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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Décrypter et de l'imagerie et la pathogenèse de Cording Published: September 9, 2015 doi: 10.3791/53130
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 3, 1, 1,2
1Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS, UMR 535, Université Montpellier, 2Centre d'études d'agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé, CNRS, FRE 3689, Université Montpellier, 3Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Santé, EA3647-EPIM, Université Versailles St Quentin

Introduction

Mycobacterium abscessus est un pathogène émergent qui provoque une large gamme de syndromes cliniques chez l'homme. Ceux-ci comprennent les infections cutanées ainsi que des infections pulmonaires chroniques sévères, principalement rencontrées dans immunodéprimés et chez les patients atteints de fibrose kystique 1,2,3,4. M. abscessus est également considéré comme l'un des principaux espèces de mycobactéries à croissance rapide responsables des infections nosocomiales et iatrogènes chez les humains. En outre, plusieurs rapports récents ont mis en évidence la possibilité que M. abscessus pourrait traverser la barrière hémato-encéphalique et induire des lésions importantes dans le système nerveux central (SNC) 5,6. En dépit d'être un producteur rapide, M. expositions abscessus aussi plusieurs fonctionnalités pathogènes qui sont liés à ceux de Mycobacterium tuberculosis, y compris la capacité de garder le silence pendant des années au sein des structures granulomateuses et de générer des lésions dans les poumons caséeuses 7. Plus inquiétante est le faible sensibilité de M. abscessus aux antibiotiques, ce qui rend ces infections extrêmement difficile à traiter conduisant à un taux d'échec thérapeutique significatif 8,9. La menace importante de cette espèce est principalement sa résistance intrinsèque à des antibiotiques, ce qui est une préoccupation majeure dans les établissements 10 de santé publique et d'une contre-indication à la transplantation pulmonaire 11.

M. de les écrans lisses (S) ou rugueuses morphotypes (R) de la colonie qui mènent à différents résultats cliniques. A la différence de la souche S, R bactéries ont tendance à croître de bout en bout, ce qui conduit à une corde ou un cordon structure semblable à 12,13. Plusieurs études indépendantes basées sur des modèles cellulaires ou animaux soit révélé le phénotype hyper-virulence de la R morphotype 14,15. Des études épidémiologiques, les cas les plus graves de M. infections pulmonaires abscessus semblent être associés avec des variantes R 16 qui sont la seule variantea vu persister pendant des années dans un hôte infecté 3. La différence de morphotype repose sur la présence (en S) ou perte (en R) de glycopeptidolipides de surface associée (GPL) 12. Toutefois, en raison des limites inhérentes aux modèles cellulaires / animales actuellement disponibles utilisés pour étudier M. infection abscessus, nos connaissances concernant les événements physiopathologiques des variantes de R ou S reste obscure. L'infection des souris immuno-compétentes par voie intraveineuse ou en aérosol conduit à la colonisation transitoire, d'empêcher l'utilisation de souris pour étudier les infections persistantes et pour vivo tests de sensibilité dans la drogue 17. Par conséquent, le développement de modèles animaux qui se prêtent à la manipulation de la réponse de l'hôte est un défi majeur. Dans ce contexte, les modèles non-mammifères d'infection ont été récemment mis au point, y compris Drosophila melanogaster 18 qui offre plusieurs avantages tels que le coût, la rapidité et l'acceptabilité éthique oVer le modèle de la souris. Le modèle de poisson zèbre (Danio rerio) de l'infection a également été explorée de visualiser, par imagerie non invasive, la progression et la chronologie de M. abscessus infection chez un animal en direct 19. Surtout, une preuve de concept a également été établi pour démontrer son aptitude pour les évaluations antibiotiques in vivo contre M. abscessus 17,20.

Le poisson zèbre ont été largement utilisés au cours des deux dernières décennies pour étudier les interactions entre les différents agents pathogènes et le système immunitaire de l'hôte 21. Le succès croissant de ce modèle vertébré alternatif repose sur les opportunités majeurs et uniques qui ont motivé et validés son utilisation pour une meilleure compréhension de nombreuses infections virales et bactériennes 19,22,23,24,25,26,27,28,29. Contrairement à la plupart des autres modèles animaux, embryons de poisson zèbre sont optiquement transparent, ce qui permet l'imagerie de fluorescence non invasive 30. Cette has conduit à étudier M. abscessus infecté embryons de poisson zèbre avec des détails sans précédent, culminant avec la description de Cording extracellulaire, qui représentent un exemple de plasticité morphologique bactérienne. Cording représente un nouveau mécanisme de subversion du système immunitaire et un mécanisme essentiel dans la promotion pathogenèse de M. aiguë infection abscessus 19.

Ce rapport décrit les nouveaux outils et les méthodes utilisant l'embryon de poisson zèbre à déchiffrer les traits physiopathologiques de M. abscessus infection et d'étudier les interactions intimes entre le bacille et le système immunitaire inné. Tout d'abord, la micro-injection d'un protocole détaillé qui comprend le traitement de l'inoculum bactérien, la préparation de l'embryon, et l'infection en soi, est présentée. Méthodes spécifiquement adaptés pour évaluer M. virulence abscessus par la mesure de différents paramètres, tels que la survie de l'hôte et de la charge bactérienne, sont présentés. Une attention particulière est donnée sur la façonà surveiller, à un niveau spatio-temporel, et le sort progression de l'infection et la réponse immunitaire de l'hôte à M. abscessus par microscopie vidéo. En outre, pour enquêter sur la contribution et le rôle des macrophages lors de M. abscessus infection, les méthodes pour générer des macrophages-appauvri embryons (en utilisant des approches soit génétiquement ou chimiquement base-) sont décrites. Enfin, les protocoles de visualiser les interactions spécifiques avec les macrophages ou les neutrophiles en utilisant soit des embryons fixes ou vivant sont documentés.

Le but de ce rapport est de stimuler de nouvelles études pour jeter une lumière nouvelle sur M. les mécanismes de virulence abscessus et notamment le rôle de Cording dans la mise en place d'un processus d'infection aiguë et incontrôlée.

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Protocol

Procédures expérimentales de poisson zèbre doivent se conformer aux réglementations institutionnelles et gouvernementales compétentes. Pour la présente étude, les expériences de poisson zèbre ont été effectuées à l'Université de Montpellier, selon les directives de l'Union européenne pour la manipulation des animaux de laboratoire (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) et approuvés sous la référence CEEA-LR-13007.

1. Préparation des réactifs et microinjection Équipement

  1. Préparer l'eau de poissons par dissolution de 0,06 g instantanée sel de mer de l'océan dans 1 L d'eau distillée 31, puis l'autoclave pour stériliser (120 ° C pendant 20 min) et stocker à 28,5 ° C pendant jusqu'à 1 mois.
  2. Préparer la solution de bleu de méthylène par dissolution de 1 g de bleu de méthylène dans l'eau distillée 1 L. Ajouter 300 pi de solution de bleu de méthylène dans 1 L d'eau de poisson pour obtenir de l'eau de poisson bleu, puis autoclave pour stériliser et stocker à 28,5 ° C pendant 1 mois.
    NOTE: Le additile bleu de méthylène dans l'eau de poisson empêche la croissance de moisissures.
  3. Préparation du tampon phosphate salin (PBS)
    1. Préparer une solution stock PBS X 10 par dissolution de 5,696 g Na 2 HPO 4, 680 mg KH 2 PO 4, 969 mg de KCl et 78,894 g de NaCl dans 1 L d'eau distillée et ajuster le pH à 7,0 avec HCl. Pour obtenir une X PBS, diluer à 100 ml de la solution PBS 10 X dans 900 ml d'eau distillée et autoclave pendant 20 min à 120 ° C pour stériliser.
    2. Ajouter 0,05% de Tween 80 pour obtenir 1 X PBST et stocker à température ambiante pendant jusqu'à 1 an.
  4. Préparer enrichissement oléique Acide Dextrose Catalase (OADC) en dissolvant 8,5 g de NaCl, 50 g sérum-albumine bovine, 20 g de D-glucose, 40 mg de catalase de foie de bovin et 0,5 g d'acide oléique dans l'eau distillée 1 litre puis stériliser par filtration la solution et stocker à 4 ° C pour un maximum de 6 mois.
  5. Préparez 100 ml d'acide méthane sulfonique éthyl-3 benzoate (tricaïne) solution de réserve, en dissolvant 400 mg tricaipoudre de NE dans 97,9 ml d'eau distillée. Ajouter 2,1 ml de Tris 1 M (pH 9) pour ajuster le pH à 7,0 et conserver la solution à -20 ° C.
  6. Préparer les aiguilles d'injection microcapillaire en tirant capillaires en verre borosilicate (1mm OD X 0,78 mm ID) en utilisant un dispositif micropipette extracteur avec les paramètres suivants: pression d'air 650; Chauffer 999; Tirez 50; Velocity 80; Durée 200.
  7. Préparer une solution d'agar 1,5% dans l'eau du poisson bleu et versez 25 ml de gélose fondue dans 100 mm des boîtes de Pétri. Sur le dessus de l'agar fondu, placez moules maison afin d'imprimer des canaux spécifiques. "V" en forme de canaux sont utilisées pour les embryons de position tandis que le "U" sont utilisés pour les oeufs (figure 1) 31. Une fois solidifié, retirer soigneusement l'empreinte.
    REMARQUE: Couvrir l'agar avec de l'eau du poisson bleu pour éviter la déshydratation et conserver à 4 ° C pendant jusqu'à 2 mois.

Figure 1 Figure 1. chambres de positionnement pour des injections de poisson zèbre. (A) des canaux en forme de U pour les œufs (panneau de gauche) et les canaux en forme de V pour les embryons (panneau de droite). Œufs de poisson zèbre / embryons sont pondus dans les canaux et alignés sur le même axe. (B) Visualisation chambres pour l'observation microscopique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. Préparation et stockage de l'M. abscessus inoculum

  1. M. abscessus conditions de croissance
    1. Étaler M. abscessus d'un -80 ° C sur un stock de glycérol agar Middlebrook 7H10 contenant 10% de OADC et 0,5% de glycérol (7H10 OADC) et supplémenté avec l'antibiotique approprié en fonction du marqueur de résistance porté par le vecteur codant pour la protéine fluorescente. Incuber les plaquesà 30 ° C pendant 4-5 jours.
    2. Choisir une colonie mycobactérienne fluorescence positive et inoculer 1 ml de bouillon Middlebrook 7H9 avec OADC complétée, 0,2% de glycerol, 0,05% de Tween 80 (7H9 OADC / T) avec l'antibiotique nécessaire dans un tube en plastique stérile de 15 ml. Incuber à 30 ° C pendant 1 semaine sans trembler.
      REMARQUE: Tween 80 empêche l'agrégation et l'agglutination bactérienne.
    3. Remettre en suspension le pré-culture obtenue au paragraphe 2.1.2 dans 50 ml Middlebrook 7H9 OADC / T dans 150 cm 2 flacons de culture de tissu jusqu'à une valeur finale de 0,1 OD 600 (correspondant à environ 5,10 7 bactéries / ml) et on incube en outre à 30 ° C pendant 4 jours pour obtenir une culture exponentielle de croissance (DO 600 = 0,6 à 0,8).
      Remarque: Pour réduire l'agglutination, en particulier de la variante rugueuse, l'incubation ne doit pas excéder 5 jours. Les deux variantes lisses et rugueuses affichent un taux de croissance similaire.
  2. Préparation du M. inoculum abscessus60;
    NOTE: En raison de la forte propension des rugueuse M. abscessus pour former de grands agrégats et de produire des cordes, un traitement spécifique est nécessaire pour générer inoculum homogène et quantitativement contrôlée avant microinjections dans les embryons. Ce traitement est aussi appliqué pour lisser les bactéries qui produisent des agrégats, bien que dans une moindre mesure que la souche rugueuse.
    1. Récolte des cultures en croissance exponentielle de-150 cm 2 flacons de culture tissulaire par centrifugation à 4 000 g pendant 15 min à température ambiante dans un tube en plastique de 50 ml stérile et remettre en suspension le culot bactérien dans 1 ml 7H9 OADC / T. Aliquote 200 pi de suspensions bactériennes dans 1,5 ml microtubes.
      NOTE: Travailler avec de petits volumes de seringues de 1 ml est nécessaire d'obtenir des suspensions très homogènes.
    2. Homogénéiser les suspensions bactériennes avec une aiguille 26-G (15 séquences va-et-vient), sonication trois fois pendant 10 secondes (avec pauses de 10 sec entre chaque sonication soiséquence) en utilisant un appareil à ultrasons à bain d'eau. Ajouter 1 ml de 7H9 OADC / T et le vortex brièvement. Centrifugeuse 3 min à 100 x g.
    3. Recueillir soigneusement les surnageants contenant mycobactéries pour éviter les grumeaux et la piscine les suspensions homogènes dans un tube en plastique stérile de 50 ml.
    4. Vérifier visuellement la présence d'agrégats bactériens restants éventuels.
      NOTE: Si agrégats sont toujours présents, procéder à une étape supplémentaire de centrifugation à 100 g pendant 2 min, et recueillir le surnageant.
    5. Centrifugeuse la suspension à 4000 g pendant 5 min, remettre en suspension le culot dans 200 pi 7H9 OADC / T et de procéder à l'injection.
    6. Évaluer la concentration bactérienne finale en étalant des dilutions en série (dans du PBST 1 x) sur gélose 7H10 OADC et en comptant les unités formant colonie (UFC) après 4 jours d'incubation à 30 ° C. UFC doit être déterminé pour chaque nouveau lot.
    7. Préparer les stocks de inocula congelés en stockant 5 aliquotes à -80 & #176; C.
      NOTE: L'évaluation UFC de -80 ° C aliquotes congelés est un pré-requis pour déterminer le nombre exact de bactéries viables congélation / décongélation peut affecter la viabilité de l'inoculum bactérien. Ces inoculums sont congelées prêtes à être utilisées pour les injections suivantes. Comme toutes les aliquotes contiennent le même nombre de CFU, ils permettent l'injection de bactéries de façon reproductible d'une expérience à l'autre.
  3. Contrôle de la qualité de l'inoculum
    REMARQUE: Ziehl-Neelsen (spécifique de mycobactéries) peut être utilisée pour comparer la qualité des suspensions bactériennes avant et après les procédures d'homogénéisation du point 2.2.
    1. Spot et étaler une gouttelette de la suspension bactérienne homogénéisée sur une lame de verre et lui permettre de sécher complètement, fixer le frottis pendant au moins 30 min sur une plaque chauffante réglée à 65-70 o C et tache en utilisant un protocole de coloration de Ziehl .
    2. Observez le frottis bactérien avec un microscope en utilisant un 100Objectif de X et comparer avec un frottis d'une suspension non traitée bactérienne (Figure 2).

Figure 2
Figure 2. Préparation de M. dispersé inoculums abscessus. Ziehl-Neelsen de R ou S variants cultivé sur un milieu de bouillon avant tout traitement (panneaux supérieurs) ou après le traitement (panneaux inférieurs) afin de réduire la taille et le nombre d'agrégats de mycobactéries (étapes successives de seringage, sonication et décantation) . Les bactéries ont été observées en utilisant un microscope avec 100 X APO huile 1.4 objectif NA). Les barres d'échelle:. 20 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

3. Préparer embryons de poissons zèbres

  1. Frai et la collecte des œufs de poisson zèbre de
    1. La veille de sla mise en gage, race de poisson zèbre adulte en plaçant 2 mâles et 1 femelle (généralement un ratio de 2: 1 permet le taux de fécondation optimale) dans une chambre de l'élevage, constitué d'un réservoir de poissons séparée avec un panier de collecte d'œufs 31.
      NOTE: paniers de collecte des oeufs sont utilisés pour protéger les oeufs d'être mangé par les parents et faciliter la récolte des œufs.
    2. Au 1 HPF, la récolte des œufs et d'embryons uniquement correctement développés dans un plat 100 mm de Pétri remplie avec 25 ml d'eau de poisson bleu (maximum 100 embryons par boîte) et les garder à 28,5 ° C. Oeufs non fécondés sont jetés.
  2. Préparation des embryons de poisson zèbre pour injections
    1. A environ 24 post-fertilisation h (HPF), dechorionate les embryons avec des pincettes fines dans une boîte de 100 mm de Pétri et les garder à 28,5 ° C.
    2. Recueillir les 30-48 embryons HPF aide d'une pipette et de les transférer à une chambre de positionnement en forme de "V" rempli de 25 ml d'eau de poisson contenant 270 mg / L tricaïne.Disposez les embryons correctement dans les canaux à l'aide d'un outil de pointe de microloader maison (de la pointe de chargeur micro maison écrêté) optimisé pour une micro-manipulation plus facile.
      NOTE: Orienter la face dorsale vers le bas pour les injections intraveineuses dans la veine caudale ou la face dorsale vers le haut pour les injections queue musculaires.

4. Micro-injection Procédure

NOTE: La procédure de micro-injection pour M. abscessus est similaire à celui décrit précédemment pour M. marinum injections 32. Pour évaluer la chronologie de M. infection abscessus (survie, la charge bactérienne, cinétique et caractéristiques de l'infection), les injections dans la veine caudale de 30 HPF embryons sont préférés. Pour visualiser le recrutement de cellules immunitaires, les injections sont faites dans des sites localisés tels que la queue est en muscles dans 48 hpf embryon.

  1. Diluer l'inoculum d'origine mycobactérienne dans du PBST 1 X (selon le nombre de CFU deêtre administré tel que déterminé à l'étape 2.2.6), contenant 10% de rouge de phénol pour vérifier injection appropriée.
  2. Chargez une aiguille d'injection de micro-capillaire avec 5-10 ul de l'inoculum bactérien en utilisant une pointe de microloader, connectez l'aiguille de microinjection dans le titulaire du micromanipulateur trois dimensions relié à l'injecteur et rompre le sommet de l'aiguille avec des pincettes fines pour obtenir une diamètre d'ouverture de 5-10 um.
  3. Étalonner le volume d'injection en ajustant la pression de la micro-injection (20 à 50 hPa) et l'heure (0,2 s).
    NOTE: Le volume d'injection est calibré requis par détermination visuelle du diamètre d'une gouttelette expulsée dans le jaune d'un embryon.
  4. Pour injection dans la veine caudale, positionner l'embryon avec la face ventrale face à l'aiguille (comme décrit à la section 3.2.2) et placer la pointe de l'aiguille à proximité de l'ouverture urogénitale, ciblant la veine caudale, et poussez doucement la pointe de l'aiguille dans l'embryon jusqu'à ce qu'elle perce seulement l'Caudrégion de la veine al. Livrer le volume désiré de préparation bactérienne, généralement 1-3 nl contenant environ 100 UFC / nl.
  5. Pour injection intramusculaire, positionner l'embryon avec le côté dorsale vers l'aiguille (comme dans la section 3.2.2), placer l'aiguille sur un somites et injecter un petit volume (1 nl) d'inoculum.
    NOTE: Comme pour les injections de veine caudale, infections intramusculaires sont également difficiles à effectuer. Des précautions doivent être prises pour éviter une surcharge qui peut blesser les tissus environnants.
  6. A la fin de la procédure d'injection, de contrôler la taille de l'inoculum en injectant le même volume de suspension bactérienne dans une goutte de PBST stérile suivie par étalement sur ​​OADC 7H10 et en comptant le UFC. Environ 100 embryons peuvent être injectés avec une aiguille.
    NOTE: En raison rugueuse M. abscessus peut continuer à former des agrégats dans l'aiguille, les injections doivent être faites immédiatement après la préparation de l'inoculum.
  7. Transférer les FIS infectésh plaques individuellement dans 24 puits contenant 2 ml / puits d'eau les poissons et incuber à 28,5 ° C. Les embryons injectés avec 1 à 3 nl 1 X PBST peuvent être utilisés comme témoins.
  8. Une bonne infection de bactéries fluorescentes dans des embryons est contrôlée en utilisant un microscope à fluorescence.

5. La génération d'embryons macrophages appauvri

REMARQUE: déplétion sélective des macrophages à partir de tissus est utilisée pour étudier leur contribution et leur rôle lors de l'infection. Pour visualiser le bon épuisement des macrophages, il est recommandé d'utiliser une lignée transgénique avec des macrophages fluorescentes, où mCherry est spécifiquement exprimée sous le contrôle du macrophage MPEG1 promoteur spécifique 19.

  1. Procédure à base de clodronate Lipo-
    NOTE: La procédure de lipo-clodronate permet une déplétion sélective des macrophages à partir de tissus (mais pas de neutrophiles) 19. Ce composé ne modifie ni la survie des embryons ni afFect l'intégrité de bactéries. Un protocole détaillé pour préparer clodronate encapsulé dans des liposomes a été rapporté précédemment 33.
    1. Au 24 HPF, dechorionate les embryons et les transférer sur un plat d'injection en forme de "V" rempli avec de l'eau de poisson complété avec tricaïne à maintenir les embryons dans un état anesthésié jusqu'à la fin de la procédure d'injection, comme décrit dans le paragraphe 3.2.2. Orienter la face dorsale vers le bas.
    2. Chargez une aiguille d'injection de micro-capillaire avec le clodronate encapsulé dans des liposomes (lipo-clodronate), connectez l'aiguille de microinjection dans le titulaire du micromanipulateur tridimensionnel et rompre le sommet de l'aiguille avec des pincettes fines pour obtenir un diamètre d'ouverture de pointe de 10 um.
    3. Pour étalonner le volume d'injection, ajuster la pression de la micro-injection à 20 hPa et la durée d'injection à 0,2 sec. Placez la pointe de l'aiguille à proximité de l'ouverture urogénitale, ciblant la veine caudale, et poussez doucement la pointe de l'aiguille dans leembryon jusqu'à ce qu'elle perce seulement la région de la veine caudale et délivrer le volume souhaité de solution (3.2 nl, 3 fois).
      REMARQUE: La suspension de lipo-clodronate est très collant et devrait être au vortex avant l'injection pour éviter de bloquer le système vasculaire et le meurtre de l'embryon. Il est essentiel de procéder à plusieurs injections successives de petits volumes.
    4. Transférer les embryons dans 100 plats mm de Pétri contenant de l'eau de poissons et de les garder à 28,5 ° C jusqu'à ce que l'infection.
    5. Contrôler le bon épuisement des macrophages par microscopie fluorescente.
      REMARQUE: macrophages complète appauvrissement est efficace pendant 4 jours après l'administration de lipo-clodoronate.
  2. Procédure basée morpholino-
    1. Le jour avant le frai, le poisson zèbre adulte de race en plaçant 2 mâles et 1 femelle séparés par une barrière en plastique dans une chambre de l'élevage.
    2. Le lendemain, ≈ 30 min après que la lumière tourne dans l'installation de poisson zèbre, supprimer la barrière de séparationmâles et les femelles. Attendez environ 20 minutes après le début de la ponte d'optimiser le taux de fécondation. Récolter les oeufs et de ralentir leur développement en les transférant dans une boîte de Pétri de 100 mm rempli avec de l'eau du poisson bleu froid (4 ° C).
      NOTE: Le contrôle de la ponte est crucial pour les expériences à base de morpholinos. Morpholinos ne peut être injecté dans les œufs jusqu'au stade quatre cellules.
    3. Ramassez les œufs à l'aide d'une pipette et déposer les oeufs dans la "U" injection en forme de chambre remplie d'eau de poisson bleu froid et bloquer les oeufs dans les canaux à l'aide d'un outil de pointe de microloader maison.
    4. Préparer la solution PU.1 morpholino contenant 10% de rouge de phénol, 19 comme décrit précédemment. Chargez une aiguille d'injection de micro-capillaire avec la préparation de morpholino et connecter l'aiguille de microinjection dans le titulaire du micromanipulateur trois dimensions, puis détacher la pointe de l'aiguille avec des pincettes fines pour obtena diamètre de 5-10 um d'ouverture de pointe.
    5. Pour étalonner le volume d'injection, ajuster la pression de la micro-injection de 20 à 50 hPa et la durée d'injection à 0,2 sec. Placez la pointe de l'aiguille à proximité de l'œuf et de pousser doucement la pointe de l'aiguille à travers le chorion dans l'œuf et de livrer le volume de solution morpholino souhaitée, généralement 3-5 nl.
    6. Après la micro-injection, transférer les oeufs dans une boîte de Pétri de 100 mm dans l'eau du poisson et incuber à 28,5 ° C jusqu'à ce que la procédure de l'infection commence.
    7. Analyser le (complet) épuisement correcte des macrophages dans morphants PU.1 par microscopie à fluorescence de 30 à 48 HPF..
      NOTE: En fonction de la concentration injectée, morpholinos p U.1 peuvent aussi influer sur le nombre de jeunes neutrophiles. Pour confirmer le bon épuisement des macrophages sans modifier le nombre de neutrophiles, il est recommandé d'utiliser une double ligne de poisson zèbre transgénique avec macrophages et des neutrophiles fluorescentes (avec la GFPexpression spécifiquement dirigé par le promoteur mpx) 19.

6. bactérienne Burden Quantification

  1. Détermination par UFC recensement
    1. Au point de temps désiré, recueillir des groupes de l'embryon infecté (5 par des conditions) dans 1,5 ml microtubes (1 embryon / tube), cryo-anesthésier les embryons par incubation sur de la glace pendant 10 min et euthanasier en utilisant une surdose de tricaïne (300- 500 mg / L)
    2. Laver les embryons avec de l'eau stérile deux fois et les distribuer dans un nouveau tube, chaque embryon lyse avec 2% de Triton X-100 dilué dans du PBST 1 x en utilisant une aiguille 26 G et homogénéiser la suspension jusqu'à ce que la lyse complète. Centrifuger la suspension et remettre en suspension le culot dans 1 X PBST avec 0,05% de Tween 80. dilutions en série des broyats sont étalées sur Middlebrook 7H10 OADC et complétées avec BBL MGIT PANTA, tel que recommandé par le fournisseur.
      REMARQUE: M. abscessus étant plus sensibles à NaOH treatment que M. marinum, la décontamination des lysats de poissons sans affecter M. abscessus croissance peut être réalisée avec succès en utilisant l'antibiotique cocktail BBL MGIT PANTA.
    3. Incuber les plaques pendant 4 jours à 30 ° C et comptage des colonies.
  2. Détermination par fluorescence Nombre de pixels (FPC) mesures en embryons vivants
    REMARQUE: Pour déterminer les charges bactériennes via l'émission de fluorescence, images en série d'embryons infectés sont acquis et de l'intensité de fluorescence mesurée par FPC (identification des bactéries par l'analyse de particules) en utilisant une macro maison développé pour le freeware ImageJ. Une analyse de particules nécessite une image binaire noir et blanc qui repose sur une gamme de seuil qui permet de discriminer le signal fluorescent d'intérêt de l'arrière-plan.
    1. Au point de temps désiré, tricain-anesthésier embryons infectés (5-10 par condition) en 35 mm boîtes de Pétri comme décrit dans le paragraphe 3.2.2.
    2. Retirer l'eau et submerge les embryons et l'ensemble de la surface de plat avec 1% de bas point de fusion d'agarose dans de l'eau de poisson, puis alignez latéralement les embryons. Couvrir l'agarose solidifié avec de l'eau de poisson contenant tricaïne.
    3. Acquérir des images de fluorescence de l'ensemble de l'embryon en utilisant un microscope à épifluorescence avec un objectif de 10 X.
      NOTE: L'acquisition d'image de fluorescence est une étape cruciale de la procédure des mesures FPC. Il est important d'utiliser un moniteur calibré avec une sonde de calibration des couleurs. Réglage du temps d'exposition optimal pour obtenir un fond minimal pendant l'acquisition empêche la saturation du signal. Les images doivent être au format TIFF 8-bit. Paramètres identiques sont conservés pendant toute l'expérience des fins quantitatives.
    4. Retirez soigneusement la gélose à partir des embryons avec un outil de pointe de microloader maison. Ces embryons peuvent être utilisés pour des analyses ultérieures si nécessaire. Avant la quantification de la charge bactérienne, chaque image doit être de qualité contrôlée. Pour unnalyze les images et les convertir l'intensité de fluorescence en FPC par poisson, ouvrir le freeware ImageJ.
      NOTE: La valeur FPC reflète la charge bactérienne, comme indiqué précédemment en utilisant M. marinum 34.
    5. Déterminer le seuil requis pour l'analyse d'image en utilisant une image d'un embryon non infecté (plusieurs embryons de contrôle peuvent être utilisés pour obtenir un seuil moyen). Allez dans Image → Ajuster → Seuil, puis déplacez le curseur en bas de la fenêtre de seuil vers la droite jusqu'à ce que l'arrière-plan devient complètement noir (à savoir, pour obtenir un fond devrait être à zéro). Enregistrez la valeur correspondante.
    6. Dans Image J, ouvrir la macro FPC (fichier supplémentaire) et suivez les instructions: recherchez le dossier d'images à mesurer, puis entrez le seuil préalablement déterminé et cliquez sur "OK".
      NOTE: La macro soustrait automatiquement le fond. Un seuil est ensuite appliqué. Signaux fluorescents sont identifiésfiés suite à l'analyse de particules.
    7. Copiez et collez les données à partir de la fenêtre de résumé pour le logiciel souhaité pour l'analyse des données.
      REMARQUE: Contrairement à la méthode de détermination UFC, la méthode FPC est non-invasive et permet de réutiliser les embryons pour des analyses ultérieures et, surtout, suivi de la dynamique / cinétique de la charge bactérienne sur une base individuelle. Il permet donc de réduire considérablement le nombre d'animaux, en accord avec les règles éthiques.

7. M. Imaging Les embryons infectés abscessus-

  1. L'imagerie en direct de M. infection abscessus
    1. Monter embryons de tricaïne anesthésiés (voir 3.2.2) à 1% point de fusion bas agarose dans une boîte de Pétri de 35 mm avant observations en microscopie à épifluorescence. Utilisez un plat à fond de verre pour la microscopie confocale inversé ou dans un tiroir de la dépression de la cavité unique pour la microscopie confocale verticale. Orienter l'embryon dans la position souhaitée et le couverclel'agarose solidifié avec de l'eau de poisson contenant tricaïne.
    2. Utiliser un microscope à épifluorescence avec un objectif de 10 X pour les images séquentielles d'acquisition de fluorescence et de diffusion de l'ensemble de l'embryon. Sinon, utilisez un microscope confocal à 40X ou 63X objectifs de visualiser l'activité des cellules immunitaires après une infection.
  2. Imagerie fixé M. abscessus infectés embryons
    1. Euthanasier les embryons comme décrit au point 6.1.1, et de les transférer à 1,5 ml tubes micro-centrifugeuses et fixer les embryons dans 4% de paraformaldehyde dans 1 X PBST pendant 2 heures à la température ambiante ou O / N à 4 ° C. Retirer le paraformaldehyde par lavage des embryons à deux reprises avec du PBST 1 x 10 min.
      NOTE: Afin de préserver la fluorescence, les embryons fixes doivent être protégées de la lumière.
    2. Pour préserver l'intégrité des tissus et de la fluorescence, les embryons sont incubés successivement dans des solutions de concentration croissante de glycérol (10, 20, 30, 40 et 50% dilué dans du PBST 1 x), pour10 min par condition.
      NOTE: Correction d'embryons peuvent être stockés pendant plusieurs mois dans 50% de glycérol à 4 ° C.
    3. Poser le embryon incorporé dans 50% de glycerol dans une chambre de visualisation (figure 1B) 31.
    4. Image à l'aide 40X ou 63X objectifs sur un microscope confocal.

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Representative Results

Bien que différents sites anatomiques peuvent être injectés 32, les injections de veine caudale sont souvent utilisés pour générer une infection systémique pour les analyses ultérieures, y compris les expériences de survie, la détermination de la charge bactérienne, une activité de phagocytose ou la formation du cordon. Les injections dans les muscles de la queue sont utilisés pour évaluer le recrutement des macrophages au site d'injection (figure 3A). Pour étudier et de comparer la virulence des variantes de R et S de M. abscessus, suspensions bactériennes fluorescents sont injectées dans la veine caudale de 30 embryons HPF (figure 3A) 19. Contrairement à la variante S, R morphotype induit une infection plus robuste et plus létale chez embryons de poisson zèbre (figure 3b), caractérisé par le développement rapide d'abcès bactériens au sein du système nerveux central (CNS) (Figure 3C). Injections systémiques à la fois avec le R et S variantes conduire à des infections du système nerveux central et la différence dela pathologie et des phénotypes de virulence peuvent être quantifiés, soit par observation de la microscopie à fluorescence (figure 3C), en énumérant UFC par le poisson (figure 3D) ou par détermination de la FPC d'images acquises (figure 3E). Surtout, UFC et la détermination FPC sont corrélés et soulignent à des charges bactériennes plus grandes pour la souche de R que la souche S à 3 et 5 dpi. Globalement, ces résultats appuient fortement poisson zèbre comme un modèle pertinent et non invasive de l'infection à étudier la chronologie du processus d'infection.

Peut-être l'une des caractéristiques les plus spectaculaires a été révélé par la vidéo-microscopie qui permet de visualiser les cordons de serpentine dans le SNC d'embryons infectés par la variante R (Figure 4). Merci de la transparence optique des embryons, la cinétique de la formation R-cordon peut être surveillée et imagée d'une manière non-invasive, illustrant la forte propension de la variante de R à reproduire extracellularly. Ce taux de replication incontrôlée, associée à la destruction cellulaire / tissulaire conduit rapidement à la mise au point d'abcès et finalement la mort des larves.

Les macrophages sont connus pour jouer un rôle important durant l'infection mycobactérienne et en particulier par la conduite 35 la formation de granulomes. Deux stratégies complémentaires peuvent être utilisées pour étudier M. abscessus croissance / virulence chez les embryons de type macrophage appauvri: la lipo-clodronate- et des procédures à base morpholino-(figure 5A). L'infection des embryons à des macrophages appauvri avec la variante R conduit à une augmentation massive des charges bactériennes et la production de cordon comme révélé par vidéo-microscopie (figure 5B), conduisant à extrêmement rapide décès (100% des embryons morts à 3 dpi; Figure 5C) . Cela indique clairement que les macrophages sont nécessaires pour contrôler M. infection abscessus.

Pour approfondir le rôle des macrophagescours de l'infection, les embryons transgéniques spécifiques hébergeant macrophages fluorescentes rouges (MPEG1: mCherry) peuvent être utilisés 19. Injection de M. abscessus exprimant wasabi dans la queue muscle ou dans la veine caudale induit une nette recrutement des cellules myéloïdes, principalement les macrophages, au niveau du site d'infection. Ce recrutement conduit à la phagocytose efficace des bactéries individuelles (figure 6A-6B). Malgré la présence de macrophages, la microscopie confocale révèle l'apparition de grandes cordes bactériennes qui ne peuvent phagocyter les macrophages (figure 6C). Pris ensemble, ces résultats mettent en évidence un nouveau mécanisme d'évasion immunitaire basée sur le rôle de Cording dans la prévention de la phagocytose mycobactérienne.

Figure 3
Figure 3. M. infection abscessus dans embryons de poisson zèbre. (A) (Panneau supérieur) de l'infection par injection intraveineuse effectuée fluorescente M. abscessus (représenté en blanc) dans la veine caudale (flèche 1), postérieur à l'ouverture urogénital, en 30 HPF embryons. (Partie inférieure) de l'infection par injection intramusculaire effectué mycobactéries fluorescent (représenté en blanc) dans la queue musculaire sur une somites (flèche 2), en 48 hpf embryons. (BE) 30 hpf embryons par voie intraveineuse infectés par M. tdTomato- abscessus (R et S variants). (B) courbes de survie d'embryons infectés par ≈ 300 CFU R ou S ou des variants de contrôles injectés PBS (n = 20). Les résultats représentatifs de trois expériences indépendantes sont présentés. (C) de visualisation spatio-temporelle du R ou la variante S exprimant tdTomato (blanc) à divers moments souligne post-infection réalisée par imagerie de fluorescence en direct. Pour chaque souche, une fluorescence et la transmission superposition représentant d'embryons infectés entiers est sho WN. Les mêmes embryons ont été imagées à 3 et 5 dpi. (DE) Charges bactérienne dans des embryons infectés par des variantes ou l'autre de R ou S (≈ 200 CFU) détermine CFU de comptage (D) ou des mesures FPC (E). (D) CFU de lysat d'embryons individuels à divers points de temps après l'infection déterminée par étalement sur ​​Middlebrook 7H10 OADC complété avec BBL MGIT PANTA. Les résultats sont exprimés en moyenne log ± SD (barres horizontales) CFU par embryon de trois expériences indépendantes (n = 5). Mesures (E) FPC à partir d'embryons de vie individuels à des points différents temps post-infection basée sur l'analyse de particules en utilisant ImageJ. Les résultats sont exprimés en moyenne ± écart-type log (barres horizontales) FPC par embryon de trois expériences indépendantes (n = 5). Toutes les images ont été obtenues avec un microscope à épifluorescence équipé d'un appareil photo numérique couleur. t = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
La figure 4. Dans cordonnet in vivo de la variante de r. 30 HPF embryons infectés par voie intraveineuse avec le variant de R M. abscessus et imagé à divers moments après l'infection de visualiser la progression de la formation de cordon. La flèche rouge est utilisé comme un point de référence fixe dans le but de suivre l'évolution spatio-temporelle de la corde. Les images DIC de la partie de la queue contenant la serpentine cordon croissante sont encadrés (microscope équipé d'une caméra couleur). Les barres d'échelle:. 100 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 5. L'épuisement des macrophages conduit à une prolifération accrue de cordon. (A) Les embryons sont amortis selon la procédure fondée lipo-clodronate ou de la procédure fondée morpholino. (Panneau supérieur) des liposomes de clodronate-encapsulé (lipo-clodronate) sont injectés par voie intraveineuse à 24 HPF Tg (MPEG1: mCherry) embryons. Dans la circulation, lipo-clodronate est rapidement englouti par les macrophages qui subissent l'apoptose subséquente. (Gauche-panneau inférieur) Injection de la préparation de morpholino de knock-down de l'expression du gène de PU.1 dans fécondé Tg (MPEG1: mCherry) les œufs de poisson zèbre. (Panneau droit vers le bas) L'épuisement correcte de macrophages dans des embryons est vérifiée par microscopie à fluorescence (BC) 30 hpf contenant macrophages (+) ou macrophages appauvri. (-) Embryons (après le traitement de lipo-clodronate) sont infectés par M. abscessus R exprimant tdTomato (représenté en blanc). (B) (C) de survie des embryons de macrophages ou contenant des macrophages infectés par appauvri ≈300 UFC M. abscessus R (n = 20). Des résultats représentatifs de trois expériences indépendantes sont présentés. Toutes les images ont été acquises avec un microscope relié à une caméra couleur. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6. Comportement des macrophages infectés dans les embryons, soit localement ou par voie systémique avec M. abscessus (A) 48 hpf Tg (MPEG1: mCherry). embryons de poisson zèbre sont infectés par voie intramusculaire avec Wasabi exprimant M. abscessus R. Imagi en directng en utilisant un microscope confocal à visualiser recruté macrophages phagocytizing mycobactéries individuelle (en minutes après l'infection, MPI). Projection d'intensité maximale montrant un recrutement intense de macrophages (rouge) au site d'injection (microscope confocal avec de l'eau 40X APO 0,8 objectif NA). Barre d'échelle: 20 pm (BC) 48 hpf Tg (de MPEG1: mCherry). Embryons par voie intraveineuse infectés par M. abscessus R exprimant wasabi ont été fixées et imagée par microscopie confocale (40X) à 4 hpi (B) et 3 dpi (C). (B) de projection maximum d'intensité de macrophages (rouge) ou d'autres cellules myéloïdes, probablement des neutrophiles (flèches), contenant mycobactéries isolées (vert) à proximité du site d'injection (microscope confocal avec de l'huile 63X APO 1,33 objectif NA). Barre d'échelle: 10 um (C) projection d'intensité maximale montrant un macrophage (rouge) incapable de phagocyter un cordon (vert) (de microscope confocal avec de l'huile 63X APO 1,33 objectif NA)..Barre d'échelle:. 5 pm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Le poisson zèbre a récemment émergé comme un excellent système de modèle vertébré pour étudier la dynamique de l'infection bactérienne utilisant large champ et imagerie confocale en temps réel 36. La combinaison de suspensions mycobactériennes dispersées (protocole 2.2) ainsi que les méthodes de micro-injection (protocole 4) permet infections reproductibles systémiques, et le suivi ultérieur et la visualisation de la progression de l'infection avec un accent particulier sur les interactions bactériennes avec les macrophages de l'hôte. Virulence de M. abscessus in vivo peut être étudiée grâce à l'utilisation du type sauvage poisson zèbre or 37. Pour étudier les interactions entre M. abscessus et héberger les cellules myéloïdes, plusieurs lignes de poisson zèbre transgéniques peuvent être utilisées telles que Tg (MPEG1: mCherry) pour visualiser les macrophages 19. Lignes rapporteurs transgéniques supplémentaires tels que l'que Tg (mpx: GFP) 38 ou Tg (lyz: DsRed) 39 wième soit verte de neutrophiles rouges, respectivement, peut également être utilisé pour aborder le rôle spécifique de ces granulocytes en réponse à l'infection.

M. abscessus, et en particulier la variante R, présente une propension naturelle à former des agrégats bactériennes massives 19, empêchant ainsi la micro-injection reproductible. En outre, le fait que les formes R variantes beaucoup plus grandes que les touffes de la variante de S se oppose à la comparaison potentiel aussi des phénotypes de virulence pour les deux variants isogéniques. Le protocole décrit à l'article 2 permet d'obtenir homogène et dispersée M. suspensions abscessus pour micro-injection dans des embryons. Cette préparation peut être appliquée à d'autres espèces de mycobactéries ou des souches mutantes présentant des propriétés d'agrégation excessive. Depuis l'étape de sonication peut altérer la couche de paroi cellulaire d'origine mycobactérienne la plus externe, il faut prendre soin d'évaluer l'impact de ce traitement physique sur la viabilité des bactéries Each nouvelle souche.

Détermination des charges bactériennes repose systématiquement sur CFU compter après placage embryons lysées sur un milieu gélose sélective à différents points de temps après l'infection, tel que décrit dans le protocole 6.1. Cette procédure comporte plusieurs limites: depuis animaux sont euthanasiés, chaque embryon (ou groupe d'embryons) peuvent être utilisés pour la détermination d'un seul point du temps. En outre, cette méthode reste inexactes à cause d'une grande partie des bactéries qui sont tués et / ou perdus lors de la lyse, des dilutions en série ultérieures, ou principalement par l'agglutination. Compter le UFC est également une tâche laborieuse. En variante, le protocole décrit 6.2 une méthode efficace pour quantifier l'M. charge abscessus qui comprend des étapes de traitement spécifiques, sur la base de l'analyse des images fluorescentes d'embryons infectés par le pixel quantification, tel que développé à l'origine pour M. marinum 40,41. Cette méthode basée sur l'analyse FPC de particules, montre une bonne corrélation wvec les comptages CFU. De même, en combinant la microscopie de fluorescence et la quantification, les changements relatifs dans les nombres de cellules immunitaires innées par embryon peuvent être quantifiés par analyse d'image en utilisant des lignées transgéniques appropriées.

Embryons de poisson zèbre peuvent être utilisés pour évaluer le rôle de cellule immunitaire lors de l'infection et de l'épuisement des macrophages a été trouvé de nuire à la survie de l'hôte en réponse à M. infection abscessus. Macrophages spécifique épuisement peut être généré de manière efficace en utilisant la procédure fondée-lipo-clodronate (protocole 5.1) ou de la procédure fondée morpholino- (protocole 5.2). Néanmoins, étant donné la présence de macrophages est cruciale pour la mise en place et le maintien du système vasculaire et pour le développement embryonnaire correct, il est recommandé de pratiquer l'ablation production de macrophages à 24 HPF utilisant lipo-clodronate.

L'embryon de poisson zèbre apparaît comme un modèle unique d'étudier M. infections abscessus et le rôle de extracellparti- Cording comme une stratégie de la subversion du système immunitaire. Si déterminants contrôle Cording dans M. abscessus peut être identifié, ils pourraient conduire à l'élaboration d'options thérapeutiques innovantes. Lier l'utilisation du poisson zèbre avec des technologies innovantes à haut débit 42 ouvre également le terrain pour la découverte de médicaments et de nouvelles approches pharmacologiques contre ce pathogène résistante aux médicaments.

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Acknowledgments

Les auteurs sont reconnaissants à K. Kissa pour des discussions utiles et pour fournir lipo-clodronate et L. Ramakrishnan pour le don généreux de pTEC27 et pTEC15 qui permettent l'expression de tdTomato et Wasabi, respectivement. Ce travail fait partie des projets de l'Agence Nationale de la Recherche française (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 et DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) et septième programme-cadre de la Communauté européenne (FP7-PEOPLE-2011-ITN) en vertu de convention de subvention aucune. PITN-GA-2011-289209 pour le Marie-Curie de formation initiale Réseau FishForPharma. Nous tenons également à remercier l'Association Gregory Lemarchal et Vaincre La Mucoviscidose (RF20130500835) pour le financement CM Dupont.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BBL MGIT PANTA BD Biosciences 245114
Bovine Serum Albumin  Euromedex 04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver  Sigma-Aldrich C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar BD Biosciences 262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Oleic Acid Sigma-Aldrich O1008
Paraformaldehyde Delta Microscopie 15710
Phenol Red Sigma-Aldrich 319244
Tween 80 Sigma-Aldrich P4780
Agar Gibco Life Technologie 30391-023
Low melting agarose Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts  Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries  Sutter instrument Inc BF100-78-10 1 mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device  Sutter Instrument Inc Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector Tritech Research  Digital microINJECTOR, MINJ-D
Tweezers Sciences Tools inc Dumont # M5S 
Microloader Tips Eppendorf

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References

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Décrypter et de l&#39;imagerie et la pathogenèse de Cording<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Dans embryons de poissons zèbres
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Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet, A., Herrmann, J. L., Lutfalla, G., Kremer, L. Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (103), e53130, doi:10.3791/53130 (2015).

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