 ± 4,6%, n = 7, p> 0,05, Wilcoxon matchede par test). Disse resultater antyder, at cholinerge synapser ikke bidrager til den funktionelle forbindelse mellem skiver. Men da motorneuroner er også blevet vist at frigive glutamat ved synapser inden for CNS 11, 15, disse forsøg ikke helt udelukke deres deltagelse.
For at identificere motoriske neuroner immunhistokemiske farvninger mod den ikke-phosphorylerede neurofilament H med SMI-32 blev udført. De afslørede adskillige mærkede store celle organer er typiske for motorneuroner, fordelt over skiver (figur 3A). SMI-32 antistof er blevet rapporteret til at mærke den celle organer motoneurons 12 og dette fund gælder også for de anvendte kulturer 13. Også, farvninger af neuronale celle organer i almindelighed, f.eks, mod b-III-tubulin eller NeuN samt gliale celle organer, f.eks., Astrocytter med GFAP antistof er på linje med andre rapporter og matche morfologiske beskrivelser af disse celletyper ( Figur 3 B - D). Ikke desto mindre er mærkningen af axoner med SMI-32-antistof vedrørende (figur 3E). Mod forventning, et stort netværk af fibre vises, når du bruger denne antistof og det ligner SMI-31 farvning som mærker phosphoryleret neurofilament H (figur 3F). En fortolkning af dette resultat kunne være, at den udviklingsmæssige regulering af neurofilament phosphorylering / dephosphorylering er ikke så stramt i de anvendte kulturer sammenlignet med in vivo situationen. En blandet forekomst af phosphorylerede og ikke-phosphorylerede neurofilamenter i samme Axon kunne ekspain dette fund. En anden mulighed er, at SMI-32 mærkede axoner skyldes projektion neuroner. Tsang og kolleger 16 har vist, at fx er Clarks kolonne og intermediolaterale celle kolonne neuroner plettet af SMI-32 foruden motoneuroner. Udtalte neurit spredning af sådanne neuroner kunne også forklare den overflod af SMI-32 positive fibre.
Figur 1. Display og analyse af spontan aktivitet. (A) Diagram over en MEA. Platin beklædte elektroder er afbildet i sort, de gennemsigtige ledninger i røde og rillen i midten af MEA i gul. (B) Nærbillede af elektrodesættet beliggende i centrum af MEA. Diagrammerne er venligst stillet til rådighed af Dr. M. Heuschkel. (C) Lys-field billede af en 8 DIV gammel Culture. Skiverne er vokset og sammensmeltet langs siderne vender mod hinanden. Den gule søjle repræsenterer den electrode- og isolering uden rille i MEA. Scale bar = 400 um (D) Tidslinje eksperimenter. To rygmarv skiver af E14 rotteembryoer er placeret ved siden af hinanden på multilaterale miljøaftaler. Inden for få dage, skiverne vokse og sikringen langs siderne vender mod hinanden. I en tidsramme på 8-28 DIV, er komplette læsioner udføres ved fusion webstedet. To til tre uger senere den spontane aktivitet registreres og kulturerne fastsættes for immunohistokemiske farvninger. (E) Spontan aktivitet spor af hver enkelt elektrode af en 23 DIV gamle kultur. For tydeligere visualisering, er det kun hver anden spor illustreret. Orange spor skildrer aktivitet, der er registreret fra skive i højre side, blå spor fra venstre. De fleste af de bursts synkroniseres mellem de to. Pilen peger på en burst forekommer i venstre skive, at kun partially opformeret til højre skive. Aktiviteten i den rigtige skive imidlertid ikke nå den valgte tærskel på mindst 25% af den midlede maksimale peak aktivitet af pågældende side, og derfor ikke detekteres som en burst. Forstørrelser til højre skildrer den sidste synkroniserede burst par. (F) Raster afbildning af vist i (E) aktivitet. (G) Netværk aktivitet plot med definerede byger (søjler under baseline) af vist i (E) aktivitet. Tilpasset fra Heidemann et al. 10. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Synkroniseret versus Ikke synkroniseret Aktivitet. (A, B) Raster plots af kulturer lesioned i en ung alder (ved 7-9 DIV), viser synkroniseret aktivitet under standardbetingelser (A) og i henhold til hæmninger (B). (C, D) Raster plots af kulturer beskadigede på en alderdom (ved> 19 DIV), viser ikke synkroniseret aktivitet under standardbetingelser (C) og under hæmninger (D). (E, F) Gennemsnitlig procentdel af synkroniseret aktivitet plottet for hver enkelt læsion dag registreret under standardbetingelser (E) og under hæmninger (F). Optagelser blev taget 2 - 3 uger efter læsion. Tilpasset fra Heidemann et al. 10. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Immunhistokemisk karakterisering. (A) Farvning af motoneuronal cellelegemer med SMI-32. (B) β-III tubulin mærkning af modne neuronal celle organer og deres processer. (C) Identifikation af astrocytter med GFAP. (D) Mærkning af modent nervecelle krop med NeuN. (E) SMI-32-farvning af ikke-phosphoryleret neurofilament H. (F) Phosphoryleret neurofilament H identificeret ved SMI-31. Tilpasset fra Heidemann et al. 10. Bemærk, at med både, SMI-31 og SMI-32, et stort netværk af fibre er synlig i kulturerne. Barer AD = 20 um, H & F = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Flere elementer i den præsenterede procedure er fundamentale for udførelsen af nøjagtige og reproducerbare eksperimenter. Alle trin under fremstillingen af MEA, opløsninger og fremstillingen af skive kulturer udføres under sterile betingelser i en laminær strømning. Antibiotika anvendes ikke på det næringsstof medie, fordi de kan påvirke den spontane aktivitet 14. Under MEA belægning, den vigtigste del er at sikre, at den ekstracellulære matrix gelopløsning forbliver koldt på alle tidspunkter. Thaw den i køleskabet og holde det på is i hele proceduren for at sikre en maksimal temperatur tæt på 0 ° C. Under forberedelsen af skiver hurtig isolation og sektionering, samt at være opmærksom på en lav temperatur ved hjælp af iskolde dissektion buffere øger andelen af sunde kulturer. Desuden plasma / thrombin koagulation er en af de mest kritiske trin. Først skal du sikre, at plasma er korrekt mixed med thrombin. For det andet, være særlig opmærksom på at fjerne så meget rest som muligt for at sikre en ordentlig fastgørelse af skiverne til multilaterale miljøaftaler. Dette trin er yderst tidsfølsomme; hvis tidsrammen er for kort, for meget af plasma / thrombin blandingen fjernes. Hvis tidsrammen er for lang, koagulation allerede er sket, hvilket øger risikoen for at fjerne skiverne sammen med den resterende plasma / thrombin.
Hvis der er planlagt mekaniske læsioner, er det vigtigt at anvende MEA med et præcist design. Det område, hvor læsionen er bestemt skal være fri for elektroder, ledninger og isolering. Ellers electrics af MEA vil blive beskadiget og derfor kan ingen optagelser udføres længere.
Et andet afgørende skridt vedrører størrelsen af læsionen. Det er blevet vist tidligere, at genskabe to unge skiver efter læsion tager omkring to dage 10. Til alle forsøg blev den tommelfingerregel bruges at rummet between skiverne efter læsion bør ikke være større end bredden af MEA rille (300 um). En større læsionsstørrelsen kan resultere i en længere tidsramme for gentilslutning eller, hvis læsionen er for stor, ikke gentilslutning overhovedet. At anmærke, tidligere eksperimenter viste, at en indledende placering af de to skiver længere væk end 1 mm resulterer i en meget lav tilslutning sats.
Før starten af optagelserne, en justering på mindst 10 min til stuetemperatur, i stedet for 37 ° C i inkubatoren, og til den ekstracellulære opløsning, i stedet for næringsmedium anbefales. Tæt observation af aktivitetsmønster under disse indledende minutter sikrer, at de målte data repræsenterer den bristede mønster af kulturen passende efter optagelsen blev startet.
Til påvisning af aktiviteten, erhvervelse af data og yderligere behandling, hjemmelavet hardware (optagelsen kammer, forbindelser til forstærkere og forstærkere), programmer i LabVIEW, er C ++ og IgorPro brugt. Kommercielle MEA opsætninger og andre software pakker er velegnet som godt for disse operationer. Her bliver signalerne set af elektroderne forstærkes 1001 gange, og derefter digitaliseres ved en hastighed på 6 kHz.
Den præsenterede model kan være et nyttigt redskab til at undersøge propriospinal forbindelser, fordi in vivo, er de vanskelige at studere uden indblanding fra stigende og faldende fiber skrifter. Co-dyrkning af to rygmarv skiver kan elegant omgå dette problem. Kulturerne giver en mikromiljø, der kan styres stramt og let kan manipuleres. På den anden side, supraspinale og sanseindtryk er naturligvis mangler. Derudover fremgangsmåden ifølge fremstilling kultur repræsenterer en situation med CNS-skade. Gliaceller som astrocytter og mikroglia er kendt for at reagere på læsioner med forøget spredning og derfor vævet er til en vis grad reorganiseret. Vedrørende præsenterede tilstandl dannelsen af en glial ar efter udførelse af mekaniske læsioner blev ikke observeret. En forklaring kunne være, at adaptive mekanismer i astrocytter allerede blev udløst under forberedelsen proces, og at læsioner af kulturerne ikke resulterede i en yderligere reaktion. Også, er der ingen beviser for inddragelse af myelin associerede hæmmere, f.eks., Nogo-A, i den lave regenerering potentiale kulturer læderede på en alderdom. Det blev imidlertid vist, at behandling med phosphodiesterase 4-hæmmer Rolipram, startende umiddelbart efter udførelse af læsioner ved 23 DIV øger funktionel regenerering mellem skiverne 10. Disse resultater viser, at genvinding af funktionsevne kan øges i gamle kulturer. Mærkbart, når at tælle antallet af axoner krydser læsionsstedet blev ingen forskel mellem kulturer beskadigede i en ung alder og kulturer beskadigede på en alderdom opdaget. Disse resultater antyder, at mangel på axonal regenerering er ikke den vigtigste årsag feller tab af bedring efter sene læsioner i kultur, og derfor understrege behovet for en model, der giver mulighed for funktionel analyse af regenerering. Synaptic dannelse og synaptisk plasticitet kunne spille en vigtig rolle i helbredelsesprocessen 10. Disse mekanismer fået en masse opmærksomhed i de seneste år, og det er i dag almindeligt accepteret, at de har en stor indflydelse på resultatet, efter rygmarvsskader. Derfor kan en model, der giver stabile forhold at undersøge disse processer i isolation og i stor detalje sikkert bidrage til at opnå indsigt om funktionel regenerering i rygmarven.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
| Nutrient medium | For 100 ml | ||
| Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
| Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
| distilled, sterile water | 10 ml | ||
| Nerve growth factor-7S [5 ng/ml] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
| reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
| Coating solution | |||
| Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
| medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
| Wash solution | [mg/L] | ||
| MgCl2-6H2O | 100 | ||
| MgSO4-7H2O | 100 | ||
| KCl | 400 | ||
| KH2PO4 | 60 | ||
| NaCl | 8,000 | ||
| Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
| D-Glucose (Dextrose) | 1,000 | ||
| According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
| Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
| NaCl | 145 | ||
| KCl | 4 | ||
| MgCl2 | 1 | ||
| CaCl2 | 2 | ||
| HEPES | 5 | ||
| Na-pyruvate | 2 | ||
| Glucose | 5 | ||
| Blocking Solution | |||
| Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
| Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
| Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
| Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
| Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
| Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
| Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
| SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
| SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
| Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
| Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
| Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 | |
References
- Avossa, D., Rosato–Siri, M., Mazzarol, F., Ballerini, L. Spinal circuits formation: a study of developmentally regulated markers in organotypic cultures of embryonic mouse spinal cord. Neuroscience. 122 (2), 391-405 (2003).
- Cifra, A., Mazzone, G. L., Nani, F., Nistri, A., Mladinic, M. Postnatal developmental profile of neurons and glia in motor nuclei of the brainstem and spinal cord, and its comparison with organotypic slice cultures. Dev Neurobiol. 72 (8), 1140-1160 (2012).
- Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures. Eur. J. Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).
- Czarnecki, A., Magloire, V., Streit, J. Local oscillations of spiking activity in organotypic spinal cord slice cultures. Eur. J. Neurosci. 27 (8), 2076-2088 (2008).
- Kirkby, L. A., Sack, G. S., Firl, A., Feller, M. B. A role for correlated spontaneous activity in the assembly of neural circuits. Neuron. 80 (5), 1129-1144 (2013).
- Ballerini, L., Galante, M., Grandolfo, M., Nistri, A. Generation of rhythmic patterns of activity by ventral interneurones in rat organotypic spinal slice culture. J. Physiol. (Lond.). 517 ((Pt 2)), 459-475 (1999).
- Hanson, M. G., Landmesser, L. T. Normal patterns of spontaneous activity are required for correct motor axon guidance and the expression of specific guidance molecules). Neuron. 43 (5), 687-701 (2004).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nat. Med. 14 (1), 69-74 (2008).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model. Eur. J. Neurosci. 27 (10), 2483-2492 (2008).
- Heidemann, M., Streit, J., Tscherter, A. Functional regeneration of intraspinal connections in a new in vitro model. Neuroscience. 262, 40-52 (2014).
- Nishimaru, H., Restrepo, C. E., Ryge, J., Yanagawa, Y., Kiehn, O. Mammalian motor neurons corelease glutamate and acetylcholine at central synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (14), 5245-5249 (2005).
- Tsuji, S., et al. Proteasome inhibition induces selective motor neuron death in organotypic slice cultures. J. Neurosci. Res. 82 (4), 443-451 (2005).
- Magloire, V., Streit, J. Intrinsic activity and positive feedback in motor circuits in organotypic spinal cord slice cultures. Eur. J. Neurosci. 30 (8), 1487-1497 (2009).
- Bahrami, F., Janahmadi, M. Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture. Iran. Biomed J. 17 (2), 101-106 (2013).
- Mentis, G., et al. Noncholinergic excitatory actions of motoneurons in the neonatal mammalian spinal cord. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.. 20 (102), 7344-7349 (2005).
- Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non–phosphorylated neurofilaments: Cross– species comparison and alterations in ALS. Brain Res. 861 (45–58), (2000).
