Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Dechifrere og Imaging Patogenese og Cording af Published: September 9, 2015 doi: 10.3791/53130

Introduction

Mycobacterium abscessus er en ny patogen, der forårsager et bredt spektrum af kliniske syndromer hos mennesker. Disse omfatter kutane infektioner samt alvorlige kroniske lungeinfektioner, for det meste er stødt på i immunkompromitterede og fibrose patienter 1,2,3,4 cystiske. M. abscessus er også betragtes som en større hastigt voksende mykobakteriestammer ansvar for nosokomielle og iatrogene infektioner hos mennesker. Desuden adskillige nylige rapporter fremhævet muligheden for, at M. abscessus kunne krydse blod-hjerne-barrieren og inducerer vigtige læsioner i centralnervesystemet (CNS) 5,6. Trods en hurtig producenten, M. abscessus udstiller også flere patogene funktioner, der er relateret til de af Mycobacterium tuberculosis, herunder evnen til at forblive tavs i årevis inden granulomatøse strukturer og skabe caseøs læsioner i lungerne 7. Mere alarmerende er den lave sensomhed af M. abscessus for antibiotika, hvilket gør ekstremt vanskelige at behandle, der fører til en betydelig terapeutisk fejlrate 8,9 disse infektioner. Det vigtige trussel for denne art er primært dens iboende resistens over for antibiotika, som er af stor bekymring i sundhedsinstitutioner offentlige 10 og en kontraindikation for lungetransplantation 11.

M. abscessus skærme glat (S) eller ru (R) koloni morphotypes der fører til forskellige kliniske resultater. I modsætning til S-stammen, R bakterier har en tendens til at vokse ende til anden, hvilket fører til et reb eller snor-lignende struktur 12,13. Flere uafhængige studier baseret på enten cellulære eller dyremodeller afslørede hyper-virulens fænotype af R morphotype 14,15. Fra epidemiologiske undersøgelser, de mest alvorlige tilfælde af M. abscessus lungeinfektioner synes at være forbundet med R varianter 16, som er den eneste variant,er blevet set at vare i årevis i en inficeret vært 3. Den morphotype Forskellen er afhængig af tilstedeværelsen (i S) eller tab (i R) af overflade-associerede glycopeptidolipids (GPL) 12. Men på grund af de iboende begrænsninger ved de i øjeblikket tilgængelige cellulære / dyremodeller anvendt til at undersøge M. abscessus infektion, vores viden om de patofysiologiske begivenheder R eller S-varianter er fortsat uklar. Infektion af immuno-kompetent mus via intravenøs eller aerosol ruter fører til forbigående kolonisering, hæmmer brugen af mus for at studere vedvarende infektioner og til in vivo narkotika resistensbestemmelse 17. Og derfor udvikle dyremodeller modtagelige for manipulering af værtens respons er en stor udfordring. I denne sammenhæng har ikke-pattedyr modeller for infektion er udviklet for nylig, herunder Drosophila melanogaster 18, der byder på flere fordele, såsom omkostninger, hastighed og etisk acceptable over musemodellen. Zebrafisk (Danio rerio) model for infektion er også blevet undersøgt for at visualisere, af ikke-invasiv billeddannelse, progression og kronologi M. abscessus infektion i et levende dyr 19. Vigtigere blev en proof of concept også etableret for at vise sin egnethed til in vivo antibiotisk vurderinger mod M. abscessus 17,20.

Zebrafisken er ofte blevet brugt i løbet af de sidste to årtier til at studere samspillet mellem forskellige patogener og værtens immunsystem 21. Den stigende succes denne alternative hvirveldyr model bygger på store og unikke muligheder, der motiverede og validerede dets anvendelse til en bedre forståelse af talrige virale og bakterielle infektioner 19,22,23,24,25,26,27,28,29. I modsætning til de fleste andre dyremodeller, zebrafisk embryoner er optisk transparente, tillader ikke-invasiv fluorescensbilleddannelse 30. Dette has ført til at studere M. abscessus inficeret zebrafisk embryoner med hidtil usete detaljer, der kulminerede med beskrivelsen af ekstracellulær Cording, der repræsenterer et eksempel på bakteriel morfologiske plasticitet. Cording repræsenterer en ny mekanisme for undergravning af immunsystemet og en nøglemekanisme fremme patogenesen af akut M. abscessus infektion 19.

Denne rapport beskriver nye værktøjer og metoder ved hjælp af zebrafisk embryo at dechifrere de patofysiologiske træk af M. abscessus infektion og for at undersøge intime interaktioner mellem baciller og det medfødte immunsystem. Først en detaljeret mikroinjektion protokol, der omfatter behandling af bakterielle inokulum, forberedelse embryo, og infektion i sig selv, præsenteres. Metoder specifikt tilpasset til at vurdere M. abscessus virulens ved at måle forskellige parametre, såsom vært overlevelse og bakteriel belastning, præsenteres. Der lægges særlig fokus på, hvordanat overvåge, på et spatiotemporale plan, skæbne og progression af infektion og værtens immunrespons til M. abscessus hjælp af video mikroskopi. Desuden at undersøge bidrag og rolle makrofager under M. abscessus infektion, metoder generere makrofager-forarmet embryoner (ved hjælp af enten genetically- eller kemisk-baserede tilgange) er beskrevet. Endelig protokoller visualisere de specifikke interaktioner med makrofager eller neutrofiler hjælp enten faste eller levende fostre er dokumenteret.

Formålet med denne rapport er at stimulere yderligere undersøgelser for at kaste nyt lys ind i M. abscessus virulens mekanismer og især rolle Cording i etableringen af en akut og ukontrolleret infektion proces.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Zebrafisk eksperimentelle procedurer skal være i overensstemmelse med de relevante institutionelle og statslige regler. For den nuværende undersøgelse blev zebrafisk eksperimenter udført på University Montpellier, i henhold til EU-retningslinier for håndtering af forsøgsdyr (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) og godkendt i henhold til henvisningen CEEA-LR-13007.

1. Forberedelse af reagenser og Mikroinjektion Udstyr

  1. Forbered fiskevand ved at opløse 0,06 g Instant Ocean Sea salt i 1 L destilleret vand 31, autoklaveres for at sterilisere (120 ° C i 20 minutter) og opbevares ved 28,5 ° C i op til 1 måned.
  2. Forbered methylenblåt løsning ved at opløse 1 g methylenblåt i 1 liter destilleret vand. Der tilsættes 300 pi opløsning af methylenblåt i 1 L fisk vand til opnåelse blå fisk vand, derefter autoklaveres for at sterilisere og opbevares ved 28,5 ° C i op til 1 måned.
    BEMÆRK: additipå methylenblåt i fisk vand forhindrer skimmelsvamp.
  3. Fremstilling af phosphatbufret saltvand (PBS)
    1. Der fremstilles en 10 x PBS stamopløsning ved at opløse 5,696 g Na 2 HPO 4, 680 mg KH 2 PO 4, 969 mg KCI og 78,894 g NaCl i 1 liter destilleret vand og pH indstilles til 7,0 med HCI. For at opnå 1 X PBS, fortyndes 100 ml af 10 x PBS-opløsning i 900 ml destilleret vand og autoklave løbet af 20 minutter ved 120 ° C for at sterilisere.
    2. Tilføj 0,05% Tween 80 for at opnå 1 X PBST og opbevares ved stuetemperatur i op til 1 år.
  4. Forbered Oliesyre Dextrose Katalase (OADC) berigelse ved at opløse 8,5 g NaCl, 50 g bovint serumalbumin, 20 g D-glucose, 40 mg Catalase fra bovin lever og 0,5 g oleinsyre i 1 L destilleret vand og derefter foretage sterilisere opløsningen og opbevare det ved 4 ° C i op til 6 måneder.
  5. Fremstilling af 100 ml ethyl-3-aminobenzoat methansulfonsyre (tricaine) stamopløsning ved at opløse 400 mg tricaine pulver i 97,9 ml destilleret vand. Tilføj 2,1 ml af 1 M Tris (pH 9) for at justere pH til 7,0, og opløsningen opbevares ved -20 ° C.
  6. Forbered mikrokapillær injektionsnålene ved at trække borosilikatglas kapillærer (1 mm OD x 0,78 mm ID) ved hjælp af en mikropipette aftrækker enhed med følgende indstillinger: Lufttryk 650; Varm 999; Træk 50; Velocity 80; Tid 200.
  7. Forbered en 1,5% agar opløsning i blå fisk vand og hæld 25 ml smeltet agar i 100 mm petriskåle. På toppen af ​​den smeltede agar, placere hjemmelavede forme med henblik på at præge bestemte kanaler. "V" -formede kanaler anvendes til at placere embryoner mens "U" -formede anvendes for æg (figur 1) 31. Når størknet, fjernes omhyggeligt aftrykket.
    BEMÆRK: Dæk agar med blå fisk vand for at undgå dehydrering og opbevares ved 4 ° C i op til 2 måneder.

Figur 1 Figur 1. Placering af kamre til zebrafisk injektioner. (A) U-formede kanaler for æg (venstre panel) og V-formede kanaler for embryoner (højre panel). Zebrafisk æg / embryoner er lagt i kanalerne og tilpasset langs den samme akse. (B) Visning kamre til mikroskopisk observation. Klik her for at se en større version af dette tal.

2. Forberedelse og opbevaring af M. abscessus Podestof

  1. M. abscessus vækstbetingelser
    1. Plate ud M. abscessus fra en -80 ° C glycerol stock på en Middlebrook 7H10 agar indeholdende 10% af OADC og 0,5% glycerol (7H10 OADC) og suppleret med passende antibiotika afhængigt af modstanden markør, der bæres af vektoren, der koder for det fluorescerende protein. Inkubér pladerneved 30 ° C i 4-5 dage.
    2. Afhente en fluorescens-positive mycobakteriel koloni og inokulere 1 ml Middlebrook 7H9 bouillon suppleret med OADC, 0,2% glycerol, 0,05% Tween 80 (7H9 OADC / T) med den nødvendige antibiotikum i en 15 ml sterilt plastikrør. Der inkuberes ved 30 ° C i 1 uge uden omrystning.
      BEMÆRK: Tween 80 begrænser sammenklumpning og bakteriel aggregering.
    3. Resuspender forkultur opnået i 2.1.2 i 50 ml Middlebrook 7H9 OADC / T i 150 cm 2 vævskulturkolber til en endelig 0,1 OD 600 (svarende til ca. 5,10 7 bakterier / ml) og inkuberes yderligere ved 30 ° C i 4 dage til opnåelse af en eksponentielt voksende kultur (OD600 = 0,6 til 0,8).
      BEMÆRK: For at minimere sammenklumpning, især den ru variant, bør inkubationen ikke overstige 5 dage. Både glatte og ru varianter vise en tilsvarende vækstrate.
  2. Fremstilling af M. abscessus inokula60;
    BEMÆRK: På grund af høj tilbøjelighed af uslebne M. abscessus til at danne store aggregater og at producere ledninger, er det nødvendigt med en specifik behandling for at generere homogene og kvantitativt kontrolleret inokula før mikroinjektioner i embryoner. Denne behandling anvendes også til at udjævne bakterier, der producerer aggregater, omend i mindre grad end den ru stamme.
    1. Harvest eksponentielt voksende kulturer fra 150 cm 2 vævskulturkolber ved centrifugering ved 4, 000 xg i 15 minutter ved stuetemperatur i en 50 ml sterilt plastikrør og resuspender bakteriepelleten i 1 ml 7H9 OADC / T. Portion 200 pi bakterielle suspensioner i 1,5 ml mikrocentrifugerør.
      BEMÆRK: Arbejde med små volumener i 1 ml sprøjter er nødvendig for at opnå meget homogene suspensioner.
    2. Homogenisere bakteriesuspensioner med en 26-G kanyle (15 up-and-down-sekvenser), soniker tre gange i 10 sek (med 10 sek pauser mellem hver lydbehandling sekvens) ved hjælp af et vandbad sonikator. Tilsæt 1 ml 7H9 OADC / T og vortex kortvarigt. Centrifuge 3 minutter ved 100 x g.
    3. Indsamle forsigtigt mykobakterierne-holdige supernatanter at undgå de klumper og Pool de homogene suspensioner i en 50 ml sterilt plastrør.
    4. Kontroller visuelt for tilstedeværelsen af ​​eventuelle tilbageværende bakterielle aggregater.
      BEMÆRK: Hvis aggregater er stadig til stede, gå videre til en ekstra centrifugering skridt ved 100 xg i 2 min, og indsamle supernatanten.
    5. Centrifuger suspensionen ved 4.000 xg i 5 min, pellet resuspenderes i 200 pi 7H9 OADC / T og fortsætte til injektionen.
    6. Vurdere den endelige bakteriekoncentration ved udpladning serielle fortyndinger (i 1 x PBST) på 7H10 OADC agar og tælle kolonidannende enheder (CFU) efter 4 dages inkubation ved 30 ° C. CFUer bør bestemmes for hvert nyt parti.
    7. Forbered frosne podestoffer lagre ved at gemme 5 pi alikvoter ved -80 & #176; C.
      BEMÆRK: CFU vurdering af -80 ° C frosne portioner er en forudsætning for at fastslå det nøjagtige antal af levedygtige bakterier som fryse / optøning kan påvirke bakteriel levedygtighed inokulum. Disse frosne podestoffer er klar til at blive anvendt til efterfølgende injektioner. Eftersom alle portioner indeholder det samme antal CFU, de tillader indsprøjtning bakterier på en reproducerbar måde fra et eksperiment til en anden.
  3. Inoculum kvalitetskontrol
    BEMÆRK: Ziehl-Neelsen-farvning (specifik for mykobakterier) kan anvendes til at sammenligne kvaliteten af ​​de bakterielle suspensioner før og efter homogeniseringen beskrevet i 2.2.
    1. Spot og spredt ud en dråbe af den homogeniserede bakteriesuspension på et objektglas, og lad den tørre helt, fastsætte smøre i mindst 30 minutter på en varmeplade indstillet til 65-70 ° C og pletter ved hjælp af en Ziehl-Neelsen farvningsprotokol .
    2. Overhold den bakterielle smøre med et mikroskop ved hjælp af en 100X mål og sammenligne med en udstrygning af et ikke-behandlet bakteriesuspension (figur 2).

Figur 2
Figur 2. Udarbejdelse af spredte M. abscessus podestoffer. Ziehl-Neelsen farvning af R eller S-varianter dyrkes på bouillon medium forud for enhver behandling (øverste paneler) eller efter behandling (nedre paneler) for at reducere størrelsen og antallet af mycobakterielle aggregater (successive trin syringing, lydbehandling og dekantering) . Bakterier blev observeret under anvendelse af et mikroskop med 100 X APO olie 1.4 NA mål). Scale barer:. 20 pm Klik her for at se en større version af dette tal.

3. Forberedelse zebrafisk embryoner

  1. Gyde- og opsamling zebrafisk æg
    1. Dagen før spantsætte, race voksne zebrafisk ved at placere 2 hanner og 1 hun (normalt en 2: 1-forhold giver optimal befrugtning sats) ind i et avl kammer, der består af en separat akvarium med et æg samling kurv 31.
      BEMÆRK: ægudtagning kurve anvendes til at beskytte æggene fra at blive spist af forældrene og lette æg høst.
    2. Ved 1 HPF, høst æg og kun korrekt udviklede embryoner i en 100 mm petriskål fyldt med 25 ml blå fisk vand (maks 100 embryoner pr skål) og holde dem på 28,5 ° C. Ikke-befrugtede æg kasseres.
  2. Udarbejdelse af zebrafisk embryoner til injektioner
    1. På omkring 24 timer efter befrugtningen (HPF), dechorionate embryoner med fine pincet i en 100 mm petriskål og holde dem på 28,5 ° C.
    2. Saml de 30-48 HPF embryoner ved hjælp af en pipette og overføre dem til en "V" -formet positionering kammer fyldt med 25 ml fisk vand indeholdende 270 mg / l tricaine.Læg embryoner ordentligt i kanalerne ved hjælp af en hjemmelavet microloader spids værktøj (hjemmelavet klippet mikro loader spids) optimeret til en lettere mikro-manipulation.
      BEMÆRK: orientere den dorsale side nedad for intravenøse injektioner i halevenen eller dorsalsiden opad til hale muskel injektioner.

4. Mikro-injektion Procedure

BEMÆRK: Proceduren for mikro-injektion til M. abscessus ligner den beskrevet tidligere for M. marinum injektioner 32. For at vurdere kronologi M. abscessus infektion (overlevelse, bakterielle belastninger, kinetiske og karakteristika infektion), er injektioner i halevenen på 30 HPF embryoner foretrækkes. For at visualisere rekruttering af immun celle, er injektioner udføres i lokaliserede steder såsom i hale muskler i 48 HPF foster.

  1. Fortynd mycobakterielt inokulum i 1 X PBST (afhængigt af antallet af CFU tilindgives som bestemt i trin 2.2.6), indeholdende 10% rød phenol at kontrollere korrekt injektion.
  2. Indlæse en mikrokapillær kanyle med 5-10 pi af det bakterielle inokulum ved hjælp af en microloader tip, tilslutte mikroinjektion nålen ind indehaveren af ​​den tredimensionale mikromanipulator tilsluttet injektoren og bryde ud i toppen af ​​nålen med fine pincet til at opnå en åbningsdiameter 5-10 um.
  3. Kalibrere injektionsvolumenet ved at justere mikroinjektion tryk (20-50 hPa) og tid (0,2 sek).
    BEMÆRK: Den krævede injektionsvolumen kalibreres ved visuel bestemmelse af diameteren af ​​en dråbe udstødt ind i blommen i et foster.
  4. For halevenen injektion, placere foster med den ventrale side mod nålen (som beskrevet i afsnit 3.2.2), og placer nålespidsen tæt på urogenitale åbning, rettet halevenen, og skub forsigtigt spidsen af ​​nålen ind i embryo indtil den netop gennemborer caudal vene region. Levere den ønskede mængde af bakteriel forberedelse, som regel 1-3 nl indeholder omkring 100 CFU / nl.
  5. Til intramuskulær injektion, placere foster med dorsale side vender nålen (som i afsnit 3.2.2), skal du placere nålen over et somit og indsprøjte en lille volumen (1 nl) af inokulum.
    BEMÆRK: Som for halevenen injektioner, intramuskulære infektioner er også udfordrende at udføre. Skal være omhyggelig med at undgå en overbelastning, der kan skade det omgivende væv.
  6. Ved afslutningen af injektionsproceduren, styre størrelsen af inoculum ved at injicere det samme volumen af bakteriel suspension i en dråbe sterilt PBST efterfulgt af udpladning på 7H10 OADC og tælle CFU. Omkring 100 embryoner kan injiceres med en nål.
    BEMÆRK: Fordi ru M. abscessus kan fortsat danne aggregater i nålen, skal gøres umiddelbart efter fremstillingen af inoculum injektioner.
  7. Overfør de inficerede fish individuelt i 24-brønds plader indeholdende 2 ml / brønd fisk vand og inkuberes ved 28,5 ° C. Embryoner injiceret med 1-3 nl 1 X PBST kan anvendes som kontroller.
  8. Korrekt infektion af fluorescerende bakterier i embryoner overvåges ved hjælp af et fluorescensmikroskop.

5. Fremstilling af Makrofager-depleterede Embryoner

BEMÆRK: Selektiv depletion af makrofager fra væv anvendes til at undersøge deres bidrag og rolle under infektion. At visualisere korrekt udtømning af makrofager, anbefales det at anvende en transgen linje med fluorescerende makrofager, hvor mCherry specifikt udtrykkes under kontrol af makrofag specifikke MPEG1 promotor 19.

  1. Lipo-clodronat-baseret procedure
    BEMÆRK: lipo-clodronat procedure giver mulighed for en selektiv udtynding af makrofager fra væv (men ingen neutrofiler) 19. Denne forbindelse har hverken ændrer overlevelsen af ​​embryoner eller AFfekt integriteten af ​​bakterier. En detaljeret protokol for at forberede liposomindkapslet clodronat er blevet rapporteret tidligere 33.
    1. Ved 24 HPF, dechorionate embryoner og overføre dem til en "V" -formet injektion fad fyldt med fisk vand suppleret med tricaine at opretholde de embryoner i en bedøvet tilstand indtil afslutningen af ​​proceduren for injektion, som beskrevet i 3.2.2. Orientere den dorsale side nedad.
    2. Indlæse en mikrokapillær kanyle med liposomindkapslet clodronat (lipo-clodronat), tilslut mikroinjektion nålen ind indehaveren af ​​den tredimensionale mikromanipulator og bryde ud i toppen af ​​nålen med fine pincet til at få et tip åbning diameter på 10 um.
    3. For at kalibrere injektionsvolumen, justere mikroinjektion tryk til 20 hPa og injektionstiden til 0,2 sek. Placér nålespidsen tæt på urogenitale åbning, rettet halevenen, og skub forsigtigt spidsen af ​​nålen iembryo indtil den netop gennemborer halevenen regionen og levere den ønskede mængde opløsning (2-3 nl, 3 gange).
      BEMÆRK: lipo-clodronat suspension er meget klistret og skal vortexes før injektion for at undgå blokering karsystemet og drab på embryoet. Det er afgørende at gå videre til flere på hinanden følgende injektioner af små mængder.
    4. Overfør embryoner i 100 mm petriskåle, der indeholder fisk vand og holde dem ved 28,5 ° C, indtil infektion.
    5. Styr ordentlig udtømning af makrofager ved fluorescerende mikroskopi.
      BEMÆRK: Komplet makrofag udtynding er effektiv til 4 dage efter lipo-clodoronate administration.
  2. Morpholino-baseret procedure
    1. Dagen før gydning, race voksne zebrafisk ved at placere 2 hanner og 1 hun adskilt af en plastik barriere i en avl kammer.
    2. Den næste dag, ≈ 30 min efter at lyset tændes i zebrafisk facilitet, fjerne barrieren adskillerhanner og hunner. Vent i omkring 20 minutter efter starten af ​​gydende at optimere befrugtning sats. Høst æggene og langsom deres udvikling ved at overføre dem i en 100 mm petriskål fyldt med koldt blå fisk vand (4 ° C).
      BEMÆRK: kontrol af gydende er afgørende for morpholinos-baserede eksperimenter. Morpholinoer kan kun injiceres i æggene op til fire celler fase.
    3. Saml æggene ved hjælp af en pipette og deponere æggene ned i "U" -formede injektion-kammer fyldt med koldt blå fisk vand og blokere æggene i kanalerne ved hjælp af en hjemmelavet microloader spids værktøj.
    4. Forbered pu.1 morpholino opløsning indeholdende 10% rød phenol, som tidligere beskrevet 19. Indlæse en mikrokapillær kanyle med forberedelsen morpholino og tilslut mikroinjektion nålen ind indehaveren af ​​den tredimensionelle mikromanipulator, derefter brække spidsen af ​​nålen med fine pincet til at obtaina tip åbningsdiameter 5-10 um.
    5. Sådan kalibreres injektionsvolumenet, justere mikroinjektion trykket til 20-50 hPa og injektion tid til 0,2 sek. Placér nålespidsen tæt på ægget, og skub forsigtigt spidsen af ​​nålen gennem chorion i ægget og levere den ønskede morpholino løsning volumen, typisk 3-5 nl.
    6. Efter mikro-injektion, overføre æg i en 100 mm petriskål i fisk vand og inkuberes ved 28,5 ° C, indtil infektionen proceduren begynder.
    7. Analyser den korrekte (komplet) udtømning af makrofager i pu.1 morphants ved fluorescerende mikroskopi ved 30 til 48 HPF..
      BEMÆRK: Afhængigt af koncentrationen injicerede, kan p U.1 morpholinos også påvirke antallet af tidlige neutrofiler. For at bekræfte den korrekte udtømning af makrofager uden at ændre antallet af neutrofiler, anbefales det at bruge en dobbelt transgen zebrafisk linje med fluorescerende makrofager og neutrofiler (med GFPudtryk specifikt drevet af MPX promotor) 19.

6. Bakteriel Burden Kvantificering

  1. Bestemmelse af CFU tælling
    1. Ved det ønskede tidspunkt, indsamle grupper af inficerede embryo (5 per forhold) i 1,5 ml mikrocentrifugerør (1 embryo / rør), cryo-bedøver de embryoner ved inkubation på is i 10 minutter og aflive under anvendelse af en overdosis af tricaine (300- 500 mg / L)
    2. Vask embryoner med sterilt vand to gange og dispensere dem i et nyt rør, lyseres embryonets med 2% Triton X-100 fortyndet i 1 X PBST under anvendelse af en 26-G kanyle og homogeniseres suspensionen, indtil fuldstændig lyse. Centrifuger suspensionen og pellet resuspenderes i 1 X PBST med 0,05% Tween 80. Serielle fortyndinger af homogenaterne udplades på Middlebrook 7H10 OADC og suppleret med BBL MGIT PANTA, som anbefalet af leverandøren.
      BEMÆRK: M. abscessus være mere modtagelige for NaOH behandlit end M. marinum, dekontaminering af fisk lysater uden at påvirke M. abscessus vækst held kan opnås ved anvendelse af BBL MGIT PANTA antibiotisk cocktail.
    3. Pladerne inkuberes i 4 dage ved 30 ° C og tæller kolonier.
  2. Bestemmelse ved Fluorescens Pixel Count (FPC) målinger i levende fostre
    BEMÆRK: For at bestemme de bakterielle belastninger via fluorescensemission er serielle billeder af inficerede embryoner erhvervet og fluorescens-intensiteten målt ved FPC (identifikation af bakterier ved partikel analyse) ved hjælp af en hjemmelavet makro udviklet til ImageJ freeware. En partikel analyse kræver et binært sort og hvidt billede, der bygger på en tærskel interval gør det muligt at skelne det fluorescerende signal af interesse fra baggrunden.
    1. Ved det ønskede tidspunkt, tricain-bedøver inficerede fostre (5-10 pr tilstand) i 35 mm petriskåle som beskrevet i 3.2.2.
    2. Fjernelse af vand og submeRGE embryonerne og hele skålen overfladen med 1% agarose med lavt smeltepunkt i fisk vand, derefter justere sideværts fostrene. Dæk størknede agarose med fisk vand tilsat tricaine.
    3. Erhverve fluorescensbilleder af hele embryo under anvendelse af et epifluorescensmikroskop med en 10 X mål.
      BEMÆRK: erhvervelse Fluorescens Billedet er et afgørende skridt i FPC målinger proceduren. Det er vigtigt at bruge en kalibreret skærm med en farvekalibrering probe. Justering det optimale tidspunkt for eksponering til opnåelse af en minimal baggrunden under erhvervelse forhindrer mætning af signalet. Billeder skal være i en 8-bit TIFF-format. Identiske indstillinger holdes under hele forsøget til kvantitative formål.
    4. Fjern forsigtigt agarose fra embryoner med en hjemmelavet microloader spids værktøj. Disse embryoner kan anvendes til efterfølgende analyse, hvis det kræves. Forud for kvantificering af den bakterielle belastning, skal hvert billede skal kvaliteten kontrolleres. Til ennalyze billederne og konvertere fluorescensintensiteten i FPC pr fisk, åbne ImageJ freeware.
      BEMÆRK: FPC-værdi afspejler den bakterielle belastning som vist tidligere ved hjælp af M. marinum 34.
    5. Bestem den nødvendige tærskel for billedanalyse ved hjælp af et billede af en ikke-inficerede embryo (kan flere kontrol embryoner anvendes til at opnå en gennemsnitlig tærskel). Gå til Billede → Juster → Threshold og derefter flytte den nederste skyderen i tærsklen vinduet til højre, indtil baggrunden bliver helt sort (dvs. at opnå en baggrund bør være på nul). Optag den tilsvarende værdi.
    6. Inden Billede J, åbne FPC makro (supplerende fil) og følg vejledningen: finde mappen billeder, der skal måles, og derefter indtaste tærsklen som tidligere bestemt, og klik på "OK".
      BEMÆRK: Makroen trækker automatisk baggrunden. En tærskelværdi påføres derefter. Fluorescerende signaler er identificeretceret efter analysen partikel.
    7. Kopier og indsæt data fra resuméet vindue til det ønskede software til dataanalyse.
      BEMÆRK: I modsætning til bestemmelsesmetoden CFU, FPC metode er ikke-invasiv og tillader genbruge embryoner til efterfølgende analyser og vigtigere, overvågning dynamikken / kinetikken for bakteriel belastning på individuel basis. Det er derfor muligt at betydelig reduktion af antallet af dyr efter aftale med etiske regler.

7. Imaging M. abscessus- inficerede Embryoner

  1. Live-billeddannelse af M. abscessus infektion
    1. Mount tricaine-bedøvede embryoner (se afsnit 3.2.2) i 1% agarose med lavt smeltepunkt i en 35 mm petriskål forud for epifluorescensmikroskopi observationer. Brug et glas bund skål for omvendt konfokal mikroskopi eller i en enkelt hulrum depression slide for opretstående konfokal mikroskopi. Orientere embryoet til den ønskede position og lågetden størknede agarose med fisk vand indeholdende tricaine.
    2. Brug en epifluorescensmikroskop med en 10 x mål for sekventielle fluorescens erhvervelse og transmission billeder af hele embryo. Alternativt kan du bruge en konfokal mikroskop med 40X eller 63x mål at visualisere aktiviteten af ​​immunceller efter en infektion.
  2. Imaging fast M. abscessus inficerede embryoner
    1. Aflive embryoner, som beskrevet i 6.1.1 og overføre dem til 1,5 ml mikro-centrifugerør og løse embryoner i 4% paraformaldehyd i 1 X PBST i 2 timer ved stuetemperatur eller O / N ved 4 ° C. Fjern paraformaldehyd ved vask af embryoner to gange med 1 X PBST i 10 minutter.
      BEMÆRK: For at bevare fluorescens, skal faste embryoner beskyttes mod lys.
    2. For at bevare integriteten af ​​væv og fluorescens, er embryoner inkuberes successivt at øge glycerol koncentration løsninger (10, 20, 30, 40 og 50% fortyndet i 1 X PBST), for10 min pr tilstand.
      BEMÆRK: Fast embryoner kan opbevares i flere måneder i 50% glycerol ved 4 ° C.
    3. Læg embryo indlejret i 50% glycerol i en skuekammeret (figur 1B) 31.
    4. Billedet ved hjælp 40X eller 63x mål på en konfokal mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Selv om forskellige anatomiske steder kan injiceres 32, er halevenen injektioner ofte bruges til at generere systemisk infektion for efterfølgende analyser, herunder overlevelse eksperimenter, bakteriebyrden bestemmelse, fagocytose aktivitet eller ledningen formation. Injektioner i halemusklerne anvendes til at vurdere ansættelse af makrofager på injektionsstedet (figur 3A). For at undersøge og sammenligne virulensen af R- og S-varianter af M. abscessus, er fluorescerende bakterielle suspensioner injiceret i halevenen på 30 HPF embryoner (figur 3A) 19. I modsætning til S variant R morphotype inducerer en mere robust og dødelig infektion i zebrafisk embryoner (figur 3B), kendetegnet ved den hurtige udvikling af bakterielle bylder inden det centrale nervesystem (CNS) (figur 3C). Systemiske injektioner med både R og S-varianter fører til CNS-infektioner og forskel ipatologien og virulens fænotyper kan kvantificeres enten ved fluorescensmikroskopi observation (figur 3C), ved direkte at nævne CFU pr fisk (figur 3D) eller ved at bestemme FPC af erhvervede billeder (figur 3E). Vigtigere er det, CFU og FPC beslutsomhed er korreleret, og påpege over for større bakterielle belastninger for R stammen end S-stammen på 3 og 5 dpi. Samlet set disse resultater støtter zebrafisk som en relevant og ikke-invasiv model for infektion til at studere kronologien af ​​infektionen processen.

Måske en af de mest spektakulære funktioner blev afsløret ved hjælp af video-mikroskopi, der gør det muligt at visualisere bugtede ledninger i CNS af embryoner inficeret med R variant (figur 4). Takket være den optisk transparens af embryonet, kunne den kinetiske af R-ledningen dannelsen overvåges og afbildes på en ikke-invasiv måde, som illustrerer den høje tilbøjelighed R variant til at replikere extracellularly. Denne ukontrollerede replikation sats, kombineret med ødelæggelse cellulære / væv fører hurtigt til udvikling af bylder og i sidste ende larvernes død.

Makrofager vides at spille en vigtig rolle under mycobakteriel infektion og især ved at drive granuloma 35. To komplementære strategier kan anvendes til at studere M. abscessus vækst / virulens i makrofag-udtømte embryoner: den lipo-clodronate- og morpholino-baserede procedurer (figur 5A). Infektion af makrofag-udtømte embryoner med R-varianten fører til en massiv stigning i de bakterielle belastninger og snor produktion som afsløret ved hjælp af video-mikroskopi (figur 5B), hvilket fører til ekstremt hurtig død (100% døde fostre på 3 dpi; figur 5C) . Dette viser klart, at makrofager er forpligtet til at kontrollere M. abscessus infektion.

For yderligere at undersøge rollen af ​​makrofagerunder infektion, specifikke transgene embryoner huser rødt fluorescerende makrofager (MPEG1: mCherry) kan anvendes 19. Injektion af M. abscessus udtrykke Wasabi i halen muskel eller i halevenen inducerer en markant rekruttering af myeloide celler, hovedsageligt makrofager, ved infektionsstedet. Dette fører til rekruttering effektiv fagocytose af individuelle bakterier (figur 6A-6B). På trods af tilstedeværelsen af makrofager, konfokal mikroskopi afslører forekomsten af store bakterielle ledninger, makrofager ikke kan phagocytize (figur 6C). Tilsammen disse resultater fremhæver en ny mekanisme for immun unddragelse baseret på rolle Cording at forebygge mycobakteriel fagocytose.

Figur 3
Figur 3. M. abscessus infektion i zebrafisk embryoner. (A) (Topplade) Intravenøs infektion udføres ved at injicere fluorescerende M. abscessus (vist i hvidt) i halevenen (pil 1), posteriort for urogenitale åbning, i 30 HPF embryoner. (Nedre panel) Intramuskulær infektion udføres ved at injicere fluorescerende mycobakterier (vist i hvidt) i halen musklen over en somit (pil 2), i 48 HPF embryoer. (BE) 30 HPF embryoner intravenøst ​​inficeret med tdTomato- M. abscessus (R og S-varianter). (B) Overlevelseskurver embryoner inficeret med ≈ 300 CFU enten R eller S varianter eller PBS-injicerede kontroller (n = 20). Repræsentative resultater fra tre uafhængige eksperimenter er vist. (C) Spatiotemporal visualisering af enten R eller S variant udtrykker tdTomato (hvid) på forskellige tidspunkter peger efter infektion udføres ved fluorescens direkte billedvisning. For hver stamme, en repræsentant fluorescens og transmission overlay af hele smittede fostre er sho wn. De samme embryoer blev afbildet ved 3 og 5 dpi. (DE) Bakterielle belastninger inden embryoner inficeret med enten R- eller S-varianter (≈ 200 cfu) bestemmes ved CFU tælling (D) eller FPC målinger (E). (D) CFU fra lysat af individuelle embryoer på forskellige tidspunkter post-infektion bestemt ved udpladning på Middlebrook 7H10 OADC suppleret med BBL MGIT PANTA. Resultater er udtrykt som logaritmisk ± SD (vandrette stænger) CFU pr embryo fra tre uafhængige forsøg (n = 5). (E) FPC målinger fra enkelte levende embryoner på forskellige tidspunkter post-infektion baseret på partikel-analyse under anvendelse ImageJ. Resultater er udtrykt som logaritmisk ± SD (vandrette stænger) FPC pr embryo fra tre uafhængige forsøg (n = 5). Alle billeder blev opnået med et epifluorescensmikroskop udstyret med en digital farvekamera. t = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. In vivo Cording af R-varianten. 30 HPF embryoer inficeret intravenøst ​​med R variant af M. abscessus og afbildet på forskellige tidspunkter post-infektion for at visualisere progression af ledningen formation. Den røde pil anvendes som et fast referencepunkt for at følge spatiotemporale udviklingen i ledningen. DIC billeder af den del af halen, der indeholder den voksende serpentine ledningen er indrammet (mikroskop udstyret med et farvekamera). Scale barer:. 100 um Klik her for at se en større version af dette tal.

0 / 53130fig5.jpg "/>
Figur 5. Udtømning af makrofager fører til øget ledningen spredning. (A) Embryoner er opbrugt ved brug af lipo-clodronat-baserede procedure eller morpholino-baserede procedure. (Top panel) clodronat-indkapslede liposomer (lipo-clodronat) injiceres intravenøst ​​i 24 HPF Tg (MPEG1: mCherry) embryoner. Inden cirkulationen, er lipo-clodronat hurtigt opslugt af makrofager, der undergår efterfølgende apoptose. (Efterladt nedre panel) Injektion af præparatet morpholino til knock-down ekspressionen af genet pu.1 i befrugtede Tg (MPEG1: mCherry) zebrafisk æg. (Højre-down panel) Den korrekte udtømning af makrofager i embryoner kontrolleres ved fluorescensmikroskopi (BC) 30 HPF makrofag-indeholdende (+) eller makrofag-udtømte. (-) Embryoner (efter lipo-clodronat behandling) inficeres med M. abscessus R udtrykkende tdTomato (vist i hvidt). (B) (C) Overlevelseskurver af makrofag-holdige eller makrofag-udtømte embryoner inficeret med ≈300 CFU M. abscessus R (n = 20). Repræsentative resultater fra tre uafhængige eksperimenter er vist. Alle billeder blev erhvervet med et mikroskop tilsluttet et farvekamera. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. Behavior af makrofager med embryoner smittet enten lokalt eller systemisk med M. abscessus (A) 48 HPF Tg (MPEG1: mCherry). zebrafisk embryoner er inficeret intramuskulært med Wasabi-udtrykkende M. abscessus R. Levende imaging anvendelse af et konfokalt mikroskop til at visualisere rekrutteret makrofager fagocyterende individuelle mycobakterier (i minutter efter infektion, MPI). Maksimal intensitet projektion viser en intens rekruttering af makrofager (rød) til injektionsstedet (konfokal mikroskop med 40X APO vand 0,8 NA mål). Scale bar: 20 pm (BC) 48 HPF Tg (MPEG1: mCherry). Embryoner intravenøst ​​smittet med M. abscessus R udtrykker Wasabi blev fikseret og afbildet ved konfokal mikroskopi (40X) ved 4 hpi (B) og 3 dpi (C). (B) Maksimal projektion af makrofag (rød) eller andre myeloide celler, formentlig neutrofiler (pile), der indeholder isolerede mykobakterier (grøn) tæt på injektionsstedet (konfokal mikroskop med 63X APO olie 1,33 NA mål). Scale bar: 10 pm (C) Maksimal intensitet projektion viser en makrofag (rød) i stand til at phagocytize en snor (grøn) (konfokal mikroskop med 63X APO olie 1,33 NA mål)..Målestok:. 5 um Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Zebrafisken har for nylig vist sig at være en fremragende hvirveldyr modelsystem til undersøgelse dynamikken i bakteriel infektion ved hjælp af bredt felt og konfokal billeddannelse i realtid 36. Kombinationen af ​​spredte mycobakterielle suspensioner (protokol 2.2) sammen med mikro-injektion metoder (protokol 4) giver reproducerbare systemiske infektioner og efterfølgende overvågning og visualisering af progression af infektion med særlig fokus på de bakterielle interaktioner med værten makrofager. Virulens M. abscessus in vivo kan undersøges takket være brugen af vildtype gyldne zebrafisk 37. For at undersøge interaktioner mellem M. abscessus og vært myeloide celler, kan bruges sådan flere transgene zebrafisk linjer som Tg (MPEG1: mCherry) at visualisere makrofager 19. Yderligere transgene reporter linjer såsom som Tg (MPX: GFP) 38 eller Tg (LYZ: DsRed) 39 wi'te enten grønne røde neutrofiler, henholdsvis kan også anvendes til at behandle den særlige rolle af disse granulocytter som respons på infektionen.

M. abscessus og især R variant udviser en naturlig tilbøjelighed til at danne massive bakterielle aggregater 19, hvilket forhindrer reproducerbar mikroinjektion. Desuden den omstændighed, at R variantformer meget større klumper end S variant ligeledes er til hinder potentielle sammenligning af virulens fænotyper for de to isogene varianter. Den er beskrevet i afsnit 2 protokollen tillader opnå homogen og spredte M. abscessus suspensioner til mikro-injektion i embryoer. Dette præparat kan anvendes til andre mycobakterielle arter eller mutantstammer, der udviser store aggregerende egenskaber. Da lydbehandlingstrin kan ændre den yderste mycobakterielle cellevæg lag, skal man sørge for at vurdere virkningen af ​​denne fysiske behandling på bakteriel levedygtighed til eACH nye stamme.

Bestemmelse af bakterielle byrder rutinemæssigt afhængig af CFU tælle efter udpladning lyserede embryoner om selektiv agar medium ved forskellige tidspunkter efter infektion, som beskrevet i protokollen 6.1. Denne procedure omfatter flere begrænsninger: siden dyrene aflives, kan hver embryo (eller gruppe af embryoner) anvendes til bestemmelse af et enkelt tidspunkt. Hertil kommer, denne metode er stadig unøjagtige på grund af en stor andel af bakterier, der aflives og / eller tabt under lyse, efterfølgende serielle fortyndinger eller hovedsageligt af sammenklumpning. Tælle CFU er også en besværlig opgave. Som et alternativ, protokollen 6.2 beskriver en effektiv metode til at kvantificere M. abscessus byrde, der omfatter begrænsede håndtering trin, baseret på en analyse af fluorescerende billeder af inficerede fostre med pixel kvantificering, som oprindeligt udviklet til M. marinum 40,41. Denne FPC metode baseret på partikel analyse, viser en god korrelation wed CFU tællinger. Ligeledes ved at kombinere mikroskopi og fluorescens kvantificering, relative ændringer i medfødte immunsystem celleantal pr embryo kan kvantificeres ved billedanalyse under anvendelse af passende transgene linjer.

Zebrafisk embryoner kan anvendes til at evaluere den rolle, immuncelle under infektion og makrofag udtømning fandtes at påvirke værtens overlevelse som reaktion på M. abscessus infektion. Specifik makrofag udtømning effektivt kan genereres ved hjælp af lipo-clodronat-baseret procedure (protokol 5.1) eller morpholino-baseret procedure (protokol 5.2). Idet tilstedeværelsen af ​​makrofager er afgørende for etablering og vedligeholdelse af det vaskulære system og for korrekt fosterudvikling, anbefales det dog alligevel, at ablatere makrofag produktionen på 24 HPF hjælp lipo-clodronat.

Zebrafisk embryo vises som en unik model til at studere M. abscessus infektioner og rolle extracellular Cording som et immunsystem undergravende strategi. Hvis determinanter kontrollerende Cording i M. abscessus kan identificeres, kunne de føre til udvikling af innovative terapeutiske muligheder. Sammenkædning brugen af zebrafisk sammen med innovative high throughput teknologier 42 åbner også feltet til lægemiddelforskning og nye farmakologiske tilgange mod dette stof-resistente patogen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Forfatterne er taknemmelige for K. Kissa til nyttige diskussioner og for at tilvejebringe lipo-clodronat og L. Ramakrishnan for den generøse gave pTEC27 og pTEC15 der tillader ekspressionen af ​​tdTomato og Wasabi, hhv. Dette arbejde er en del af projekterne i den franske National Research Agency (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 og DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) og Det Europæiske Fællesskabs syvende rammeprogram (FP7-PEOPLE-2011-ITN) under tilskudsaftale nr. PITN-GA-2011-289209 for Marie-Curie Initial Training Network FishForPharma. Vi vil også gerne takke foreningen Gregory Lemarchal og vaincre La mucoviscidose (RF20130500835) til finansiering af CM Dupont.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BBL MGIT PANTA BD Biosciences 245114
Bovine Serum Albumin  Euromedex 04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver  Sigma-Aldrich C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar BD Biosciences 262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Oleic Acid Sigma-Aldrich O1008
Paraformaldehyde Delta Microscopie 15710
Phenol Red Sigma-Aldrich 319244
Tween 80 Sigma-Aldrich P4780
Agar Gibco Life Technologie 30391-023
Low melting agarose Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts  Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries  Sutter instrument Inc BF100-78-10 1 mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device  Sutter Instrument Inc Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector Tritech Research  Digital microINJECTOR, MINJ-D
Tweezers Sciences Tools inc Dumont # M5S 
Microloader Tips Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown-Elliott, B. A., Wallace, R. J. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 716-746 (2002).
  2. Aitken, M. L., Limaye, A., et al. Respiratory outbreak of Mycobacterium abscessus subspecies massiliense in a lung transplant and cystic fibrosis center. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 185 (2), 231-232 (2012).
  3. Gilljam, M., Lindblad, A., Ridell, M., Wold, A. E., Welinder-Olsson, C. Molecular epidemiology of Mycobacterium abscessus, with focus on cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1497-1504 (2007).
  4. Roux, A. -L., Catherinot, E., et al. Multicenter study of prevalence of nontuberculous mycobacteria in patients with cystic fibrosis in France. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4124-4128 (2009).
  5. Lee, M. -R., Cheng, A., et al. CNS infections caused by Mycobacterium abscessus complex: clinical features and antimicrobial susceptibilities of isolates. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (1), 222-225 (2012).
  6. Talati, N. J., Rouphael, N., Kuppalli, K., Franco-Paredes, C. Spectrum of CNS disease caused by rapidly growing mycobacteria. The Lancet Infectious Diseases. 8 (6), 390-398 (2008).
  7. Medjahed, H., Gaillard, J. -L., Reyrat, J. -M. Mycobacterium abscessus: a new player in the mycobacterial field. Trends in Microbiology. 18 (3), 117-123 (2010).
  8. Griffith, D. E., Girard, W. M., Wallace, R. J. Clinical features of pulmonary disease caused by rapidly growing mycobacteria. An analysis of 154 patients. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1271-1278 (1993).
  9. Nessar, R., Cambau, E., Reyrat, J. M., Murray, A., Gicquel, B. Mycobacterium abscessus: a new antibiotic nightmare. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (4), 810-818 (2012).
  10. Sanguinetti, M., Ardito, F., et al. Fatal pulmonary infection due to multidrug-resistant Mycobacterium abscessus a patient with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 39 (2), 816-819 (2001).
  11. Griffith, D. E., Aksamit, T., et al. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 175 (4), 367-416 (2007).
  12. Howard, S. T., Rhoades, E., et al. Spontaneous reversion of Mycobacterium abscessus a smooth to a rough morphotype is associated with reduced expression of glycopeptidolipid and reacquisition of an invasive phenotype. Microbiology (Reading, England). 152 (Pt 6), 1581-1590 (2006).
  13. Chardi, A., Olivares, F., Byrd, T. F., Julián, E., Brambilla, C., Luquin, M. Demonstration of cord formation by rough Mycobacterium abscessus variants: implications for the clinical microbiology laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 49 (6), 2293-2295 (2011).
  14. Byrd, T. F., Lyons, C. R. Preliminary characterization of a Mycobacterium abscessus mutant in human and murine models of infection. Infection and Immunity. 67 (9), 4700-4707 (1999).
  15. Catherinot, E., Clarissou, J., et al. Hypervariance of a rough variant of the Mycobacterium abscessus type strain. Infection and Immunity. 75 (2), 1055-1058 (2007).
  16. Catherinot, E., Roux, A. -L., et al. Acute respiratory failure involving an R variant of Mycobacterium abscessus. Journal of Clinical Microbiology. 47 (1), 271-274 (2009).
  17. Bernut, A., Le Moigne, V., Lesne, T., Lutfalla, G., Herrmann, J. -L., Kremer, L. In vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium abscessus using the embryonic zebrafish test system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (7), 4054-4063 (2014).
  18. Oh, C. -T., Moon, C., Jeong, M. S., Kwon, S. -H., Jang, J. Drosophila melanogaster for Mycobacterium abscessus infection. Microbes and Infection / Institut Pasteur. 15 (12), 788-795 (2013).
  19. Bernut, A., Herrmann, J. -L., et al. Mycobacterium abscessus cording prevents phagocytosis and promotes abscess formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), E943-E952 (2014).
  20. Dubée, V., Bernut, A., et al. β-Lactamase inhibition by avibactam in Mycobacterium abscessus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (4), 1051-1058 (2015).
  21. Torraca, V., Masud, S., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Macrophage-pathogen interactions in infectious diseases: new therapeutic insights from the zebrafish host model. Disease Models Mechanisms. 7 (7), 785-797 (2014).
  22. Alibaud, L., Rombouts, Y., et al. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Molecular Microbiology. 80 (4), 919-934 (2011).
  23. Clay, H., Volkman, H. E., Ramakrishnan, L. Tumor necrosis factor signaling mediates resistance to mycobacteria by inhibiting bacterial growth and macrophage death. Immunity. 29 (2), 283-294 (2008).
  24. Palha, N., Guivel-Benhassine, F., et al. Real-time whole-body visualization of Chikungunya Virus infection and host interferon response in zebrafish. PLoS pathogens. 9 (9), e1003619 (2013).
  25. Mostowy, S., Boucontet, L., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS pathogens. 9 (9), e1003588 (2013).
  26. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10 (11), 2312-2325 (2008).
  27. Van der Sar, A. M., Appelmelk, B. J., Vandenbroucke-Grauls, C. M. J. E., Bitter, W. A star with stripes: zebrafish as an infection model. Trends in Microbiology. 12 (10), 451-457 (2004).
  28. Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O’Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infection and Immunity. 78 (4), 1495-1508 (2010).
  29. Levraud, J. -P., Disson, O., et al. Real-time observation of Listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infection and Immunity. 77 (9), 3651-3660 (2009).
  30. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
  31. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
  32. Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  33. Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 83-93 (1994).
  34. Adams, K. N., Takaki, K., et al. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145 (1), 39-53 (2011).
  35. Ramakrishnan, L. Looking within the zebrafish to understand the tuberculous granuloma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 783, 251-266 (2013).
  36. Davis, J. M., Clay, H., Lewis, J. L., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of Mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  37. Lamason, R. L., Mohideen, M. -A. P. K., et al. SLC24A5, a putative cation exchanger, affects pigmentation in zebrafish and humans. Science (New York, NY). 310 (5755), 1782-1786 (2005).
  38. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  39. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC developmental biology. 7, 42 (2007).
  40. Takaki, K., Davis, J. M., Winglee, K., Ramakrishnan, L. Evaluation of the pathogenesis and treatment of Mycobacterium marinum in zebrafish. Nature Protocols. 8 (6), 1114-1124 (2013).
  41. Stoop, E. J. M., Schipper, T., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Models Mechanisms. 4 (4), 526-536 (2011).
  42. Carvalho, R., de Sonneville, J., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PloS One. 6 (2), e16779 (2011).

Tags

Infektion , Zebrafisk infektion patogenese medfødte immunitet makrofag mikro-injektion fluorescens mikroskopi direkte billedvisning Cording.
Dechifrere og Imaging Patogenese og Cording af<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; I zebrafisk embryoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet,More

Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet, A., Herrmann, J. L., Lutfalla, G., Kremer, L. Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (103), e53130, doi:10.3791/53130 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter