Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, das am Rückenmark Scheiben auf Multielektrodenarrays kultiviert, um funktionelle Regeneration propriospinale Verbindungen in vitro-Studie basiert.
Introduction
Organotypischen Kulturen des zentralen Nervensystems (ZNS) haben intensiv genutzt worden, um verschiedene physiologische und pathologische Erscheinungen reichen von neuronalen Entwicklung zur Neurodegeneration zu untersuchen. Verglichen mit dissoziierten Zellkulturen bieten organotypischen Scheiben den Vorteil einer Komplexität, die mit einem intakten Zellarchitektur und lokaler Synapsenschaltungen. Gleichzeitig kann das Gewebe in einer isolierten Art und Weise ohne die Notwendigkeit, die Komplexität der gesamten in vivo Kontext impliziert analysiert werden. Darüber hinaus wird eine einfache und wiederholt den Zugriff auf die Zellen der Wahl erfordern, kann der extrazellulären Umgebung genau gesteuert werden kann und in der Regel sind in-vitro-Modellen weniger kostspielig als ihre in vivo-Gegenstücke. In den letzten Jahren stellte verschiedene Studien auffallende Ähnlichkeiten zwischen den Entwicklungsprofile der langen Zeitkulturen gegenüber den entsprechenden lebenden Tieren 1,2. Es wurde gezeigt, dass neuronaler Schaltkreise verschiedener ZNS regions Ausdruck spontaner Netzwerkaktivität während der Entwicklung und organotypischen Schnitten teilweise dieses Phänomen 3 -7 erhalten. Isolated Rückenmarks Vorbereitungen insbesondere eingesetzt, um Rhythmuserzeugung 6 und die Bildung von neuronalen Schaltkreisen 1 zu untersuchen.
Ein Weg, um die spontane Aktivität organotypischen Scheiben aufnehmen soll Kultur sie oben auf Multielektrodenanordnungen (MEAs). Diese Geräte enthalten mehrere Elektroden, die die extrazellulären Potentiale von Aktionspotentialen aus zahlreichen Zellen gleichzeitig (Multi-Unit-Aufnahme) erzeugt überwachen können. Die hohe zeitliche Auflösung der MEA-Aufnahmen verwendet werden, um die genauen Aktivitätsdynamik innerhalb eines bestimmten neuronalen Schaltkreis zu rekonstruieren. Zusätzlich, im Gegensatz zu Patch-Clamp die Technik ist nicht-invasiv, was Langzeitmessungen und führt zu der Tatsache, daß Neuronen in ihrem Verhalten nicht beeinträchtigt ermöglicht.
Foder das Ziel dieser Studie war die Kombination von organotypischen Rückenmarks Kokulturen und auf mehrere Aufnahmen wurde zur funktionellen Regeneration innerhalb des Rückenmarks zu untersuchen. Seit Erwachsenen höheren Wirbeltieren haben Potenzial, sich nach Schäden des Rückenmarks beschränkt erholen, haben unterschiedliche Strategien untersucht, um die Regeneration nach Verletzungen des Rückenmarks zu fördern. Bisher hat sich die Pyramidenbahn in der Regel für solche Untersuchungen war die Modellsystem der Wahl. Diese Experimente sind in der Regel zeitaufwendig, teuer und erfordern große Tier Kohorten aufgrund der hohen Variabilität innerhalb einzelnen Gruppen. Darüber hinaus Hinweise darauf, dass propriospinale Anschlüsse (Neuronen, die vollständig innerhalb des Rückenmarks beschränkt sind) können eine entscheidende Rolle bei der Wiederherstellung nach Rückenmarksverletzungen 8 zu spielen. Diese Fasern lassen sich nur schwer in vivo ohne die Einmischung und absteigenden Faserbahnen zu untersuchen. Bonnici und Kapfhammer 9 verwendet LängsrückenmarksSchnittkulturen der postnatalen Mäusen als alternativer Ansatz. Nach der Durchführung mechanische Läsionen sie analysiert semiquantitativ die morphologische Regeneration von Axonen zwischen Rückenmarksegmente. Sie beobachteten, weniger, aber nicht keine Axone Querung der Läsion in in einem reifen Alter schneiden Kulturen. Im Gegensatz dazu Kulturen, die in einem jüngeren Stadium lädierten wurden angezeigt, eine hohe Menge an axonale Regeneration 5-7 Tage nach der Beschädigung. Allerdings Beweis für funktionelle Verbindungen wurde nicht vorgelegt.
Daher kann die Entwicklung eines Vertreters in vitro-Modell der propriospinale Fasern, die die Untersuchung der funktionalen Regeneration kann ein wertvolles Werkzeug, um das Wissen über Regenerationsprozesse im Rückenmark zu verlängern.
Protocol
Tierpflege war in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Schweizer Gemeinden (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, Veterinärdienst, Sekretariat Tierversuche, Zulassungs Nrs. 52/11 und 35/14) genehmigt. Diese Richtlinien sind in Übereinstimmung mit der Europäischen Gemeinschaft die Richtlinie 2010/63 / EU.
Hinweis: Arbeiten Sie in einer Sterilbank mit sterilen Instrumenten und Lösungen für alle Schritte 1-5 einschließlich Teilschritte.
1. Herstellung von MEAs
Hinweis: MEAs werden aus einem Glassubstrat, Mikro-Metallelektroden und einer SU-8-Polymer-Isolationsschicht zusammengesetzt ist (siehe auch Tscherter et al. 3). Für die Zwecke dieser Studie wurden die im Handel erhältlichen MEAs mit einer angepassten Elektrodenarray layout (Figur 1 A und B) angeordnet. Die 68 Elektroden sind in einem rechteckigen Raster, die durch eine 300 um breite Rille frei von Elektroden, Strom in zwei Zonen aufgeteilt ist angeordnet,iCal Leitungen und Isolierung. Jede Elektrode ist 40 x 40 & mgr; m groß und sie sind um 200 & mgr; m von Mitte zu Mitte beabstandet. Vier große Masseelektroden sind um die Aufnahmestelle positioniert. Sie unterscheiden sich von anderen im Handel erhältlichen Standard-MEAs in ihrer Größe (21 mm x 21 mm) und sie haben keine feste Aufnahme Kammer haben.
- Desinfektionsspülung MEAs in 100% Ethanol (2x), 70% Ethanol (1x) und destilliertem Wasser (2x) für jede von mindestens 30 sec. Trocknen lassen. Setzen 10-12 MEAs in einem sauberen Glas-Petrischale (150 mm x 25 mm) und den Deckel schließen.
- MEAs Autoklaven für 20 min bei 120 ° C. Lagern bei RT.
- Bereiten Sie die Beschichtungslösung (siehe Materialliste) für die MEAs und speichern Aliquots bei -20 ° C.
- Setzen jedes MEA in einem Individuum sterile Petrischale (35 mm x 10 mm).
- Verwenden Sie einen gekühlten Pipette 150 ul gekühlte Beschichtungslösung an der Spitze der Elektroden gelegt und schließen Sie den Deckel der Petrischale. Nach etwa 10 min, überprüfen Sie Luftblasen auf der Oberseitedie Elektroden und sanft entfernen sie mit einer gummibeschichteten Spatels falls erforderlich. Ruhen lassen für 1 h bei RT.
- Absaugen Beschichtungslösung Rückstände, waschen 1x mit Medium für pränatale und embryonalen Neuronen und 2x mit destilliertem, sterilem Wasser optimiert. Wenn MEAs sind nicht bis zum nächsten Tag verwendet, bewahren Sie sie in destilliertem, sterilem Wasser bei 37 ° C im Brutschrank O / N. Ansonsten lassen Sie bei RT direkt trocken.
2. Zutaten für die Zubereitung und das Wachstum von organotypischen Kulturen Erforderlich
- Bereiten calciumfreien Waschlösung (siehe Materialliste).
- Rekonstituieren Hühnerplasma in Waschlösung (1: 1, leicht schütteln, Blasenbildung zu vermeiden), Zentrifuge bei 3.000 × g für etwa 20 min und dekantiert die klare Inhalte in einem sterilen Röhrchen. Aliquot 200 ul in Kryoröhrchen und bei -20 ° C.
- Rekonstituieren Thrombin aus Rinderplasma entsprechend (200 U / ml) und steril-Filter (0,2 um Porenfilter). Aliquot 200 ul in crytotubes und bei -20 ° C.
- 30 Kulturen vorzubereiten 100 ml Nährmedium (siehe Materialliste).
3. Rückenmarksgewebe Dissection
Anmerkung: Verfahren liefert in Abhängigkeit von der Anzahl der Embryonen, Rückenmarksschnitten für etwa 25 - 35 Co-Kulturen und im Inneren einer Haube mit laminarer Strömung unter sterilen Bedingungen hergestellt.
- Wenden eine letale Dosis von Pentobarbital (0,4 ml) mit dem Muttertier durch intramuskuläre Injektion. Bestätigen tiefer Narkose durch Überprüfung der Pedalrückzugreflex. Geben E14 Rattenembryonen durch Kaiserschnitt und Opfer durch Enthauptung.
- Übertragen Sie die Leichen der Embryonen in eine Petrischale mit sterilem, gekühlt, Waschlösung gefüllt.
- Führen Sie eine vollständige Querschnitt mit einem Skalpell über die Hinterbeine und ein weiteres über die Vorderbeine und die Gliedmaßen aus dem Körper zu entfernen. Als nächstes stellen Sie einen Schnitt in der Frontalebene, um Eingeweide aus dem Rückenteil mit dem Rücken Co trennenrd.
- Zum Schneiden, übergeben die Rückenteile, die das Rückenmark eine zu einem Zeitpunkt auf einer Montageplatte und in einer Dicke von 225 geschnitten - 250 um mit einem Gewebe-Chopper. Einen Tropfen Waschlösung auf dem gehackten Gewebe und übertragen Scheiben mit einem Spatel in 35 mm x 10 mm Petrischalen mit sterilen, gekühlt, Waschlösung gefüllt.
- Für jede Scheibe einzeln, sezieren Rückenmark vom übrigen Gewebe. Lassen Dorsalwurzelganglien angebracht.
- Lassen Sie die Scheiben ruhen für 1 h bei 4 ° C.
4. Montage Rückenmarksgewebe-Scheiben auf MEAs
- Warm up sterilem Nährmedium in den Inkubator (37 ° C, leicht abgeschraubt Deckel für die Sauerstoffversorgung).
- Position MEA mit einer sterilen Pinzette mit gummibeschichteten Spitzen bei RT in der Petrischale unter einem Stereomikroskop mit der Elektrodenanordnung im Fokus. Mitte ein 6 ul Tropfen Hühnerplasma auf der sauberen, staubfreien und sterilen Elektroden-Array. Mit einem kleinen Spachtel, Schiebenzwei Rückenmarkschnitte ventralen einander zugewandten Seiten in das Plasma Tröpfchens. Die Elektroden nicht berühren, mit dem Spatel.
- In 8 ul Thrombin um das Huhn Plasmatropfen. Unter Verwendung des Thrombin-Pipettenspitze, sorgfältig zu mischen und verteilen Sie das Huhn Plasma / Thrombin-Gemisch um die beiden Scheiben. Auch nicht die spröde Elektrodenanordnung berühren direkt. Kurz vor der Koagulation, saugen Sie die überschüssige Hähnchen Plasma / Thrombin.
- Kappe der Petrischale mit hoher Luftfeuchtigkeit zu halten, während die MEA / Kultur Anordnung sitzt etwa 1 Stunde in einer feuchten Kammer im Inkubator bei 37 ° C.
- 10 & mgr; l Nährmedium sorgfältig auf die Kulturkammer hinzuzufügen, Kappe der Petrischale und wieder in den Inkubator für ca. 30 min.
- Platzieren Sie jede MEA / Kultur Montage mit sterilem, gummierten Spitzen in eine Wickelrohr, 3 ml Nährmedium und fest den Deckel schließen. Die Walze Rohr im Walzentrommeldreh einem 1 - in einem 5% CO 2 im Brutschrank rpm
- Ändern Hälfte des Nährmediums nach 7 Tagen in vitro (DIV) und anschließend 1 bis 2 mal pro Woche.
5. Mechanische Läsionen
- Nehmen Sie die MEA / Kultur Montage mit sterilem, gummierte Tipps aus dem Wickelrohr und in eine Petrischale ohne Nährmedium unter einem Stereomikroskop mit dem Gewebe im Fokus. Visuell überprüfen, ob die zwei Scheiben verschmolzen sind.
- Halten Sie die MEA / Kultur, indem Pinzette mit gummierten Spitzen auf dem MEA Montage stabil.
- Platzieren einer Skalpellklinge in der Nut der MEA nahe der Gewebeschnitt. Halten Sie das Skalpell und nicht horizontal.
- Heben Sie das Skalpell Griff nach oben, aber lassen Sie die Skalpellklinge bleiben in der Nut der MEA in der Weise, dass die Klinge "rollt" von der Basis bis zur Spitze und schneidet dabei durch die für den Nut Gewebe.
- Schwere irgendwelche Restgewebeverbindungen mit einer 25 G Nadelspitze, wenn necessary. Nur Arbeit auf dem Gebiet innerhalb der Nut und die Ausschreibungsunterkanten nicht berühren.
- Setzen Sie den MEA / Kultur Baugruppe wieder in die Tuchwelle. Geben Sie 3 ml frischem Nährmedium zu den Kulturen und legen Sie sie zurück in die Bandage im Inkubator.
6. elektrophysiologischen Ableitungen der Spontanaktivität
- Um funktionelle Regeneration zwischen den beiden Rückenmarksscheiben nach der gewählten Anzahl der DIV zu untersuchen, montieren Sie die MEA / Kultur Anordnung in einer Aufnahmekammer auf einem Mikroskop und gelten etwa 500 & mgr; l extrazellulären Lösung (siehe Materialliste).
- Warten 10 min vor der ersten Aufnahme zu ermöglichen, das System zu stabilisieren.
- Rekordgrund spontane Aktivität 2x ca. 10 min von jeder Aktivität-Erfassungselektrode der MEA bei RT.
- Um stabile extrazellulären Bedingungen zu gewährleisten, tauschen extrazellulären Lösung nach jeder Aufnahme-Session.
- Um die Netzwerk enthemmen gelten extrazellulären Lösung containing Strychnin (1 uM) und Gabazin (10 uM). Warten für mindestens 2 min vor Beginn der Aufzeichnung.
7. Datenanalyse
Anmerkung: Für die Erfassung der aufgezeichneten Aktionspotentiale extrazellulär verwenden für jede Elektrode einen Detektor der Basis von Standardabweichungen und einem anschließenden Unterscheider. Dieses Verfahren ist im Detail in Tscherter et al. 3.
- Zeigen Sie den detektierten neuronalen Aktivität jeder Elektrode in einem Raster-Plot nach Standardverfahren 3 (1F).
- Ermitteln Sie und zeigen Sie die Gesamtnetzwerkaktivität für jede Scheibe durch Addition der Anzahl der Ereignisse in den nach Kanälen innerhalb eines Schiebefensters von 10 ms, von 1 ms Schritten verschoben (1G und sehen Tscherter et al. 3).
- Erkennen in jeder Scheibe einzelnen Bursts (Cluster von Wirtschaftszweigen, die auf mehreren Elektroden angezeigt). Deshalb, Stellen eine minimale Spitzenaktivitätsschwelle in der entsprechenden Gesamtnetzwerkaktivität und definieren jeden Burst-Start-und Burst-Ende. Zum Beispiel ist ein geeigneter Schwellenwert von 25% des durchschnittlichen Burstamplitude und eine Burst-Start kann, indem sie die erste Veranstaltung in einem Zeitfenster von mindestens 5 ms, ein Burst-Ende festgelegt werden, indem das letzte Ereignis in einem Zeitfenster von mindestens 25 ms (siehe Heidemann et al. 10).
- Zur Quantifizierung funktionelle Regeneration Berechnung des Prozentsatzes der Bursts synchronisiert zwischen den beiden Scheiben. Um dies zu tun, die Berechnung der Wartezeit zwischen einem Burst in einer Schicht und der folgenden Burst in der anderen Scheibe.
Hinweis: Ein Burst-Paar wird als "synchronisiert", wenn die Wartezeit kleiner als die durchschnittliche Burst-Länge. Insbesondere in Co-Kulturen mit einer Menge der Aktivität, besteht die Möglichkeit, dass beide Seiten übereinstimmend initiieren einen Burst in der gewählten Latenz Fenster. Diese Tatsache muss bei der Quantifizierung des Prozentsatzes von sy berücksichtigt werdennchronized platzt. Für eine detaillierte Beschreibung der Berechnungen siehe Heidemann et al. 10.
8. Die Fixierung der Kulturen und Immunhistochemie
- Für alle Schritte, die Wasch- oder Inkubation sind Sie sicher, dass die Kulturen auf einem Kipptisch gelegt, um die ordnungsgemäße Diffusion der Lösung durch das Gewebe zu gewährleisten.
- Direkt nach der Aufnahme-Session beendet ist nehmen Sie die MEA / Kultur Baugruppe aus dem Setup, steckte es in eine Petrischale (35 mm x 10 mm), und fügen Sie ca. 2 ml extrazellulären Lösung.
- Um die Scheiben aus den umliegenden Zellschichten, die während der Zeit, in vitro gebildet haben, zu trennen, werfen Sie einen 10 ul Pipettenspitze und kreisen Sie die Scheiben. Achten Sie nicht auf die Kulturen schädigen. Es ist möglich, diesen Schritt zu verzichten, aber die Einbettung später ist einfacher, wenn es ausgeführt wird.
- Verwenden Sie einen dünnen nichtmetallischen Spritzennadel (siehe Materialliste) in Kombination mit einer 1 ml Spritze mit extrazellulären soluti gefülltauf, um sanft zu blasen, die Kultur von der MEA.
- Entfernen Sie die Spitze einer Pasteur-Pipette und setzen Sie den Gummiball auf dem slivered Ende. Verwenden das hintere Ende, um die Kultur in Fixierlösung (4% Paraformaldehyd mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, 0,1 M)) zu übertragen. Verwenden Sie nicht die Standard-Spitze des Pasteur-Pipette für die Übertragung, weil es zu klein ist und die Kulturen würde gefaltet werden und wahrscheinlich beschädigt. Fix für 1-2 h bei 4 ° C. Spülen Sie die MEA mit destilliertem Wasser, und entfernen Sie Gewebereste mit den Fingerspitzen, aber nicht mit dem Nagel zu kratzen. Shop MEAs in destilliertem Wasser bei 4 ° C
- Für jeden mindestens 10 min 3x Waschen Sie die Kulturen in PBS. Speichern in PBS bei 4 ° C oder direkt mit dem Färbungsverfahren zu starten.
- Die Kulturen für mindestens 90 min in Blockierlösung (5% Ziegenserum, 1% Rinderserumalbumin, 0,3% Detergens in PBS) inkubiert.
- Fügen Sie den ersten Antikörper in Blockierungslösung verdünnt und Inkubation für 3 Nächte bei 4 ° C.
- Waschen 3x in PBS bei löstlich je 30 min.
- Hinzufügen des zweiten Antikörpers in PBS für 2 h bei RT verdünnt.
- Waschen 3x in PBS für jeweils mindestens 30 min.
- Übertragen Sie die Scheiben mit einer Pasteurpipette mit entfernten Spitze auf einem Objektträger. Entfernen Sie überschüssiges PBS und betten mit Eindeckmedium.
Representative Results
Um das Potential für die funktionelle Wiedergewinnung der Co-Kulturen aus dem Rückenmark von E14-Rattenembryos abgeleiteten untersuchen, wurden Läsionen in einem Zeitfenster von 8-28 DIV geführt. 2 bis 3 Wochen später wurde die spontane neuronale Aktivität mit den MEAs (Abbildung 1 C & D) aufgezeichnet. Extrazellulär erfasst Aktionspotentiale offline für jede einzelne Elektrode (1E) identifiziert. Aus diesen Daten Raster Parzellen wurden erzeugt (1F), gefolgt von der Netzwerkaktivität Stücke zur Gesamtaktivität separat pro Seite (1G) zu visualisieren. In jeder Scheibe die spontane Aktivität ist in der Regel in Bursts organisiert. Wenn die Scheiben funktional verbunden ist, können diese Ausbrüche von einer Scheibe auf die andere ausbreiten kann. Daher kann die Menge der synchronisierten Bursts zwischen den beiden Scheiben wurde berechnet, um quantitativ zu messen funktionalen Regeneration. Für eine detaillierte Beschreibung, wie die Transformation into die verschiedenen Grundstücke durchgeführt wird und wie die Formel für die Berechnung des Prozentsatzes der synchronisierten Aktivität wurde abgeleitet, finden Sie Heidemann et al. 10.
In allen Experimenten wurde die Aktivität zuerst bei Normalbedingungen aufgezeichnet. In einem zweiten Schritt wurde die synaptische Inhibition durch Zugabe von Strychnin (1 uM) und Gabazin (10 uM) an die extrazelluläre Badlösung blockiert. Diese Enthemmung führt meist zu einer regelmäßigen Aktivitätsmuster mit einer längeren Bursts und Burst-Intervallen, die der Definition von Bursts und damit die Bestimmung der Burst-Synchronisation zwischen den Scheiben erleichtert.
Kulturen in einem jungen Alter läsionierten (7-9 DIV) zeigte einen hohen Anteil von synchronisierten Aktivität 2-3 Wochen nach der Läsion wohingegen Kulturen, die bei späteren Stufen (> 19 DIV) zeigten eine deutliche Reduktion der Fähigkeit zur Regeneration (Abbildung 2 A läsionierten - F). Diese Befunde zeigen, dass die Fähigkeit zur Regenerationvon funktionellen Verbindungen im Rückenmark Schnittkulturen nimmt von einem hohen Niveau, die den embryonalen Zustand in vivo, auf einem niedrigen Niveau, die die weiterentwickelten Zustand in vivo innerhalb von drei Wochen in der Kultur.
Welche Arten von Verbindungen werden tatsächlich platzen Synchronisation zwischen den beiden Scheiben beteiligt? Neben propriospinale Verbindungen könnten die Fasern auch aus Motoneuronen oder Dorsalwurzelganglionneuronen auftreten. Es wurde zuvor gezeigt, dass Dorsalwurzelganglionneuronen sind für die funktionelle Konnektivität relevant zwischen dem Rückenmark 10 schneidet. , Die Beteiligung von Motoneuronen blieb jedoch eine Möglichkeit. Da Motoneuronen ist bekannt, dass cholinerge Verbindungen zum Rückenmarksneuronen durch Nikotinrezeptoren 13 zu bilden, wurde die Aktivität von Rückenmarks Kokulturen auf 8 DIV, eine Zeit, wenn die Kulturen zeigen sehr synchronisierten Aktivität 10 und nikotinischen Antagonisten Mecam zeichnetenylamin (MEC, 100 & mgr; M) wurde zu der extrazellulären Badlösung zugesetzt. Eine Beteiligung von Motoneuronen in der Verbindung zwischen den beiden Schichten würde zu einem verminderten Anteil an synchronisierten Aktivität. Dies war jedoch nicht der Fall (MEC: 91,0 ± 4,5%, n = 7; Kontrolle: 93,6 ± 4,6%, n = 7, p> 0,05, Wilcoxon abgestimmte Paare Test). Diese Ergebnisse legen nahe, dass cholinergische Synapsen nicht auf die funktionelle Verbindung zwischen den Schichten bei. Da jedoch Motoneuronen haben auch gezeigt, daß Glutamat an Synapsen im ZNS 11, 15 freizugeben, diese Versuche nicht ganz ihre Beteiligung auszuschließen.
Mit SMI-32 wurden durchgeführt, zu identifizieren Motoneuronen Immunhistochemie gegen den nicht phosphorylierten Neurofilament H. Sie zeigte mehrere markierte großen Zellkörper typisch für Motoneuronen, über die Scheiben (3A) verteilt. Der SMI-32-Antikörper wurde berichtet, dass die Zellkörper der motoneuro beschriftenNS 12 und diese Feststellung gilt auch für die verwendeten Kulturen 13. Auch Färbungen von neuronalen Zellkörpern im Allgemeinen, zB gegen b-III-Tubulin oder NeuN sowie Glia-Zellkörpern, z. B. Astrozyten mit GFAP-Antikörper sind im Einklang mit anderen Berichten und passen Sie die morphologischen Beschreibungen dieser Zelltypen ( Abbildung 3 B - D). Dennoch ist die Kennzeichnung von Axonen mit dem SMI-32-Antikörper zur (3E). Entgegen den Erwartungen, erscheint ein großes Netzwerk von Fasern bei der Verwendung dieses Antikörpers und es ähnlich wie die SMI-31-Färbung, die phosphoryliert Neurofilament H (3F) Etiketten aussieht. Eine Interpretation dieses Ergebnisses möglich, dass der Entwicklungsregulation von Neurofilament-Phosphorylierung / Dephosphorylierung ist nicht so eng in den verwendeten Kulturen im Vergleich zu der in vivo-Situation. Eine gemischte Auftreten von phosphoryliertem und nicht-phosphoryliertem Neurofilamenten in derselben Axon Expl konnteain diese Feststellung. Eine andere Möglichkeit ist, dass die SMI-32 markierte Axone entstehen aus Projektionsneuronen. Tsang und seine Kollegen 16 haben gezeigt, dass beispielsweise gezeigt, sind Clarks Säule und intermediolateralen Zellenspalte Neuronen durch SMI-32 neben Motoneuronen gefärbt. Ausgesprochen Neuriten Verbreitung solcher Neuronen könnte auch erklären, die Fülle der SMI-32-positive Fasern.
Abbildung 1. Darstellung und Analyse der Spontanaktivität. (A) Schematische Darstellung eines MEA. Die Platinelektroden abgedeckt sind schwarz, die transparenten Adern in rot und die Nut in der Mitte der MEA in gelb dargestellt. (B) Close-up der Elektrodenanordnung in der Mitte der MEA befinden. Die Diagramme werden freundlicherweise von Dr. M. Heuschkel vorgesehen. (C) Hellfeldbild eines 8 DIV alten culture. Die Scheiben sind gewachsen und entlang den einander zugewandten Seiten fusioniert. Der gelbe Balken steht für die Elektroden- und Isolationsfreie Nut des MEA. Maßstabsbalken = 400 & mgr; m (D) Timeline von Experimenten. Zwei Rückenmarksscheiben E14-Rattenembryos sind nebeneinander auf MEAs angeordnet. Innerhalb von wenigen Tagen, die Scheiben zu wachsen und die Sicherung entlang der Seiten einander zugewandt sind. In einem Zeitrahmen von 8-28 DIV werden komplette Läsionen durch die Fusionsstelle durchgeführt. Zwei bis drei Wochen später wurde die spontane Aktivität wird aufgezeichnet, und die Kulturen werden für immunhistochemischen fixiert. (E) spontane Aktivität Spuren einer jeden individuellen Elektrode einer 23 DIV alte Kultur. Zur besseren Visualisierung wird nur jede zweite Spur dargestellt. Orange Spuren zeigen Aktivität, die von der Scheibe auf der rechten Seite aufgezeichnet worden ist, blau Spuren von der linken Seite. Die meisten der Bursts zwischen beiden synchronisiert. Der Pfeil zeigt auf einen Burst in der linken Scheibe, dass nur p auftretenartially nach rechts Scheibe propagiert. Die Aktivität in der rechten Scheibe hat jedoch nicht den gewählten Schwelle zu erreichen von zumindest 25% des gemittelten maximalen Spitzenaktivität des entsprechenden Seite und ist daher nicht als ein Burst detektiert wird. Vergrößerungen auf der rechten Seite zeigen die zuletzt synchronisierten Burst-pair. (F) Raster Handlung des in (E) gezeigt, Aktivität. (G) Netzwerkaktivität Grundstück mit definierten Bursts (Balken unter den Ausgangswert) des in (E) gezeigt, Aktivität. Von Heidemann et al. 10 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Synchronisierte gegenüber nicht synchronisiert Aktivität. (A, B) Raster Grund Kulturen lesioned in jungen Jahren (bei 7-9 DIV), welche synchronisiert Aktivität unter Standardbedingungen (A) und unter Enthemmung (B). (C, D) Raster Grund Kulturen im hohen Alter (bei> 19 DIV) verletzten, zeigt nicht synchronisiert Aktivität unter Standardbedingungen (C) und unter Enthemmung (D). (E, F) Mittlerer Prozentsatz der synchronisierten Aktivität aufgetragen für jede einzelne Läsion Tage unter Standardbedingungen (E) und unter Enthemmung (F) aufgezeichnet. 3 Wochen nach dem Tag der Läsion - Aufnahmen wurden 2 aufgenommen. Von Heidemann et al. 10 angepasst. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Fild 3. Immunhistochemische Charakterisierung. (A) Färbung von motoneuralen Zellkörper mit SMI-32. (B) β-III-Tubulin-Kennzeichnung von reifen neuronalen Zellkörpern und deren Prozesse. (C) Identifizierung von Astrozyten mit GFAP. (D) Markierung von reifen Nervenzellkörper mit NeuN. (E) SMI-32-Färbung von nicht phosphorylierten Neurofilament H (F) Phosphorylierte Neurofilament H durch SMI-31 identifiziert. Von Heidemann et al. 10 angepasst. Man beachte, dass sowohl mit SMI-31 und SMI-32, ein großes Netzwerk von Fasern in den Kulturen sichtbar. Bars AD = 20 & mgr; H & F = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
Mehrere Elemente in der angegebenen Verfahren sind von grundlegender Bedeutung für die Durchführung von genauen und reproduzierbaren Experimenten. Alle Schritte bei der Herstellung der MEAs, Lösungen und die Herstellung der Scheibe Kulturen werden unter sterilen Bedingungen in einer Sterilbank durchgeführt. Antibiotika werden nicht zu dem Nährmedium angewendet werden, weil sie die spontane Aktivität 14 beeinflussen können. Während der MEA-Beschichtung, der wichtigste Teil ist, um sicherzustellen, dass die extrazelluläre Matrix-Gel-Lösung bleibt kalt zu allen Zeiten. Tauwetter in den Kühlschrank und halten Sie sie auf Eis für das gesamte Verfahren, um eine maximale Temperatur von etwa 0 ° C zu gewährleisten. Während der Vorbereitung der Scheiben schnelle Isolierung und Schnitte sowie die Aufmerksamkeit auf einer niedrigen Temperatur unter Verwendung von eiskaltem Dissektion Puffer erhöht den Prozentsatz der gesunden Kulturen. Darüber hinaus ist die Plasma / Thrombin-Gerinnungs einer der kritischen Schritte. Stellen Sie zunächst sicher, dass das Plasma ist richtig mixed mit dem Thrombin. Zweitens, ein besonderes Augenmerk auf die Beseitigung so viel Rückstand wie möglich, um die ordnungsgemäße Befestigung der Scheiben zu den MEAs zu gewährleisten. Dieser Schritt ist äußerst zeitempfindlich; wenn der Zeitraum zu kurz ist, zu viel von dem Plasma / Thrombin-Mischung entfernt wird. Wenn der Zeitraum zu lang ist, die Koagulation bereits geschehen, wodurch das Risiko des Entfernens der Scheiben zusammen mit dem Restplasma / Thrombin.
Wenn mechanische Läsionen geplant sind, ist es wichtig, MEAs mit einer genauen Design zu verwenden. Der Bereich, in dem die Läsion soll muss frei von Elektroden, Drähte und Isolation zu sein. Andernfalls werden die Elektrik der MEA geht, beschädigt zu werden, und daher kann keine Aufnahmen mehr durchgeführt werden.
Ein weiterer entscheidender Schritt betrifft die Größe der Läsion. Es wurde bereits früher, dass der Wiederverbindung zwei junge Scheiben nach Läsion dauert etwa zwei Tage 10 gezeigt worden. Bei allen Versuchen wurde die Faustregel, dass der Raum betwe verwendeten der Scheiben nach der Läsion sollte nicht größer als die Breite des MEA Nut (300 & mgr; m) betragen. Eine größere Läsionsgröße könnte in einem längeren Zeitrahmen für die Wiederverbindung führen, oder, wenn die Läsion ist zu groß, keine Wiederverbindung überhaupt. Zu kommentieren, zeigte früheren Versuchen, dass eine anfängliche Platzierung der zwei Scheiben weiter als 1 mm ergibt sich eine sehr geringe Verbindungsgeschwindigkeit.
Vor Beginn der Aufnahmen einer Anpassungszeit von mindestens 10 min auf RT statt bei 37 ° C des Inkubators, und die extrazelluläre Lösung, anstelle des Nährmedium wird empfohlen. Die genaue Beobachtung des Aktivitätsmuster in diesen ersten Minuten gewährleistet, dass die Messdaten stellen den Platzen Muster der Kultur angemessen Nachdem die Aufnahme gestartet.
Für die Detektion der Aktivität, Datenerfassung und Weiterverarbeitung, hausgemachte Hardware (Aufnahmekammer, Verbindungen zu den Verstärkern und Verstärker), Programme im LabVIEW, C ++ und IgorPro verwendet. Kommerzielle MEA-Setups und andere Software-Pakete sind auch für diese Vorgänge geeignet. Hier werden die Signale von den Elektroden gesehen 1001-fach verstärkt und dann digitalisiert mit einer Rate von 6 kHz.
Das vorgestellte Modell kann ein hilfreiches Werkzeug, um propriospinale Verbindungen zu untersuchen, da in vivo, schwierig, ohne die Einmischung der auf- und absteigenden Faserbahnen zu studieren sind. Die Co-Kultivierung von zwei Rückenmarksscheiben können dieses Problem elegant zu umgehen. Die Kulturen eine Mikroumgebung, die eng gesteuert werden kann und leicht zu manipulieren. Auf der anderen Seite, ist natürlich fehlen supraspinale und sensorischen Input. Zusätzlich kann das Verfahren der Kulturansatz stellt eine Situation der ZNS-Schädigung. Gliazellen Astrozyten und Mikroglia, wie bekannt, um Läsionen mit einer erhöhten Proliferation und damit zu reagieren, wird das Gewebe in einem gewissen Ausmaß neu geordnet. Im Zusammenhang mit der vorgeModusl die Bildung einer glialen Narbe nach der Durchführung mechanische Läsionen wurde nicht beobachtet. Eine Erklärung könnte sein, dass adaptive Mechanismen Astrozyten wurden bereits während des Herstellungsverfahrens ausgelöst und Läsionen der Kulturen nicht zu einer weiteren Reaktion führen. Auch gibt es keinen Beweis für die Beteiligung von Myelin assoziierten Inhibitoren, z. B. Nogo-A, in der niedrigen Regenerationspotential der Kulturen im hohen Alter Läsion. Jedoch wurde gezeigt, dass die Behandlung mit dem Phosphodiesterase-4-Inhibitor Rolipram, beginnend unmittelbar nach der Durchführung Läsionen bei 23 DIV zunimmt funktionelle Regeneration zwischen den Scheiben 10 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, dass die funktionelle Wiederherstellung kann in alten Kulturen erhöht. Spürbar, wenn das Zählen der Anzahl von Axonen Querung der Läsion, keinen Unterschied zwischen den Kulturen in einem jungen Alter lädierten und Kulturen im hohen Alter lädierten entdeckt wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass fehlende axonale Regeneration ist nicht der Hauptgrund foder der Verlust der Erholung nach späten Läsionen in der Kultur und damit unterstreichen die Notwendigkeit für ein Modell, das die funktionelle Analyse der Regeneration ermöglicht. Synaptic Bildung und synaptische Plastizität könnte eine wichtige Rolle bei der Wiederherstellung 10 zu spielen. Diese Mechanismen gewonnen viel Aufmerksamkeit in den letzten Jahren, und es ist heute allgemein anerkannt, dass sie einen großen Einfluss auf das Ergebnis nach einer Rückenmarksverletzung zu haben. Daher kann ein Modell, das stabilen Bedingungen bietet, um diese Prozesse in Isolation und in allen Einzelheiten zu untersuchen sicherlich dazu beitragen, Erkenntnisse über funktionelle Regeneration im Rückenmark zu erhalten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
| Nutrient medium | For 100 ml | ||
| Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
| Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
| distilled, sterile water | 10 ml | ||
| Nerve growth factor-7S [5 ng/ml] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
| reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
| Coating solution | |||
| Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
| medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
| Wash solution | [mg/L] | ||
| MgCl2-6H2O | 100 | ||
| MgSO4-7H2O | 100 | ||
| KCl | 400 | ||
| KH2PO4 | 60 | ||
| NaCl | 8,000 | ||
| Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
| D-Glucose (Dextrose) | 1,000 | ||
| According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
| Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
| NaCl | 145 | ||
| KCl | 4 | ||
| MgCl2 | 1 | ||
| CaCl2 | 2 | ||
| HEPES | 5 | ||
| Na-pyruvate | 2 | ||
| Glucose | 5 | ||
| Blocking Solution | |||
| Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
| Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
| Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
| Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
| Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
| Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
| Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
| SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
| SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
| Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
| Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
| Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 | |
References
- Avossa, D., Rosato–Siri, M., Mazzarol, F., Ballerini, L. Spinal circuits formation: a study of developmentally regulated markers in organotypic cultures of embryonic mouse spinal cord. Neuroscience. 122 (2), 391-405 (2003).
- Cifra, A., Mazzone, G. L., Nani, F., Nistri, A., Mladinic, M. Postnatal developmental profile of neurons and glia in motor nuclei of the brainstem and spinal cord, and its comparison with organotypic slice cultures. Dev Neurobiol. 72 (8), 1140-1160 (2012).
- Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures. Eur. J. Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).
- Czarnecki, A., Magloire, V., Streit, J. Local oscillations of spiking activity in organotypic spinal cord slice cultures. Eur. J. Neurosci. 27 (8), 2076-2088 (2008).
- Kirkby, L. A., Sack, G. S., Firl, A., Feller, M. B. A role for correlated spontaneous activity in the assembly of neural circuits. Neuron. 80 (5), 1129-1144 (2013).
- Ballerini, L., Galante, M., Grandolfo, M., Nistri, A. Generation of rhythmic patterns of activity by ventral interneurones in rat organotypic spinal slice culture. J. Physiol. (Lond.). 517 ((Pt 2)), 459-475 (1999).
- Hanson, M. G., Landmesser, L. T. Normal patterns of spontaneous activity are required for correct motor axon guidance and the expression of specific guidance molecules). Neuron. 43 (5), 687-701 (2004).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nat. Med. 14 (1), 69-74 (2008).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model. Eur. J. Neurosci. 27 (10), 2483-2492 (2008).
- Heidemann, M., Streit, J., Tscherter, A. Functional regeneration of intraspinal connections in a new in vitro model. Neuroscience. 262, 40-52 (2014).
- Nishimaru, H., Restrepo, C. E., Ryge, J., Yanagawa, Y., Kiehn, O. Mammalian motor neurons corelease glutamate and acetylcholine at central synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (14), 5245-5249 (2005).
- Tsuji, S., et al. Proteasome inhibition induces selective motor neuron death in organotypic slice cultures. J. Neurosci. Res. 82 (4), 443-451 (2005).
- Magloire, V., Streit, J. Intrinsic activity and positive feedback in motor circuits in organotypic spinal cord slice cultures. Eur. J. Neurosci. 30 (8), 1487-1497 (2009).
- Bahrami, F., Janahmadi, M. Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture. Iran. Biomed J. 17 (2), 101-106 (2013).
- Mentis, G., et al. Noncholinergic excitatory actions of motoneurons in the neonatal mammalian spinal cord. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.. 20 (102), 7344-7349 (2005).
- Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non–phosphorylated neurofilaments: Cross– species comparison and alterations in ALS. Brain Res. 861 (45–58), (2000).
