Gransker Funksjonell Regeneration i organotypiske Ryggmargs Co-kulturer dyrket på Multi-elektrode Arrays

Summary

Her presenterer vi en protokoll som er basert på ryggmargs skiver dyrket på multi-elektrode arrays for å studere funksjonelle regenerering av propriospinal tilkoblinger in vitro.

Introduction

Organotypiske skive kulturer i sentralnervesystemet (CNS) har vært anvendt i stor utstrekning for å studere forskjellige fysiologiske og patologiske fenomener som strakk seg fra neuronal utvikling til neurodegenerering. Sammenlignet med dissosierte cellekulturer, organotypiske stykker byr på den fordel mer kompleksitet med en intakt cytoarchitecture og lokal synaptisk kretser. På samme tid, kan vevet analyseres på en isolert måte, uten behov for å implisere det detaljerte hele in vivo sammenheng. Videre er enkel og gjentatt adgang til cellene i valg berettiget, det ekstracellulære miljø kan kontrolleres nøyaktig, og vanligvis, in vitro modeller er mindre kostbare enn deres in vivo motstykker. I de senere årene, ulike studier presenteres slående likheter mellom de utviklingsmessige profiler av langsiktige kulturer kontra tilsvarende levende dyr ^1,2. Det er blitt vist at neuronal kretser av forskjellige CNS regions uttrykke spontan nettverksaktivitet under utvikling og at organotypiske skiver delvis opprettholde dette fenomenet ^{3 -7.} Isolerte ryggmargs forberedelser er særlig brukes til å undersøke rytme generasjon ⁶ og dannelsen av nevrale kretser ^1.

En måte å registrere den spontane aktiviteten organotypiske skiver er til kultur dem på toppen av multi-elektrode arrays (måle). Disse enhetene inneholder flere elektroder som kan overvåke de ekstracellulære potensialer generert av aksjonspotensialer fra mange celler samtidig (multi-unit opptak). Den høye tidsmessig oppløsning av MEA-opptak kan bli brukt til å rekonstruere de nøyaktige aktivitet dynamikken i en gitt neuronal krets. I tillegg, i motsetning til patch-klem teknikken er ikke-invasiv, som tillater langtidsmålinger og resulterer i det faktum at neuroner ikke påvirkes i sin adferd.

Feller formålet med denne studien var kombinasjonen av organotypiske ryggmargs co-kulturer og flersteds innspillinger brukes til å undersøke funksjonelle regenerering i ryggmargen. Siden voksen høyere virveldyr har begrenset potensial for å gjenopprette fra skade i ryggmargen, har ulike strategier blitt studert for å fremme foryngelse etter ryggmargsskade. Så langt har corticospinal veiene vanligvis vært modell system av valget for slike undersøkelser. Disse forsøk er vanligvis tidkrevende, kostbart og krever store dyr kullene på grunn av høy variabilitet i enkeltgrupper. Videre antyder bevis på at propriospinal tilkoblinger (nevroner som er helt låst i ryggmargen) kan spille en sentral rolle i gjenopprett følgende ryggmargslesjoner ^8. Disse fibrene er vanskelig å studere in vivo uten forstyrrelser av stigende og synkende fiber traktater. Bonnici og Kapfhammer ⁹ brukes langsgående ryggmargenslice kulturer av postnatal mus som en alternativ tilnærming. Etter å ha utført mekaniske skader de analyserte semi-kvantitativt den morfologiske regenerering av axoner mellom ryggmargssegmenter. De observerte mindre, men ikke ingen axoner krysser lesjon området i kulturer kuttet i voksen alder. I kontrast kulturer som ble lesioned i yngre stadium viste en høy mengde av aksonal regenerering 5 - 7 dager etter skaden. Men bevis for funksjonelle forbindelser ble ikke presentert.

Derfor kan utviklingen av en representativ in vitro modell av propriospinal fibre som tillater undersøkelse av funksjonell restitusjon være et verdifullt verktøy for å utvide kunnskapen om regenerative prosesser i ryggmargen.

Protocol

Dyr omsorg var i samsvar med retningslinjer godkjent av sveitsiske lokale myndigheter (Amt für Landwirtschaft und Natur des Kantons Bern, Veterinärdienst, Sekretariat Tierversuche, godkjenning Nrs. 52/11 og 35/14). Disse retningslinjene er i samsvar med EU-direktiv 2010/63 / EU.

Merk: Arbeid i en laminær hette med sterile instrumenter og løsninger for alle trinn 1 - 5 inkludert under trinn.

1. Utarbeidelse av MEAs

Merk: MEAs er sammensatt av et glass-substrat, mikro-metallelektroder og et SU-8 polymerisolasjonssjikt (se også Tscherter et ^{al. 3).} For formålet med denne studien, ble kommersielt tilgjengelige MEAs bestilles med en tilpasset elektrodesystem layout (figur 1 A & B). De 68 elektrodene er anordnet i et rektangulært gitter som er delt i to soner ved en 300 mikrometer brede spor fri for elektroder, elektriCal fører og isolasjon. Hver elektrode er 40 x 40 mikrometer i størrelse, og de er adskilt fra hverandre ved 200 nm fra senter til senter. Fire store jordelektroder er plassert rundt registreringsstedet. De skiller seg fra andre kommersielt tilgjengelige standard MEAs i deres størrelse (21 mm x 21 mm), og de har ingen fast opptakskammeret.

1. For desinfeksjon skylle MEAs i 100% etanol (2x), 70% etanol (1x) og destillert vann (2x) i minst 30 sekunder hver. La tørke. Sett 10 - 12 MEAs i et rent glass petriskål (150 mm x 25 mm), og lukk lokket.
2. Autoclave MEAs for 20 minutter ved 120 ° C. Oppbevar ved romtemperatur.
3. Forbered belegg løsning (se liste materialer) for de MEAs og butikk alikvoter ved -20 ° C.
4. Sette hver MEA i et individ steril petriskål (35 mm x 10 mm).
5. Bruker en avkjølt pipette for å sette 150 ul avkjølt beleggoppløsningen på toppen av elektrodene og lukke lokket av petriskålen. Etter ca 10 min, sjekk for luftbobler på toppen avelektrodene og fjern forsiktig dem med en gummikledd patel om nødvendig. La den hvile i 1 time ved RT.
6. Sug belegg løsningsester, vaskes 1 gang med medium optimalisert for prenatal og embryonale nevroner og 2 ganger med destillert, sterilt vann. Hvis MEAs ikke er vant til neste dag, holde dem i destillert, sterilt vann ved 37 ° C i kuvøse O / N. Ellers la direkte tørke ved romtemperatur.

2. ingrediensene som kreves for utarbeiding og vekst av organotypiske kulturer

1. Forbered kalsium fritt vaskeløsning (se liste materialer).
2. Rekonstituer kylling plasma i vaskeoppløsning (1: 1, riste forsiktig, unngå dannelse av bobler), sentrifuger ved 3000 xg i 20 minutter og dekanter klart innhold inn i et sterilt rør. Delmengde 200 ul inn cryotubes og oppbevares ved -20 ° C.
3. Rekonstituer trombin fra bovint plasma tilsvarende (200 U / ml) og sterilfilter (0,2 pm pore-filter). Alikvote 200 ul inn crytotubes og oppbevares ved -20 ° C.
4. For 30 kulturer forberede 100 ml næringsmedium (se liste materialer).

3. Spinal Cord Tissue Dissection

Merk: Fremgangsmåte utbytter, avhengig av antall embryoer, ryggmargs skiver i ca. 25 - 35 ko-kulturer, og fremstilles i en laminær strømningshette under sterile betingelser.

1. Anvende en dødelig dose av pentobarbital (0,4 ml) til moder dyret ved intramuskulær injeksjon. Bekreft dyp anestesi ved å sjekke pedalen tilbaketrekking refleks. Lever E14 rotte embryoer ved keisersnitt og offer ved halshogging.
2. Overfør likene av embryoene i en petriskål fylt med sterilt, kjølt, vaskeløsning.
3. Utføre en fullstendig tverrgående snitt med en skalpell ovenfor bakbena og en annen over forlemmene og fjerne bena fra kroppen. Deretter gjør et kutt i frontalplanet for å skille innvollene fra bakstykke inneholdende rygg cord.
4. For kutting, overføre bakstykkene som inneholder ryggmargen en om gangen på en monteringsplaten og kuttet med en tykkelse på 225 - 250 pm med en tissue chopper. Sett en dråpe vask løsning på hakket vev og overføre skiver med en slikkepott i 35 mm x 10 mm petriskåler fylt med sterilt, kjølt, vaskeløsning.
5. For hver skive separat, dissekere ryggmargen fra gjenværende vev. La ryggmargen vedlagt.
6. La skivene hvile i 1 time ved 4 ° C.

4. Montering ryggmarg vevssnitt på MEAs

1. Varm opp sterilt næringsmedium i inkubatoren (37 ° C, lett skrus løs lokk for oksygenering).
2. Stilling MEA med steril pinsett med gummibelagte tips ved RT i petriskålen under et stereomikroskop med elektrodegruppen i fokus. Sentrere en 6 pl dråpe av kylling plasma på rene, støvfritt, og steril elektrode array. Ved hjelp av en liten slikkepott, skyvto ryggmargs seksjoner med ventral sider mot hverandre i plasma dråpen. Ikke rør elektrodene med slikkepott.
3. Legg 8 mL av trombin rundt kyllingen plasma dråpen. Bruk av trombin pipettespissen, nøye mikse og spre kylling plasma / trombin blandingen rundt de to skiver. Igjen, ikke røre den sprø elektrodegruppen direkte. Like før koagulering, aspirer overflødig kylling plasma / trombin.
4. Lokk på petriskål for å beholde høy fuktighet, mens den MEA / kultur enheten sitter i ca. 1 time i et fuktet kammer inne i inkubator ved 37 ° C.
5. Tilsett forsiktig 10 ul av næringsmedium med kulturen kammeret cap petriskål og satt tilbake i inkubatoren i omtrent 30 min.
6. Plasser hver MEA / kultur montering med sterile, gummibelagte tips til en berg tube, tilsett 3 ml næringsmedium og tett lukke lokket. Plasser valsen røret i valsen trommelen roterer ved 1-2 opm i inkubatoren i en 5% CO
7. Endre halvparten av næringsmedium etter 7 dager in vitro (DIV) og etterpå 1 - 2 ganger per uke.

5. Mekaniske lesjoner

1. Ta MEA / kultur montering med sterile, gummibelagte tips ut av rullen rør og plasser i en petriskål uten næringsmedium under en stereo mikroskop med vevet i fokus. Visuell kontroll av at de to skivene er smeltet.
2. Hold MEA / kultur montering stødig ved å plassere pinsett med gummibelagte tips om MEA.
3. Plasser et skalpellblad i sporet på MEA nær vevssnitt. Hold skalpell heller horisontalt.
4. Løft skalpell håndtaket opp, men la den bli skalpellblad i sporet på MEA på en slik måte at bladet "ruller" fra basen til spissen, og derved skjærer gjennom vevet som dekker sporet.
5. Alvorlig eventuelle rest vev forbindelser med en 25 G nål tips hvis nødvenær. Arbeid bare i området i sporet og ikke røre konkurranse kantene.
6. Sett MEA / kultur enheten i valsen røret. Gi 3 ml fersk næringsmedium til kulturene og legg dem tilbake i valsen trommelen i kuvøse.

6. Elektro Recordings of Spontan aktivitet

1. For å undersøke funksjonelle regenerering blant de to ryggmargs skiver etter valgt antall DIV, montere MEA / kultur montering i et opptak kammer på et mikroskop og bruke ca 500 mL ekstracellulært løsning (se liste materialer).
2. Vent 10 minutter før det første opptaket slik at systemet til å stabilisere seg.
3. Rekordgrunnleggende spontan aktivitet 2x for ca 10 min fra hver aktivitet-detektering elektrode av MEA på RT.
4. For å sikre stabile ekstracellulære forhold, utveksle ekstracellulært løsning etter hvert opptak.
5. Til disinhibit nettverket, gjelder ekstracellulært løsning containing stryknin (1 mm) og gabazine (10 mm). Vent i minst 2 minutter før opptaket.

7. Data Analysis

Merk: For deteksjon av ekstracellulært registrert aksjonspotensialer bruke for hver elektrode en detektor basert på standardavvik og en påfølgende discriminator. Denne fremgangsmåten er beskrevet i detalj i Tscherter et al. ^3.

1. Vise detektert neuronal aktivitet av hver elektrode i et raster plott i henhold til standardprosedyrer ³ (figur 1F).
2. Bestemme og vise den totale nettverksaktivitet for hver skive ved å summere opp antall hendelser i henhold kanaler innenfor en glidende vindu på 10 ms, forskjøvet med 1 ms trinn (Figur 1G og se Tscherter et al. ^3).
3. Oppdage i hver skive individuelle bursts (klynger av aktivitet som vises på flere elektroder). Derfor, Satt en minimal topp aktivitet terskel i den tilsvarende total nettverksaktivitet og definere hvert sprekke start og brast slutt. For eksempel, er en passende terskelverdi 25% av den gjennomsnittlige burst amplitude og en spreng start kan defineres ved at den første hendelse i et tidsvindu på minst 5 millisekunder, en burst ende ved å være den siste arrangement i et tidsvindu på minst 25 msek (se Heidemann et al. ^10).
4. For å kvantifisere funksjonell restitusjon beregne hvor stor andel av synkroniserte støt mellom de to skiver. For å gjøre dette, beregne ventetid mellom et utbrudd i én sektor og følgende utbrudd i andre skive.
   Merk: En burst pair kalles "synkronisert" når latency er mindre enn gjennomsnittet burst lengden. Spesielt i co-kulturer med mye aktivitet, finnes det en mulighet for at begge sider tilfeldigvis starte et utbrudd i det valgte latency vinduet. Dette faktum må tas i betraktning ved kvantifisering av prosentandelen av synchronized bursts. For en nærmere beskrivelse av beregningene se Heidemann et al. ^10.

8. Fiksering av kulturer og Immunohistochemistry

1. For alle trinn som omfatter vasking eller inkubasjon sørge for å sette kulturene på et bord skråstilling for å sikre korrekt spredning av løsningen gjennom vevet.
2. Rett etter innspillingen er ferdig tar MEA / kultur enheten ut av oppsettet, legg den i en petriskål (35 mm x 10 mm) og tilsett ca 2 ml av ekstracellulært løsning.
3. For å skille skivene fra de omkringliggende cellelagene som har dannet i løpet av tiden in vitro, ta en 10 mL pipette tips og sirkel skiver. Ta hensyn til ikke å skade kulturer. Det er mulig å utelate dette trinnet, men innebygging senere er enklere når det er utført.
4. Bruk en tynn metallisk sprøyte nål (se materialer liste) i kombinasjon med en 1 ml sprøyte fylt med ekstracellulære solutipå å forsiktig blåse kulturen av MEA.
5. Fjern spissen av en Pasteur pipette og monter gummi pære på slivered slutten. Bruk den bakre enden for å overføre kulturen til fiksativ (4% paraformaldehyd med fosfatbuffret saltvann (PBS, 0,1 M)). Ikke bruk av standard tuppen av Pasteur pipette for overføringen, fordi det er for lite, og kulturene ble foldet og sannsynligvis skadet. Fix for 1 - 2 timer ved 4 ° C. Skyll MEA med destillert vann og fjerne vev rester med fingertuppene, men ikke skrape med neglen. Oppbevar MEAs i destillert vann ved 4 ° C.
6. Vask kulturene 3 x i PBS i minst 10 minutter hver. Oppbevar i PBS ved 4 ° C, eller direkte starte med fargeprosedyre.
7. Inkuber kulturene i minst 90 minutter i blokkeringsløsning (5% geiteserum, 1% bovint serumalbumin, 0,3% detergent i PBS).
8. Legg det første antistoff fortynnet i blokkering løsning og inkuberes i 3 netter på 4 ° C.
9. Vask 3 x i PBS i l iøst 30 min hver.
10. Legge til det andre antistoff fortynnet i PBS i 2 timer ved RT.
11. Vask 3 x i PBS i minst 30 minutter hver.
12. Overfør skiver med en Pasteur pipette med fjernet spiss på et objekt lysbilde. Fjern overflødig PBS og legge inn med monteringsmedium.

Representative Results

Å undersøke potensialet for funksjonelle utvinning av co-kulturer som stammer fra ryggmargen av E14 rotte embryoer, ble lesjoner utført i et tidsvindu på 8-28 DIV. 2 til 3 uker senere, ble den spontane neuronal aktivitet registrert med MEAs (Figur 1 C & D). De ekstracellulært registrert aksjonspotensialer ble identifisert pålogget for hver enkelt elektrode (figur 1E). Fra disse data ble generert raster-plott (figur 1F), fulgt av nettverket virksomhets plott for å visualisere den totale aktiviteten separat per side (figur 1G). I hver skive den spontane aktiviteten er vanligvis organisert i bølger. Hvis skivene er funksjonelt koblet til, kan disse sprekker forplanter seg fra den ene skive til den andre. Derfor ble mengden av synkroniserte støt mellom de to skiver beregnet til kvantitativt å måle funksjonell restitusjon. For en detaljert beskrivelse av hvordan transformasjonen into de forskjellige tomter er utført og hvordan formelen for beregning av prosentandel av synkronisert aktivitet ble avledet, se Heidemann et al. ^10.

I alle forsøk ble aktiviteten først ført under standard betingelser. I et andre trinn ble synaptiske inhibering blokkert ved tilsetning av stryknin (1 uM) og gabazine (10 pM) til den ekstracellulære badløsningen. Dette disinhibition fører vanligvis til en mer regelmessig aktivitet mønster med lange serieopptak og brast intervaller, noe som forenkler definisjonen av bursts og dermed fastsettelse av burst synkronisering mellom skivene.

Kulturer lesioned i ung alder (7-9 DIV) viste en høy mengde synkronisert aktivitet 2-3 uker etter lesjon, mens kulturer lesioned på senere stadier (> 19 DIV) viste en tydelig reduksjon i evnen til å regenerere (figur 2 A - F). Disse funnene tyder på at regenerering evneav funksjonelle forbindelser i ryggmargs skive kulturer reduseres fra et høyt nivå, som representerer den embryoniske tilstand in vivo, til et lavt nivå, som representerer videreutviklet tilstand in vivo, i løpet av tre uker i kultur.

Hva slags tilkoblinger er faktisk involvert i brast synkronisering mellom de to skiver? Foruten propriospinal tilkoblinger, kan fibrene også oppstå fra motoneurons eller rygg root ganglion nevroner. Det har vist seg tidligere at rygg root ganglion nevroner er ikke relevante for den funksjonelle tilkobling mellom ryggmargen skiver ^10. Men involvering av motoneurons forble en mulighet. Siden motoneurons er kjent for å danne kolinerge forbindelser til ryggmargs nevroner gjennom nikotinreseptorene ^13, ble aktiviteten til ryggmargs co-kulturer registrert ved 8 DIV, en tid da de kulturer viser svært synkronisert aktivitet ^10, og nikotin antagonist Mecamylamin (MEC, 100 uM) ble tilsatt til det ekstracellulære badløsningen. En deltakelse av motoneurons i forbindelsen mellom de to skiver vil resultere i en redusert prosentandel av synkronisert aktivitet. Imidlertid var dette ikke tilfelle (MEC: 91,0 ± 4,5%, n = 7, kontroll: 93,6 ± 4,6%, n = 7, p> 0.05, Wilcoxon matchet parvis test). Disse resultatene tyder på at kolinerge synapser ikke bidrar til den funksjonelle forbindelse mellom skiver. Men siden motoneurons har også blitt vist å frigi glutamat ved synapser i CNS ^{11, 15,} disse eksperimentene ikke helt utelukke deres engasjement.

Å identifisere motoneurons immunhistokjemiske stainings mot ikke-fosforylert neurofilament H med SMI-32 ble utført. De avdekket flere merkede store cellelegemer typiske for motoneurons, fordelt over skiver (figur 3A). SMI-32 antistoffet har blitt rapportert å merke cellen likene av motoneurons ^{12 og} dette funnet gjelder også for de brukte kulturer ^13. Også stainings av nervecellelegemer generelt, for eksempel, mot b-III-tubulin eller Neun samt gliacelle organer, f.eks., Astrocytter med GFAP antistoff er i tråd med andre rapporter og matche morfologiske beskrivelser av disse celletyper ( Figur 3 B - D). Likevel er den merking av aksoner med SMI-32-antistoff angå (figur 3E). Mot forventningene, vises et stort nettverk av fibre ved bruk av dette antistoffet og det ligner på SMI-31 flekker som merker fosforylert neurofilament H (Figur 3F). En tolkning av dette resultatet kan være at den utviklingsmessige regulering av neurofilament fosforylering / defosforylering er ikke så tett i de anvendte kulturer i forhold til in vivo-situasjonen. En blandet forekomst av fosforylerte og ikke-fosforylerte nevrofilamenter på samme axon kunne eksplain dette funnet. En annen mulighet er at SMI-32 merket axoner oppstå fra projeksjon nevroner. Tsang og kolleger ¹⁶ har vist at for eksempel, er Clarks kolonne og intermediolateral celle kolonne nevroner farget av SMI-32 foruten motoneurons. Uttalt neurite spredning av slike nerveceller kan også forklare den overflod av SMI-32 positive fibre.

Figur 1. Vis og analyse av Spontan aktivitet. (A) Diagram av en MEA. Platinaelektroder dekket er vist i sort, de transparente trådene i rødt og sporet i midten av MEA i gult. (B) nærbilde av elektrodegruppen befinner seg i midten av MEA. Diagrammene er vennlig levert av Dr. M. Heuschkel. (C) Bright-feltet bilde av en 8 DIV gammel culture. Sektorene har vokst og smeltet sammen langs sidene som vender mot hverandre. Den gule linjen representerer elektrode og isolasjon frie sporet av MEA. Scale bar = 400 mikrometer (D) Tidslinje eksperimenter. To ryggmargs skiver av E14 rotte embryoer er plassert ved siden av hverandre på MEAs. I løpet av få dager, skivene vokse og sikring langs sidene som vender mot hverandre. I et tidsrom på 8-28 DIV, er fullstendig lesjoner utføres via fusjon området. To til tre uker senere den spontane aktiviteten er registrert og kulturene er fast for immunhistokjemiske stainings. (E) spontane aktivitet spor av hver individuelle elektrode av et 23 DIV gammel kultur. For klarere visualisering, er bare hver andre spor illustrert. Oransje spor skildre aktivitet som er registrert fra skive på høyre side, blå spor fra venstre side. De fleste av de bursts er synkronisert mellom de to. Pilen peker på et utbrudd forekommer i venstre skive som bare partially spredd til høyre skive. Aktiviteten i den høyre skive, men nådde ikke den valgte terskelverdi på minst 25% av den gjennomsnittlige maksimale topp aktivitet av det i henhold til siden, og derfor ikke blir gjenkjent som en burst. Forstørrelse på høyre side viser det siste par synkroniserte briste. (F) Raster plott av aktiviteten vist i (E). (G) for nettverksaktivitet tomt med definerte bursts (barer under baseline) av aktiviteten vist i (E). Tilpasset fra Heidemann et al. ^10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Synkronisert versus ikke synkronisert aktivitet. (A, B) Raster plott av kulturer lesioned i ung alder (på 7 - 9 DIV), viser synkronisert aktivitet under standardbetingelser (A) og etter disinhibition (B). (C, D) Raster plott av kulturer lesioned i en alder (ved> 19 DIV), viser ikke synkronisert aktivitet under standardbetingelser (C) og i henhold disinhibition (D). (E, F) Gjennomsnittlig prosent av synkronisert aktivitet plottet for hver enkelt lesjon dag ført under standardbetingelser (E) og i henhold til disinhibition (F). Opptakene ble tatt 2 - 3 uker etter dag av lesjon. Tilpasset fra Heidemann et al. ^10. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Immunhistokjemisk karakterisering. (A) Farging av motoneuronal celle organer med SMI-32. (B) β-III tubulin merking av modne nevronale cellelegemer og deres prosesser. (C) Identifisering av astrocytter med GFAP. (D) Merking av modne nevronale cellekroppen med Neun. (E) SMI-32 farging av ikke-fosforylert neurofilament H. (F) Fosforylert neurofilament H identifisert ved SMI-31. Tilpasset fra Heidemann et al. ^10. Legg merke til at med begge, er SMI-31 og SMI-32, et stort nettverk av fibre synlig i kulturene. Barer AD = 20 mikrometer, H & F = 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Flere elementer i den framlagte prosedyren er grunnleggende for gjennomføring av nøyaktige og reproduserbare eksperimenter. Alle trinn under fremstillingen av MEAS, oppløsninger og fremstilling av skive kulturer utføres under sterile betingelser i en laminær strømningshette. Antibiotika er ikke brukt til næringsmedium fordi de kan påvirke den spontane aktiviteten ^14. Under MEA belegg, er den viktigste delen for å være sikker på at den ekstracellulære matrise geloppløsning holder seg kald hele tiden. Tine den i kjøleskapet og holde det på is for hele prosedyren for å sikre en maksimal temperatur nær 0 ° C. Under fremstillingen av skiver rask isolering og snitte, så vel som å legge merke til en lav temperatur ved hjelp av iskald disseksjon buffere øker andelen av friske kulturer. Videre er plasma / trombin koagulasjon en av de mest kritiske trinn. Først må du kontrollere at plasma er skikkelig mixed, med trombin. Sekund, betaler spesiell oppmerksomhet til å fjerne så mye rester som mulig for å sikre riktig feste av skivene til MEAs. Dette trinnet er ekstremt tidssensitiv; hvis tidsrammen er for kort, for mye av plasma / trombin blandingen blir fjernet. Dersom tidsrammen er for lang, koagulering allerede har skjedd, som øker risikoen for å fjerne stykker sammen med det gjenværende plasma / trombin.

Dersom mekaniske lesjoner planlegges, er det viktig å bruke MEAs med en nøyaktig utforming. Området hvor lesjonen er ment må være fri for elektroder, ledninger og isolasjon. Ellers blir elektrisk av MEA kommer til å være skadet, og derfor kan ingen opptak gjøres lenger.

En annen avgjørende skritt gjelder størrelsen på lesjonen. Det har vist seg tidligere at du kobler to unge skiver etter lesjon tar ca to dager ^10. For alle forsøkene ble tommelfingerregel brukes som plassen betweno skivene etter lesjonen bør ikke være større enn bredden av MEA sporet (300 um). En større lesjonsstørrelsen kan resultere i en lengre tidsperiode for omkobling eller, dersom lesjonen er for stor, ingen omkobling i det hele tatt. For å kommentere, tidligere forsøk viste at en innledende plassering av de to skiver lengre borte enn 1 mm resulterer i en svært lav hastighet forbindelse.

Før starten av opptakene, en justering tid på minst 10 min til romtemperatur, i stedet for 37 ° C i inkubator, og til det ekstracellulære oppløsning, i stedet for ernæring medium anbefales. Nøye observasjon av aktivitetsmønster i løpet av disse første minuttene sikrer at målte data representerer sprengning mønster av kulturen hensiktsmessig etter opptaket ble startet.

For påvisning av aktiviteten, datainnsamling og videre behandling, hjemmelaget maskinvare (opptak kammer, forbindelser til forsterkere og forsterkere), programmer i LabVIEW, C ⁺⁺ og IgorPro benyttes. Kommersielle MEA oppsett og andre programvarepakker er egnet også for disse operasjonene. Her blir signalene sett av elektrodene amplifisert 1001 ganger, og så digitalisert med en hastighet på 6 kHz.

Den presenterte modellen kan være et nyttig verktøy for å undersøke propriospinal tilkoblinger fordi in vivo, er de vanskelige å studere uten forstyrrelser av stigende og synkende fiber traktater. Co-dyrking av to ryggmargs skiver kan elegant omgå dette problemet. Kulturene gir en mikromiljøet som kan bli kontrollert og lett manipuleres. På den annen side, er supraspinal og sanseinntrykk selvfølgelig mangler. I tillegg er fremgangsmåten av fremstillingen kultur representerer en situasjon med CNS-skade. Gliaceller som astrocytter og mikroglia er kjent for å reagere på lesjoner med økt proliferasjon og derfor er vevet til en viss grad omorganisert. Knyttet til presentmodusl dannelsen av en glial arr etter å ha utført mekaniske skader ble ikke observert. En forklaring kan være at adaptive mekanismer for astrocytter var allerede utløst i løpet av forberedelsesprosessen og at lesjoner av kulturene ikke resulterte i en ytterligere reaksjon. Også er det ingen bevis for involvering av myelin forbundet hemmere, f.eks., Nogo-A, i den lave regenerering potensialet av kulturer lesioned på en alderdom. Imidlertid ble det vist at behandling med fosfodiesterase 4-inhibitor rolipram, med start rett etter å ha utført lesjoner ved 23 DIV øker funksjonell restitusjon mellom skivene ^10. Disse resultater viser at funksjonell bedring kan økes i gamle kulturer. Merkbart, når man teller antall axoner krysser lesjon området, ble det ingen forskjell mellom kulturer lesioned i ung alder og kulturer lesioned på en alderdom oppdaget. Disse funnene tyder på at mangel på aksonal regenerasjon er ikke den viktigste grunnen til feller tap av restitusjon etter sene lesjoner i kultur og derfor understreke behovet for en modell som gjør at funksjonsanalyse av regenerering. Synaptic dannelse og synaptisk plastisitet kan spille en viktig rolle i gjenopprett ^10. Disse mekanismene har fått mye oppmerksomhet de siste årene, og det er i dag allment akseptert at de har en stor innvirkning på utfallet etter ryggmargsskade. Derfor kan en modell som gir stabile forhold for å undersøke disse prosessene i isolasjon og i stor detalj sikkert bidra til å få innsikt om funksjonell regenerering i ryggmargen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Planar multielectrode array	Qwane Biosciences		custom-made according to the design of our lab
Nutrient medium			For 100 ml
Dulbeccos modified Eagle's medium	Gibco	31966-021	80 ml
Horse serum	Gibco	26050-070	10 ml
distilled, sterile water			10 ml
Nerve growth factor-7S [5 ng/ml]	Sigma-Aldrich	N0513	200 µl
reconstituted in wash solution with 1% BSA
Coating solution
Extracellular matrix gel	BD Biosciences	356230	Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons
medium optimized for prenatal and embryonic neurons	Gibco	21103-049
Wash solution			[mg/L]
MgCl2-6H2O			100
MgSO4-7H2O			100
KCl			400
KH2PO4			60
NaCl			8,000
Na2HPO4 anhydrous			48
D-Glucose (Dextrose)			1,000
According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html
Extracellular solution (pH 7.4)			[mM]
NaCl			145
KCl			4
MgCl2			1
CaCl2			2
HEPES			5
Na-pyruvate			2
Glucose			5
Blocking Solution
Detergent: Triton X-100			0.3%, harmful if swallowed
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9418	1%
Goat serum	Gibco	16210-064	5%
Chicken Plasma	Sigma-Aldrich	P2366	Lyophilized, reconstitute with wash solution
Gabazine	Sigma-Aldrich	SR-95531
Mecamylamine hydrochloride	Tocris	2843	toxic if swallowed
Micropipette	World Precision Instruments, Inc.	MF28G-5
Paraformaldehyde			harmful, 4%
SMI-31	Covance	SMI-31P
SMI-32	Covance	SMI-32R-500
Strychnine	Sigma-Aldrich	S0532	toxic
Thrombin	Merck Millipore	1123740001	irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution
Tissue culture flat tube 10 (= roller tube)	Techno Plastic Products AG	91243