Summary
여기에서 우리는 체외에서 propriospinal 연결 기능 재생을 연구하기 위해 다중 전극 배열에 배양 척수 조각을 기반으로하는 프로토콜을 제시한다.
Introduction
중추 신경계 (CNS)의 Organotypic 슬라이스 배양 신경 발달의 신경 퇴행에 도달하는 다양한 생리 학적 및 병리학 적 현상을 연구하기 위해 광범위하게 사용되어왔다. 해리 된 세포 배양에 비해의 Organotypic 슬라이스 그대로 cytoarchitecture와 로컬 시냅스 회로가 더 많은 복잡성 이점을 제공한다. 동시에, 조직이 생체 내 환경에서의 전체적인 복잡함 연루 않고도 격리 방법으로 분석 될 수있다. 또한, 선택의 세포에 쉽게 반복 액세스, 보증 세포 외 환경을 정밀하게 제어 할 수 있고, 보통, 체외 모델은 생체에 비해 저렴하다. 최근 몇 년 동안, 다양한 연구는 대응하는 살아있는 동물, 2 대 장기 문화의 발달 프로파일 사이에 놀라운 유사성을 발표했다. 다양한 중추 신경계 레지오의 신경 회로를 보여왔다NS는 개발 과정에서 자발적인 네트워크 활동을 표현하고의 Organotypic 조각은 부분적으로 이러한 현상 3 -7을 유지하는 것이다. 격리 척수 제제가 특히 리듬 생성 회로 (6)과의 연결 (1)의 형성을 조사하는데 사용되어왔다.
슬라이스의 Organotypic 자발적인 활동을 기록 할 수있는 방법은 멀티 - 전극 어레이 (다자간)의 상단에이를 배양하는 것이다. 이 장치는 다수의 동시 세포 (멀티 유닛 녹음)에서 활동 전위에 의해 생성 된 세포 외 잠재력을 모니터링 할 수있는 여러 전극이 포함되어 있습니다. MEA 레코딩 높은 시간 해상도는 주어진 신경 회로에서 정확한 활성 역학을 재구성하는데 사용될 수있다. 또한, 달리 패치 클램프 기술은 뉴런의 행동에 영향을받지 않도록 사실상 장기 및 측정 결과를 허용하는 비 침습적이다.
F또는 본 연구의 목적은 척수의 Organotypic 공동 배양 및 다중 기록의 결합은 척수 내의 재생 기능을 조사하기 위해 사용 하였다. 성인 높은 척추 동물은 척수의 손상으로부터 회복 할 가능성이 제한되어 있기 때문에, 다양한 전략이 척수 손상 후 재생을 촉진하기 위해 연구되어왔다. 지금까지, 피질 관은 일반적으로 연구를 위해 선택한 모델 시스템이었다. 이러한 실험은 일반적으로 시간이 많이 소요, 비용이 많이 드는 인해 하나의 그룹 내 높은 변동성에 큰 동물 동료를 필요로한다. 또한, 증거 propriospinal 연결 (전적으로 척수 내에 갇혀 뉴런) 척수 병변 8 다음 복구 과정에서 중요한 역할을 수행 할 수 있음을 시사한다. 이 섬유는 상승과 섬유 책자를 내림차순의 간섭을받지 않고 생체 내에서 공부하기가 어렵습니다. BONNICI 및 Kapfhammer 9 종 척수를 사용다른 방법으로 출생 후 마우스의 슬라이스 문화. 기계적인 병변을 수행 한 후 그들은 반 정량적으로 척수 세그먼트 사이 축삭의 재생 형태를 분석 하였다. 그들은 성숙한 나이에 컷 문화 병변 사이트를 건너 적은 있지만 없음 축색 돌기를 관찰했다. 7 일 피해 후 - 반면, 젊은 단계에서 병변 된 문화는 5 축삭 재생의 높은 금액을 표시. 그러나 기능적인 연결을위한 증거는 제시되지 않았다.
따라서, 기능 중생의 조사를 허용 propriospinal 섬유의 체외 모델의 대표의 개발은 척수의 재생 프로세스에 대한 우리의 지식을 확장 할 수있는 유용한 도구가 될 수 있습니다.
Protocol
동물 보호는 스위스 지방 자치 단체 AMT (대 Landwirtschaft 싶게 투르 데 Kantons 베른, Veterinärdienst, Sekretariat Tierversuche, 승인 NRS. 11분의 52과 14분의 35)에 의해 승인 지침에 따라이었다. 이 지침은 유럽 공동체 지침 63분의 2,010 / 유럽 연합 (EU)과 일치한다.
참고 : 멸균 장비 및 솔루션을 층류 후드에서 작업을 모든 단계 1 - 하위 단계를 포함하여 5.
다자간 1. 준비
주 : MEA의 유리 기판, 마이크로 제조 된 금속 전극과 SU-8 폴리머 절연 층으로 구성된다 (. 또한 Tscherter 외 3 참조). 이 연구의 목적을 위하여 상업적으로 이용 가능한 다자간는 맞춤형 전극 어레이 레이아웃 (도 1 A & B)과 정렬되었다. 68 전극은 전극의 무료 300 μm의 넓은 홈, ELECTR에 의해 두 개의 영역으로 분할 사각형 격자 배열되어iCal의 리드 및 절연. 각 전극의 크기는 40 × 40 μm의 그리고 그들은 센터에 센터에서 200 μm의에 의해 이격되어있다. 4 개의 큰 접지 전극은 기록 사이트 주위에 위치된다. 그들은 그들의 크기 (21mm X 21mm)의 다른 상업적으로 이용 가능한 표준 다자간 다를 그들은 고정 된 기록 챔버가 없습니다.
- 적어도 30 초마다 100 % 에탄올 (2 배), 70 % 에탄올 (1X) 및 증류수 (2 ×)로 세척 소독 용 다자간. 건조 보자. 깨끗한 유리 페트리 접시 (150mm X 25mm) 12 MEA의 뚜껑을 닫습니다 - (10)를 넣습니다.
- 120 ℃에서 20 분 동안 오토 클레이브 다자간. 실온에서 보관하십시오.
- -20 ℃에서 저장 MEA의 분취 액에 대한 코팅 용액 (물질의 목록 참조)를 준비한다.
- 개별 멸균 페트리 접시 (35mm X 10mm)의 각 MEA를 넣습니다.
- 전극의 상단에 150 μL 냉장 코팅 용액을 넣어 배양 접시의 뚜껑을 닫습니다 냉각 피펫을 사용합니다. 약 10 분 후, 상단에 공기 방울을 확인필요한 경우 전극과 부드럽게는 고무로 덮인 주걱으로 제거합니다. 실온에서 1 시간 동안 휴식을 보자.
- 기음 코팅 용액의 잔류 물, 증류수, 멸균 수와 태아 및 배아 신경과 배에 최적화 된 매체 1X 씻는다. MEA의 다음날까지 사용되지 않은 경우, 인큐베이터 O / N에서 37 ° C에서 증류, 멸균 수에 보관. 그렇지 않으면, 실온에서 직접 건조 할 수 있습니다.
의 Organotypic 문화의 준비 및 성장에 필요한 2. 재료
- 칼슘이없는 세척 솔루션 (자료 목록 참조) 준비합니다.
- 약 20 분 동안 3,000 XG에, (거품의 형성을 피하기 부드럽게 흔들어, 1 1) 원심 분리기 및 멸균 튜브에 명확한 내용을 가만히 따르다 세척 용액에 닭 플라즈마를 복원합니다. 나누어지는 -20 ° C에서 cryotubes 및 저장에 200 μL.
- 따라서 소 플라즈마 (200 U / ㎖) 및 살균 필터 (0.2 μm의 기공 필터)에서 트롬빈을 복원합니다. cryt로 나누어지는 200 μL-20 ° C에서 otubes 및 저장.
- (30) 문화를 들면 영양 배지 100 ㎖를 (자료 목록 참조) 준비합니다.
3. 척수 조직의 해부
약 25 배아, 척수 슬라이스의 수에 따라, 프로 시저 수율 - 35 공동 배양 무균 조건 하에서 층류 후드 안쪽 제조 : 참고.
- 근육 주사에 의해 어머니의 동물에 펜 토바 비탈 (0.4 ㎖)의 치사량을 적용합니다. 페달 철수 반사를 확인하여 깊은 마취를 확인합니다. 잘린 제왕 절개와 희생에 의해 E14 쥐의 배아를 제공합니다.
- 살균, 냉각, 세척 용액으로 가득 페트리 접시에 배아의 몸을 전송합니다.
- 뒷다리 위의 메스와 앞다리 위의 또 다른 하나의 완전한 횡단 컷을 수행하고 몸에서 사지를 제거합니다. 다음으로, 정면 평면에서 절단 척수 공동을 포함하는 다시 조각에서 내장을 분리 할 수 있도록RD.
- 슬라이싱 들어, 디스크 장착시 척수를 포함하는 부분을 다시 전송하고 (225)의 두께로 절단 - 조직 초퍼 250 μm의. 다진 조직에 세척 용액 한 방울을 넣고 35mm 살균, 냉각, 세척 용액으로 가득 X 10mm 배양 접시에 주걱으로 조각을 전송합니다.
- 개별적으로 각 슬라이스를 들어, 조직 남은에서 멀리 척수를 해부하다. 부착 등의 루트 신경을 남겨주세요.
- 조각은 4 ℃에서 1 시간 동안 휴식을 보자.
4. 다자간에 척수 조직의 조각을 설치
- 인큐베이터에서 멸균 영양 배지를 따뜻하게 (37 ° C, 가볍게 산소에 대한 뚜껑을 풀고).
- 초점 전극 배열 스테레오 현미경 페트리 접시에 실온에서 고무 덮인 팁 멸균 핀셋 위치 MEA. 깨끗하고 먼지가없는, 및 살균 전극 배열에 닭 플라즈마의 6 μL 방울을 센터입니다. 조심스럽게 밀어 작은 주걱을 사용하여복부 측면 플라즈마 액적으로 서로 마주 보는 두 척수 부. 주걱으로 전극을 만지지 마십시오.
- 닭 플라즈마 방울 주위에 트롬빈의 8 μl를 추가합니다. , 트롬빈 피펫 팁을 사용하여 조심스럽게 혼합하고 두 조각 주위 닭 플라즈마 / 트롬빈 혼합물을 확산. 또, 직접 취성 전극 배열을 만지지 마십시오. 그냥 응고하기 전에, 초과 닭 플라즈마 / 트롬빈을 대기음.
- MEA / 문화 조립는 37 ° C에서 인큐베이터 내부 가습 실에서 약 1 시간 동안 앉아있는 동안 높은 습도를 유지하기 위해 배양 접시를 모자.
- 조심스럽게 페트리 접시 캡 약 30 분 동안 인큐베이터에 다시 넣어, 문화 챔버에 영양 배지의 10 μl를 추가합니다.
- , 롤러 튜브에 멸균, 고무 덮인 팁 각각의 MEA / 문화 어셈블리를 놓고 3 영양 배지 ㎖의 단단히 가까운 뚜껑을 추가합니다. 5 % CO에서 배양기에서 2 RPM - 1 회전 롤러 드럼 롤러 튜브를 배치
- 일주일에 2 회 - 체외에서 칠일 (DIV), 그 후 1 일 이후 영양 배지의 절반을 변경합니다.
5. 기계 병변
- 초점 조직과 스테레오 현미경 영양 배지 않고 배양 접시에서 롤러 튜브와 장소 중 멸균, 고무 덮인 팁 MEA / 문화 어셈블리를 가져 가라. 시각적으로 두 조각이 융합되어 있는지 확인합니다.
- MEA에 고무 덮인 팁 핀셋을 배치하여 조립 정상 MEA / 문화를 잡습니다.
- 조직 조각에 가까운 MEA의 홈에 메스 블레이드를 배치합니다. 오히려 수평으로 메스를 잡고.
- 메스 업 처리하지만 메스 블레이드는 블레이드 기부에서 "롤"팁하여 홈을 덮는 티슈를 절단하는 방식으로 MEA의 홈 내에 머물게 리프트.
- 25 G 바늘 끝 necess 경우와 심한 잔여 조직 연결진. 홈 내의 지역에서만 작동하고 부드러운 가장자리를 만지지 마십시오.
- 롤러 튜브에 다시 MEA / 문화 어셈블리를 넣습니다. 문화에 신선한 영양 배지 3 ㎖를 제공하고 인큐베이터에서 롤러 드럼에 다시 배치합니다.
자발적인 활동 6. 전기 생리 녹음
- DIV의 선택한 숫자 후 두 척수 조각들 사이의 기능 재생을 조사하기 위해, 현미경에 기록 챔버에서 MEA / 문화 어셈블리를 장착하고 약 500 μL 세포 외 용액 (자료 목록 참조)에 적용됩니다.
- 시스템이 안정 될 수 있도록, 제 1 기록하기 전에 10 분을 기다립니다.
- RT에서 MEA의 각 활동 검출 전극에서 약 10 분 동안 녹음 기본 자발적인 활동 배.
- 안정적인 세포 외 조건을 확인 모든 기록 세션 후 세포 외 솔루션을 교환합니다.
- 네트워크를 disinhibit하기 위해, 세포 외 솔루션 공동 적용스트 리키 닌 (1 μM)과 gabazine (10 μM)를 ntaining. 녹음을 시작하기 전에 최소 2 분 동안 기다립니다.
7. 데이터 분석
주 : 세포 외로 기록 활동 전위의 검출을 위해 각각의 전극과 표준 편차에 기초하여 후속 판별 검출기의 사용. 이 절차는 Tscherter 외. (3)에서 자세히 설명한다.
- 표준 절차 3 (그림 1 층)에 따라 래스터 음모에 각 전극의 검출 된 신경 세포의 활동을 표시합니다.
- 결정 및 1 msec의 단계만큼 시프트를 10msec의 슬라이딩 윈도우 내의 따른 채널의 이벤트의 수 합산함으로써 슬라이스마다 전체 네트워크 활동을 표시 (도 1G와 Tscherter 외. 3 참조).
- 각 조각 개별 버스트 (여러 전극에 표시 활동의 클러스터)에 감지합니다. 따라서, 대응하는 전체 네트워크 활동의 최소한의 피크 활동 임계치를 설정하고, 각 버스트 시작 및 버스트 끝을 정의한다. 예를 들어, 적절한 임계 값은 평균 버스트 진폭의 25 %이며, 버스트 개시는에서의 시간 윈도우 내의 마지막 이벤트 됨으로써 적어도 5 밀리 초, 버스트 종료의 시간 윈도우에서의 첫 번째 이벤트 인에 의해 정의 될 수있다 적어도 25 밀리 초 (하이 데르 외. 10 참조).
- 재생 기능이 두 조각간에 동기화 버스트의 백분율을 계산 정량화. 이를 위해, 하나의 슬라이스 버스트와 다른 슬라이스 내의 다음 버스트 사이의 대기 시간을 계산한다.
주 : 평균 대기 시간, 버스트 길이보다 작을 때, 버스트 쌍 불리는 "동기화"된다. 특히 활동의 많은 공동 배양 물에서, 가능성 양면 동시 선택 창의 대기 버스트를 개시하는 것이 존재한다. 이 사실은 SY의 비율의 정량에서 고려되어야nchronized 버스트. 계산에 대한 자세한 설명은 하이 데르 등의 알을 참조하십시오. 10.
문화와 면역 8. 고정
- 세척 또는 배양을 포함하는 모든 단계는 조직을 통해 솔루션의 적절한 확산을 위해 틸팅 테이블에 문화를 넣을 수 있는지 확인하십시오.
- 기록 세션이 설정에서 MEA / 문화 조립을 완료 직후, 페트리 접시 (35mm X 10mm)에 넣어 약 2 ml의 세포 외 용액을 추가합니다.
- 시험관의 시간 동안 형성 한 주변의 세포 층에서 조각을 분리하기 위해, 10 μL 피펫 팁을 가지고 조각을 동그라미. 문화를 손상하지 않도록주의하십시오. 이것은이 단계를 생략하지만,이 수행되는 경우, 나중에 삽입하는 것은 용이 할 수있다.
- 얇은 비금속 주사기 바늘을 사용하여 세포 외 soluti로 채워진 1 ML의 주사기와 조합 (자료 목록 참조)에 부드럽게 MEA 떨어져 문화를 날려 버릴 수 있습니다.
- 파스퇴르 피펫의 끝 부분을 제거하고 slivered 끝에 고무 전구에 맞게. (인산염 완충 식염수 (PBS, 0.1 M)와 4 % 파라 포름 알데히드) 정착액에 문화를 전송하는 백 엔드를 사용합니다. 너무 작은 및 배양이 절첩 될 것이고, 아마도 손상 때문에 전송 파스퇴르 피펫 팁의 표준을 사용하지 않는다. 4 ° C에서 2 시간 - 1 수정. 증류수로 MEA를 씻어 손가락 끝으로 조직 잔류 물을 제거하지만 손톱으로 긁지 않는다. 4 ℃에서 증류수에 보관 다자간
- 적어도 10 분마다 PBS에 문화를 배를 씻으십시오. 4 ° C에서 PBS에 저장하거나 직접 염색 절차를 시작합니다.
- 용액 (5 % 염소 혈청, 1 % 소 혈청 알부민, 0.3 % PBS 세제)을 차단하는 적어도 90 분 동안 배양 물을 배양한다.
- 차단 솔루션에 희석 최초의 항체를 추가하고 4 ℃에서 3 일 동안 품어.
- L에 대한 PBS에 세척 배동쪽으로 30 분마다.
- 실온에서 2 시간 동안 PBS에 희석 두 번째 항체를 추가합니다.
- 적어도 30 분마다 PBS에 세척 배.
- 객체 슬라이드에 제거 팁 파스퇴르 피펫으로 조각을 전송합니다. 초과 PBS를 제거하고 매체를 장착하여 내장.
Representative Results
E14 쥐 배아 척수 유래의 공동 배양의 기능 회복에 대한 가능성을 조사하기 위해, 병변은 28 DIV 8의 타임 윈도우에서 수행 하였다. 2~3주 후, 자발적인 신경 활동은 신체의 체중 측정 (그림 1 C & D)를 기록했다. 세포 외로 기록 된 활동 전위는 각각의 전극 (그림 1E) 오프라인 확인되었다. 네트워크 활동 플롯 다음 래스터 플롯이 생성 된 이러한 데이터 (그림 1 층)에서면 (그림 1G)마다 별도로 총 활동을 시각화합니다. 각 조각에서 자발적인 활동은 일반적으로 버스트로 구성되어있다. 슬라이스가 기능적으로 연결되어있는 경우, 이러한 버스트는 한 조각에서 다른 전파 할 수 있습니다. 따라서, 두 개의 조각 사이의 동기 버스트의 양을 정량적으로 재생 기능을 측정하기 위해 계산되었다. 어떻게 변환 INT의 상세한 설명은다른 플롯 O를 수행하고 동기화 된 활성의 백분율을 계산하기위한 공식이 유도 된 상황, 하이 데르 외. 10 참조주세요된다.
모든 실험에서, 활성은 제 표준 조건 하에서 기록되었다. 제 2 단계에서, 억제는 시냅스 세포 욕 용액 스트 리키 닌 (1 μM)와 gabazine (10 μM)을 첨가함으로써 차단 하였다. 이 탈 억제는 버스트의 정의함으로써 슬라이스 버스트 간의 동기화의 결정을 용이하게 연장 된 버스트 및 버스트 간격보다 규칙적인 활동 패턴, 통상 리드.
젊은 나이에 병변 문화 - 문화 나중에 단계 (> 19 DIV) (그림 2를 재생하는 기능에 뚜렷한 감소를 보였다에서 병변 반면 (7 9 DIV)는 2-3주 병변 후 동기화 활동의 높은 금액을 표시 - F). 이러한 결과는 나타내는 재생 능력은 그척수 슬라이스 배양 기능적 연결 배양 세 주 안에 생체 내에서 추가로 개발 된 상태를 나타내는 로우 레벨로, 생체 내에서 배아의 상태를 나타내는 하이 레벨로 감소한다.
연결의 어떤 종류는 실제로 두 조각 사이의 버스트 동기화에 관여? propriospinal 연결 외에, 섬유도의 motoneurons 또는 지느러미 루트 신경절 신경 세포에서 발생할 수 있습니다. 이것은 척수 10 슬라이스 화 사이 배측 루트 신경절 뉴런 기능적 연결성과 관련이없는 것으로 이미 밝혀졌다. 그러나,의 motoneurons의 참여 가능성이 남아 있었다. 운동 신경원은 니코틴 성 수용체 (13)을 통해 척수 뉴런 콜린성 연결을 형성하는 것으로 알려져 있기 때문에, 척수 공동 배양 물의 활성은 8 DIV, 문화는 고도로 활성 10 동기화 보여 시간, 니코틴 성 안타고니스트 Mecam 기록하였습니다아민 (MEC, 100 μM)은 세포 외 욕 용액에 첨가 하였다. 두 조각 사이의 연결에서의 motoneurons의 참여 동기 활동의 감소 비율을 초래할 것입니다. 그러나, 이러한 경우가 있었다 (MEC : 91.0 ± 4.5 %, N = 7; 제어 : 93.6 ± 4.6 %, N = 7, p> 0.05, 윌 콕슨 일치 쌍 시험). 이러한 결과는 콜린성 시냅스 슬라이스 간의 기능적 연결에 기여하지 않는다는 것을 시사한다. 운동 신경원이 또한 CNS (11), (15) 내의 글루타메이트 시냅스를 방출하는 것으로 나타났다 때문에, 이들 실험은 완전히 그들의 참여를 배제하지 않는다.
SMI-32를 실시했다과 운동 신경원에게 비 인산화 된 신경 미세 섬유의 면역 조직 화학적 염색과 H에 대해 동정을 행 하였다. 그들은 조각 (그림 3A)에 분산의 motoneurons에 대한 일반적인 몇 가지 레이블 큰 세포 기관을 밝혔다. SMI-32 항체 motoneuro의 세포체 라벨을보고되었다NS (12)이 발견은 또한 사용 된 배양 물 (13)도 마찬가지. 또한, B-III-tubulin의 또는 NeuN뿐만 아니라 아교 세포 기관, 예. 대한 일반적인 예에서 신경 세포 기관의 염색과는 GFAP 항체와 성상 세포는 다른 보고서와 일치하며 (이러한 종류의 세포 형태 학적 설명과 일치 그림 3 B - D). 그럼에도 불구하고, SMI-32 항체와 축삭의 라벨 (그림 3E)에 직결된다. 기대에 대해,이 항체를 사용하는 경우 섬유의 거대한 네트워크가 나타납니다 그리고 인산화 신경 미세 섬유의 H (그림 3 층) 레이블 SMI-31 염색 비슷합니다. 이 결과 중 하나는 해석은 신경 미세 섬유 인산화 / 탈 인산화의 개발 규제가 생체 내 상황에 비해 사용 문화 꽉 아니라고 할 수있다. 동일한 엑손의 인산화 및 비 인산화 neurofilaments의 혼합 된 발생 수는 폭발물이 발견을 아 인. 또 다른 가능성은 SMI-32는 표지 된 축색 돌기 뉴런에서 발생한다는 것이다. TSANG 및 동료 (16)는 그 예를 보여 주었다, 클라크의 열 및 intermediolateral 세포 열 뉴런의 motoneurons 외에 SMI-32에 의해 염색된다. 이러한 신경 세포의 발음 신경 돌기의 증식은 SMI-32 개의 긍정적 인 섬유의 풍요 로움을 설명 할 수 있었다.
그림 1. 디스플레이 및 자발적인 활동의 분석. (A) MEA의 다이어그램. 백금 피복 전극은 검은 색, 빨간색 투명 전선과 노란색의 MEA의 중앙에있는 홈에 그려져있다. (B) MEA의 중심에있는 전극 배열의 근접. 다이어그램은 친절 박사 M. Heuschkel에 의해 제공됩니다. (C) 8 DIV 이전이 배양의 밝은 필드 이미지전자. 슬라이스는 성장과 서로 마주 보는 변을 따라 접합했다. 노란색 막대는 MEA의 electrode- 및 절연없는 홈을 나타냅니다. 실험의 스케일 바 = 400 μm의 (D) 타임 라인. E14 쥐 배아의 두 척수 조각은 다자간에 서로 옆에 배치됩니다. 며칠, 슬라이스 성장 퓨즈 대향 측면을 따라. 8 시간 프레임에서 - 28 DIV 완료 병변 융합 사이트를 통해 수행된다. 2-3 주 후에 자발적인 활동이 기록되고, 문화 면역 조직 화학 염색에 고정되어 있습니다. (E) 23 DIV 옛 문화의 각 전극의 자발적인 활동을 추적합니다. 명확하게 시각화를 들어, 매 두 번째 추적이 도시되어있다. 오렌지 트레이스는 왼쪽에서 오른쪽 조각으로부터 기록 된 활동, 푸른 흔적을 도시한다. 버스트의 대부분은 둘 사이에 동기화된다. 왼쪽 슬라이스 만 페이지에서 발생하는 버스트에 화살표가artially 오른쪽 슬라이스로 전파. 오른쪽 슬라이스 내의 활성 그러나 따른 측의 평균 최대 피크 활성의 적어도 25 %의 선택 임계치에 도달하지 않았으며, 따라서 버스트로서 검출되지 않는다. 오른쪽 배율은 마지막 동기화 버스트 쌍을 도시한다. (E)에 도시 된 활성 (F) 래스터 플롯. (E)에 도시 활동의 정의 버스트 (기준선 아래 바)와 (G) 네트워크 활동 플롯. 하이 데르 등. 10에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2.하지 동기화 작업 대 동기화. (A, B) 문화의 래스터 플롯 lesione젊은 나이에 D (7시 - 9 DIV), 표준 조건 (A) 및 탈 억제 아래 (B)에서 동기화 작업을 게재합니다. (C, D) 표준 조건 (C) 및 탈 억제 아래 (D)가 아니며, 동기화 활동을 보여주는 (> 19 DIV에서) 나이에 병변 문화, 래스터 플롯. 동기화 활동 (E, F)의 평균 비율은 표준 조건 (E) 및 탈 억제에서 (F)에서 기록 된 각각의 병변 하루 꾸몄다. 3 주 병변의 날 이후 - 녹음은 2 촬영했다. 하이 데르 등. 10에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Figure 3. 면역 조직 화학적 특성. SMI-32 motoneuronal 세포 기관의 (A) 염색. (B) 성숙한 신경 세포 기관과 그 과정의 β-III의 튜 불린 라벨. GFAP와 성상 세포의 (C) 확인. NeuN 성숙한 신경 세포 본체의 (D) 레이블. SMI-31에 의해 식별 비 인산화 된 신경 미세 섬유 H. (F)의 인산화 된 신경 미세 섬유 H (E) SMI-32 염색. 하이 데르 등. 10에서 적응. 모두 그 주, SMI-31, SMI-32, 섬유의 대규모 네트워크는 문화에서 볼 수 있습니다. 바 AD = 20 μm의 H & F = 100 ㎛. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
제시된 절차의 여러 요소가 정확하고 재현성있는 실험의 성과에 대한 기본적인. MEA의, 용액의 제조 및 슬라이스 배양 물의 제조시 모든 단계는 층류 후드에서 멸균 조건 하에서 수행된다. 그들은 자발적인 활동 (14)에 영향을 미칠 수 있기 때문에 항생제는 영양 배지에 적용되지 않습니다. MEA 코팅시, 가장 중요한 부분은 세포 외 기질 겔 용액 항상 차가운 유지하는지 확인하는 것입니다. 냉장고에 전체 절차 얼음에 보관은 해동은 0 ℃에 가까운 최대 온도를 확인합니다. 빙냉 해부 버퍼를 사용하여 저온 슬라이스 빠른 분리 및 절편의 제조뿐만 아니라, 신경을 쓰는 동안 건강 문화의 비율을 증가시킨다. 또한, 플라즈마 / 트롬빈 응고는 가장 중요한 단계 중 하나이다. 첫째, 플라즈마가 제대로 mixe 있는지 확인트롬빈와 D. 둘째, MEA의 슬라이스에 적절히 부착되도록 최대한 잔사를 제거하기에 특히주의. 이 단계는 매우 시간에 민감한입니다; 기간이 너무 짧으면, 혈장 / 트롬빈 혼합물을 너무 많이 제거한다. 기간이 너무 길면, 응고 이미 잔여 혈장 / 트롬빈과 함께 조각을 제거하는 위험을 증가 일어났다.
기계적인 병변을 계획하는 경우에는, 그것은 정확한 디자인을 가진 MEA를 사용하는 것이 중요하다. 병변 의도 지역은 전극, 배선 및 절연의 자유를 필요로한다. 그렇지 않으면, MEA의 전기가 손상 될 수 있으므로, 어떤 기록이 더 이상 수행 할 수없는 것입니다.
다른 중요한 단계는 병변의 크기에 관한 것이다. 그것은 병변 후 두 젊은 조각을 다시 연결하는 것은 이틀 10 걸리는 이전에 표시되었습니다. 모든 실험을 위해, 엄지 손가락의 규칙은 공간 betwe 것을 사용병변 후 조각 엉 MEA 홈 (300 μm의)의 폭보다 더 큰이어야한다. 병변이 더 재 연결이 전혀 너무 큰없는 경우 더 큰 병변의 크기, 재 연결을위한 긴 시간 프레임에서 발생 또는 수 있습니다. 주석, 전 실험 밝혀 그 매우 낮은 연결 속도에 초기 두 조각의 배치에 더 멀리보다 1mm 결과.
대신 인큐베이터 37 ° C의 녹음, RT 적어도 10 분의 조정 시간의 시작하기 전에, 그리고 세포 외 용액에 대신 영양 매체의 권장합니다. 이러한 초기 분 동안의 활동 패턴의 확대 관찰 측정 된 데이터는 기록이 시작된 적절 후 문화의 붕괴의 패턴을 나타내는 것을 보장한다.
활동, 데이터 수집 및 추가 처리의 검출을 위해, 제 하드웨어는 랩의 프로그램 (증폭기 및 증폭기에 연결 실 촬영)보기, C ++ 및 IgorPro이 사용된다. 상업 MEA의 설정 및 기타 소프트웨어 패키지는 이러한 작업뿐만 아니라 적합합니다. 여기서, 전극 볼 신호는 1,001 배 증폭하고 6 kHz의 속도로 디지털화된다.
생체 내에서, 그들은 상승 및 섬유 책자를 내림차순의 간섭을받지 않고 공부하기 어려운 있기 때문에 제시된 모델은 propriospinal 연결을 검사 할 수있는 유용한 도구가 될 수 있습니다. 두 척수 조각의 공동 배양은 우아하게이 문제를 회피 할 수 있습니다. 배양 물은 엄격하게 제어하고 쉽게 조작 할 수있는 미세 환경을 제공한다. 한편, 척 주상과 감각 입력은 누락 물론이다. 또한, 문화의 제조 프로세스는 CNS 손상 상황을 나타낸다. 성상 세포 및 미세 아교 세포와 같은 신경 교세포가 따라서 증가 된 증식과 함께 병변에 반응하는 것으로 알려져있다, 조직 재구성 어느 정도이다. 제시된 모드에 관한기계적인 병변을 수행 한 후 L 교세포 반흔의 형성은 관찰되지 않았다. 한 설명은 성상 세포의 적응 메커니즘이 이미 준비 과정이 트리거되었는지와 문화 병변 상기 반응에 포함되지 않은 것일 수있다. 또한, 수초 관련 억제제의 참여, 예에 대한 증거가 없다., 노고, 나이에 병변 문화의 낮은 재생 가능성이있다. 그러나, 롤 리프 람이, 조각 (10) 사이에 23 DIV 증가 기능 재생에 병변을 수행 한 후 바로 시작하는 포스 포 디에스 4 억제제가 치료를 줬습니다. 이 결과는 기능 회복이 오래 배양에서 증가 될 수 있음을 보여준다. 병변 사이트를 건너 축색 돌기의 수를 계산하는 경우에 띄게, 젊은 나이에 병변 문화와 나이에 병변 문화 간의 차이는 발견되지 않았다. 이러한 연구 결과는 축삭 재생의 부족이 주요 이유 F없는 제안따라서 또는 배양 후반 병변 후 회복 손실 및 재생의 기능적 분석을 가능 모델에 대한 필요성을 강조한다. 시냅스 형성과 시냅스는 복구 프로세스 (10)에서 중요한 역할을 할 수있다. 이러한 메커니즘은 최근 몇 년 동안 많은 관심을 받고 있으며 현재 널리들이 척수 손상 후의 결과에 큰 영향을 미칠 것으로 받아 들여진다. 따라서, 격리 및 훌륭한 세부 사항에 이러한 프로세스를 조사하기 위해 안정된 조건을 제공하는 모델은 확실히 척수 기능 회복에 대한 통찰력을 얻을하는 데 도움이 될 수 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
| Nutrient medium | For 100 ml | ||
| Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
| Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
| distilled, sterile water | 10 ml | ||
| Nerve growth factor-7S [5 ng/ml] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
| reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
| Coating solution | |||
| Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
| medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
| Wash solution | [mg/L] | ||
| MgCl2-6H2O | 100 | ||
| MgSO4-7H2O | 100 | ||
| KCl | 400 | ||
| KH2PO4 | 60 | ||
| NaCl | 8,000 | ||
| Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
| D-Glucose (Dextrose) | 1,000 | ||
| According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
| Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
| NaCl | 145 | ||
| KCl | 4 | ||
| MgCl2 | 1 | ||
| CaCl2 | 2 | ||
| HEPES | 5 | ||
| Na-pyruvate | 2 | ||
| Glucose | 5 | ||
| Blocking Solution | |||
| Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
| Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
| Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
| Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
| Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
| Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
| Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
| SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
| SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
| Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
| Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
| Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 | |
References
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