Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על פרוסות חוט השדרה בתרבית על מערכים רב-אלקטרודה ללמוד התחדשות פונקציונלית של קשרי propriospinal במבחנה.
Introduction
תרבויות פרוסה Organotypic של מערכת העצבים המרכזית (CNS) נעשו שימוש נרחב ללמוד תופעות פיסיולוגיות ופתולוגיים שונות להגיע מפיתוח עצבי לניוון של מערכת עצבים. בהשוואה לתרביות תאים ניתק, פרוסות organotypic מציעות את היתרון של יותר מורכבות עם cytoarchitecture שלם ומעגלים הסינפטי מקומיים. במקביל, הרקמות ניתן לנתח באופן מבודד ללא הצורך לסבך את המורכבות של כל בהקשר vivo. יתר על כן, גישה קלה וחזרה לתאים של בחירה היא מוצדק, הסביבה תאית ניתן לשלוט באופן מדויק, ובדרך כלל, במבחנה דגמים פחות יקרים מאשר עמיתיהם בvivo. בשנים האחרונות, מחקרים שונים המוצגים דמיון בולט בין הפרופילים ההתפתחותי של תרבויות לטווח ארוכות לעומת בעלי החיים המקבילים החיים 1,2. הוכח כי מעגלים עצביים של מערכת העצבים המרכזית Regio השוניםNS להביע פעילות רשת ספונטנית במהלך פיתוח ושפרוסות organotypic חלקית לשמור תופעה זו 3 -7. הכנות חוט השדרה מבודדות כבר בשימוש במיוחד כדי לחקור דור קצב 6 והיווצרות של מעגלים עצביים 1.
דרך כדי להקליט את הפעילות הספונטנית של פרוסות organotypic היא תרבותם על גבי מערכים רב-אלקטרודה (MEAs). מכשירים אלה מכילים אלקטרודות מרובות שיכול לפקח על הפוטנציאל תאי שנוצר על ידי פוטנציאל פעולה ממספר רב של תאים בו זמנית (הקלטה רבת-יחידה). הרזולוציה הגבוהה הזמנית של הקלטות MEA ניתן להשתמש כדי לשחזר את דינמיקת הפעילות המדויקת בתוך מעגל עצבי נתון. בנוסף, בניגוד לתיקון-מהדקת את הטכניקה הוא לא פולשנית, המאפשר מדידות ארוכת טווח ותוצאות בעובדה שתאי עצב אינם מושפעים בהתנהגות שלהם.
Fאו מטרתו של מחקר זה, השילוב של שיתוף תרבויות חוט השדרה organotypic והקלטות מרובות אתרים שימש לחקור התחדשות פונקציונלית בתוך חוט השדרה. מאז חוליות גבוהות מבוגרות יש פוטנציאל להתאושש מנזק של חוט השדרה מוגבלת, אסטרטגיות שונות נחקרו לקידום התחדשות לאחר פגיעה בחוט השדרה. עד כה, בדרכי corticospinal יש בדרך כלל היו מערכת המודל של בחירה לחקירות כאלה. ניסויים אלה הם בדרך כלל זמן רב, יקר ודורשים קבוצות בעלי חיים גדולות בשל שונות גבוהות בתוך קבוצות יחידה. יתר על כן, ראיות מצביעות על כך שקשרי propriospinal (נוירונים שכלואים לגמרי בתוך חוט השדרה) יכולים לשחק תפקיד מרכזי בתהליך ההתאוששות הבא נגעים בחוט השדרה 8. סיבים אלו הם קשים ללמוד in vivo ללא ההתערבות של עולה ויורדים שטחי סיבים. Bonnici ו -9 Kapfhammer משמשים חוט השדרה אורךתרבויות פרוסה של עכברים לאחר לידה כגישה חלופית. לאחר ביצוע נגעים מכאניים הם ניתחו חצי כמותית התחדשות מורפולוגי של אקסונים בין מגזרי חוט השדרה. הם נצפו אקסונים אף פחות אך לא חוצים את אתר הנגע בתרבויות לחתוך בגיל בוגר. לעומת זאת, תרבויות שlesioned בשלב צעיר מוצגות כמות גבוהה של התחדשות axonal 5 - 7 ימים לאחר הפגיעה. עם זאת, הוכחה לקשרים פונקציונליים לא הוצגה.
לכן, הפיתוח של נציג במודל חוץ גופית של סיבי propriospinal המאפשר החקירה של התחדשות פונקציונלית יכול להיות כלי רב ערך ללהרחיב את הידע שלנו על תהליכי התחדשות בחוט השדרה.
Protocol
טיפול בבעלי חיים היה בהתאם להנחיות שאושרו על ידי הרשויות שוויצריים המקומיות (AMT für Landwirtschaft und Natur des Kantons ברן, Veterinärdienst, Sekretariat Tierversuche, NRS אישור. 52/11 ו35 / 14). הנחיות אלה הן בהסכם עם הדירקטיבה האירופית הקהילה 2010/63 / האיחוד האירופי.
הערה: עבודה בזרימה למינרית עם מכשירים ופתרונות סטרילי לכל השלבים 1 - 5, כולל תת-שלבים.
1. הכנת MEAs
הערה: MEAs מורכב ממצע זכוכית, אלקטרודות מתכת-מפוברק מיקרו ושכבת בידוד פולימר SU-8 (ראה גם Tscherter et al 3.). לצורך מחקר זה, MEAs זמין מסחרי נצטוו עם פריסת מערך אלקטרודות מותאמת אישית (איור 1 וארוחת בוקר). 68 אלקטרודות מסודרות ברשת מלבנית שמחולקת לשני אזורים על ידי חריץ רחב 300 מיקרומטר חופשי של אלקטרודות, חשמלמוביל iCal ובידוד. כל אלקטרודה היא 40 x 40 מיקרומטר בגודל והם במרווחים על ידי 200 מיקרומטר ממרכז למרכז. ארבע אלקטרודות קרקע גדולות מוצבות מסביב אתר ההקלטה. הם שונים מMEAs הסטנדרטי זמין מסחרי האחר בגודלם (21 מ"מ x 21 מ"מ) ואין להם תא הקלטה קבוע.
- לMEAs שטיפת חיטוי באתנול 100% (2x), 70% אתנול (1x) ומים מזוקקים (2x) לפחות 30 שניות כל אחד. בואו יבש. שים 10 - 12 MEAs בצלחת פטרי זכוכית נקייה (150 מ"מ x 25 מ"מ) ולסגור את המכסה.
- MEAs החיטוי במשך 20 דקות ב 120 מעלות צלזיוס. אחסן בRT.
- הכן את פתרון הציפוי (ראה רשימת חומרים) לMEAs וaliquots החנות ב -20 ° C.
- לשים את כל MEA בצלחת פטרי בודד סטרילי (35 מ"מ x 10 מ"מ).
- השתמש פיפטה מקוררת לשים 150 פתרון ציפוי μl מצונן על גבי אלקטרודות ולסגור את המכסה של צלחת פטרי. לאחר כ -10 דקות, לבדוק בועות אוויר על גביאלקטרודות ועדינות להסיר אותם עם מרית גומי מכוסה במידת צורך. בואו שאר עבור שעה 1 ב RT.
- שאריות פתרון ציפוי לשאוב, לשטוף 1x עם המדיום מותאם לטרום לידתי ונוירונים עובריים ו2x עם מים מזוקקים, סטרילי. אם MEAs אינו משמש עד למחרת, לשמור אותם במים מזוקקים, סטרילי על 37 מעלות צלזיוס בחממת O / N. אחרת, בואו ישירות יבש ב RT.
2. מצרכים דרושים להכנת והצמיחה של תרבויות Organotypic
- הכן פתרון לשטוף ללא סידן (ראה רשימת חומרים).
- מחדש פלזמה עוף בפתרון לשטוף (1: 1, ללחוץ בעדינות, למנוע היווצרות של בועות), צנטריפוגות ב -3,000 XG במשך כ 20 דקות ולמזוג את התוכן ברור לתוך צינור סטרילי. Aliquot 200 μl לcryotubes ולאחסן ב -20 ° C.
- מחדש תרומבין מפלסמת שור בהתאם (200 U / ml) וסטרילי-מסנן (פילטר 0.2 מיקרומטר הנקבובית). Aliquot 200 μl לcrytotubes ולאחסן ב -20 ° C.
- במשך 30 תרבויות להכין של מדיום מזין 100 מיליליטר (ראה רשימת חומרים).
Dissection רקמות 3. חוט השדרה
הערה: תשואות נוהל, בהתאם למספר העוברים, פרוסות חוט השדרה לכ -25 - שיתוף תרבויות 35 ומוכן בתוך הזרימה למינרית בתנאים סטריליים.
- החל מנה קטלנית של (0.4 מיליליטר) pentobarbital לבעלי חי אם על ידי זריקה תוך שרירית. לאשר הרדמה עמוקה על ידי בדיקת רפלקס נסיגת דוושה. לספק עוברי עכברים E14 בניתוח קיסרי והקרבה על ידי עריפת ראש.
- העבר את גופותיהם של העוברים בצלחת פטרי מלאים בתמיסה סטרילית, מצוננת, לשטוף.
- לבצע קיצוץ רוחבי מלא אחד עם אזמל מעל hindlimbs ועוד אחד מעל forelimbs ולהסיר את האיברים מן הגוף. בשלב הבא, לעשות חתך במישור הפרונטלי להפריד קרביים מהחתיכה מכילה שיתוף השדרה בחזרהRD.
- לחיתוך, להעביר את החתיכות בחזרה מכילות את חוט השדרה אחד בכל פעם על דיסק התקנה ולחתוך בעובי של 225-250 מיקרומטר עם מסוק רקמות. לשים טיפה של פתרון לשטוף ברקמה הקצוצה ולהעביר פרוסות עם מרית ב -35 מ"מ צלחות פטרי x 10 מ"מ מלא פתרון סטרילי, צונן, לשטוף.
- לכל פרוסה בנפרד, לנתח חוט השדרה מנותר רקמה. השאר גרעיני שורש הגבי מצורפים.
- בואו פרוסות לנוח במשך שעה 1 ב 4 מעלות צלזיוס.
4. הרכבה פרוסות רקמת חוט השדרה על MEAs
- להתחמם בינוני מזין סטרילי בחממה (37 ° C, קל פתח מכסה לחמצון).
- MEA עמדה עם פינצטה סטרילי עם טיפים מכוסים גומי ב RT בצלחת פטרי תחת מיקרוסקופ סטריאו עם מערך אלקטרודות בפוקוס. מרכז אגל 6 μl של פלזמה עוף במערך אלקטרודות הנקי, ללא אבק, וסטרילי. בעזרת מרית קטנה, בזהירות להחליקשני חלקי חוט השדרה עם צדדים הגחון מול זה לתוך אגל הפלזמה. אל תיגעו באלקטרודות עם המרית.
- הוסף 8 μl של תרומבין סביב אגל הפלזמה עוף. באמצעות קצה פיפטה תרומבין, לערבב בזהירות ולהפיץ את תערובת הפלזמה / תרומבין העוף סביב שתי פרוסות. שוב, אין לגעת במערך אלקטרודות השביר ישירות. רק לפני הקרישה, לשאוב פלזמה עודפת / תרומבין עוף.
- מכסה את צלחת פטרי כדי לשמור על לחות גבוהה ואילו ההרכבה MEA / התרבות יושבת במשך כשעה 1 בתא humidified בתוך החממה על 37 מעלות צלזיוס.
- בזהירות להוסיף 10 μl של מדיום מזין לתא התרבות, מכסה את צלחת פטרי והחזרתי לתוך החממה במשך כ -30 דקות.
- מניחים כל הרכבה MEA / תרבות עם טיפים לתוך צינור רולר סטרילי, מכוסה גומי, להוסיף 3 מיליליטר של מדיום מזין וסוגרת היטב את המכסה. מניחים את צינור רולר בתוף מסתובב בהרי 1 - סל"ד 2 בחממה ב5% CO
- לשנות מחצית בינונית התזונתי לאחר 7 ימים במבחנה (DIV) ולאחר מכן 1 - 2 פעמים בשבוע.
5. פצעים מכניים
- קח ההרכבה MEA / התרבות עם טיפים סטריליים, מכוסה גומי מצינור רולר והמקום בצלחת פטרי ללא מדיום תזונתי תחת מיקרוסקופ סטריאו עם הרקמה בפוקוס. מבחינה ויזואלית לוודא ששתי פרוסות הם התמזגו.
- החזק את MEA / התרבות יציבה הרכבה על ידי הצבת פינצטה עם עצות מכוסות גומי על MEA.
- הנח להב סכין מנתחים בחריץ של MEA הקרוב לפרוסות הרקמה. החזק את האזמל ולא אופקי.
- הרם את האזמל לטפל עד אבל בואו להב סכין המנתחים להישאר בחריץ של MEA באופן כזה ש" הלחמניות "להב מבסיס ועד לקצה ובכך חוצות את הרקמה המכסה את החריץ.
- כל חיבורי רקמות שייר חמורים עם קצה מחט 25 G אם necessארי. עובד רק באזור בתוך החריץ ולא לגעת בקצות המכרז.
- שים MEA / ההרכבה התרבות בחזרה לתוך צינור רולר. לספק 3 מיליליטר של מדיום תזונתי טרי לתרבויות ולמקם אותם בחזרה לתוך תוף רולר בחממה.
6. אלקטרו הקלטות של פעילות ספונטנית
- לחקור התחדשות תפקודית בין שתי פרוסות חוט השדרה לאחר המספר הנבחר של DIV, הר ההרכבה MEA / התרבות בתא הקלטה על מיקרוסקופ ולהחיל כ -500 פתרון תאי μl (ראה רשימת חומרים).
- חכה 10 דקות לפני ההקלטה הראשונה כדי לאפשר למערכת כדי לייצב.
- 2x השיא בסיסי פעילות ספונטנית כ -10 דקות מכל אלקטרודה גילוי-פעילות של MEA ב RT.
- כדי להבטיח תנאים תאיים יציבים, להחליף פתרון תאי לאחר כל פגישת הקלטה.
- לdisinhibit הרשת, להחיל שיתוף פתרון תאיntaining סטריכנין (1 מיקרומטר) וgabazine (10 מיקרומטר). חכה לפחות 2 דקות לפני תחילת ההקלטה.
ניתוח 7. נתונים
הערה: זיהוי של פוטנציאל הפעולה נרשם extracellularly להשתמש לכל אלקטרודה גלאי המבוסס על סטיות תקן ומאבחן שלאחר מכן. הליך זה מתואר בפירוט ובאח Tscherter אל. 3.
- להציג את הפעילות העצבית המזוהה של כל אלקטרודה בעלילה סריקה על פי נהלים קבועים 3 (איור 1F).
- לקבוע ולהציג את פעילות הרשת הכוללת לכל פרוסה על ידי סיכום מספר האירועים בערוצים לפי בתוך חלון הזזה של 10 אלפיות שני, עברו על ידי צעדי msec 1 (איור 1G ותראה Tscherter et al. 3).
- זיהוי בכל התפרצויות בודדות פרוסה (אשכולות של פעילות המופיעים בכמה אלקטרודות). לכן, נקבע סף שיא פעילות מינימאלי בסך פעילות הרשת המתאימה ולהגדיר כל התחלה פרצה וסופו של דבר פרץ. לדוגמא, סף מתאים הוא 25% של משרעת הפרץ הממוצעת והתחלה פרץ יכולה להיות מוגדרת על ידי להיות האירוע הראשון בחלון של אלפיות שני לפחות 5, סוף פרץ זמן על ידי כך את האירוע האחרון בחלון של זמן ב לפחות 25 אלפיות שני (ראה היידמן et al. 10).
- כדי לכמת התחדשות פונקציונלית לחשב את אחוז הפרצים המסונכרנים בין שתי הפרוסות. כדי לעשות זאת, לחשב את זמן האחזור בין פרץ בפרוסה אחת והפרץ בפרוסה אחרת הבא.
הערה: צמד פרץ מכונה "מסונכרן" כאשר ההשהיה קטנה יותר מאורך הפרץ הממוצע. במיוחד בשיתוף תרבויות עם הרבה פעילות, קיימת האפשרות ששני הצדדים במקרה ליזום פרץ בחלון ההשהיה שנבחר. עובדה זו צריכה להילקח בחשבון בכימות של אחוז סאיפרצי nchronized. לתיאור מפורט של החישובים לראות אל היידמן et. 10.
8. קיבוע של התרבויות ואימונוהיסטוכימיה
- לכל הצעדים שכוללים שטיפה או דגירה לוודא לשים תרבויות על שולחן הטיה כדי להבטיח דיפוזיה הנכונה של הפתרון דרך הרקמות.
- מייד לאחר פגישת ההקלטה סיימה לקחת את ההרכבה MEA / התרבות מההתקנה, לשים אותו בצלחת פטרי (35 מ"מ x 10 מ"מ) ולהוסיף על 2 מיליליטר של פתרון תאי.
- כדי להפריד את הפרוסות משכבות התאים המקיפות שנוצרו במהלך הזמן במבחנה, לקחת קצה פיפטה 10 μl ומקיף את הפרוסות. שים לב שלא לפגוע בתרבויות. ניתן להשמיט את הצעד הזה אבל ההטבעה מאוחר יותר היא קלה יותר כאשר הוא מבוצע.
- שימוש במחט מזרק אל מתכתיים דקה (ראה חומרי רשימה) בשילוב עם מזרק 1 מיליליטר המלא בsoluti תאיעל לפוצץ בעדינות התרבות את MEA.
- הסר את הקצה של פיפטה פסטר ולהתאים את הנורה הגומי בקצה הפרוס. השתמש בסוף חזרה להעברת התרבות למקבע (paraformaldehyde 4% עם מלח פוספט (PBS, 0.1 מ ')). אל תשתמש בקצה הסטנדרטי של פיפטה פסטר להעברה כי הוא קטן מדי והתרבויות יהיו מקופלות וכנראה פגום. תקן עבור 1 - 2 שעות על 4 מעלות צלזיוס. יש לשטוף את MEA עם מים מזוקקים ולהסיר שאריות רקמה בקץ אצבעות, אבל לא לשרוט עם הציפורניים. MEAs חנות במים מזוקקים ב 4 ° C.
- שטוף את התרבויות 3x ב PBS במשך לפחות 10 דקות כל אחד. אחסן בPBS על 4 מעלות צלזיוס או ישירות להתחיל עם ההליך מכתים.
- דגירה התרבויות לפחות 90 דקות בפתרון חסימה (5% סרום עז, 1% אלבומין בסרום שור, חומר ניקוי של 0.3% בPBS).
- הוסף את הנוגדן הראשון המדולל בפתרון חסימת דגירה במשך 3 לילות על 4 מעלות צלזיוס.
- 3x לשטוף בPBS בl30 דקות מזרח כל אחד.
- הוסף את הנוגדן השני מדולל PBS לשעה 2 ב RT.
- 3x לשטוף בPBS לפחות 30 דקות כל אחד.
- העבר את הפרוסות עם פיפטה פסטר עם קצה שהוסר על שקופית אובייקט. הסר PBS העודף ולהטביע עם ההרכבה בינונית.
Representative Results
כדי לחקור את הפוטנציאל להחלמה תפקודית של שיתוף התרבויות נגזרות מחוט השדרה של עוברי עכברים E14, נגעים בוצעו בחלון של 8 זמן לDIV 28. 2 עד 3 שבועות מאוחר יותר, הפעילות העצבית הספונטנית נרשמה עם MEAs (איור 1 C & D). פוטנציאל הפעולה נרשם extracellularly זוהו מחובר לכל אלקטרודה בודדת (איור 1E). מנתונים אלה חלקות סריקה נוצרו (איור 1F), ואחריו חלקות פעילות רשת כדי להמחיש את הפעילות הכוללת בנפרד לכל צד (איור 1G). בכל פרוסה הפעילות הספונטנית בדרך כלל מאורגנת בצרורות. אם הפרוסות מחוברות תפקודי, התפרצויות אלה יכולים להפיץ מפרוסה אחת לשנייה. לפיכך, הסכום של התפרצויות מסונכרנות בין שתי הפרוסות היה מחושב למדוד התחדשות פונקציונלית כמותית. לתיאור מפורט של איך int השינויo החלקות השונות מתבצע וכיצד הנוסחא לחישוב אחוז הפעילות מסונכרנת נגזרה, אנא ראה et al היידמן. 10.
בכל הניסויים, הפעילות נרשמה ראשונה בתנאים סטנדרטיים. בשלב שני, עיכוב סינפטי נחסם על ידי הוספת סטריכנין (1 מיקרומטר) וgabazine (10 מיקרומטר) לפתרון האמבטיה תאי. ביטול עכבות זה מוביל בדרך כלל לתבנית סדירה יותר פעילות עם פרצים ממושכים ומרווחים פרצו, המאפשרת הגדרה של התפרצויות ולכן קביעת סנכרון פרץ בין הפרוסות.
תרבויות lesioned בגיל צעיר (7 - 9 DIV) מוצגות כמות גבוהה של פעילות מסונכרנת 2-3 שבועות לאחר נגע ואילו תרבויות lesioned בשלבים מאוחר יותר (> DIV 19) הראה ירידה מובהקת ביכולת להתחדש (איור 2 - F). ממצאים אלה מצביעים על כך שיכולת ההתחדשותקשרים פונקציונליים בתרבויות פרוסה חוט השדרה יורדת מרמה גבוהה, המייצג את המדינה העוברית in vivo, לרמה נמוכה, המייצג את המדינה מפותחת נוסף בvivo, בתוך שלושה שבועות בתרבות.
אילו סוגים של חיבורים למעשה מעורבים בסנכרון פרץ בין שתי פרוסות? מלבד קשרי propriospinal, הסיבים יכולים גם לנבוע מmotoneurons או נוירונים גנגליון השורש הגבי. זה כבר הראה בעבר כי תאי עצב גנגליון השורש הגבי אינם רלוונטיים לקישוריות הפונקציונלית בין חוט השדרה פרוס 10. עם זאת, המעורבות של motoneurons נותרה אפשרות. מאז motoneurons ידוע כדי ליצור קשרי כולינרגית לתאי עצב בחוט השדרה באמצעות קולטני ניקוטין 13, הפעילות של שיתוף תרבויות חוט השדרה נרשמה בשעת 8 DIV, תקופה שבה התרבויות מראות מאוד מסונכרנות פעילות 10, ואנטגוניסט ניקוטינית Mecamylamine (MEC, 100 מיקרומטר) התווסף לפתרון האמבטיה תאי. השתתפות של motoneurons בחיבור בין שתי הפרוסות תגרום לירידה באחוז של פעילות מסונכרנת. עם זאת, זה לא היה המקרה (MEC: 91.0 ± 4.5%, n = 7; שליטה: 93.6 ± 4.6%, n = 7, מבחן זוגות> 0.05, Wilcoxon תאם עמ '). תוצאות אלו מצביעות על כך שסינפסות כולינרגית אינה תורמת לחיבור הפונקציונלי בין פרוסות. עם זאת, מאז motoneurons יש גם הוכח כדי לשחרר גלוטמט בסינפסות בתוך 11 מערכת העצבים המרכזית, 15, ניסויים אלה לא לגמרי שוללים את מעורבותם.
לזהות motoneurons stainings immunohistochemical נגד H neurofilament הלא פוספורילציה עם SMI-32 בוצעו. הם חשפו כמה גופי שכותרת גדולים תא אופייניים לmotoneurons, מפוזרים על פני פרוסות (איור 3 א). נוגדן SMI-32 דווח לתייג גופי התא של motoneuroNS 12 וממצא זה מחזיק נכון גם לתרבויות משמשות 13. כמו כן, stainings של גופים עצביים תא באופן כללי, למשל, נגד ב-III טובולין או NeuN כמו גם גופי תא גליה, למשל., האסטרוציטים עם נוגדני GFAP בקנה אחד עם דיווחים אחרים ולהתאים את התיאור המורפולוגי של סוגים אלה תא ( איור 3 ב '- ד'). עם זאת, התיוג של אקסונים עם נוגדן SMI-32 הוא נוגע (3E איור). בניגוד לציפיות, רשת עצומה של סיבים מופיעה בעת שימוש בנוגדן זה וזה נראה דומה לצביעת SMI-31 שתוויות H phosphorylated neurofilament (איור 3F). פרשנות אחת של תוצאה זו יכולה להיות שהרגולציה ההתפתחותי של זירחון neurofilament / dephosphorylation היא לא חזק כמו בתרבויות משמשות בהשוואה למצב בvivo. התרחשות מעורבת של neurofilaments פוספורילציה והלא פוספורילציה באותו האקסון יכולה Explעין ממצא זה. אפשרות נוספת היא שSMI-32 אקסונים שהכותרת נובעים מנוירונים הקרנה. צאנג ועמיתים 16 הראו למשל ש, נוירונים העמודה ועמודה תא intermediolateral של קלארק הם מוכתמים על ידי SMI-32 מלבד motoneurons. התפשטות neurite הבולטת של תאי עצב כזה יכול גם להסביר את השפע של SMI-32 סיבים חיוביים.
איור 1. תצוגה וניתוח של פעילות ספונטנית. () תרשים של MEA. אלקטרודות הפלטינה מכוסות מתוארות ב, חוטים השחורים השקופים באדום והחריץ באמצע MEA בצהוב. תקריב של מערך אלקטרודות ממוקם במרכז של MEA (B). התרשימים ניתנים באדיבות על ידי ד"ר מ Heuschkel. תמונה בהירה שדה של cultur בן 8 DIV (C)דואר. פרוסות גדלו והתמזגו יחד הצדדים זה מול זה. בר הצהוב מייצג את חריץ electrode- וללא בידוד של MEA. בר ציר זמן בקנה מידה = 400 מיקרומטר (ד) של ניסויים. שתי פרוסות חוט השדרה של עוברי עכברים E14 ממוקמות ליד שני על MEAs. תוך כמה ימים, את הפרוסות לגדול ופתיל לאורך הצדדים זה מול זה. במסגרת של 8 זמן - DIV 28, מבוצעים נגעים מלאים דרך אתר ההיתוך. שבועות עד שלושה שבועות מאוחר יותר הפעילות הספונטנית נרשמת והתרבויות קבועות לstainings immunohistochemical. (ה) עקבות פעילות ספונטניות של כל אלקטרודה בודדת של תרבות בת 23 DIV. להדמיה ברורה יותר, רק כל זכר שני מודגם. עקבות כתומות מתארות פעילות שנרשמה מהפרוסה בצד ימין, עקבות כחולות מצד השמאל. רוב ההתפרצויות מסונכרנות בין שתיים. נקודות החצים כדי פרץ מתרחשות בפרוסה עזבה כי רק עמ 'artially מופץ לפרוסה תקין. הפעילות בפרוסה תקין זאת לא מגיעה לסף הנבחר של לפחות 25% מפעילות השיא מקסימאלי הממוצעת של הצד על פי ולכן, לא זוהתה כפרץ. הגדלה מהימין מתארת זוג הפרץ המסונכרן האחרון. עלילה (F) סריקה של הפעילות מוצגת ב( E). (G) עלילת פעילות רשת עם פרצים מוגדרים (להלן ברים בסיס) של הפעילות מוצגת ב( E). מעובד מתוך היידמן et al. 10. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. מסונכרן לעומת פעילות לא מסונכרן. (A, B) חלקות סריקה של תרבויות lesioneד בגיל צעיר (ב7 - 9 DIV), מראה פעילות מסונכרנת בתנאים סטנדרטיים () ותחת ביטול עכבות (B). (C, D) מגרשי סריקה של תרבויות lesioned בזקנה (ב> 19 DIV), מראים פעילות לא מסונכרנת בתנאים סטנדרטיים (C) ותחת ביטול עכבות (ד '). (E, F) אחוז הממוצע של פעילות מסונכרנת זמם עבור כל יום נגע בודד שנרשם בתנאים סטנדרטיים (E) ותחת ביטול עכבות (F). הקלטות נלקחו 2 - 3 שבועות לאחר היום של נגע. מעובד מתוך היידמן et al. 10. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Figure 3. אימונוהיסטוכימיים אפיון. מכתים () של גופי תא motoneuronal עם SMI-32. תיוג טובולין β-III של גופי תא עצבי בוגרים והתהליכים שלהם (B). זיהוי (C) של האסטרוציטים עם GFAP. תיוג (D) של גוף תא עצבי בוגר עם NeuN. (ה) SMI-32 צביעה של ה neurofilament הלא פוספורילציה (F) neurofilament phosphorylated H זוהתה על ידי SMI-31. מעובד מתוך היידמן et al. 10. שימו לב שעם שניהם, SMI-31 וSMI-32, רשת גדולה של סיבים גלויים בתרבויות. ברים לספירה = 20 מיקרומטר, H & F = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
כמה גורמים בהליך שהוצג הם יסוד להישג של ניסויים מדויקים ושחזור. כל הצעדים במהלך תקופת ההכנה של MEAs, הפתרונות והייצור של התרבויות הפרוסה מבוצעים בתנאים סטריליים בזרימה למינרית. אנטיביוטיקה אינה חלה על המדיום מזין, כי הם יכולים להשפיע על הפעילות הספונטנית 14. במהלך ציפוי MEA, החלק החשוב ביותר הוא לוודא כי פתרון ג'ל מטריקס נשאר קר בכל העת. הפשירי אותו במקרר ולשמור אותו על קרח לכל התהליך כדי להבטיח טמפרטורה מקסימלי קרובה ל 0 מעלות צלזיוס. במהלך תקופת ההכנה של הבידוד מהיר פרוסות וחתך, כמו גם תשומת הלב משלם לטמפרטורה נמוכה על ידי שימוש במאגרי נתיחה קרים קרח מגדיל את אחוז התרבויות הבריאים. יתר על כן, הקרישה / תרומבין הפלזמה היא אחד השלבים הקריטיים ביותר. ראשית, ודא שהפלזמה היא mixe כראויד עם תרומבין. שנית, להקדיש תשומת לב מיוחדת להסרת כמה שיותר שאריות ככל האפשר כדי להבטיח מצורף תקינה של פרוסות לMEAs. שלב זה הוא מאוד רגיש לזמן; אם מסגרת הזמן קצרה מדי, יותר מדי מתערובת הפלזמה / תרומבין מוסר. אם מסגרת הזמן ארוכה מדי, קרישה כבר קרה, מעלה את הסיכון להסרת פרוסות יחד עם הפלזמה / תרומבין השייר.
אם נגעים מכאניים מתוכננים, חשוב להשתמש MEAs עם עיצוב מדויק. האזור שבו הנגע מיועד צריך להיות חופשי של אלקטרודות, חוטים ובידוד. אחרת, החשמל של MEA הולך להיות פגום ולכן, יכולות להתבצע ללא הקלטות יותר.
עוד צעד מכריע נוגע לגודל הנגע. זה כבר הראה בעבר כי חיבור מחדש שתי פרוסות צעירות לאחר הנגע לוקח בערך יומיים 10. לכל הניסויים, כלל אצבע ששמש betwe החללen פרוסות לאחר נגע לא צריך להיות גדול יותר מאשר הרוחב של חריץ MEA (300 מיקרומטר). גודל נגע גדול יותר עלול לגרום למסגרת זמן ארוכה יותר לחיבור מחדש או, אם הנגע הוא גדול מדי, אין חיבור מחדש בכל. כדי להוסיף הערות, ניסויים לשעבר חשפו כי הצבה ראשונית של שתי פרוסות רחוקות מתוצאות 1 מ"מ בשיעור חיבור נמוך מאוד.
לפני תחילת ההקלטות, זמן הסתגלות של לפחות 10 דקות לRT, במקום 37 מעלות צלזיוס של החממה, ולפתרון תאי, במקום בינוני התזונה מומלצת. תצפית קרובה של דפוס הפעילות בדקות אלה ראשוניים מבטיחה כי הנתונים שנמדדו מייצגים את דפוס התפוצצות התרבות כראוי לאחר ההקלטה החלה.
לצורך זיהוי של הפעילות, רכישת נתונים ועיבוד נוסף, חומרת תוצרת בית (הקלטה קאמרית, חיבורים למגברים והמגברים), התוכניות במעבדהVIEW, C ++ וIgorPro משמשים. הגדרות MEA מסחריות וחבילות תוכנה אחרות מתאימות, כמו גם לפעולות אלה. הנה, ראו האותות על ידי אלקטרודות מוגברות 1,001 פעמים, ולאחר מכן דיגיטציה בשיעור של 6 קילו-הרץ.
המודל שהוצג יכול להיות כלי מועיל לבחון קשרי propriospinal כי in vivo, הם קשים ללמוד בלי ההפרעות של עולה ויורדים שטחי סיבים. שיתוף culturing של שתי פרוסות חוט השדרה יכול לעקוף באלגנטיות נושא זה. התרבויות לספק מייקרו-סביבה שיכולה להיות מבוקר היטב ובקלות מניפולציות. מצד השני, קלט supraspinal והחושי הוא כמובן חסר. בנוסף, בתהליך של הכנת התרבות מייצג מצב של נזק במערכת העצבים המרכזית. תאי גלייה כמו האסטרוציטים ומיקרוגלים ידועים להגיב לנגעים עם התפשטות מוגברת ולכן, הרקמה היא ארגון מחדש במידה מסוימת. הנוגע למצב שהוצגl היווצרות צלקת גליה לאחר ביצוע נגעים מכאניים לא נצפה. הסבר אחד יכול להיות שמנגנוני הסתגלות של האסטרוציטים כבר מופעלים בתהליך ההכנה וכי נגעים של התרבויות לא לגרום לתגובה נוספת. כמו כן, אין ראיות למעורבותם של המעכבים הקשורים המיאלין, למשל., Nogo-, בפוטנציאל ההתחדשות הנמוך של תרבויות lesioned בזקנה. עם זאת, זה הראה כי טיפול במעכבים phosphodiesterase 4 Rolipram, מתחיל מייד לאחר ביצוע נגעים בהתחדשות תפקודית 23 DIV עליות בין הפרוסות 10. תוצאות אלו מראות כי התאוששות תפקודית יכולה להיות מוגברת בתרבויות עתיקות. ניכר, כאשר סופר את מספר אקסונים חוצים את אתר הנגע, אין הבדל בין תרבויות lesioned בגיל צעיר ותרבויות lesioned בזקנה התגלה. ממצאים אלה מראים כי חוסר התחדשות axonal הוא לא הסיבה העיקרית ואו האובדן של התאוששות לאחר נגעים מאוחר בתרבות ולכן מדגיש את הצורך במודל המאפשר ניתוח פונקציונלי של התחדשות. היווצרות Synaptic ופלסטיות הסינפטית יכולים לשחק תפקיד מרכזי בתהליך ההתאוששות 10. מנגנונים אלה צברו הרבה תשומת לב בשנים האחרונות וזה בימינו מקובל שיש להם השפעה משמעותית על התוצאה לאחר פגיעה בחוט השדרה. לכן, מודל המספק תנאים יציבים לחקור תהליכים אלה בבידוד ובפירוט רב בהחלט יכול לעזור להשיג תובנה על התחדשות פונקציונלית בחוט השדרה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
| Nutrient medium | For 100 ml | ||
| Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
| Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
| distilled, sterile water | 10 ml | ||
| Nerve growth factor-7S [5 ng/ml] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
| reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
| Coating solution | |||
| Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
| medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
| Wash solution | [mg/L] | ||
| MgCl2-6H2O | 100 | ||
| MgSO4-7H2O | 100 | ||
| KCl | 400 | ||
| KH2PO4 | 60 | ||
| NaCl | 8,000 | ||
| Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
| D-Glucose (Dextrose) | 1,000 | ||
| According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
| Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
| NaCl | 145 | ||
| KCl | 4 | ||
| MgCl2 | 1 | ||
| CaCl2 | 2 | ||
| HEPES | 5 | ||
| Na-pyruvate | 2 | ||
| Glucose | 5 | ||
| Blocking Solution | |||
| Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
| Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
| Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
| Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
| Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
| Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
| Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
| SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
| SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
| Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
| Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
| Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 | |
References
- Avossa, D., Rosato–Siri, M., Mazzarol, F., Ballerini, L. Spinal circuits formation: a study of developmentally regulated markers in organotypic cultures of embryonic mouse spinal cord. Neuroscience. 122 (2), 391-405 (2003).
- Cifra, A., Mazzone, G. L., Nani, F., Nistri, A., Mladinic, M. Postnatal developmental profile of neurons and glia in motor nuclei of the brainstem and spinal cord, and its comparison with organotypic slice cultures. Dev Neurobiol. 72 (8), 1140-1160 (2012).
- Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures. Eur. J. Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).
- Czarnecki, A., Magloire, V., Streit, J. Local oscillations of spiking activity in organotypic spinal cord slice cultures. Eur. J. Neurosci. 27 (8), 2076-2088 (2008).
- Kirkby, L. A., Sack, G. S., Firl, A., Feller, M. B. A role for correlated spontaneous activity in the assembly of neural circuits. Neuron. 80 (5), 1129-1144 (2013).
- Ballerini, L., Galante, M., Grandolfo, M., Nistri, A. Generation of rhythmic patterns of activity by ventral interneurones in rat organotypic spinal slice culture. J. Physiol. (Lond.). 517 ((Pt 2)), 459-475 (1999).
- Hanson, M. G., Landmesser, L. T. Normal patterns of spontaneous activity are required for correct motor axon guidance and the expression of specific guidance molecules). Neuron. 43 (5), 687-701 (2004).
- Courtine, G., et al. Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury. Nat. Med. 14 (1), 69-74 (2008).
- Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model. Eur. J. Neurosci. 27 (10), 2483-2492 (2008).
- Heidemann, M., Streit, J., Tscherter, A. Functional regeneration of intraspinal connections in a new in vitro model. Neuroscience. 262, 40-52 (2014).
- Nishimaru, H., Restrepo, C. E., Ryge, J., Yanagawa, Y., Kiehn, O. Mammalian motor neurons corelease glutamate and acetylcholine at central synapses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (14), 5245-5249 (2005).
- Tsuji, S., et al. Proteasome inhibition induces selective motor neuron death in organotypic slice cultures. J. Neurosci. Res. 82 (4), 443-451 (2005).
- Magloire, V., Streit, J. Intrinsic activity and positive feedback in motor circuits in organotypic spinal cord slice cultures. Eur. J. Neurosci. 30 (8), 1487-1497 (2009).
- Bahrami, F., Janahmadi, M. Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture. Iran. Biomed J. 17 (2), 101-106 (2013).
- Mentis, G., et al. Noncholinergic excitatory actions of motoneurons in the neonatal mammalian spinal cord. Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.. 20 (102), 7344-7349 (2005).
- Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non–phosphorylated neurofilaments: Cross– species comparison and alterations in ALS. Brain Res. 861 (45–58), (2000).
