Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מבחני ויראלי המוקדם כניסה לזיהוי והערכה של אנטי תרכובות

Published: October 29, 2015 doi: 10.3791/53124
Automatic Translation
1,2, 3, 4,5, 2,4, 3,6
1Department of Chinese Medicine, Taipei Medical University Hospital, 2Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 3Department of Microbiology and Immunology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 4Division of Hematology and Oncology, Department of Internal Medicine, Taipei Medical University Hospital, 5Department of Internal Medicine, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 6Graduate Institute of Medical Sciences, College of Medicine, Taipei Medical University

Protocol

הערה: ודא שכל ההליכים כרוכים בתרבית תאים וזיהום בנגיף מתנהלים בברדסי בטיחות ביולוגית מוסמכים המתאימים לרמת הבטיחות הביולוגית של הדגימות בטיפול. לצורך המתאר את הפרוטוקולים, HCV-מתויג כתב בלוציפראז Gaussia משמש כוירוס מודל 32. בהקשר של תוצאות הנציג, חומצת chebulagic תרכובות (CHLA) וpunicalagin (PUG) משמשים כאנטי-נגיפיים מועמד כי יעד אינטראקציות גליקופרוטאין נגיפיים עם glycosaminoglycans פני תא בכניסת ויראלי מוקדם שלבים 31. הפרין, אשר ידוע להפריע לכניסה של וירוסים רבים 30,31,33,34, משמש כטיפול שליטה חיובי בהקשר כזה. לרקע בסיסי על טכניקות וירולוגיה, התפשטות של וירוסים, קביעת כייל נגיף, וביטוי של מינון זיהומיות ביחידות פלאק ויוצרים (PFU), להתמקד יחידות יוצרים (FFU), או ריבוי של זיהום (משרד הפנים), הקורא הוא מחדשהופנה להתייחסות 35. לדוגמאות קודמות ותנאים מותאמים המשמשים לאיתור וירוסים המוצגים בתוצאות הנציג, הקורא נקרא אזכור 30-32,36-39 כמו גם פרטים המופיעים בטבלה 1, איור 1 א, ואיור 2 א.

תרבות 1. תא, הכנת מתחם, וCytotoxicity מתחם

  1. לגדול קו התא המתאים למערכת הזיהום בנגיף להיות מנותח (טבלה 1). לHCV, לגדול הא-7.5 תאים בינוניים השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS), 200 U / פניצילין G מיליליטר, 200 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין, ו 0.5 מיקרוגרם / מיליליטר amphotericin B.
  2. הכן את תרכובות בדיקה ובקרת שימוש בממסים שלהם: למשל, לפזר CHLA ופג בsulfoxide דימתיל (DMSO); להכין הפרין במים מזוקקים כפולים סטרילי. לכל דילולים הבאים, להשתמש בתקשורת ובתרבות.
    הערה: concent הסופימנה של DMSO בטיפולי מתחם מבחן היא פחות מ -1% בניסויים; DMSO 1% כלולים כטיפול ביקורת שלילי במבחנים להשוואה.
  3. לקבוע הרעיל של תרכובות הבדיקה (למשל, CHLA וPUG) בתאים לזיהום ויראלי באמצעות קביעת כדאיות תא מגיב כמו XTT (2,3-bis [2-methoxy-4-ניטרו-5-sulfophenyl] -5-Phenylamino) -carbonyl] -2H-tetrazolium הידרוקסיד):
    1. לHCV, זרע הא-7.5 תאים בצלחת 96-היטב (1 × 10 4 תאים לכל טוב) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO 2 O / N להשיג שכבה.
    2. החל שליטת DMSO (1%) או ריכוזים הולכים וגדל של CHLA תרכובות בדיקה וPUG (לשעבר. 0, 10, 50, 100, ו -500 מיקרומטר) לבארות התרבות בשלושה עותקים.
    3. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות, ואז להשליך את המדיום בצלחת ולשטוף את התאים עם 200 μl של נאגר מלוח פוספט (PBS) פעמיים.
    4. להוסיף assayin של 100 μlפתרון גרם מערכה במבחנה assay טוקסיקולוגיה מבוססת XTT לכל היטב דגירה הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס למשך עוד 3 שעות כדי לאפשר XTT ייצור formazan.
    5. לקבוע את הספיגה עם קורא microplate באורך גל של 492 ננומטר בדיקה ואורך גל של 690 ננומטר התייחסות.
    6. לחשב את אחוז הישרדות תאים באמצעות הנוסחה הבאה: כדאיות תא (%) = ב/ כ× 100%, שבו 'ב'ו' בשם 'מתייחס לספיגה של תרכובות הבדיקה ובקרת הממס (לשעבר DMSO 1%. טיפולים), בהתאמה. קבע את הריכוז של 50% רעילים סלולארי (CC 50) של תרכובות בדיקה מתוכנה אנליטיים כגון GraphPad פריזמה על פי הפרוטוקול של היצרן.

2. Readout של זיהום ויראלי

הערה: קריאת הנתונים של זיהום ויראלי תלוי במערכת הווירוס השתמשה ויכולות לערב שיטות כגון מבחני פלאק או מאה שSuring אותות כתב מוירוסים מתויג כתב. השיטה לאיתור זיהום הכתב-HCV מבוסס על פעילות הכתב בלוציפראז מתוארת להלן.

  1. לאסוף supernatants מהבארות נגועות ולהבהיר ב17,000 XG ב microcentrifuge למשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
  2. מערבבים 20 μl של supernatant מבחן 50 μl של מצע בלוציפראז מערכת assay בלוציפראז Gaussia ולמדוד ישירות עם luminometer לפי הוראות היצרן.
  3. הגעה infectivity HCV כיומן 10 יחידות יחסי אור (RLU) לקביעת עיכוב נגיפי (%) ולחשב את 50% הריכוז יעיל (EC 50) של תרכובות הבדיקה נגד זיהום HCV באמצעות אלגוריתמים מהתוכנה GraphPad פריזמה על פי הפרוטוקול של היצרן.

3. ויראלי האיון Assay

הערה: דוגמאות לתקופת דגירה ומינון נגיפי לוירוסים שוניםמחדש מופיע באיור 1 א. ריכוזים גבוהים יותר של הווירוס יכולים גם להיבדק על ידי הגדלת משרד הפנים / PFU.

  1. זרע הא-7.5 תאים בצלחת 96-היטב (1 × 10 4 תאים לכל טוב) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO 2 O / N להשיג שכבה.
  2. דגירה תרכובות בדיקה או ביקורת (ריכוזים סופיים הם: CHLA = 50 מיקרומטר; PUG = 50 מיקרומטר; הפרין = 1,000 מיקרוגרם / מיליליטר; DMSO = 1%) עם חלקיקי HCV על ​​37 מעלות צלזיוס (איור 1 א, 'לטווח ארוך " ) ביחס של 1: 1. לדוגמא, לבידוד נגיף 100 μl המכיל 1 x 10 4 FFU, להוסיף לדילול עובד 100 מיקרומטר CHLA 100 μl; זה מניב טיפול CHLA בריכוז סופי של 50 מיקרומטר.
  3. לדלל את תערובת הסמים וירוס ריכוז ל" תת-טיפולי "(יעיל) של תרכובות הבדיקה. לדוגמא, הריכוז יעיל של CHLA וPUG נגד HCV הוא במיקרומטר 1 31; לכןזה דורש דילול של פי 50 מתערובת הסמים וירוס שיכול להיות מושלמת עם 9.8 מיליליטר של המדיום בסיסי (בינוני culturing תא עם 2% FBS).
    הערה: הדילול לריכוז תת-טיפוליים מונע אינטראקציה משמעותית בין תרכובות הבדיקה ופני השטח של התא המארח, ומאפשר בדיקה של השפעת טיפול על virions התא ללא. שים לב שדילול זה תלוי בתגובת המינון אנטי של תרכובות המבחן נגד זיהום ויראלי מסוים, והוא נקבע לפני ביצוע assay המסוים הזה 31.
  4. לשם השוואה, לערבב את הווירוס עם תרכובות בדיקה ומייד לדלל (אין תקופת דגירה) לריכוז תת-טיפולי לפני הזיהום (איור 1 א, 'לטווח קצר ").
  5. להוסיף את התערובת של HCV-התרופה מדוללת 100 μl על הא-7.5 monolayer התא (כמות הנגיף היא עכשיו ב1 x 10 2 FFU; משרד הפנים סופיים = 0.01) ודגירה של 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר נגיפיספיחה.
  6. בעקבות הזיהום, להסיר את inocula המדולל ולשטוף בעדינות את הבארות עם 200 μl של PBS פעמיים.
    הערה: בצע שטיפה בעדינות כדי למנוע הרמת התאים.
  7. החל ממדיום בסיס 100 μl היטב כל אחד ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות.
  8. נתח את הזיהום וכתוצאה מכך על ידי מנסה לאמוד את supernatant לפעילות בלוציפראז כמתואר ב'2. קריאת נתונים של זיהום ויראלי '.

4. Assay הקובץ המצורף ויראלי

הערה: דוגמאות לתקופת דגירה ומינון נגיפי לוירוסים שונים המופיעות באיור 2 א, 'קובץ מצורף'. ריכוזים גבוהים יותר של הווירוס יכולים גם להיבדק על ידי הגדלת משרד הפנים / PFU.

  1. זרע הא-7.5 תאים בצלחת 96-היטב (1 × 10 4 תאים לכל טוב) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO 2 O / N להשיג שכבה.
  2. טרום צמרמורת monolayers התא בצלחות ב 4 ° C FOR 1 שעה.
  3. שיתוף לטפל בתאים עם הבידוד HCV (משרד הפנים = 0.01) ותרכובות בדיקה או ביקורת (ריכוזים סופיים הם: CHLA = 50 מיקרומטר; PUG = 50 מיקרומטר; הפרין = 1,000 מיקרוגרם / מיליליטר; DMSO = 1%) בשעת 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. לדוגמא, לבידוד נגיף 90 μl המכיל 1 x 10 2 FFU, להוסיף 10 μl של דילול עובד 500 מיקרומטר CHLA; זה מניב טיפול CHLA בריכוז סופי של 50 מיקרומטר וזיהום על ידי HCV במשרד הפנים = 0.01 על monolayer התא.
    הערה: חשוב לבצע את הניסוי על 4 מעלות צלזיוס שכן הוא מאפשר לוירוס מחייב אך מונע כניסה אשר מתרחשת באופן יעיל ביותר על 37 מעלות צלזיוס. בצע את התוספת של תרכובות וירוס ובדיקה על קרח והדגירה שהתפתחה במקרר 4 ° C על מנת להבטיח שהטמפרטורה נשמרת על 4 מעלות צלזיוס.
  4. הסר את supernatant ולשטוף בעדינות את monolayer התא עם 200 μl של PBS קר כקרח פעמיים.
    הערה: בצע שטיפה בעדינות כדי למנוע הרמת התאים <./ Li>
  5. החל ממדיום בסיס 100 μl היטב כל אחד ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות.
  6. נתח את הזיהום וכתוצאה מכך על ידי מנסה לאמוד את supernatant לפעילות בלוציפראז כמתואר ב'2. קריאת נתונים של זיהום ויראלי '.

5. כניסה / Assay Fusion ויראלי

הערה: דוגמא לתקופות דגירה ומינון נגיפי לוירוסים שונים המפורטות ב'הכניסה / היתוך 'איור 2 א. ריכוזים גבוהים יותר של הווירוס יכולים גם להיבדק על ידי הגדלת משרד הפנים / PFU.

  1. זרע הא-7.5 תאים בצלחת 96-היטב (1 × 10 4 תאים לכל טוב) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה של 5% CO 2 O / N להשיג שכבה.
  2. טרום צמרמורת monolayers התא בצלחות על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
  3. להדביק את התאים עם HCV (משרד הפנים = 0.01) בשעת 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. לדוגמא, השתמש הבידוד נגיף 100 μl המכיל 1 x 10 2 FFU.
    הערה: בצע addition של הבידוד הנגיפי על קרח והדגירה שהתפתחה במקרר 4 ° C כדי לשמור על הטמפרטורה 4 ° C, המאפשר כניסה מחייבת אך לא ויראלי.
  4. הסר את supernatant ולשטוף בעדינות monolayers התא עם 200 μl של PBS קר כקרח פעמיים.
    הערה: בצע שטיפה בעדינות כדי למנוע הרמת התאים.
  5. פנק את הבארות עם תרכובות בדיקה או ביקורת (ריכוזים סופיים הם: CHLA = 50 מיקרומטר; PUG = 50 מיקרומטר; הפרין = 1,000 מיקרוגרם / מיליליטר; DMSO = 1%) ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות. לדוגמא, להוסיף 10 μl של דילול עובד 500 מיקרומטר CHLA 90 μl של תקשורת, לערבב, וטיפול בבארות; זה מניב טיפול CHLA בריכוז סופי של 50 מיקרומטר.
    הערה: המעבר מ4 מעלות צלזיוס עד 37 מעלות צלזיוס עכשיו מקלה אירוע כניסה / היתוך הנגיפי ולכן מאפשרת הערכה של ההשפעה "תרכובות בדיקה בשלב מסוים זה.
  6. לשאוב supernatant המכיל סמים ולהסיר הלא הפניםוירוסים תאיים או על ידי שטיפה עם 200 μl של חיץ ציטרט (נתרן ציטרט 50 מ"מ, 4 מ"מ אשלגן כלורי, pH 3.0) או PBS. החל ממדיום הבסיס 100 μl לפני דוגרים על 37 מעלות צלזיוס במשך 72 שעות.
  7. נתח את הזיהום וכתוצאה מכך על ידי מנסה לאמוד את supernatant לפעילות בלוציפראז כמתואר ב'2. קריאת נתונים של זיהום ויראלי '.

Representative Results

באיור 1, 'assay איון ויראלי' בוצע לבחון האם שתי CHLA הספציפי טבעי התרכובות וPUG יכולים להשבית הווירוסים עטפו השונים במדינה ללא תא ולמנוע זיהום שלאחר מכן. תגובת המינון הרעילה ואנטי של תרכובות אלה נקבעה קודם לביצוע מחקר מכניסטית 31. היו מראש שטופלו הווירוסים עם תרכובות בדיקה ולאחר מכן תערובות הסמים וירוס היו בדילול לריכוזים תת-טיפוליים לפני החיסון על monolayer התא המתאים לכל מערכת וירוס. כפי שניתן לראות באיור 1, שני CHLA וPUG הופיעו לאינטראקציה עם virions ללא הסלולרי, וכתוצאה מכך השפעות בלתי הפיכות שהגנה על monolayer התא מהזיהום שלאחר מכן. שתי תרכובות המבחן השיגו עיכוב 100% ליד נגד HCMV, HCV, וDENV-2, ואילו 60 - בלוק 80% נצפה נגד MV וRSV. סג תוצאות אלוest שיש לי CHLA וPUG השפעה ישירה על חלקיקי הנגיף הללו בחינם על ידי inactivating ונטרול infectivity.

באיור 2, את הקובץ המצורף וכניסה / מבחני היתוך בוצעו כדי לחקור את ההשפעה של CHLA וPUG נגד אירועים אלה מוקדם נגיפיים הקשורות לכניסה מHCMV, HCV, DENV-2, MV, וRSV. CHLA וPUG שני מנעו מחייב של הווירוסים נחקרו על התא מארח בהתאמה, כפי שמוצגים על ידי עיכוב בזיהום נגיפי וכתוצאה מכך (איור 2, 'קובץ מצורף': פסים אפורים בהירים). ההשפעה המעכבת על קובץ מצורף וירוס על ידי שני התרכובות דומה נגד HCMV (איור 2), HCV (איור 2 ג), DENV-2 (איור 2 ד), וRSV (איור 2F), הנע 90-100%. מצד השני, PUG הופיע להיות יעיל יותר מאשר CHLA נגד MV המחייב (איור 2E), עם שיעור העיכוב מTWתרכובות o משתנות בין 50 - 80%. הפרין טיפול שליטה, אשר ידוע לחסום כניסה של וירוסים רבים, גם קובץ מצורף עכבות של HCMV, DENV-2, RSV, מודעת MV, אבל היה פחות יעיל נגד HCV. "Assay כניסה / היתוך ויראלי 'שלאחר מכן בדק האם CHLA וPUG שמרו את פעילותם במהלך שלב כניסת וירוס / היתוך (איור 2,' כניסה / היתוך ': פסים אפורים כהים). שוב, שתי CHLA וPUG נצפו לפגוע ביעילות צעד כניסה / היתוך הנגיפי של הווירוסים שנבדקו (איור 2 ב - F), מניב 50 - 90% השפעה מגנה על monolayer התא המתאים. הפרין גם כניסה / היתוך בעצמת עכבות בDENV-2 וזיהומי RSV, אך היה פחות יעיל נגד HCMV, HCV, וMV (<עיכוב של 40% בממוצע).

<td> HEL
וירוס סוג התא
HCMV
HCV הא-7.5
DENV-2 Vero
MV CHO-SLAM
RSV הפ-2

טבלה 1:. סוג התא מארח לזיהום ויראלי סוג התא המשמש לכל מערכת זיהום ויראלי שתוארה בתוצאות הנציג מצויינים. ניתן למצוא פרטים נוספים על התאים בהתייחסות 31.

איור 1
איון איור 1. של זיהומים נגיפיים על ידי CHLA תרכובות בדיקה וPUG טופלו וירוסים שונים עם תרכובות הבדיקה לתקופה ארוכה. (טופחה במשך 1.5-3 שעות לפני טיטרציה; ברים אפורים בהירים) או תקופה קצרה (בדילול מייד; אפור כהה ברים) על 37 מעלות צלזיוס לפני דילול לConcentra תת-טיפוליtion וניתוח שלאחר מכן של זיהום בתאי המארח המתאים. (א) שרטוטים של הניסוי (מוצג משמאל) עם ריכוז הווירוס הסופי (PFU / טוב או משרד הפנים), לטווח ארוך תקופת דגירה סמים וירוס (i), וזמן דגירה לאחר מכן (ii) מצויינים עבור כל וירוס בטבלה בצד הימין. הניתוח לHCV HCMV (ב), (ג), (ד) DENV-2, (E) MV, וRSV (F) מצוין בכל לוח נוסף. תוצאות הם זממו נגד טיפול DMSO השלילי שליטה לזיהום בנגיף והנתונים המוצגים הם אמצעי ± שגיאות תקן של הממוצע (SEM) משלושה ניסויים בלתי תלויים. נתון זה שונה מהתייחסות 31. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. הערכה של פעילות אנטי של CHLA תרכובות בדיקה וPUG נגד מצורף וירוס וכניסה / היתוך. (א) ההליך ניסיוני, ריכוז וירוס (PFU / טוב או משרד הפנים), והזמן של חיבור וטיפול בתרכובות הבדיקה (I, II, III) מוצגים לכל וירוס בשרטוטים והשולחנות הקשורים. בניתוח קובץ מצורף וירוס (פסים אפורים בהירים), monolayers של סוגי תאים שונים היו מראש מקורר-על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1, ולאחר מכן טופל בשיתוף עם וירוסי בהתאמה ותרכובות מבחן על 4 מעלות צלזיוס (1.5-3 שעות; i) לפני הכביסה את מחסן ותרכובות מבחן לדגירה לאחר מכן (37 ° C; ii) ובדיקה של זיהום בנגיף. בכניסת וירוס / ניתוח איחוי (פסים אפורים כהים), monolayers תא זרע היו טרום צונן על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 ולאחר מכן קרא תיגר עם וירוסי בהתאמה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1.5-3 שעות (i). תאים היו אזשטף וטופל בתרכובות המבחן לתקופת דגירה נוספת (ii) שבמהלכה הטמפרטורה הועברה 37 ° C כדי להקל על אירוע כניסה / היתוך ויראלי. בסוף הדגירה, וירוסים תאיים הוסרו על ידי שני חיץ ציטרט (pH 3.0) או שוטף PBS והתאים הודגרו נוספים (iii) לניתוח של זיהום בנגיף. תוצאות עבור HCV HCMV (ב), (ג), (ד) DENV-2, (E) MV, וRSV (F) מצוינות בכל לוח נוסף. הנתונים הם זממו נגד טיפול ביקורת השלילי DMSO של זיהום בנגיף ומוצגים כאמצעי ± SEM משלושה ניסויים בלתי תלויים. נתון זה שונה מהתייחסות 31. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM GIBCO 11995-040
FBS GIBCO 26140-079
Penicillin-Streptomycin GIBCO 15070-063
Amphotericin B GIBCO 15290-018
DMSO Sigma D5879
In vitro toxicology assay kit, XTT-based Sigma TOX2
PBS pH 7.4  GIBCO 10010023
Microplate reader Thermo Scientific 89087-320
Microcentrifuge Thermo Scientific 75002420
BioLux Gaussia luciferase assay kit New England Biolabs E3300L   
Luminometer Promega GloMax-20/20
Sodium citrate, dihydrate Sigma 71402
Potassium chloride Sigma P5405

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Munier, C. M., Andersen, C. R., Kelleher, A. D. HIV vaccines: progress to date. Drugs. 71, 387-414 (2011).
  2. Rothman, A. L. Immunity to dengue virus: a tale of original antigenic sin and tropical cytokine storms. Nat Rev Immunol. 11, 532-543 (2011).
  3. Sung, H., Schleiss, M. R. Update on the current status of cytomegalovirus vaccines. Expert Rev Vaccines. 9, 1303-1314 (2010).
  4. Torresi, J., Johnson, D., Wedemeyer, H. Progress in the development of preventive and therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J Hepatol. 54, 1273-1285 (2011).
  5. Wright, M., Piedimonte, G. Respiratory syncytial virus prevention and therapy: past, present, and future. Pediatr Pulmonol. 46, 324-347 (2011).
  6. Christou, L. The global burden of bacterial and viral zoonotic infections. Clin Microbiol Infect. 17, 326-330 (2011).
  7. Cascio, A., Bosilkovski, M., Rodriguez-Morales, A. J., Pappas, G. The socio-ecology of zoonotic infections. Clin Microbiol Infect. 17, 336-342 (2011).
  8. Grais, R. F. Measles vaccination in humanitarian emergencies: a review of recent practice. Confl Health. 5, 21 (2011).
  9. Gautret, P. Emerging viral respiratory tract infections-environmental risk factors and transmission. Lancet Infect Dis. 14, 1113-1122 (2014).
  10. Sampathkumar, P. Middle East respiratory syndrome: what clinicians need to know. Mayo Clin Proc. 89, 1153-1158 (2014).
  11. Burd, E. M. Ebola Virus: a Clear and Present Danger. J Clin Microbiol. 53, 4-8 (2015).
  12. Bishop, B. M. Potential and Emerging Treatment Options for Ebola Virus Disease. Ann Pharmacother. , (2014).
  13. Arduino, P. G., Porter, S. R. Oral and perioral herpes simplex virus type 1 (HSV-1) infection: review of its management. Oral Dis. 12, 254-270 (2006).
  14. Mitrasinovic, P. M. Advances in the structure-based design of the influenza A neuraminidase inhibitors. Curr Drug Targets. 11, 315-326 (2010).
  15. Soriano, V. Directly acting antivirals against hepatitis C virus. J Antimicrob Chemother. 66, 1673-1686 (2011).
  16. Haqqani, A. A., Tilton, J. C. Entry inhibitors and their use in the treatment of HIV-1 infection. Antiviral Res. 98, 158-170 (2013).
  17. Melby, T., Westby, M. Inhibitors of viral entry. Handb Exp Pharmacol. , 177-202 (2009).
  18. Vanderlinden, E., Naesens, L. Emerging antiviral strategies to interfere with influenza virus entry. Med Res Rev. 34, 301-339 (2014).
  19. Antoine, T. E., Park, P. J., Shukla, D. Glycoprotein targeted therapeutics: a new era of anti-herpes simplex virus-1 therapeutics. Rev Med Virol. 23, 194-208 (2013).
  20. Pawlotsky, J. M., Chevaliez, S., McHutchison, J. G. The hepatitis C virus life cycle as a target for new antiviral therapies. Gastroenterology. 132, 1979-1998 (2007).
  21. Beyleveld, G., White, K. M., Ayllon, J., Shaw, M. L. New-generation screening assays for the detection of anti-influenza compounds targeting viral and host functions. Antiviral Res. 100, 120-132 (2013).
  22. Kilianski, A., Baker, S. C. Cell-based antiviral screening against coronaviruses: developing virus-specific and broad-spectrum inhibitors. Antiviral Res. 101, 105-112 (2014).
  23. Caillet-Saguy, C., Lim, S. P., Shi, P. Y., Lescar, J., Bressanelli, S. Polymerases of hepatitis C viruses and flaviviruses: structural and mechanistic insights and drug development. Antiviral Res. 105, 8-16 (2014).
  24. Frey, S. Temperature dependence of cell-cell fusion induced by the envelope glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 69, 1462-1472 (1995).
  25. Tscherne, D. M. Time- and temperature-dependent activation of hepatitis C virus for low-pH-triggered entry. J Virol. 80, 1734-1741 (2006).
  26. Madan, R. P. Molecular umbrellas: a novel class of candidate topical microbicides to prevent human immunodeficiency virus and herpes simplex virus infections. J Virol. 81, 7636-7646 (2007).
  27. Haywood, A. M., Boyer, B. P. Time and temperature dependence of influenza virus membrane fusion at neutral pH. J Gen Virol. 67 (Pt 12), 2813-2817 (1986).
  28. Haywood, A. M., Boyer, B. P. Sendai virus membrane fusion: time course and effect of temperature, pH, calcium, and receptor concentration). Biochemistry. 21, 6041-6046 (1982).
  29. Wang, G., Hernandez, R., Weninger, K., Brown, D. T. Infection of cells by Sindbis virus at low temperature. Virology. 362, 461-467 (2007).
  30. Lin, L. T. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. J Virol. 85, 4386-4398 (2011).
  31. Lin, L. T. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiol. 13, 187 (2013).
  32. Marukian, S. Cell culture-produced hepatitis C virus does not infect peripheral blood mononuclear cells. Hepatology. 48, 1843-1850 (2008).
  33. Baba, M., Snoeck, R., Pauwels, R., de Clercq, E. Sulfated polysaccharides are potent and selective inhibitors of various enveloped viruses, including herpes simplex virus, cytomegalovirus, vesicular stomatitis virus, and human immunodeficiency virus. Antimicrob Agents ChemotheR. 32, 1742-1745 (1988).
  34. Barth, H. Cellular binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparan sulfate. J Biol CheM. 278, 41003-41012 (2003).
  35. Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of Virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
  36. Brown, M. G. Dramatic caspase-dependent apoptosis in antibody-enhanced dengue virus infection of human mast cells. J Leukoc Biol. 85, 71-80 (2009).
  37. Huang, Y., Cyr, S. L., Burt, D. S., Anderson, R. Murine host responses to respiratory syncytial virus (RSV) following intranasal administration of a Protollin-adjuvanted, epitope-enhanced recombinant G protein vaccine. J Clin Virol. 44, 287-291 (2009).
  38. Isaacson, M. K., Compton, T. Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress. J Virol. 83, 3891-3903 (2009).
  39. Leonard, V. H., et al. Measles virus blind to its epithelial cell receptor remains virulent in rhesus monkeys but cannot cross the airway epithelium and is not shed. J Clin Invest. 118, 2448-2458 (2009).
  40. Ciesek, S. The green tea polyphenol, epigallocatechin-3-gallate, inhibits hepatitis C virus entry. Hepatology. 54, 1947-1955 (2011).
  41. Lin, L. T. Saikosaponin b2 is a naturally occurring terpenoid that efficiently inhibits hepatitis C virus entry. J Hepatol. 62, 541-548 (2015).
  42. Atkins, C., Evans, C. W., White, E. L., Noah, J. W. Screening methods for influenza antiviral drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7, 429-438 (2012).
  43. Zhang, J. Identification of novel virus inhibitors by influenza A virus specific reporter cell based screening. Antiviral Res. 93, 48-54 (2012).

Tags

אימונולוגיה גיליון 104 פיתוח תרופות פעילות אנטי כניסה נגיפית מוקדמת איון נגיפי קובץ מצורף / מחייב כניסה נגיפית / היתוך ויראלי.
מבחני ויראלי המוקדם כניסה לזיהוי והערכה של אנטי תרכובות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J.,… More

Tai, C. J., Li, C. L., Tai, C. J., Wang, C. K., Lin, L. T. Early Viral Entry Assays for the Identification and Evaluation of Antiviral Compounds. J. Vis. Exp. (104), e53124, doi:10.3791/53124 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter