Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ניתוח ביטוי מירנה ברקמות קליניות בסרטן הערמונית

Published: September 8, 2015 doi: 10.3791/53123
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Urology, Veterans Affairs Medical Center, San Francisco, University of California San Francisco

Abstract

אתגר קריטי בסרטן ערמונית ניהול קליני (PCA) הוא שמציב את חוסר ההתאמה של סמנים ביולוגיים המשמשים כיום להקרנת מחלה, אבחון, הפרוגנוזה וטיפול. בשנים האחרונות, מיקרו RNA (miRNAs) צמחו סמנים ביולוגיים חלופיים מבטיחים כלאבחון סרטן הערמונית והפרוגנוזה. עם זאת, הפיתוח של miRNAs כסמנים ביולוגיים יעילים לסרטן הערמונית מסתמך במידה רבה על זיהוי מדויק שלהם ברקמות קליניות. מירנה ניתוחים בדגימות קליניות בסרטן הערמונית הוא לעתים קרובות מאתגרת בשל ההטרוגניות גידול, טעויות דגימה, זיהום וכו 'סטרומה מטרתו של מאמר זה היא לתאר את זרימת עבודה פשוטה למירנה הניתוחים בFFPE ארכיון או דגימות קליניות בסרטן הערמונית קפואים באמצעות שילוב של בזמן אמת PCR (RT-PCR) וכלאה באתר (עורך). בתוך זרימת עבודה זו, אנו לייעל את השיטות הקיימות להפקת מירנה מFFPE וtissu ערמונית קפואהes וביטוי מנתחים ידי TaqMan-בדיקה מירנה RT-PCR מבוסס. בנוסף, אנו מתארים שיטה מותאמת לISH מנתחת זיהוי formiRNA ברקמות ערמונית באמצעות חומצת גרעין נעול (LNA) - בדיקות מבוססות. פרוטוקול מירנה ISH מותאם שלנו יכול להיות מיושם על שקופיות סרטן ערמונית רקמות או microarrays רקמות סרטן הערמונית (TMA).

Introduction

הסרטן של בלוטת הערמונית הוא גידול ממאיר נפוצה זכר אובחן כי הוא אחד הגורמים עיקריים לתמותה מהסרטן הקשורים בקרב גברים. בארה"ב, מוערך 220800 מקרים חדשים ו27540 מקרי מוות ידווחו בשנת 2015 1.

סרטן הערמונית הוא מחלה הטרוגנית עם מחלה משתנה מאוד כמובן את הגידולים יכולים להיות עצלים או מאוד אגרסיביים. אתגר קריטי בניהול קליני בסרטן הערמונית הוא שמציב את חוסר ההתאמה של שיטות המשמשים כיום / סמנים ביולוגיים להקרנת מחלה, אבחון, הפרוגנוזה וטיפול 2. שיטות הקרנה נוכחית כוללות אנטיגן ספציפי לערמונית בדיקה (PSA) ובדיקה רקטלית דיגיטלית (DRE) ואחריו ביופסיות ערמונית 3. אנטיגן הספציפי לערמונית (PSA) הוא הסמן הביולוגי לסרטן הערמונית הנפוץ ביותר שיש מהפכה ניהול ושיעורי הישרדות משופרת 4 קליניים משמעותי. עם זאת, בשל מגבלות מובנות של Lac PSA כוללk של סגוליות, הקרנה מבוססת ה- PSA הוביל לעל אבחון ועל טיפול במחלה. לאור זאת, מאמצים אינטנסיביים מתבצעים מכוונים חיפוש עבור סמנים לסרטן הערמונית חלופיים, במיוחד אלה שיכולים לחזות את האגרסיביות של המחלה וקבלת החלטות טובות יותר לטיפול 4,5. בשנים האחרונות, מיקרו RNA (miRNAs) צמחו כסמנים לסרטן הערמונית חלופיים מבטיחים.

מיקרו RNA (miRNAs) מהווה כיתה אבולוציונית שימור של RNAs קידוד שאינו קטן המדכאים ביטוי גנים לאחר תעתיק באמצעות אינטראקציות רצף ספציפי עם 3'- האזורים מתורגמים (UTRs) של מטרות mRNA מקור. הערכה היא כי> 60% של mRNAs נשמרים מטרות של miRNAs 6. גני מירנה ממוקמים באזורי intergenic או בתוך אינטרונים או אקסונים חלבון / חלבון שאינו של קידוד גנים 7. גנים אלה עיבד מועדף על ידי RNA פולימראז II לפרימהmiRNAs ר"י (פרי-miRNAs, ארוך כמה קילו-בסיס) שמבנים משניים גזע לולאה בצורת סיכת ראש הטופס. פרי-miRNAs אלה מעובדים לmiRNAs המבשר (טרום miRNAs, ארוך 60-75 נוקלאוטיד) שמיוצאים לציטופלסמה ועיבוד נוסף לmiRNAs הבוגר (18-25 נוקליאוטידים ארוך) 8-10. miRNAs לווסת תהליכים תאיים מרכזיים, כולל התפשטות, פיתוח, בידול ואפופטוזיס 11. מחקרים מראים חוסר ויסות נרחבת של פרופילי ביטוי מירנה בגידולים ממאירים אנושיים שונים, כוללים סרטן הערמונית 12-15. פרופילי ביטוי מירנה כבר דיווחו להיות dysregulated נרחב בסרטן הערמונית גרורתי ראשוני ו. ביטוי שינה מירנה נקשר עם התקדמות סרטן הערמונית, תוקפנות והישנות המדגישה את הפוטנציאל פרוגנוסטיים של miRNAs 12,14,16-19. גוף הולך וגדל של ראיות מצביע על כך שmiRNAs לשחק תפקידים מכניסטית חשובים בייזום סרטן הערמונית, פיתוח, התקדמותיון וגרורות. בסך הכל, miRNAs הם מתעוררים סמנים ביולוגיים חלופיים מבטיחים כלאבחון סרטן הערמונית והפרוגנוזה שיכול להבחין בין רקמות וסיוע נורמלים וסרטן בריבוד של גידולי ערמונית 12. כמו כן, miRNAs הם מטרות חשובות לפיתוח תרופות יעילות נגד סרטן הערמונית 20.

בשל גודלם הקטן והתנגדות לפעילות RNase אנדוגני, miRNAs הם סמנים ביולוגיים יציבים שניתן לאתר בקלות ברקמות-קבוע פורמלין 21 ובביופסיות ערמונית 22. יתר על כן, פרופילי הביטוי של miRNAs כבר לעומת ברקמות קפואות ופורמלין קבוע ונמצאו להיות מתואמים חזק 21. עם זאת, ביטוי מירנה פרופיל ברקמות קליניות בסרטן הערמונית הוא לעתים קרובות מאתגר בשל ההטרוגניות גידול, טעויות דגימה, זיהום וכו 'סטרומה הפיתוח של miRNAs כסמנים ביולוגיים יעילים לסרטן הערמונית רלי כבדותes על זיהוי מדויק שלהם ברקמות קליניות. כאן אנו מתארים זרימת עבודה פשוטה המשמשת במעבדה שלנו לביטוי מירנה פרופיל בFFPE ארכיון או דגימות קליניות בסרטן הערמונית קפואים. אנו מעסיקים שילוב של זמן אמת כמותי PCR וכלאה באתר למירנה ניתוחים של דגימות קליניות, עם המידע לשעבר מניב כמותית נוספת והאחרון להמחשת ביטוי ההפרש של סמנים ביולוגיים מירנה פוטנציאליות במערך של רקמות. בתוך זרימת עבודה זו, אנו לייעל את השיטות הקיימות להפקת מירנה מFFPE ורקמות ערמונית קפוא, ביטוי מנתח ידי TaqMan-בדיקה מירנה RT-PCR ומירנה בטכניקת הכלאה באתר מבוסס באמצעות חומצות גרעין נעולים (LNA) מבוסס בדיקות 23. בדיקות מבוססות LNA מציעות רגישות וסגוליות מוגברות בהשוואה לדנ"א או בדיקות המבוססות RNA- ומאפשרת זיהוי חזק של כל רצפי מירנה, ללא קשר לתוכן GC שלהם וגם לאפשר discrimination של משפחות מירנה. פרוטוקול מירנה ISH מותאם שלנו יכול להיות מיושם על שקופיות סרטן ערמונית רקמות או microarrays רקמות סרטן הערמונית (TMA), עם האחרונים מציע את הפוטנציאל להאצת גילוי סמן ביולוגי מירנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

קבוע פורמלין, משובץ פרפין (FFPE) או דגימות סרטן ערמונית קפואים התקבלו מSFVAMC. דגימות מחולי סרטן הערמונית שעברו כריתה רדיקלית של ערמונית בSFVAMC. נכתב הסכמה מהדעת התקבלה מכל החולים והמחקר אושר על ידי ועדת קליפורניה בסן פרנסיסקו על מחקר אנושי. לחלופין, microarrays רקמות סרטן הערמונית היו רכש ממקורות מסחריים ומשמש למירנה ניתוחים על ידי איש. מידע Clinicopathological ומעקב לחולי סרטן ערמונית ניתחו נאסף.

1. דגימות רקמה

  1. חותך דגימות רקמת סרטן ערמונית לסעיפים 10 מיקרומטר באמצעות microtome וכתם עם H & E הבאה הפרוטוקול של היצרן.
  2. סקור שקופיות צבעוניות לזיהוי מוקדי סרטן ערמונית כמו גם אפיתל בלוטות נורמלי סמוך.
    הערה: הפתולוג לוח מוסמך לבחון את השקופיות ואמא H & E מוכתמותRK לגידול ואזורים נורמלים. השתמש בשקופיות סומנו כמדריכים בסעיפים הבאים למירנה ניתוחים מגידול לעומת אזורים נורמלים.

2. ניתוח ביטוי מירנה על ידי בזמן אמת כמותי PCR

הערה: זרימת עבודה זו כוללת את השלבים הבאים: microdissection לייזר לכידת, בידוד של רנ"א הכל (כולל מירנה וmRNA), assaying של miRNAs הבוגר באמצעות מבחני ביטוי TaqMan MicroRNA כמפורט בסעיפים הבאים.

  1. RNA הפקה
    1. בידוד של מירנה מערמונית רקמות FFPE סרטן
      1. microdissection ללכוד לייזר (LCM)
        הערה: בצע את השלבים 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4 במנדף כימי.
        1. הכן שקופיות רקמה (10 מיקרומטר חלקים) לLCM. סעיפי רקמות Deparrafinize על ידי השרייה בקסילן (2x), במשך 10 דקות כל אחד, אז רעננות הרקמות על ידי דוגרים השקופיות עבור 5 דקות כל אחד באתנול מדורג (100%, 95%, 90%, 80%, 70%) ואחריו מזוקק מים(5 דקות).
        2. בעקבות התייבשות, קטעי כתם עם hematoxylin למשך 30 שניות ואחריו מים.
        3. רקמות מקום באתנול מדורג (70%, 95% 90%, 80%, 70%) (5 דקות כל אחד) וקסילן (5 דקות).
        4. מגלשות יבשים במנדף ולאחר מכן למקם במכשיר LCM לmicrodissection.
        5. בצע microdissections עם מערכת LCM בהתאם להוראות היצרן 24. פתולוג השימוש מסומן שקופיות כמדריכים לזיהוי מוקדי סרטן ערמונית, כמו גם הרקמה נורמלית סמוכה. השתמש בקרן הלייזר בקוטר 10-20 פעימות מיקרומטר עם כוח של 70-90 mW.
        6. אזורי לכידתו של עניין עם פעימות לייזר אינפרא-אדומים על כובעי LCM. לשלב תאים 2-5 כמוסות להפקת מירנה לדגימה. כדי להבטיח את השלמות של RNA חילוץ, מייד לעבד תאים שנתפסו להפקת מירנה.
        7. לחלופין, תאי lyse במאגר חילוץ מירנה (על פי הפרוטוקול של היצרן) וSTOמחדש lysates ב -80 מעלות צלזיוס.
      2. מירנה הפקה וניתוח מרקמות microdissected LCM
        1. לחלץ RNA המוחלט מרקמות microdissected FFPE באמצעות ערכה מסחרית הבאה הוראות היצרן.
          הערה: התשואה של רנ"א מmiscrodissection לכידת לייזר היא בדרך כלל נמוכה. לכן, RNA הוא eluted להיקפים נמוכים (20-30 μl) ומשמש לפרופיל ביטוי באמצעות מבחני ביטוי TaqMan microRNA הבאים הוראות יצרן (גם מתואר בסעיף 2.2). אופטימיזציה של RNA קלט בזמן אמת איתור PCR של miRNAs הבוגר עולה כי 5 μl של רנ"א eluted הוא אופטימלי עבור כל תגובת שעתוק לאחור מירנה ספציפית. כשליטת אנדוגני, משמש RNU48 / RNU24. לתגובות שליטה, 2 μl של רנ"א eluted משמש לתגובת השעתוק לאחור.
    2. בידוד של מירנה מערמונית רקמות קפואות סרטן
      1. Homogenize קפוא רקמות ערמונית כריתה על ידי שחיקה הרקמות בחנקן נוזלי באמצעות מכתש ועלי. העבר את הרקמה הומוגני לצינור microcentrifuge בעזרת מרית מקוררת. לשמור מרגמה / העלי ומרית באותה הטמפרטורה על ידי טבילה ברקמה כל כך הומוגני חנקן נוזלי ניתן להעביר בקלות.
      2. להוסיף מגיב guanidine המסחרית isothiocyanate-פנול (1 מיליליטר / 0.1 גרם של רקמה) לרקמה הומוגני ודגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
        הערה: רקמות הומוגני במגיבה isothiocyanate-פנול guanidine המסחרית יכולות להיות מאוחסנות ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים.
      3. להוסיף כלורופורם לhomogenate (0.2 מיליליטר כלורופורם / מיליליטר) ולנער במרץ למשך 30 שניות. דגירה דגימות ב RT במשך 3-5 דקות ואחריו צנטריפוגה ב 10,000 XG במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
      4. מעבירים את השלב העליון המימי לצינור 1.5 מיליליטר טרי סטרילי RNase ללא.
      5. הוסף נפח שווה של אלכוהול איזופרופיל. לערבב דגירה במשך 10 מילn ב RT ואחריו צנטריפוגה ב XG 12,000 במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס עד גלולה RNA.
      6. לשאוב supernatant ולשטוף את גלולה RNA עם 1 מ"ל של אתנול 70%. צנטריפוגה ב XG 12,000 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
      7. בזהירות לשאוב supernatant. כדורים יבשים RNA ב RT למשך 5-10 דקות. לפזר RNA ב50-100 nuclease ללא מים μl.
      8. בצע כימות של RNA באמצעות ספקטרופוטומטר nanodrop ולקבוע שלמות RNA עם bioanalyzer. התאם ריכוזי RNA עד 10 ng / μl. השתמש 10-50 RNA ng לתגובת cDNA הספציפי miRNA- אחרי זמן אמת PCR ניתוחים (סעיף 2.2).
  2. PCR בזמן אמת כמותי לניתוח ביטוי מירנה
    הערה: miRNAs הבוגר Assay באמצעות פרוטוקול RT-PCR שני שלבים כמפורט להלן.
    1. הפוך תמלול (RT)
      1. הפוך לתמלל cDNA מ- RNA באמצעות ערכת שעתוק לאחור מירנה בהתאם להוראות היצרן.השתמש 10-50 ננוגרם של רנ"א הכל עם פריימר הספציפי מירנה מערכת מבחני MicroRNA וRT. השתמש RNU48 / RNU24 / RNU6B שולטת. לדלל cDNA 1: 5 ל01:10 (תלוי בשפע של מירנה ניתחה) ולהשתמש בזיהוי PCR בזמן אמת כפי שמתוארת בשלב הבא.
    2. בזמן אמת PCR לאיתור של מבוגרים מירנה
      1. להגביר מוצרי ה- PCR מדגימות cDNA באמצעות מבחני MicroRNA עם תערובת אמן אוניברסלית מהירה בהתאם להוראות יצרן. לנרמל דגימות לRNU48 / RNU24 / שליטת RNU6B. השתמש בשיטה ההשוואתית CT (מחזור סף) כדי לחשב את השינויים יחסי בביטוי גנים במערכת ה- PCR בזמן אמת מהירה. לנתח כל דגימה בשלושת עותקים.

ניתוח ביטוי 3. מירנה על ידי באתרו הכלאה (עורך)

  1. טרום טיפול ברקמות
    1. חותך 5 מיקרומטר חלקים מלוקי רקמת סרטן ערמונית FFPE באמצעות microtome.
      2. הערה: ניתן לאחסן שקופיות ב RT במשך כמה שבועות למירנה ניתוחים.
    2. Deparrafinize הרקמות על ידי שריה השקופיות עם קסילן (2x), במשך 15 דקות כל אחד.
    3. רעננות הרקמות על ידי דוגרים השקופיות עבור 5 דקות כל אחד באתנול מדורג (100% (2x), 95%, 90%, 80%, 70%) ואחריו מים מזוקקים (5 דקות).
    4. תקן את השקופיות עם paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות.
    5. שטוף את השקופיות עם PBS (2x) בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות כל אחד.
    6. פנק את השקופיות עם 10 מיקרוגרם / מיליליטר proteinase K ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות במאגר K proteinase המחומם מראש (5 טריס-HCL מ"מ pH 7.4, 1 mM EDTA, 1 מ"מ NaCl).
    7. בעקבות טיפול proteinase-K, לשטוף את השקופיות עם גליצין 0.2% ב PBS למשך 30 שניות.
    8. לשטוף שקופיות בPBS (1X) בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות.
    9. תקן את השקופיות עם Paraformaldehyde 4% ב- ​​PBS במשך 15 דקות.
    10. מגלשות יש לשטוף עםPBS במשך 5 דקות.
  2. הכלאה
    1. טרום להכליא את השקופיות עם פתרון הכלאה מראש במשך 3-4 שעות על 55 מעלות צלזיוס בתא humidified. השתמש במגבוני מעבדה רקמה ספוגים ב- 50% SSC פוראמיד / 50% 5x כדי לשמור על התא humidified.
    2. השתמש 5 בדיקות "שכותרתו digoxigenin בריכוז של 20-50 ננומטר במאגר הכלאה. לדלל בדיקה מירנה ספציפית (20-50 ננומטר) ובדיקה קטנה RNA הגרעיני שליטת U6 (20 ננומטר), חום ב -90 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות, מניח אותו על קרח, ולהוסיף למאגר הכלאת קרח קר (2-4 ng / μl ).
    3. הסר פתרון הכלאה מראש, להוסיף פתרון הכלאה (בדיקה + חיץ הכלאה, לכל שקופית 100 μl), דגירה של 12-16 שעות בטמפרטורת הכלאת בדיקה ספציפית (טמפרטורת הכלאה = בדיקה-21 Tm מעלות צלזיוס). לבצע הכלאות בתא humidified (50% פוראמיד / 50% SSC 5x).
  3. שלבי כביסה
    1. שטוף את השקופיות עם 2x SSC במשך 10 דקות ב 45 מעלות צלזיוס.
    2. לשטוף tהוא מחליק עם SSC 1.5x במשך 10 דקות ב 45 מעלות צלזיוס.
    3. שטוף את השקופיות עם SSC 0.2X (2x) על 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות כל אחד.
    4. דגירה שקופיות עם פתרון חסימת 1x במשך 1-2 שעות בטמפרטורת חדר
  4. זיהוי
    1. דגירה השקופיות עם 1: 100 PBS בדילול נוגדן אנטי digoxigenin AP-מצומדות ל1-4 שעות או הלילה בשעת 4 מעלות צלזיוס.
    2. שטוף את השקופיות עם PBS (3x) בטמפ 'החדר למשך 10 דקות כל אחד.
    3. שטוף את השקופיות (2x) עם אלקליין phosphatase חיץ (100 מ"מ טריס pH 9.5, 50 מ"מ MgCl 2, 100 מ"מ NaCl, Tween-20 0.1%) ב RT במשך 5 דקות כל אחד.
    4. דגירה השקופיות במצע BM הסגול AP בחושך ב RT עבור 1-20 שעות.
    5. יש לשטוף את השקופיות עם PBS המכיל 0.1% Tween-20 ולשטוף (2x) במים.
    6. הר השקופיות באמצעות תקשורת הרכבה מימית ולבחון תחת מיקרוסקופ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרופיל ביטוי של miR-203 בדגימות קליניות בסרטן הערמונית העיקרית LCM על ידי RT-PCR ניתוחים (איור 1)

RT-PCR ניתוחי ביטוי ביחס miR-203 ברקמות סרטן ערמונית העיקרית LCM והאזורים הסמוכים נורמלי ההתאמה בוצעו כפי שתואר בסאיני et al. 15 RNU48 שימש כביקורת. הטבלה שלהלן מסכמת את ביטוי miR-203 היחסי ברקמות גידול סרטן הערמונית בהשוואה לרקמות נורמליות סמוכות.

השוואה של ביטוי miR-383 על ידי RT-PCR ניתוחים בmicrodissected לעומת לכידת לייזר microdissected רקמות PCA (איור 2)

רקמות סרטן הערמונית היו microdissected או מתחת למיקרוסקופ או היו נתונים לLCM אחרי RT-PCR ניתוחים של miR-383 ביטוי ברקמות גידול ביחס לביטוי המתאים הסמוך הנורמלי tissues.Relative miR-383 בדגימות גידוליםהם shown.RNU48 שימש כביקורת. כפי שניתן לראות באיור 2, נצפו הבדלים כאשר ביטוי מירנה נותח ברקמות אלה. יש LCM יתרון על פני microdissection תחת מיקרוסקופ שכן היא מאפשרת בידוד של אוכלוסייה טהורה יחסית של רקמות ערמונית ואמינה יותר.

ISH ניתוחי ביטוי miR-203 ברקמות קליניות בסרטן הערמונית (איור 3)

הכלאה באתר מנתח ביטוי miR-203 ברקמות סרטן ערמונית גרורתי נורמליות ועצם בוצע כפי שתואר בסאיני et al. Microarray רקמות סרטן ערמונית 15 שימש לISH ניתוחים באמצעות 5'- DIG שכותרתו בדיקות LNA ספציפיים לmiR-203 ו U6. דוגמא מייצגת של איש ניתוחים מוצגת באיור 3, דמות לשכפל בחלק מסאיני et al. Expres showsmiR-203 (2011) 15 איור 3A ו3Bשיאון (משמאל) וביטוי שליטת U6 (מימין) ברקמות שצוינו. אותות ISH היו חצי כמותית מדורגת המבוסס על עוצמת מכתימה ואחוזים של תאים מוכתמים והוקצה ציון של 1 עד 4. ציוני עוצמה של miR-203 ביטוי חולקו על ידי אלה ביטוי U6 להשיג רמות ביטוי מנורמלות miR-203 ש היו זממו באיור 3 ג.

איור 1
איור 1: פרופיל ביטוי של miR-203 בדגימות קליניות בסרטן הערמונית העיקרית LCM על ידי RT-PCR ניתוחים. ניתוח RT-PCR ביטוי miR-203 יחסי ברקמות סרטן ערמונית LCM-והאזורים הסמוכים הרגילים המתאימים. RNU48 שימש כביקורת. הטבלה שלהלן מסכמת את ביטוי miR-203 היחסי ברקמות גידול סרטן הערמונית בהשוואה לרקמות נורמליות סמוכות. אנא לחץ כאןכדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: השוואה של miR-383 ביטוי על ידי RT-PCR הניתוחים בmicrodissected לעומת לכידת לייזר microdissected רקמות PCA רקמות סרטן הערמונית או היו microdissected מתחת למיקרוסקופ או היו נתונים לLCM אחרי RT-PCR ניתוחים של miR-383 ביטוי ב. רקמות גידול ביחס לרקמות נורמליות סמוכות מתאימות. miR-383 ביטויים יחסי בדגימות גידולם shown.RNU48 שימשו כביקורת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3:. ISH ניתוחי ביטוי miR-203 ברקמות קליניות בסרטן ערמונית נתון זה שונה מ15. רקמות הכלאה עם DIG-Labeמלא חומצת גרעין נעולה (LNA) בדיקות המבוססות על mir-203 וU6 (שליטה) כמתואר ב -15. דוגמא מייצגת של ניתוח ISH ביטוי miR-203 (פנלים משמאל) וביטוי U6 השליטה (לוחות מימין) ברקמות נורמליות גרורתי ועצם סרטן הערמונית אנושי הראה נחלשה miR-203 ביטוי ברקמות עצם גרורתי. דוגמאות ISH נציג מוצגות בהגדלה גבוהה יותר (40X). רמות ביטוי miR-203 יחסית ברקמות ערמונית נורמליות ורקמות סרטן ערמונית גרורתי בעצמות כפי שהוערכו על ידי ניתוח איש. ביטוי miR-203, נכבש, מנורמל לעשרות U6 וזמם. קו אופקי מייצג את הערך הממוצע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

במאמר זה, אנו מתארים זרימת עבודה פשוטה לביטוי מירנה פרופיל בFFPE ארכיון או רקמות קליניות בסרטן הערמונית קפואים. בסרטן הערמונית, מספר מחקרים מצביעים על תפקיד חשוב של מיקרו-רנ"א בסרטן ערמונית ייזום, התקדמות וגרורות. עם זאת, תוצאות סותרות לעתים קרובות מתקבלות על 22 מירנה ספציפית מאז חילוץ מירנה ומנתחת את השיטות שונות באופן נרחב. לאור הראיות המתעוררות התמיכה יישום הפוטנציאל של miRNAs כסמנים לסרטן הערמונית חלופיים לפרוגנוזה של סרטן הערמונית, אבחון וטיפול, יש צורך לכמת במדויק פרופילי ביטוי מירנה ברקמות קליניות.

אנו מעסיקים שילוב של זמן אמת כמותי PCR וכלאה באתר למירנה ניתוחים של דגימות קליניות בסרטן הערמונית. בתוך זרימת עבודה זו, אנו מותאמים מתודולוגיות קיימות להפקת מירנה, הביטוי מנתח ידי תקיפריימר איש RT-PCR וISH מבוסס ניתוח על ידי בדיקות LNA. במהלך כל העבודה, זה הוא בעל חשיבות עליונה לשמירה על סביבה נקיה RNase. כל חומרים כימיים / הפתרונות המשמשים צריכים להיות RNase חופשיים וזהירות יש להשתמש בטיפול RNA וחומרים כימיים אחרים. יש להגדיר את כל התגובות בזמן אמת על קרח כדי למזער השפלה RNA.

פרופיל ביטוי מדויק ברקמות סרטן ערמונית מתעכבת לעתים קרובות על ידי הטרוגניות וטבע multifocal של נגעי סרטן הערמונית 25. זה ניתן להתגבר על ידי שימוש בטכניקת microdisssection לייזר לכידה המאפשרת את ההפרדה של תאי האפיתל שפירים וממאירים וגם מפחיתה זיהום סטרומה, המאפשר ניתוחים מולקולריים במורד הזרם מדויק של רקמות ערמונית 22,25. אנו מעסיקים LCM של רקמות FFPE ארכיון אחרי ביטוי מירנה פרופיל באמצעות מבחני ביטוי TaqMan MicroRNA שכבר דיווחו להיות אמין. פרופיל מירנה של רקמות LCM יש signifפוטנציאל icant כדי לשפר את גילוי סמן ביולוגי מירנה. למעשה, יש עניין רב בניתוח רקמות FFPE בהתחשב בכך שהרקמות אלה נמצאים בשימוש נרחבת על ידי פתולוגים לניתוחים קליניים, שימור, ואחסון וזמין 3 קלות. כמו כן, בשל גודלם הקטן והתנגדות לפעילות RNase אנדוגני, miRNAs הם יחסית פחות מושפע משפלה תלויה FFPE וסמנים ביולוגיים פוטנציאליים אטרקטיביים 3. פרופילי ביטוי מירנה של רקמות פורמלין קבועים כבר דיווחו להיות מתואמים חזק לאלה של רקמות קפואות 21.

אנחנו עובדים והשוואת שתי ערכות מסחריות שונות להפקת מירנה מרקמות FFPE. בעוד שני ערכות הניבו RNA באיכות גבוהה עבור RT-PCR ניתוחים, השתמשנו באחד המשתמש בפרוטוקול פשוט, יעיל לטיהור עקבית של miRNAs ו- RNA הכולל מרקמות FFPE.

שלמות, טוהר וריכוז של שאול RNAd להיבדק לפני RT-PCR הניתוחים. דוגמאות מראים יחס נמוך A260 / A230 (<1.8) צריכים להיות מחדש זירזה מחדש ניתחו לטוהר לפני השימוש בתגובת RT. כמו כן, בזמן אמת PCR ניתוחים של רקמות קליניות ייתכן שיצטרך להיות מותאמים יותר. מחזור סף (ערכי ה- CT)> 33 מצביעים על הגברה נמוכה המשקפת תבנית cDNA ההתחלה נמוכה. במקרה זה, ניתן להגדיל תשומות תבנית cDNA. כמו כן, זה הוא בעל חשיבות עליונה ששליטה נאותה משמשת לנרמול וקביעת quantifications מירנה היחסית בין רקמות נורמליות וסרטניות. שליטת אנדוגני (RNU48 / RNU24 / RNU6B) נבחרה מבוססת על האחידות של אותות הגברה בנורמלי לעומת דגימות גידול.

כמו כן, אנו מתארים פרוטוקול מותאם למירנה ISH ניתוחים של רקמות סרטן הערמונית מבוססות על בדיקות מבוססות LNA-. פרוטוקול מירנה ISH מותאם שלנו יכול להיות מיושם על שקופיות רקמת סרטן הערמונית או microarrays רקמות סרטן הערמונית (TMA), עם ההנפקה האחרונה החזקהial להאיץ גילוי סמן ביולוגי מירנה. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם לסוגים אחרים של רקמות. עם זאת, משך proteinaseKdigestionandparaformaldehydetreatment ייתכן שיצטרך להיות מותאם. עיכול proteinase K מאפשר בדיקה מירנה להיכנס לתאים ואילו יש צורך קיבוע paraformaldehyde כדי למנוע אובדן מירנה הבא permeabilization. פרוטוקול זה, שפותח במקור לשימוש עם בדיקות LNA 26 הוא מותאם כדי לקבל אות מסוימת עם רקע מינימאלי ברקמות ערמונית. ריכוזי בדיקה ותנאי דגירה מותאמים לרקמות סרטן הערמונית. אנו מעסיקים 5'digoxigeninlabeledprobes בריכוז של 20-50 ננומטר בהתאם לשפע של מירנה. עם זאת, 3'digoxigeninlabeledprobes והכפול שכותרתו (5 'ו 3') שכותרתו ניתן להחליף בדיקות. למעשה, בדיקות שכותרתו כפולה מציעות את הפוטנציאל לפיתוח colorimetric טוב יותר לזיהוי מיקרו-רנ"א ומומלצים לגילוי מירנה שפע נמוך. כמו כן, משך incubations חסימה והנוגדן יכול להיות מותאם. חסימה ארוכה יותר מומלצת לרקע נמוך יותר, במיוחד עם miRNAs שפע נמוך. Thedurationofcolor תגובה עם מצע סגול BM צריכה להיות תחת פיקוח הדוק. incubations יותר יכול ליצור מכתים רקע. בדרך כלל, miRNAs השפע דורש incubations הקצר (1-2 שעות) ואילו מירנה פחות שופעת מזוהות עם incubations יותר. במהלך איש, חשוב להבטיח כי חלקי הרקמות לא יתייבשו במהלך כל אחד מהשלבים שכן הדבר עלול להוביל חפצים מכתים.

לסיכום, למרות שמספר מחקרים מראים miRNAs כסמנים לסרטן הערמונית חשובים, את המשמעות של כמה ממחקרים אלה הוא לעתים קרובות לדיון בשל תוצאות סותרות. כאן יש לנו הגדרת זרימת עבודה מותאמת לביטוי מירנה מדויק ניתוחים בדגימות קליניות בסרטן הערמונית שיש פוטנציאל להאצת הגילוי של מירנה כסמנים ביולוגיים לסרטן הערמונית. בעודיש זרימת עבודה זו פוטנציאל משמעותי לביטוי מירנה במדויק פרופיל ברקמות קליניות בסרטן הערמונית, יש מגבלות של הטכניקות מועסקות. miRNAs שפע נמוך עלול להיות קשה לפרופיל עם מירנה RT-PCR מותאם וISH ניתוחים שתואר כאן. למרות פרופיל מבוסס RT-PCR יש טווח דינמי רחב יותר מאשר ISH 27,28, כמויות RNA נמוכות המתקבלות מLCM עלולות להגביל את זיהוי של miRNAs שפע הנמוך. זיהוי של miRNAs מבוסס-איש מניב מידע מרחבי רב עוצמה, אולם המגבלות שלה הן שהיא טכניקה חצי כמותית עם טווח דינמי פחות 28. טכניקה זו מסתמכת על רגישות וסגוליות של בדיקות המועסקות וגם על אופטימיזציה של תנאים להכלאה וזיהוי של miRNAs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר רוג'ר אריקסון על תמיכתו וסיוע בהכנת כתב היד.

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לסרטן במכונים הלאומי לבריאות

(גרנט מספר RO1CA177984; RO1CA138642), פרויקט תכנית VA בסרטן הערמונית (BX001604).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Microtome Leica Biosystems  RM2255
Arcturus Autopix for LCM Arcturus/ Life Technologies LCM1621/LCM1110 Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used. 
CapSure Macro LCM Caps Life Technologies LCM0211
miRNeasy FFPE Kit  Qiagen 217504
7500 Fast Real-time PCR System  Applied Biosystems/ Life Technologies 4351106
Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit  Applied Biosystems/ Life Technologies 4366596
Taqman Fast Universal PCR master mix  Applied Biosystems/ Life Technologies 4352042
DIG labeled LNA probe for U6 Exiqon 99002-01
BM Purple AP substrate Roche 11442074001
Pre-hybridization solution  Biochain K2191050-1
Hybridization solution  Biochain K2191050-2
Blocking solution  Biochain K2191050-8
AP-conjugated anti-digoxigenin antibody Biochain K2191050-7
Aqueous mounting media  Vector Laboratories  H-5501  
Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)  Life Technologies 15596-018
Harris hematoxylin Statlab SL200
Eosin  Statlab SL201 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  2. Shen, M. M., Abate-Shen, C. Molecular genetics of prostate cancer: new prospects for old challenges. Genes Dev. 24 (18), 1967-2000 (2010).
  3. Sequeiros, T., et al. Molecular markers for prostate cancer in formalin-fixed paraffin-embedded tissues. Biomed Res Int. 2013, 283635 (2013).
  4. Cary, K. C., Cooperberg, M. R. Biomarkers in prostate cancer surveillance and screening: past, present, and future. Ther Adv Urol. 5 (6), 318-329 (2013).
  5. Sartori, D. A., Chan, D. W. Biomarkers in prostate cancer: what's new. Curr Opin Oncol. 26 (3), 259-264 (2014).
  6. Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
  7. Rodriguez, A., Griffiths-Jones, S., Ashurst, J. L., Bradley, A. Identification of mammalian microRNA host genes and transcription units. Genome Res. 14 (10A), 1902-1910 (2004).
  8. Borchert, G. M., Lanier, W., Davidson, B. L. RNA polymerase III transcribes human microRNAs. Nat Struct Mol Biol. 13 (12), 1097-1101 (2006).
  9. Cai, X., Hagedorn, C. H., Cullen, B. R. Human microRNAs are processed from capped, polyadenylated transcripts that can also function as mRNAs. RNA. 10 (12), 1957-1966 (2004).
  10. Lee, Y., et al. MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II. EMBO J. 23 (20), 4051-4060 (2004).
  11. Bartel, D. P., et al. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
  12. Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Seth, A. MicroRNAs in prostate cancer: from biomarkers to molecularly-based therapeutics. Prostate Cancer Prostatic Dis. 15 (4), 314-319 (2012).
  13. Hurst, D. R., Edmonds, M. D., Welch, D. R. Metastamir: the field of metastasis-regulatory microRNA is spreading. Cancer Res. 69 (19), 7495-7498 (2009).
  14. Saini, S., Majid, S., Dahiya, R. Diet, microRNAs and prostate cancer. Pharm Res. 27 (6), 1014-1026 (2010).
  15. Saini, S., et al. Regulatory Role of mir-203 in Prostate Cancer Progression and Metastasis. Clin Cancer Res. 17 (16), 5287-5298 (2011).
  16. Ambs, S., et al. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68 (15), 6162-6170 (2008).
  17. Martens-Uzunova, E. S., et al. Diagnostic and prognostic signatures from the small non-coding RNA transcriptome in prostate cancer. Oncogene. 31 (8), 978-991 (2012).
  18. Porkka, K. P., et al. MicroRNA expression profiling in prostate cancer. Cancer Res. 67 (13), 6130-6135 (2007).
  19. Schaefer, A., et al. Diagnostic and prognostic implications of microRNA profiling in prostate carcinoma. Int J Cancer. 126 (5), 1166-1176 (2010).
  20. Maugeri-Sacca, M., Coppola, V., De Maria, R., Bonci, D. Functional role of microRNAs in prostate cancer and therapeutic opportunities. Crit Rev Oncog. 18 (4), 303-315 (2013).
  21. Xi, Y., et al. Systematic analysis of microRNA expression of RNA extracted from fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples. RNA. 13 (10), 1668-1674 (2007).
  22. Lucas, S. M., Heath, E. I. Current challenges in development of differentially expressed and prognostic prostate cancer biomarkers. Prostate Cancer. , 640968 (2012).
  23. Singh, S. K., Kumar, R., Wengel, J. Synthesis of Novel Bicyclo[2.2.1] Ribonucleosides: 2'-Amino- and 2'-Thio-LNA Monomeric Nucleosides. J Org Chem. 63 (18), 6078-6079 (1998).
  24. Suh, S. O., et al. MicroRNA-145 is regulated by DNA methylation and p53 gene mutation in prostate cancer. Carcinogenesis. 32 (5), 772-778 (2011).
  25. Shukla, C. J., Pennington, C. J., Riddick, A. C., Sethia, K. K., Ball, R. Y., Edwards, D. R. Laser-capture microdissection in prostate cancer research: establishment and validation of a powerful tool for the assessment of tumour-stroma interactions. BJU Int. 101 (6), 765-774 (2008).
  26. Nelson, P. T., et al. RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain. RNA. 12 (2), 187-191 (2006).
  27. Chen, C., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33 (20), e179 (2005).
  28. Hanna, J. A., et al. Quantitative analysis of microRNAs in tissue microarrays by in situ hybridization. Biotechniques. 52 (4), 235-245 (2012).

Tags

רפואה גיליון 103 מיקרו RNA סרטן הערמונית רקמות קליניות ביטוי מנתח בזמן אמת PCR,
ניתוח ביטוי מירנה ברקמות קליניות בסרטן הערמונית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bucay, N., Shahryari, V., Majid, S., … More

Bucay, N., Shahryari, V., Majid, S., Yamamura, S., Mitsui, Y., Tabatabai, Z. L., Greene, K., Deng, G., Dahiya, R., Tanaka, Y., Saini, S. miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues. J. Vis. Exp. (103), e53123, doi:10.3791/53123 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter