Protocol
Observera: Se till att alla förfaranden som rör cellkultur och virusinfektion sker i certifierade biosäkerhet kåpor som är lämpliga för biosäkerhetsnivån av proverna som hanteras. I syfte att beskriva protokollen är Gaussia luciferas reporter-märkta HCV som modell virus 32. I samband med de representativa resultat, är föreningarna chebulagic syra (Chla) och punicalagin (MOPS) används som kandidat antivirala medel som riktar virala glykoprotein interaktioner med cellytan glykosaminoglykaner under den tidiga viralt inträde steg 31. Heparin, som är känt för att interferera med införandet av många virus 30,31,33,34, används som en positiv kontrollbehandling i ett sådant sammanhang. För grundläggande bakgrund på virologi tekniker, förökning av virus, bestämning av virustiter, och expression av infektiös dos i plackbildande enheter (PFU), fokusera bildande enheter (FFU), eller multiplicitet av infektion (MOI), är läsaren reförts till referens 35. För tidigare exempel och optimerade betingelser som användes för virus som visas i representativa resultat, hänvisas till referenser 30-32,36-39 samt uppgifter som anges i tabell 1, figur 1A och figur 2A.
1. Cell Culture, förening beredning, och förening cytotoxicitet
- Odla den respektive cellinje för virusinfektionen systemet som skall analyseras (tabell 1). För HCV, odla Huh-7,5-celler i Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS), 200 U / ml penicillin G, 200 ^ g / ml streptomycin och 0,5 | ig / ml amfotericin B.
- Preparera testföreningar och kontroller med hjälp av deras respektive lösningsmedel: exempelvis upplösa Chla och Mops i dimetylsulfoxid (DMSO); förbereda heparin i sterilt dubbeldestillerat vatten. För alla efterföljande utspädningar, använda odlingsmedia.
Obs: Den slutliga concentranson av DMSO i testföreningsbehandlingar är mindre än 1% i experimenten; 1% DMSO är inkluderad som en negativ kontrollbehandling vid analyserna för jämförelse. - Bestäm cytotoxiciteten av testföreningarna (t ex, Chla och PUG) på cellerna under den virala infektionen genom användning av en cellviabilitet bestämning reagens såsom XTT (2,3-bis [2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenyl] -5-fenylamino) karbonyl] -2H-tetrazolium-hydroxid):
- För HCV, utsäde Huh-7,5-celler i en 96-brunnars platta (1 x 10 4 celler per brunn) och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator O / N för erhållande av ett monoskikt.
- Applicera DMSO kontroll (1%) eller ökande koncentrationer av testföreningarna Chla och MOPS (ex. 0, 10, 50, 100 och 500 M) till kulturbrunnarna i tre exemplar.
- Inkubera vid 37 ° C under 72 h, sedan kassera mediet i plattan och tvätta cellerna med 200 pl fosfatbuffrad saltlösning (PBS) två gånger.
- Tillsätt 100 ni assaying lösning från XTT-baserad in vitro-toxikologi analyssats till varje brunn och inkubera plattorna vid 37 ° C under ytterligare 3 h för att tillåta XTT formazanproduktion.
- Bestäm absorbansen med en mikroplattläsare vid en testvåglängd av 492 nm och en referensvåglängd av 690 nm.
- Beräkna andelen överlevande celler med hjälp av följande formel: cellviabiliteten (%) = At / Som x 100%, där "I" och "Som" avser absorbansen av testföreningarna och lösningsmedelskontroll (ex 1% DMSO. ) behandlingar, respektive. Bestäm koncentrationen av 50% cellulär cytotoxicitet (CC 50) för testföreningar från en analytisk programvara såsom GraphPad Prism enligt tillverkarens protokoll.
2. Avläsning av virusinfektion
Obs! Avläsning av virusinfektion beror på virus system som används och kan innebära metoder såsom plackanalyser eller measuring reportersignaler från reporter-taggade virus. Metoden för att påvisa reporter-HCV-infektion baserat på luciferas reporteraktivitet beskrivs nedan.
- Samla supernatanterna från de infekterade brunnarna och klargöra vid 17.000 xg i en mikrocentrifug under 5 minuter vid 4 ° C.
- Blanda 20 pl testsupernatant till 50 | il luciferas-substrat från Gaussia luciferasanalysen kit och direkt mäta med en luminometer enligt tillverkarens instruktioner.
- Uttryck HCV infektivitet som log 10 av relativa ljusenheter (RLU) för bestämning virala hämning (%) och beräkna den effektiva koncentrationen 50% (EG 50) av testföreningarna mot HCV-infektion med användning av algoritmer från GraphPad Prism mjukvara enligt tillverkarens protokoll.
3. Virusinaktive Assay
Obs: Exempel på inkubationstiden och viral dos för olika virus enre anges i figur 1A. Högre koncentrationer av viruset kan också testas genom att öka MOI / PFU.
- Seed Huh-7,5-celler i en 96-brunnars platta (1 x 10 4 celler per brunn) och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator O / N för erhållande av ett monoskikt.
- Inkubera testföreningarna eller kontroller (slutkoncentrationer är: Chla = 50 iM; MOPS = 50 iM; heparin = 1,000 mikrogram / ml, DMSO = 1%) med HCV-partiklar vid 37 ° C (Figur 1A, "Long-Term" ) i en 1: 1-förhållande. Till exempel, för en 100 ul virus inokulum innehållande 1 x 10 4 FFU, tillsätt 100 pl av en 100 iM Chla arbets utspädning; detta ger Chla behandling vid en slutlig koncentration av 50 pM.
- Späd viruset-läkemedelsblandningen till "subterapeutisk" (ineffektiva) koncentration av testföreningarna. Till exempel är den ineffektiva koncentrationen av Chla och MOPS mot HCV vid en iM 31; därfördetta kräver en 50-faldig spädning av viruset-läkemedelsblandningen vilket kan åstadkommas med 9,8 ml basalmedium (cellodlingsmedium med 2% FBS).
Obs: Utspädnings till sub-terapeutisk koncentration förhindrar signifikant interaktion mellan testföreningarna och värdcellytan och tillåter undersökning av behandlingseffekten på de cellfria virioner. Observera att denna utspädning är beroende av den antivirala dosresponsen av testföreningarna mot särskilt virusinfektion, och bestäms innan du utför denna analys 31. - Som jämförelse, blanda virus med testföreningarna och omedelbart utspädd (ingen inkubationstid) till sub-terapeutisk koncentration före infektion (Figur 1A, "Short-Term").
- Tillsätt 100 | il av den utspädda HCV-läkemedelsblandningen på Huh-7,5-cellmonoskikt (mängden virus ligger nu på en x 10 2 FFU; slutlig MOI = 0,01) och inkubera under 3 h vid 37 ° C för att tillåta viraltadsorption.
- Efter infektionen, ta bort den utspädda inokulat och försiktigt tvätta brunnarna med 200 pl PBS två gånger.
Obs: Utför tvättar försiktigt för att undvika att lyfta cellerna. - Tillsätt 100 ul av basalmedium till varje brunn och inkubera vid 37 ° C under 72 timmar.
- Analysera den resulterande infektion genom analys av supernatanten för luciferasaktivitet som beskrivs i "2. Avläsning av virusinfektion ".
4. Viral Attachment Analys
Obs: Exempel på inkubationstiden och viral dos för olika virus listas i figur 2A, "beslag". Högre koncentrationer av viruset kan också testas genom att öka MOI / PFU.
- Seed Huh-7,5-celler i en 96-brunnars platta (1 x 10 4 celler per brunn) och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator O / N för erhållande av ett monoskikt.
- Pre-chill cellmonoskikt i plattor vid 4 ° C for 1 h.
- Co-behandla cellerna med HCV-inokulat (MOI = 0,01) och testföreningar eller kontroller (slutkoncentrationer är: Chla = 50 uM; MOPS = 50 uM; heparin = 1000 | j, g / ml; DMSO = 1%) vid 4 ° C under 3 tim. Till exempel, för en 90 pl virus inokulum innehållande 1 x 10 2 FFU, tillsätt 10 ul av en 500 iM Chla arbets utspädning; detta ger Chla behandling vid en slutlig koncentration av 50 pM och en infektion av HCV vid MOI = 0,01 på cellmonoskiktet.
Obs: Det är viktigt att utföra experiment vid 4 ° C, eftersom det gör det möjligt för virusbindning, men utesluter posten som mest effektivt sker vid 37 ° C. Utför tillsatsen av virus och testföreningar på is och den efterföljande inkubation i en 4 ° C kylskåp för att säkerställa att temperaturen hålles vid 4 ° C. - Avlägsna supernatanten och tvätta försiktigt cellmonoskiktet med 200 pl iskall PBS två gånger.
Obs: Utför tvättar försiktigt för att undvika att lyfta cellerna <./ li> - Tillsätt 100 ul av basalmedium till varje brunn och inkubera vid 37 ° C under 72 timmar.
- Analysera den resulterande infektion genom analys av supernatanten för luciferasaktivitet som beskrivs i "2. Avläsning av virusinfektion ".
5. Viral Entry / Fusion-analys
Obs: Exempel på inkubationstider och viral dos för olika virus listas i figur 2A 'Entry / Fusion ". Högre koncentrationer av viruset kan också testas genom att öka MOI / PFU.
- Seed Huh-7,5-celler i en 96-brunnars platta (1 x 10 4 celler per brunn) och inkubera vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator O / N för erhållande av ett monoskikt.
- Pre-chill cellmonoskikt i plattor vid 4 ° C under 1 timme.
- Infektera celler med HCV (MOI = 0,01) vid 4 ° C under 3 h. Till exempel använder en 100 ul virus inokulum innehållande 1 x 10 2 FFU.
Obs: Utför ytterlining av det virala inokulum på is och den efterföljande inkubation i en 4 ° C kylskåp för att hålla temperaturen vid 4 ° C, vilket tillåter viral bindning men inte posten. - Avlägsna supernatanten och försiktigt tvätta cellmonolagren med 200 pl iskall PBS två gånger.
Obs: Utför tvättar försiktigt för att undvika att lyfta cellerna. - Behandla brunnarna med testföreningarna eller kontroller (slutkoncentrationer är: Chla = 50 uM; MOPS = 50 uM; heparin = 1000 | j, g / ml; DMSO = 1%) och inkubera vid 37 ° C under 3 h. Till exempel, tillsätt 10 ul av en 500 iM Chla arbetsspädning till 90 pl av media, blanda, och behandla brunnarna; detta ger Chla behandling vid en slutlig koncentration av 50 pM.
Obs: Den förskjutning från 4 ° C till 37 ° C underlättar nu den viralt inträde / fusion händelse och därför tillåter bedömning av testföreningar 'effekt på detta speciella steg. - Aspirera läkemedelsinnehållande supernatanten och avlägsna icke-internaextracellulära virus genom antingen tvättning med 200 pl citratbuffert (50 mM natriumcitrat, 4 mM kaliumklorid, pH 3,0) eller PBS. Tillsätt 100 ul av basalmediet före inkubering vid 37 ° C under 72 timmar.
- Analysera den resulterande infektion genom analys av supernatanten för luciferasaktivitet som beskrivs i "2. Avläsning av virusinfektion ".
Representative Results
I figur 1, var "virusinaktive analys" för att undersöka om två specifika naturliga föreningar Chla och MOPS kan inaktivera de olika höljeförsedda virus i cellfritt tillstånd och förhindra efterföljande infektion. Cytotoxiciteten och antivirala dos-respons av dessa föreningar har bestämts innan du utför den mekanistiska studier 31. Virusen som förbehandlats med testföreningarna och därefter virusläkemedelsblandningar späddes till sub-terapeutiska koncentrationer före inokulering på respektive cellmonoskiktet för varje virus-system. Såsom visas i fig 1, både Chla och MOPS verkade interagera med de cellfria virioner, vilket resulterar i irreversibla effekter som skyddade cellmonoskiktet från efterföljande infektion. De två testföreningarna uppnått en nära 100% inhibition mot HCMV, HCV och DENV-2, medan en 60-80% blockad sågs mot MV och RSV. Dessa resultat Suggest som Chla och MOPS har direkt inverkan på dessa fria viruspartiklar genom att inaktivera dem och neutralisera deras smittsamhet.
I figur 2, var den bifogade filen och posten / fusion analyser genomförs för att undersöka effekten av Chla och MOPS mot dessa tidiga virala inträde relaterade händelser från HCMV, HCV, DENV-2, MV, och RSV. Både Chla och MOPS förhindras effektivt bindning av de undersökta virus på respektive värdcellen som visas genom hämning på den resulterande virusinfektion (Figur 2, "beslag": ljust grå staplar). Den hämmande effekten på virus fastsättning av båda föreningarna var likartad mot HCMV (figur 2B), HCV (figur 2C), DENV-2 (figur 2D), och RSV (Figur 2F), som sträcker sig från 90 till 100%. Å andra sidan, föreföll MOPS att vara mer effektiva än Chla mot MV-bindning (fig 2E), med inhibitionshastighet från two föreningar varierar mellan 50-80%. Kontrollbehandlingen heparin, som är känd för att blockera inträde av många virus, också inhiberade vidhäftning av HCMV, DENV-2, RSV, ad MV, men var mindre effektiv mot HCV. Den påföljande "viralt inträde / fusion-analysen" undersökte huruvida Chla och MOPS bibehöll sin aktivitet under virus posten / fusion fasen (Figur 2, 'Entry / Fusion ": mörk grå staplar). Återigen var båda Chla och MOPS observer att effektivt försämrar viralt inträde / fusion steget av de virus som undersökts (figur 2B - F), vilket ger en 50 - 90% skyddande effekt på den respektive cellmonoskiktet. Heparin också potent inhiberade inträde / fusion i DENV-2 och RSV-infektioner, men var mindre effektiv mot HCMV, HCV och MV (<40% hämning i genomsnitt).
| Virus | Celltyp |
| HCMV | <td> HEL|
| HCV | Huh-7,5 |
| DENV-2 | Vero |
| MV | CHO-SLAM |
| RSV | HEp-2 |
Tabell 1:. Värd celltyp för virusinfektion Celltypen som används för varje virusinfektion system som beskrivs i de representativa resultat indikeras. Ytterligare detaljer beträffande cellerna kan hittas i 31 referens.
Figur 1. Inaktivering av virusinfektioner vid testföreningarna Chla och MOPS Olika virus behandlades med testföreningarna under en lång period. (Inkuberas under 1,5 - 3 h före titreringen, ljusgrå staplar) eller kort period (omedelbart späddes; mörkgrå staplar) vid 37 ° C före en utspädning till subterapeutisk Concentraning och efterföljande analys av infektion på respektive värdceller. (A) Schema för experimentet (visas till vänster) med den slutliga viruskoncentrationen (PFU / brunn eller MOI), långtidsvirusdrog inkubationsperioden (i), och efterföljande inkubationstid (ii) anges för varje virus i tabellen till höger. Analys för (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV, och (F) RSV indikeras i varje ytterligare panelen. Resultaten plottas mot DMSO negativ kontroll behandling för virusinfektion och de data som visas är medelvärden ± standardfel av medelvärdet (SEM) från tre oberoende experiment. Denna siffra har ändrats från 31 referens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Utvärdering av antivirala verksamhet testföreningarna Chla och MOPS mot virus kvarstad och inträde / fusion. (A) Den experimentella proceduren, virus koncentration (PFU / brunn eller MOI), och tiden för tillsats och behandling med testföreningarna (I, II, III) presenteras för varje virus i schemat och tillhörande tabeller. I virusfästanalys (ljusgrå staplar), monoskikt av olika celltyper för-kyld vid 4 ° C under 1 timme, därefter sam-behandlades med respektive virus och testföreningar vid 4 ° C (1,5 - 3 h, i) innan tvätta bort inokulat och testföreningarna för efterföljande inkubation (37 ° C, ii) och undersökning av virusinfektion. I virus inträde / fusion analys (mörkgrå staplar), ympade cellmonoskikt var för-kyld vid 4 ° C under 1 h och därefter utmanades med respektive virus vid 4 ° C under 1,5 - 3 h (i). Celler sedantvättades och behandlades med testföreningarna för en ytterligare inkuberingsperiod (ii) under vilken temperaturen skiftades till 37 ° C för att underlätta viralt inträde / fusion händelse. Vid slutet av inkuberingen extracellulära virus avlägsnades genom antingen citratbuffert (pH 3,0) eller PBS-tvättar och cellerna inkuberades ytterligare (iii) för analys av virusinfektion. Resultat för (B) HCMV, (C) HCV, (D) DENV-2, (E) MV, och (F) RSV indikeras i varje ytterligare panelen. Data plottas mot DMSO negativ kontroll behandling av virusinfektion och presenteras som medelvärden ± SEM från tre oberoende experiment. Denna siffra har ändrats från 31 referens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO | 11995-040 | |
| FBS | GIBCO | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO | 15070-063 | |
| Amphotericin B | GIBCO | 15290-018 | |
| DMSO | Sigma | D5879 | |
| In vitro toxicology assay kit, XTT-based | Sigma | TOX2 | |
| PBS pH 7.4 | GIBCO | 10010023 | |
| Microplate reader | Thermo Scientific | 89087-320 | |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | 75002420 | |
| BioLux Gaussia luciferase assay kit | New England Biolabs | E3300L | |
| Luminometer | Promega | GloMax-20/20 | |
| Sodium citrate, dihydrate | Sigma | 71402 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 |
References
- Munier, C. M., Andersen, C. R., Kelleher, A. D. HIV vaccines: progress to date. Drugs. 71, 387-414 (2011).
- Rothman, A. L. Immunity to dengue virus: a tale of original antigenic sin and tropical cytokine storms. Nat Rev Immunol. 11, 532-543 (2011).
- Sung, H., Schleiss, M. R. Update on the current status of cytomegalovirus vaccines. Expert Rev Vaccines. 9, 1303-1314 (2010).
- Torresi, J., Johnson, D., Wedemeyer, H. Progress in the development of preventive and therapeutic vaccines for hepatitis C virus. J Hepatol. 54, 1273-1285 (2011).
- Wright, M., Piedimonte, G. Respiratory syncytial virus prevention and therapy: past, present, and future. Pediatr Pulmonol. 46, 324-347 (2011).
- Christou, L. The global burden of bacterial and viral zoonotic infections. Clin Microbiol Infect. 17, 326-330 (2011).
- Cascio, A., Bosilkovski, M., Rodriguez-Morales, A. J., Pappas, G. The socio-ecology of zoonotic infections. Clin Microbiol Infect. 17, 336-342 (2011).
- Grais, R. F. Measles vaccination in humanitarian emergencies: a review of recent practice. Confl Health. 5, 21 (2011).
- Gautret, P. Emerging viral respiratory tract infections-environmental risk factors and transmission. Lancet Infect Dis. 14, 1113-1122 (2014).
- Sampathkumar, P. Middle East respiratory syndrome: what clinicians need to know. Mayo Clin Proc. 89, 1153-1158 (2014).
- Burd, E. M. Ebola Virus: a Clear and Present Danger. J Clin Microbiol. 53, 4-8 (2015).
- Bishop, B. M. Potential and Emerging Treatment Options for Ebola Virus Disease. Ann Pharmacother. , (2014).
- Arduino, P. G., Porter, S. R. Oral and perioral herpes simplex virus type 1 (HSV-1) infection: review of its management. Oral Dis. 12, 254-270 (2006).
- Mitrasinovic, P. M. Advances in the structure-based design of the influenza A neuraminidase inhibitors. Curr Drug Targets. 11, 315-326 (2010).
- Soriano, V. Directly acting antivirals against hepatitis C virus. J Antimicrob Chemother. 66, 1673-1686 (2011).
- Haqqani, A. A., Tilton, J. C. Entry inhibitors and their use in the treatment of HIV-1 infection. Antiviral Res. 98, 158-170 (2013).
- Melby, T., Westby, M. Inhibitors of viral entry. Handb Exp Pharmacol. , 177-202 (2009).
- Vanderlinden, E., Naesens, L. Emerging antiviral strategies to interfere with influenza virus entry. Med Res Rev. 34, 301-339 (2014).
- Antoine, T. E., Park, P. J., Shukla, D. Glycoprotein targeted therapeutics: a new era of anti-herpes simplex virus-1 therapeutics. Rev Med Virol. 23, 194-208 (2013).
- Pawlotsky, J. M., Chevaliez, S., McHutchison, J. G. The hepatitis C virus life cycle as a target for new antiviral therapies. Gastroenterology. 132, 1979-1998 (2007).
- Beyleveld, G., White, K. M., Ayllon, J., Shaw, M. L. New-generation screening assays for the detection of anti-influenza compounds targeting viral and host functions. Antiviral Res. 100, 120-132 (2013).
- Kilianski, A., Baker, S. C. Cell-based antiviral screening against coronaviruses: developing virus-specific and broad-spectrum inhibitors. Antiviral Res. 101, 105-112 (2014).
- Caillet-Saguy, C., Lim, S. P., Shi, P. Y., Lescar, J., Bressanelli, S. Polymerases of hepatitis C viruses and flaviviruses: structural and mechanistic insights and drug development. Antiviral Res. 105, 8-16 (2014).
- Frey, S. Temperature dependence of cell-cell fusion induced by the envelope glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1. J Virol. 69, 1462-1472 (1995).
- Tscherne, D. M. Time- and temperature-dependent activation of hepatitis C virus for low-pH-triggered entry. J Virol. 80, 1734-1741 (2006).
- Madan, R. P. Molecular umbrellas: a novel class of candidate topical microbicides to prevent human immunodeficiency virus and herpes simplex virus infections. J Virol. 81, 7636-7646 (2007).
- Haywood, A. M., Boyer, B. P. Time and temperature dependence of influenza virus membrane fusion at neutral pH. J Gen Virol. 67 (Pt 12), 2813-2817 (1986).
- Haywood, A. M., Boyer, B. P. Sendai virus membrane fusion: time course and effect of temperature, pH, calcium, and receptor concentration). Biochemistry. 21, 6041-6046 (1982).
- Wang, G., Hernandez, R., Weninger, K., Brown, D. T. Infection of cells by Sindbis virus at low temperature. Virology. 362, 461-467 (2007).
- Lin, L. T. Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cell-to-cell spread. J Virol. 85, 4386-4398 (2011).
- Lin, L. T. Broad-spectrum antiviral activity of chebulagic acid and punicalagin against viruses that use glycosaminoglycans for entry. BMC Microbiol. 13, 187 (2013).
- Marukian, S. Cell culture-produced hepatitis C virus does not infect peripheral blood mononuclear cells. Hepatology. 48, 1843-1850 (2008).
- Baba, M., Snoeck, R., Pauwels, R., de Clercq, E. Sulfated polysaccharides are potent and selective inhibitors of various enveloped viruses, including herpes simplex virus, cytomegalovirus, vesicular stomatitis virus, and human immunodeficiency virus. Antimicrob Agents ChemotheR. 32, 1742-1745 (1988).
- Barth, H. Cellular binding of hepatitis C virus envelope glycoprotein E2 requires cell surface heparan sulfate. J Biol CheM. 278, 41003-41012 (2003).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. Principles of Virology. , 3rd edn, ASM Press. (2008).
- Brown, M. G. Dramatic caspase-dependent apoptosis in antibody-enhanced dengue virus infection of human mast cells. J Leukoc Biol. 85, 71-80 (2009).
- Huang, Y., Cyr, S. L., Burt, D. S., Anderson, R. Murine host responses to respiratory syncytial virus (RSV) following intranasal administration of a Protollin-adjuvanted, epitope-enhanced recombinant G protein vaccine. J Clin Virol. 44, 287-291 (2009).
- Isaacson, M. K., Compton, T. Human cytomegalovirus glycoprotein B is required for virus entry and cell-to-cell spread but not for virion attachment, assembly, or egress. J Virol. 83, 3891-3903 (2009).
- Leonard, V. H., et al. Measles virus blind to its epithelial cell receptor remains virulent in rhesus monkeys but cannot cross the airway epithelium and is not shed. J Clin Invest. 118, 2448-2458 (2009).
- Ciesek, S. The green tea polyphenol, epigallocatechin-3-gallate, inhibits hepatitis C virus entry. Hepatology. 54, 1947-1955 (2011).
- Lin, L. T. Saikosaponin b2 is a naturally occurring terpenoid that efficiently inhibits hepatitis C virus entry. J Hepatol. 62, 541-548 (2015).
- Atkins, C., Evans, C. W., White, E. L., Noah, J. W. Screening methods for influenza antiviral drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 7, 429-438 (2012).
- Zhang, J. Identification of novel virus inhibitors by influenza A virus specific reporter cell based screening. Antiviral Res. 93, 48-54 (2012).
