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Immunology and Infection

इमेजिंग रोगजनन और के मुताबिक गूढ़ रहस्य और Published: September 9, 2015 doi: 10.3791/53130
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 3, 1, 1,2
1Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS, UMR 535, Université Montpellier, 2Centre d'études d'agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé, CNRS, FRE 3689, Université Montpellier, 3Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Santé, EA3647-EPIM, Université Versailles St Quentin

Introduction

माइकोबैक्टीरियम abscessus मानव में नैदानिक ​​सिंड्रोम की एक व्यापक स्पेक्ट्रम का कारण बनता है कि एक उभरते हुए रोगज़नक़ है। ये त्वचा संबंधी संक्रमण के रूप में अच्छी तरह से गंभीर क्रोनिक फेफड़े में संक्रमण, ज्यादातर प्रतिरक्षा में और सिस्टिक फाइब्रोसिस रोगियों 1,2,3,4 में सामना करना शामिल हैं। एम abscessus भी मनुष्यों में nosocomial और चिकित्सकजनित संक्रमण के लिए जिम्मेदार एक प्रमुख तेजी से बढ़ते माइक्रोबैक्टीरियल प्रजाति के रूप में माना जाता है। इसके अलावा, हाल ही में कई रिपोर्टों संभावना पर प्रकाश डाला कि एम abscessus रक्त मस्तिष्क बाधा पार और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) 5,6 में महत्वपूर्ण घावों को प्रेरित कर सकता है। एक तेजी से उत्पादक, एम होने के बावजूद यह भी abscessus दर्शाती granulomatous संरचनाओं के भीतर साल के लिए चुप रहने के लिए और फेफड़ों 7 में किलाटी घावों को उत्पन्न करने की क्षमता सहित माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग के उन लोगों से संबंधित हैं जो कई रोगजनक सुविधाओं,। अधिक खतरनाक कम सेन हैएम के sitivity एंटीबायोटिक दवाओं के लिए abscessus, एक महत्वपूर्ण चिकित्सीय असफलता की दर 8,9 करने के लिए अग्रणी के इलाज के लिए बेहद मुश्किल इन संक्रमणों प्रतिपादन। इस प्रजाति के महत्वपूर्ण खतरा मुख्य रूप से प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य संस्थानों के 10 में चिंता का विषय है और फेफड़ों प्रत्यारोपण 11 के लिए एक contraindication की है जो एंटीबायोटिक दवाओं के लिए अपने आंतरिक प्रतिरोध है।

एम abscessus प्रदर्शित करता है अलग अलग नैदानिक ​​परिणामों के लिए नेतृत्व कि चिकनी (एस) या किसी न किसी (आर) कॉलोनी morphotypes। एस तनाव के विपरीत, आर बैक्टीरिया एक रस्सी या रस्सी की तरह संरचना 12,13 के लिए अग्रणी अंत करने के लिए अंत बढ़ने की प्रवृत्ति है। सेलुलर या जानवर या तो मॉडल के आधार पर कई स्वतंत्र अध्ययन आर के हाइपर-डाह फेनोटाइप 14,15 मोर्फोटाइप का पता चला। महामारी विज्ञान के अध्ययन, एम के सबसे गंभीर मामलों से abscessus फेफड़े में संक्रमण आर के साथ जुड़े होने के लिए प्रकट केवल संस्करण हैं, जो 16 वेरिएंट किएक संक्रमित मेजबान 3 में साल के लिए जारी रहती है देखा गया है। मोर्फोटाइप अंतर सतह से जुड़े glycopeptidolipids (जीपीएल) 12 (एस) में उपस्थिति या (आर) में नुकसान पर निर्भर करता है। हालांकि, वर्तमान में उपलब्ध सेलुलर / पशु मॉडल के निहित सीमाओं की वजह से एम अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया abscessus संक्रमण, आर या एस वेरिएंट की pathophysiological घटनाओं के बारे में हमारे ज्ञान अस्पष्ट बनी हुई है। नसों में या एयरोसोल मार्गों के माध्यम से इम्युनो सक्षम चूहों के संक्रमण लगातार संक्रमण और इन विवो दवा संवेदनशीलता परीक्षण 17 के लिए अध्ययन करने के लिए चूहों का उपयोग बाधा, क्षणिक उपनिवेशन की ओर जाता है। इसलिए, मेजबान प्रतिक्रिया के हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी पशु मॉडल को विकसित करने के लिए एक बड़ी चुनौती है। इस संदर्भ में, संक्रमण की गैर स्तनधारी मॉडल ऐसे लागत, गति और नैतिक स्वीकार्यता ओ के रूप में कई लाभ प्रदान करता है कि 18 मेलानोगास्टर ड्रोसोफिला सहित हाल ही में विकसित किया गया हैमाउस मॉडल देखें। संक्रमण का zebrafish (Danio rerio) मॉडल भी गैर इनवेसिव इमेजिंग, एम की प्रगति और कालक्रम से, कल्पना करने के लिए पता लगाया गया है एक जीवित जानवर 19 में abscessus संक्रमण। महत्वपूर्ण बात है, अवधारणा के एक सबूत भी एम के खिलाफ इन विवो एंटीबायोटिक आकलन के लिए इसकी उपयुक्तता प्रदर्शित करने के लिए स्थापित किया गया था 17,20 abscessus।

zebrafish व्यापक रूप से विभिन्न रोगजनकों और मेजबान प्रतिरक्षा प्रणाली 21 के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए पिछले दो दशकों के दौरान इस्तेमाल किया गया है। इस विकल्प कशेरुकी मॉडल की बढ़ती सफलता से प्रेरित है और कई वायरल और बैक्टीरियल संक्रमण 19,22,23,24,25,26,27,28,29 को बेहतर ढंग से समझने के लिए इसके उपयोग के लिए मान्य है कि प्रमुख और अद्वितीय अवसर पर निर्भर करता है। अधिकांश अन्य पशु मॉडल के लिए विरोध के रूप में, zebrafish भ्रूण गैर इनवेसिव इमेजिंग प्रतिदीप्ति 30। यह हा अनुमति देता है, ऑप्टिकली पारदर्शी हैंएम अध्ययन करने के लिए एलईडी abscessus बैक्टीरियल रूपात्मक प्लास्टिसिटी का एक उदाहरण का प्रतिनिधित्व करते हैं कि बाह्य मुताबिक के विवरण के साथ समापन अभूतपूर्व विवरण के साथ zebrafish भ्रूण संक्रमित। मुताबिक प्रतिरक्षा प्रणाली की तोड़फोड़ के एक नए तंत्र और तीव्र एम के रोगजनन को बढ़ावा देने के एक महत्वपूर्ण तंत्र का प्रतिनिधित्व करता है abscessus संक्रमण 19।

इस रिपोर्ट में एम के pathophysiological लक्षण समझने के लिए zebrafish भ्रूण का उपयोग कर नए उपकरण और विधियों का वर्णन संक्रमण abscessus और बेसिली और सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच अंतरंग बातचीत का अध्ययन करने के लिए। सबसे पहले, एसई प्रति बैक्टीरियल inoculum, भ्रूण तैयार करने, और संक्रमण के प्रसंस्करण शामिल है कि एक विस्तृत microinjection प्रोटोकॉल, प्रस्तुत किया है। तरीके विशेष एम का आकलन करने के लिए अनुकूलित इस तरह मेजबान अस्तित्व और बैक्टीरियल बोझ के रूप में विभिन्न मापदंडों को मापने के द्वारा abscessus डाह, प्रस्तुत कर रहे हैं। विशेष ध्यान देने के तरीके के बारे में दी गई हैएक spatiotemporal स्तर पर, भाग्य और प्रगति के संक्रमण की और एम के लिए मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर नजर रखने के लिए वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग abscessus। इसके अलावा, एम के दौरान योगदान और मैक्रोफेज की भूमिका की जांच करने के लिए संक्रमण abscessus, तरीकों (genetically- या रासायनिक आधारित या तो तरीकों का उपयोग) मैक्रोफेज समाप्त भ्रूण वर्णित हैं उत्पन्न करने के लिए। अंत में, प्रोटोकॉल निश्चित या रहने वाले भ्रूण या तो उपयोग मैक्रोफेज या न्यूट्रोफिल दस्तावेज हैं के साथ विशेष बातचीत कल्पना करने के लिए।

इस रिपोर्ट का उद्देश्य एम में नया प्रकाश डाला करने के लिए आगे के अध्ययन को प्रोत्साहित करने के लिए है abscessus डाह तंत्र और एक गंभीर और अनियंत्रित संक्रमण की प्रक्रिया की स्थापना में मुताबिक की विशेष रूप से भूमिका।

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Protocol

Zebrafish प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं प्रासंगिक संस्थागत और सरकारी नियमों का पालन करना चाहिए। वर्तमान अध्ययन के लिए, zebrafish प्रयोगों प्रयोगशाला पशुओं से निपटने के लिए यूरोपीय संघ के दिशा-निर्देशों के अनुसार, विश्वविद्यालय मोंटपेलियर में (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) किया गया था और संदर्भ के तहत स्वीकृत CEEA-एलआर-13007।

अभिकर्मकों और microinjection उपकरण की 1. तैयारी

  1. तब तक के लिए 1 महीने के लिए 28.5 डिग्री सेल्सियस पर और दुकान (20 मिनट के लिए 120 डिग्री सेल्सियस) बाँझ आटोक्लेव, 1 एल आसुत जल 31 में 0.06 जी त्वरित महासागर सागर नमक भंग द्वारा मछली पानी को तैयार है।
  2. 1 एल आसुत जल में methylene नीले रंग की 1 ग्राम भंग द्वारा methylene नीले समाधान तैयार है। तब तक के लिए 1 महीने के लिए 28.5 डिग्री सेल्सियस पर बाँझ और स्टोर करने के लिए आटोक्लेव, नीली मछली पानी प्राप्त करने के लिए 1 एल मछली पानी में methylene नीले समाधान के 300 μl जोड़ें।
    नोट: additiमछली पानी में methylene नीले की पर आचारण विकास को रोकता है।
  3. फॉस्फेट खारा बफर की तैयारी (पीबीएस)
    1. 5.696 ग्राम ना 2 4 HPO, 680 मिलीग्राम के.एच. 2 पीओ 4, 969 मिलीग्राम KCl और 78.894 छ NaCl 1 एल में आसुत जल भंग द्वारा एक 10 x पीबीएस शेयर समाधान तैयार है और एचसीएल के साथ 7.0 पीएच को समायोजित करें। , 1 x पीबीएस प्राप्त बाँझ 120 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के दौरान पानी और आटोक्लेव आसुत 900 मिलीलीटर में 10 एक्स पीबीएस समाधान के 100 मिलीलीटर पतला करने के लिए।
    2. अप करने के लिए 1 वर्ष के लिए आरटी पर 1 एक्स PBST प्राप्त करने के लिए 0.05% के बीच 80 जोड़े और दुकान।
  4. तो समाधान बाँझ को फिल्टर गोजातीय जिगर और 1 एल आसुत जल में ओलिक एसिड की 0.5 ग्राम से 8.5 ग्राम सोडियम क्लोराइड, 50 ग्राम गोजातीय सीरम albumin, 20 ग्राम डी ग्लूकोज, 40 मिलीग्राम Catalase भंग द्वारा ओलिक एसिड Dextrose Catalase (OADC) संवर्धन को तैयार है और अप करने के लिए 6 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर यह दुकान।
  5. 400 मिलीग्राम tricai भंग द्वारा एथिल 3-aminobenzoate methanesulfonic एसिड (tricaine) शेयर समाधान के 100 मिलीलीटर की तैयारी97.9 मिलीलीटर में NE पाउडर पानी आसुत। 7.0 पीएच को समायोजित करने और -20 डिग्री सेल्सियस पर समाधान स्टोर करने के लिए 1 एम Tris (पीएच 9) के 2.1 मिलीलीटर जोड़ें।
  6. निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ एक micropipette खींचने डिवाइस का उपयोग borosilicate ग्लास केशिकाओं (1 मिमी आयुध डिपो एक्स 0.78 मिमी आईडी) खींच कर microcapillary इंजेक्शन सुई तैयार: वायु दबाव 650; 999 गर्मी; 50 खींच; वेग 80; समय 200।
  7. ब्लू मछली पानी में 1.5% अगर समाधान तैयार है और 100 मिमी पेट्री डिश में पिघल अगर की 25 मिलीलीटर डालना। पिघल अगर के शीर्ष पर, विशिष्ट चैनलों छाप करने के लिए घर का बना molds रखें। 'वी' आकार चैनलों स्थिति भ्रूण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं अंडे (चित्रा 1) 31 के लिए उपयोग किया जाता है के आकार का 'यू' है। जम जाने के बाद, ध्यान से छाप हटा दें।
    नोट: अप करने के लिए 2 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर निर्जलीकरण और दुकान से बचने के लिए नीले रंग की मछली पानी के साथ अगर कवर।

चित्र 1 Zebrafish इंजेक्शन के लिए चित्रा 1. पोजिशनिंग कक्षों। (ए) अंडे (बाएं पैनल) और भ्रूण के लिए वी के आकार का चैनल (सही पैनल) के लिए यू के आकार का चैनल। Zebrafish अंडे / भ्रूण चैनलों में रखी और एक ही धुरी के साथ गठबंधन कर रहे हैं। (बी) देखने कक्षों सूक्ष्म अवलोकन के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. तैयारी और एम का भंडारण abscessus Inoculum

  1. एम abscessus विकास की स्थिति
    1. एम बाहर प्लेट OADC का 10% और 0.5% ग्लिसरॉल (7H10 OADC) और उचित एंटीबायोटिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन एन्कोडिंग वेक्टर द्वारा किए गए विरोध मार्कर पर निर्भर करता है के साथ पूरक युक्त Middlebrook 7H10 अगर पर एक -80 डिग्री सेल्सियस ग्लिसरॉल स्टॉक से abscessus। प्लेटें सेते4-5 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर।
    2. एक प्रतिदीप्ति पॉजिटिव माइक्रोबैक्टीरियल कॉलोनी उठाओ और एक 15 मिलीलीटर बाँझ प्लास्टिक ट्यूब में आवश्यक एंटीबायोटिक के साथ OADC के साथ पूरक 1 मिलीलीटर Middlebrook 7H9 शोरबा, 0.2% ग्लिसरॉल, 0.05% के बीच 80 (7H9 OADC / टी) टीका लगाना। मिलाते हुए बिना एक सप्ताह के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      नोट: बीच 80 clumping और बैक्टीरियल एकत्रीकरण प्रतिबंधित करता है।
    3. (करीब 5.10 7 बैक्टीरिया / एमएल के लिए इसी) एक अंतिम 0.1 600 आयुध डिपो के लिए 150 सेमी 2 टिशू कल्चर बोतल में 50 मिलीलीटर Middlebrook 7H9 OADC / टी में 2.1.2 में प्राप्त पूर्व संस्कृति Resuspend और 4 के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर आगे सेते दिनों एक तेजी से बढ़ती संस्कृति (600 आयुध डिपो = 0.6-0.8) प्राप्त करने के लिए।
      नोट: clumping को कम करने के लिए, विशेष रूप से किसी न किसी प्रकार का, ऊष्मायन 5 दिन से अधिक नहीं होना चाहिए। दोनों चिकनी और किसी न किसी तरह वेरिएंट एक समान विकास दर प्रदर्शित करते हैं।
  2. एम की तैयारी abscessus inocula60;
    नोट: कारण किसी न किसी एम के उच्च प्रवृत्ति के लिए abscessus बड़े समुच्चय के रूप में करने के लिए और डोरियों का उत्पादन करने के लिए, एक विशेष उपचार से पहले भ्रूण में microinjections के लिए सजातीय और मात्रात्मक नियंत्रित inocula उत्पन्न करने के लिए आवश्यक है। इस इलाज भी किसी न किसी तनाव से एक हद तक कम करने के लिए ही सही, समुच्चय का उत्पादन है कि बैक्टीरिया सुचारू करने के लिए लागू किया जाता है।
    1. हार्वेस्ट 4 पर centrifugation द्वारा 150 सेमी 2 टिशू कल्चर बोतल से संस्कृतियों में तेजी से बढ़ रही है, 000 एक 50 मिलीलीटर बाँझ प्लास्टिक ट्यूब में आरटी पर 15 मिनट के लिए XG और 1 मिलीलीटर 7H9 OADC / टी में बैक्टीरिया गोली resuspend। अशेष 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में बैक्टीरियल निलंबन के 200 μl।
      नोट: 1 मिलीलीटर सीरिंज में छोटे संस्करणों के साथ कार्य करना अत्यधिक सजातीय निलंबन प्राप्त करने के लिए आवश्यक है।
    2. प्रत्येक sonication एसई के बीच 10 सेकंड के ब्रेक के साथ (10 सेकंड के लिए, (15 ऊपर और नीचे दृश्यों) sonicate तीन बार एक 26-जी सुई के साथ बैक्टीरियल निलंबन Homogenizeएक waterbath sonicator का उपयोग quence)। संक्षेप में 7H9 OADC / टी और भंवर के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 100 x जी पर अपकेंद्रित्र 3 मिनट।
    3. ध्यान झुरमुटों से बचने और एक 50 मिलीलीटर बाँझ प्लास्टिक ट्यूब में समरूप निलंबन पूल करने के लिए माइक्रोबैक्टीरिया युक्त supernatants इकट्ठा।
    4. अंतिम शेष जीवाणु समुच्चय की उपस्थिति के लिए नेत्रहीन जाँच करें।
      नोट: समुच्चय अभी भी मौजूद हैं, तो 2 मिनट के लिए 100 XG पर एक अतिरिक्त centrifugation कदम के लिए आगे बढ़ना है, और सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
    5. अपकेंद्रित्र निलंबन 5 मिनट के लिए 4,000 XG पर, 200 μl 7H9 OADC / टी में गोली resuspend और इंजेक्शन के लिए आगे बढ़ें।
    6. 7H10 OADC अगर पर (1 एक्स PBST में) धारावाहिक dilutions चढ़ाना और 30 डिग्री सेल्सियस पर 4 दिनों के ऊष्मायन के बाद कॉलोनी बनाने इकाइयों (सीएफयू) की गणना के द्वारा अंतिम जीवाणु एकाग्रता का आकलन करें। CFUs प्रत्येक नए बैच के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए।
    7. -80 & # पर 5 μl aliquots के भंडारण के द्वारा जमे हुए inocula स्टॉक तैयार176, सी।
      नोट: -80 डिग्री सेल्सियस जमे हुए aliquots की सीएफयू मूल्यांकन / फ्रीज विगलन inoculum के बैक्टीरियल व्यवहार्यता को प्रभावित कर सकते हैं के रूप में व्यवहार्य बैक्टीरिया की सही संख्या निर्धारित करने के लिए एक पूर्व शर्त है। ये जमे हुए inocula बाद इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं। सभी aliquots CFU की संख्या में एक ही होते हैं, वे एक दूसरे के प्रयोग से एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तरीके से बैक्टीरिया इंजेक्शन लगाने की अनुमति देते हैं।
  3. Inoculum गुणवत्ता नियंत्रण
    नोट: (माइक्रोबैक्टीरिया के लिए विशिष्ट) Ziehl-नील्सन धुंधला करने से पहले और 2.2 में वर्णित homogenization प्रक्रियाओं के बाद जीवाणु निलंबन की गुणवत्ता की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
    1. स्पॉट और एक गिलास स्लाइड पर homogenized जीवाणु निलंबन की एक छोटी बूंद बाहर फैला है और यह पूरी तरह से सूखा 65-70 ओ सी और दाग एक Ziehl-नील्सन धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए सेट एक गर्म थाली पर कम से कम 30 मिनट के लिए धब्बा को ठीक करने के लिए अनुमति ।
    2. एक खुर्दबीन एक 100 का उपयोग कर के साथ बैक्टीरियल धब्बा का निरीक्षणएक्स उद्देश्य और एक गैर प्रसंस्कृत जीवाणु निलंबन का धब्बा साथ तुलना (चित्रा 2)।

चित्र 2
छितरी एम चित्रा 2. तैयारी abscessus inocula। आर या एस के Ziehl-नील्सन धुंधला (ऊपरी पैनल) किसी भी इलाज के लिए पहले शोरबा मध्यम पर हो वेरिएंट या उपचार (कम पैनल) के बाद माइक्रोबैक्टीरियल समुच्चय के आकार और संख्या (syringing, sonication और निस्तारण की लगातार कदम) को कम करने के लिए । जीवाणु 100 एक्स एपीओ तेल 1.4 एनए उद्देश्य) के साथ एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर मनाया गया। स्केल सलाखों:। 20 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

3. Zebrafish भ्रूण तैयारी

  1. Zebrafish अंडे स्पॉन और एकत्रित
    1. एस पहले दिनpawning, 2 पुरुषों और 1 महिला रखकर नस्ल वयस्क zebrafish: एक अंडा संग्रह टोकरी 31 के साथ एक अलग मछली टैंक से मिलकर, एक प्रजनन के चेंबर में (आमतौर पर एक 2 1 के अनुपात इष्टतम निषेचन दर अनुमति देता है)।
      नोट: अंडा संग्रह बास्केट माता-पिता द्वारा खाया जा रहा से अंडे की रक्षा और अंडे की कटाई की सुविधा के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।
    2. 28.5 डिग्री सेल्सियस पर 25 मिलीलीटर ब्लू मछली पानी (अधिकतम 100 पकवान प्रति भ्रूण) और उन्हें रखने से भरा एक 100 मिमी पेट्री डिश में 1 HPF, फसल अंडे और केवल ठीक से विकसित भ्रूण पर। गैर निषेचित अंडे खारिज कर रहे हैं।
  2. इंजेक्शन के लिए zebrafish भ्रूण की तैयारी
    1. के बारे में 24 घंटे के बाद निषेचन (HPF) में, एक 100 मिमी पेट्री डिश में ठीक चिमटी के साथ भ्रूण dechorionate और 28.5 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें रखने के लिए।
    2. एक विंदुक का उपयोग 30-48 HPF भ्रूण लीजिए और मछली पानी के 25 एमएल 270 मिलीग्राम / एल tricaine युक्त से भरा एक 'वी' के आकार का स्थिति चैम्बर को हस्तांतरण।एक आसान सूक्ष्म हेरफेर के लिए अनुकूलित एक घर का बना microloader टिप उपकरण (घर का बना काटा सूक्ष्म लोडर टिप) का उपयोग चैनलों में ठीक से भ्रूण निर्धारित करना।
      नोट: दुम नस या पूंछ पेशी इंजेक्शन के लिए ऊपर की तरफ पृष्ठीय पक्ष में नसों में इंजेक्शन के लिए नीचे की ओर पृष्ठीय पक्ष बोध।

4. माइक्रो इंजेक्शन प्रक्रिया

नोट: एम के लिए सूक्ष्म इंजेक्शन प्रक्रिया abscessus एम के लिए पहले से वर्णित एक के समान है Marinum 32 इंजेक्शन। एम के कालक्रम आकलन करने के लिए abscessus संक्रमण (अस्तित्व, जीवाणु भार, काइनेटिक और संक्रमण की विशेषताओं), 30 HPF भ्रूण की दुम नस में इंजेक्शन पसंद कर रहे हैं। प्रतिरक्षा सेल की भर्ती कल्पना, इंजेक्शन 48 HPF भ्रूण में पूंछ की मांसपेशियों में है कि इस तरह के रूप में स्थानीय साइटों में किया जाता है।

  1. CFU की संख्या के आधार पर 1 एक्स PBST (में माइक्रोबैक्टीरियल inoculum पतलाउचित इंजेक्शन जाँच करने के लिए 10% लाल फिनोल युक्त, चरण 2.2.6) में निर्धारित रूप में प्रशासित किया।
  2. एक microloader टिप का उपयोग बैक्टीरियल inoculum के 5-10 μl के साथ एक microcapillary इंजेक्शन सुई लोड, इंजेक्टर से जुड़े तीन आयामी micromanipulator के धारक में microinjection सुई कनेक्ट और एक प्राप्त करने के लिए ठीक चिमटी के साथ सुई के ऊपर से तोड़ने 5-10 माइक्रोन का व्यास खोलने।
  3. Microinjection दबाव (20-50 एचपीए) और समय (0.2 सेकंड) का समायोजन करके इंजेक्शन की मात्रा जांचना।
    नोट: आवश्यक इंजेक्शन की मात्रा एक भ्रूण की जर्दी में निष्कासित कर दिया एक छोटी बूंद के व्यास का दृश्य दृढ़ संकल्प से calibrated है।
  4. दुम नस इंजेक्शन के लिए, (धारा 3.2.2 में वर्णित है) सुई का सामना करना पड़ उदर पक्ष के साथ भ्रूण की स्थिति और दुम नस को निशाना मूत्रजननांगी खोलने के लिए सुई की नोक के करीब है, जगह है, और धीरे भ्रूण में सुई की नोक धक्का यह सिर्फ caud pierces तकअल नस क्षेत्र। आम तौर पर लगभग 100 CFU / nl युक्त 1-3 NL, बैक्टीरियल तैयारी के वांछित मात्रा देने।
  5. इंट्रामस्क्युलर इंजेक्शन के लिए, (धारा 3.2.2 के रूप में) सुई का सामना करना पड़ पृष्ठीय पक्ष के साथ भ्रूण की स्थिति, एक विखंड पर सुई जगह और inoculum की एक छोटी मात्रा (1 NL) इंजेक्षन।
    नोट: दुम नस में इंजेक्शन के रूप में, इंट्रामस्क्युलर संक्रमण भी प्रदर्शन करने की चुनौती दे रहे हैं। देखभाल के आसपास के ऊतकों को नुकसान हो सकता है कि एक से अधिक भार से बचने के लिए लिया जाना चाहिए।
  6. इंजेक्शन प्रक्रिया के अंत में, 7H10 OADC पर चढ़ाना और CFU गिनती के द्वारा पीछा बाँझ PBST की एक बूंद में जीवाणु निलंबन का एक ही मात्रा इंजेक्शन द्वारा inoculum के आकार को नियंत्रित। करीब 100 भ्रूण एक सुई के साथ इंजेक्शन जा सकता है।
    नोट: क्योंकि किसी न किसी एम abscessus सुई में समुच्चय के रूप में करने के लिए जारी रख सकते हैं, इंजेक्शन inoculum की तैयारी के बाद तुरंत किया जाना चाहिए।
  7. संक्रमित वित्तीय संस्थाओं स्थानांतरण2 मिलीलीटर / अच्छी तरह मछली पानी और 28.5 डिग्री सेल्सियस पर सेते युक्त ज व्यक्तिगत रूप में 24 अच्छी तरह प्लेटें। 1-3 nl 1 एक्स PBST के साथ इंजेक्शन भ्रूण नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  8. भ्रूण में फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया के समुचित संक्रमण एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग निगरानी रखी जाती है।

बृहतभक्षककोशिका समाप्त भ्रूण 5. जनरेशन

नोट: ऊतकों से मैक्रोफेज के चुनिंदा कमी संक्रमण के दौरान उनके योगदान और भूमिका की जांच करने के लिए प्रयोग किया जाता है। मैक्रोफेज के समुचित कमी कल्पना करने के लिए, यह mCherry विशेष बृहतभक्षककोशिका विशिष्ट MPEG1 प्रमोटर 19 के नियंत्रण में व्यक्त किया जाता है, जहां फ्लोरोसेंट मैक्रोफेज, के साथ एक ट्रांसजेनिक लाइन का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है।

  1. लाइपो-clodronate आधारित प्रक्रिया
    नोट: लाइपो-clodronate प्रक्रिया ऊतकों से मैक्रोफेज की एक चयनात्मक कमी (लेकिन कोई न्यूट्रोफिल) 19 अनुमति देता है। इस यौगिक न भ्रूण और न ही वायुसेना के अस्तित्व को बदल देता हैबैक्टीरिया की अखंडता fect। Liposome समझाया clodronate तैयार करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पहले 33 सूचित किया गया है।
    1. 24 HPF पर, भ्रूण dechorionate और 3.2.2 में वर्णित है, इंजेक्शन प्रक्रिया के अंत तक एक anesthetized राज्य में भ्रूण बनाए रखने के लिए tricaine के साथ पूरक मछली पानी से भरा एक 'वी' के आकार का इंजेक्शन पकवान को हस्तांतरण। नीचे की तरफ पृष्ठीय पक्ष बोध।
    2. Liposome समझाया clodronate (लाइपो-clodronate) के साथ एक microcapillary इंजेक्शन सुई लोड, तीन आयामी micromanipulator के धारक में microinjection सुई कनेक्ट और 10 माइक्रोन के एक टिप खोलने व्यास प्राप्त करने के लिए ठीक चिमटी के साथ सुई के ऊपर से टूट गया।
    3. इंजेक्शन की मात्रा जांचना, 20 एचपीए के लिए microinjection के दबाव और 0.2 सेकंड के लिए इंजेक्शन समय समायोजित। दुम नस को निशाना, मूत्रजननांगी खोलने के लिए सुई की नोक के पास जगह है, और धीरे में सुई की नोक धक्काभ्रूण यह सिर्फ दुम नस क्षेत्र में घुसा और समाधान के वांछित मात्रा (2-3 NL, 3 बार) देने तक।
      नोट: लाइपो-clodronate निलंबन बहुत चिपचिपा है और भ्रूण की नाड़ी तंत्र और हत्या अवरुद्ध से बचने के लिए इंजेक्शन के लिए पहले vortexed किया जाना चाहिए। यह छोटे संस्करणों के लगातार कई इंजेक्शन के लिए आगे बढ़ने के लिए महत्वपूर्ण है।
    4. मछली पानी युक्त 100 मिमी पेट्री डिश में भ्रूण स्थानांतरण और संक्रमण जब तक 28.5 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें रखने के लिए।
    5. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा मैक्रोफेज के समुचित कमी पर नियंत्रण रखें।
      नोट: पूरा बृहतभक्षककोशिका कमी लाइपो-clodoronate प्रशासन के बाद 4 दिनों के लिए प्रभावी है।
  2. Morpholino आधारित प्रक्रिया
    1. 2 पुरुषों और एक प्रजनन कक्ष में एक प्लास्टिक की बाधा से अलग कर दिया 1 महिला रखकर स्पॉन, नस्ल वयस्क zebrafish एक दिन पहले।
    2. अगले दिन, प्रकाश zebrafish सुविधा में बदल जाता है पर उसके बाद ≈ 30 मिनट, को अलग बाधा को दूरपुरुषों और महिलाओं। निषेचन दर अनुकूलन करने के लिए स्पॉन की शुरुआत के बाद लगभग 20 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। अंडे फसल और ठंड नीली मछली पानी (4 डिग्री सेल्सियस) से भरा एक 100 मिमी पेट्री डिश में उन्हें स्थानांतरित करने से उनके विकास धीमी गति से।
      नोट: स्पॉन का नियंत्रण morpholinos आधारित प्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण है। Morpholinos केवल चार कोशिकाओं चरण के लिए ऊपर अंडे में इंजेक्ट किया जा सकता है।
    3. एक विंदुक का उपयोग अंडे ले लीजिए और ठंड नीली मछली पानी से भरे 'यू' आकार का इंजेक्शन कक्ष में अंडे नीचे जमा और एक घर का बना microloader टिप उपकरण का उपयोग चैनलों में अंडे ब्लॉक।
    4. पहले 19 में वर्णित है, के रूप में लाल फिनोल के 10% से युक्त pu.1 morpholino समाधान तैयार करें। Morpholino तैयारी के साथ एक microcapillary इंजेक्शन सुई लोड और तीन आयामी micromanipulator के धारक में microinjection सुई कनेक्ट, तो obtai को ठीक चिमटी के साथ सुई की नोक से दूर तोड़ने5-10 माइक्रोन की ना टिप खोलने व्यास।
    5. इंजेक्शन की मात्रा जांचना, 20-50 एचपीए के लिए microinjection के दबाव और 0.2 सेकंड के लिए इंजेक्शन समय समायोजित। अंडे के करीब सुई की नोक प्लेस और धीरे वांछित morpholino समाधान मात्रा, आम तौर पर 3-5 nl अंडे में जरायु के माध्यम से सुई की नोक धक्का और देने के लिए।
    6. सूक्ष्म इंजेक्शन के बाद, मछली पानी में एक 100 मिमी पेट्री डिश में अंडे हस्तांतरण और संक्रमण प्रक्रिया शुरू होती है जब तक 28.5 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    7. 30-48 HPF पर फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा pu.1 morphants में मैक्रोफेज के समुचित (पूर्ण) की कमी का विश्लेषण करें।।
      नोट: इंजेक्ट एकाग्रता पर निर्भर करता है, पी u.1 morpholinos भी जल्दी न्यूट्रोफिल की संख्या को प्रभावित कर सकता है। न्यूट्रोफिल की संख्या में फेरबदल के बिना मैक्रोफेज के समुचित कमी की पुष्टि करने के लिए, यह GFP के साथ (फ्लोरोसेंट मैक्रोफेज और जीवाणुओं के साथ एक डबल ट्रांसजेनिक zebrafish लाइन का उपयोग करने के लिए सिफारिश की हैविशेष रूप से MPX प्रमोटर द्वारा संचालित अभिव्यक्ति) 19।

6. बैक्टीरियल बोझ मात्रा

  1. CFU गणन द्वारा निर्धारण
    1. वांछित समय बिंदु पर, 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में संक्रमित भ्रूण के समूह (शर्तों के अनुसार 5) (1 भ्रूण / ट्यूब), 10 मिनट के लिए बर्फ पर ऊष्मायन द्वारा भ्रूण क्रायो anesthetize और tricaine की अधिक मात्रा का उपयोग कर euthanize (300 इकट्ठा 500 मिलीग्राम / एल)
    2. दो बार बाँझ पानी के साथ भ्रूण धो लें और एक नया ट्यूब में उन्हें बांटना, ल्य्से साथ प्रत्येक भ्रूण 2% ट्राइटन X-100 एक 26 जी सुई का उपयोग और पूर्ण सेल तक निलंबन homogenize 1 एक्स PBST में पतला। निलंबन अपकेंद्रित्र और 0.05% के बीच homogenates के 80 सीरियल dilutions Middlebrook 7H10 OADC पर चढ़ाया और आपूर्तिकर्ता की सिफारिश के अनुसार, बीबीएल MGIT PANTA के साथ पूरक हैं के साथ 1 एक्स PBST में गोली resuspend।
      नोट: एम NaOH के उपचार के लिए अतिसंवेदनशील जा रहा abscessusएम से टी एम को प्रभावित किए बिना मछली lysates के Marinum, परिशोधन abscessus विकास सफलतापूर्वक बीबीएल MGIT PANTA एंटीबायोटिक कॉकटेल का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है।
    3. 30 डिग्री सेल्सियस और गिनती कालोनियों में 4 दिनों के लिए प्लेटें सेते हैं।
  2. प्रतिदीप्ति पिक्सेल द्वारा निर्धारण लाइव भ्रूण में (पांचवें वेतन आयोग) माप गणना
    नोट: प्रतिदीप्ति उत्सर्जन के माध्यम से जीवाणु भार निर्धारित करने के लिए, संक्रमित भ्रूण के धारावाहिक छवियों का अधिग्रहण कर रहे हैं और पांचवें वेतन आयोग (कण विश्लेषण से बैक्टीरिया की पहचान) द्वारा मापा प्रतिदीप्ति तीव्रता ImageJ फ्रीवेयर के लिए विकसित किया गया एक घर का बना मैक्रो का उपयोग कर। एक कण विश्लेषण पृष्ठभूमि से ब्याज की फ्लोरोसेंट संकेत भेदभाव करने के लिए अनुमति देता है कि एक सीमा से सीमा पर निर्भर करता है कि एक द्विआधारी काले और सफेद छवि की आवश्यकता है।
    1. 3.2.2 में वर्णित के रूप में वांछित समय बिंदु पर, 35 मिमी पेट्री डिश में संक्रमित भ्रूण (शर्त के अनुसार 5-10) tricain-anesthetize।
    2. पानी और subme हटायेrge भ्रूण और मछली पानी में 1% कम पिघलने बिंदु agarose के साथ पूरे पकवान सतह, तो laterally भ्रूण संरेखित। मछली पानी tricaine युक्त साथ जम agarose कवर।
    3. एक 10 x उद्देश्य के साथ एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग पूरे भ्रूण के प्रतिदीप्ति छवियों मोल।
      नोट: प्रतिदीप्ति छवि अधिग्रहण पांचवें वेतन आयोग माप प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण कदम है। यह एक रंग अंशांकन जांच के साथ एक calibrated मॉनिटर का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। अधिग्रहण के संकेत के संतृप्ति रोकता दौरान जोखिम का इष्टतम समय का समायोजन एक न्यूनतम पृष्ठभूमि प्राप्त करने के लिए। छवियाँ एक 8 बिट झगड़ा प्रारूप में होना चाहिए। समान सेटिंग्स मात्रात्मक प्रयोजनों के लिए पूरे प्रयोग के दौरान रखा जाता है।
    4. एक घर का बना microloader टिप उपकरण के साथ भ्रूण से ध्यान agarose निकालें। यदि जरूरी हुआ तो इन भ्रूण बाद के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। जीवाणु लोड की मात्रा का ठहराव के लिए पहले, प्रत्येक तस्वीर की गुणवत्ता नियंत्रित किया जाएगा। एक करने के लिएछवियों nalyze और मछली प्रति पांचवें वेतन आयोग में प्रतिदीप्ति तीव्रता परिवर्तित, ImageJ फ्रीवेयर खुला।
      नोट: पांचवें वेतन आयोग मूल्य बैक्टीरियल बोझ को दर्शाता पहले एम का उपयोग कर के रूप में दिखाया Marinum 34।
    5. एक असंक्रमित भ्रूण की एक छवि का उपयोग कर छवि विश्लेषण के लिए आवश्यक सीमा का निर्धारण करते हैं (कई नियंत्रण भ्रूण औसत दहलीज प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है)। → → दहलीज समायोजित और फिर पृष्ठभूमि पूरी तरह से काला हो जाता है जब तक (यानी, शून्य पर होना चाहिए एक पृष्ठभूमि प्राप्त करने के लिए) सही करने के लिए सीमा विंडो में नीचे स्लाइडर ले छवि के लिए जाने। इसी मूल्य रिकॉर्ड।
    6. छवि जम्मू के भीतर, पांचवें वेतन आयोग मैक्रो (अनुपूरक फाइल) खोलने के लिए और संकेतों का पालन करें: छवियों के फ़ोल्डर मापा जा लगाने और पहले से निर्धारित और "ठीक" पर क्लिक करें रूप में तो सीमा दर्ज करें।
      नोट: मैक्रो स्वतः पृष्ठभूमि घटा देती है। एक सीमा तो लागू किया जाता है। फ्लोरोसेंट संकेतों की पहचान कर रहे हैंकण विश्लेषण निम्नलिखित fied।
    7. कॉपी डेटा विश्लेषण के लिए वांछित सॉफ्टवेयर को सारांश खिड़की से डेटा पेस्ट और।
      नोट: सीएफयू दृढ़ संकल्प विधि के विपरीत, पांचवें वेतन आयोग विधि गैर आक्रामक है और गतिशीलता की निगरानी, ​​महत्वपूर्ण बात, बाद के विश्लेषण के लिए भ्रूण पुनः उपयोग और अनुमति देता है / एक व्यक्तिगत आधार पर बैक्टीरियल बोझ के कैनेटीक्स। यह इसलिए भी महत्वपूर्ण है, नैतिक नियमों के साथ समझौते में, जानवरों की संख्या को कम करने के लिए अनुमति देता है।

7. इमेजिंग एम abscessus- संक्रमित भ्रूण

  1. एम का लाइव इमेजिंग abscessus संक्रमण
    1. माउंट tricaine-anesthetized भ्रूण (3.2.2 देखें) epifluorescence माइक्रोस्कोपी टिप्पणियों के लिए पहले एक 35 मिमी पेट्री डिश में 1% कम पिघलने बिंदु agarose में। औंधा confocal माइक्रोस्कोपी के लिए या ईमानदार confocal माइक्रोस्कोपी के लिए एक एकल गुहा अवसाद स्लाइड में एक गिलास नीचे पकवान का प्रयोग करें। इच्छित स्थान और कवर करने के लिए भ्रूण बोधमछली पानी tricaine युक्त साथ जम agarose।
    2. पूरे भ्रूण के अनुक्रमिक प्रतिदीप्ति अधिग्रहण और ट्रांसमिशन छवियों के लिए एक 10 एक्स उद्देश्य के साथ एक epifluorescence माइक्रोस्कोप का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, एक संक्रमण के बाद प्रतिरक्षा कोशिकाओं की गतिविधि कल्पना करने के लिए 40X या 63X उद्देश्यों के साथ एक confocal खुर्दबीन का उपयोग करें।
  2. इमेजिंग एम तय abscessus संक्रमित भ्रूण
    1. 6.1.1 में वर्णित के रूप में भ्रूण euthanize और 4 डिग्री सेल्सियस पर आर टी या हे / एन पर 2 घंटे के लिए 1 एक्स PBST में 4% paraformaldehyde में भ्रूण 1.5 मिलीलीटर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र ट्यूबों के लिए स्थानांतरण और तय कर लो। 10 मिनट के लिए 1 एक्स PBST के साथ दो बार भ्रूण धोने से paraformaldehyde निकालें।
      नोट: प्रतिदीप्ति की रक्षा करने के लिए, तय भ्रूण प्रकाश से संरक्षित किया जाना चाहिए।
    2. ऊतकों और प्रतिदीप्ति की अखंडता की रक्षा करने के लिए, भ्रूण के लिए, (1 x PBST में पतला 10, 20, 30, 40 और 50%) ग्लिसरॉल एकाग्रता समाधान बढ़ाने में क्रमिक incubated हैंशर्त के अनुसार 10 मिनट।
      नोट: तय भ्रूण 4 डिग्री सेल्सियस पर 50% ग्लिसरॉल में कई महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है।
    3. एक को देखने चैम्बर (चित्रा 1 बी), 31 में 50% ग्लिसरॉल में एम्बेडेड भ्रूण निर्धारित करना।
    4. एक confocal खुर्दबीन पर 40X या 63X उद्देश्यों का उपयोग छवि।

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Representative Results

विभिन्न संरचनात्मक साइटों 32 इंजेक्ट किया जा सकता है, दुम नस में इंजेक्शन अक्सर अस्तित्व प्रयोगों, बैक्टीरियल बोझ दृढ़ संकल्प, phagocytosis गतिविधि या रस्सी गठन सहित बाद के विश्लेषण के लिए प्रणालीगत संक्रमण उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। पूंछ की मांसपेशियों में इंजेक्शन इंजेक्शन (चित्रा 3) के स्थल पर मैक्रोफेज की भर्ती का आकलन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। जांच और एम आर और एस वेरिएंट की डाह तुलना करने के लिए abscessus, फ्लोरोसेंट बैक्टीरियल निलंबन 30 HPF भ्रूण (चित्रा 3) 19 की दुम नस में इंजेक्शन हैं। एस संस्करण के विपरीत, आर मोर्फोटाइप केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) (चित्रा 3 सी) के भीतर बैक्टीरियल फोड़े के तेजी से विकास के द्वारा होती zebrafish भ्रूण (चित्रा 3 बी), में एक और अधिक मजबूत और घातक संक्रमण लाती है। आर और एस वेरिएंट दोनों के साथ प्रणालीगत इंजेक्शन सीएनएस में संक्रमण और अंतर में नेतृत्व करने के लिएपैथोलॉजी और डाह phenotypes प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी अवलोकन (चित्रा 3 सी) द्वारा, मछली (चित्रा 3 डी) के अनुसार CFU गणना करके या अधिग्रहीत छवियों के पांचवें वेतन आयोग (3E चित्रा) निर्धारित करने से या तो मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात है, सीएफयू और पांचवें वेतन आयोग दृढ़ संकल्प सहसंबद्ध और 3 और 5 डीपीआई पर एस तनाव से आर तनाव के लिए बड़ा बैक्टीरियल लोड करने के लिए बाहर बात कर रहे हैं। कुल मिलाकर, इन परिणामों दृढ़ता से संक्रमण की प्रक्रिया के कालक्रम अध्ययन करने के लिए संक्रमण का एक प्रासंगिक और गैर इनवेसिव मॉडल के रूप में zebrafish समर्थन करते हैं।

शायद सबसे शानदार सुविधाओं में से एक आर संस्करण से संक्रमित भ्रूण के सीएनएस (चित्रा 4) के भीतर टेढ़ा डोरियों visualizing की अनुमति देता है कि वीडियो माइक्रोस्कोपी द्वारा पता चला था। भ्रूण के ऑप्टिकल पारदर्शिता के लिए धन्यवाद, आर-कॉर्ड गठन की गतिज एक्सटेंशन को दोहराने के लिए आर संस्करण के उच्च प्रवृत्ति को दर्शाता हुआ, एक गैर-आक्रामक ढंग से नजर रखी और imaged किया जा सकता हैracellularly। / सेलुलर ऊतक विनाश के साथ संयुक्त यह अनियंत्रित प्रतिकृति दर, तेजी से फोड़े के विकास और अंततः लार्वा मौत हो जाती है।

मैक्रोफेज माइक्रोबैक्टीरियल संक्रमण के दौरान और विशेष रूप से ग्रेन्युलोमा गठन 35 ड्राइविंग द्वारा एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है। दो पूरक रणनीतियों एम अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता बृहतभक्षककोशिका समाप्त भ्रूण में abscessus विकास / डाह: लाइपो-clodronate- और morpholino आधारित प्रक्रियाओं (चित्रा 5 ए)। वीडियो-माइक्रोस्कोपी (चित्रा 5 ब) द्वारा पता चला के रूप में आर संस्करण के साथ बृहतभक्षककोशिका समाप्त भ्रूण का संक्रमण प्रमुख, जीवाणु भार और कॉर्ड उत्पादन में भारी वृद्धि करने के लिए सुराग के लिए बेहद तेजी से मृत्यु (100% मृत भ्रूण 3 डीपीआई पर, चित्रा 5C) । यह स्पष्ट रूप से मैक्रोफेज एम नियंत्रित करने के लिए आवश्यक हैं कि इंगित करता है abscessus संक्रमण।

आगे मैक्रोफेज की भूमिका की जांच करने के लिएसंक्रमण के दौरान, लाल फ्लोरोसेंट मैक्रोफेज (MPEG1: mCherry) को शरण विशिष्ट ट्रांसजेनिक भ्रूण 19 का इस्तेमाल किया जा सकता है। एम इंजेक्शन पूंछ मांसपेशी में या दुम नस में वसाबी व्यक्त abscessus संक्रमण के स्थल पर माइलॉयड कोशिकाओं, मुख्य रूप से मैक्रोफेज की एक उल्लेखनीय भर्ती, लाती है। इस भर्ती व्यक्तिगत बैक्टीरिया के कुशल phagocytosis (चित्रा 6A-6B) की ओर जाता है। मैक्रोफेज की मौजूदगी के बावजूद, confocal माइक्रोस्कोपी मैक्रोफेज (चित्रा 6C) का भक्षण नहीं कर सकते हैं कि बड़े बैक्टीरियल डोरियों की उपस्थिति का पता चलता है। साथ में ले ली, इन निष्कर्षों माइक्रोबैक्टीरियल phagocytosis को रोकने में मुताबिक की भूमिका पर आधारित प्रतिरक्षा चोरी के एक नए तंत्र पर प्रकाश डाला।

चित्र तीन
चित्रा 3. एम zebrafish भ्रूण में abscessus संक्रमण। (ए) (शीर्ष पैनल) फ्लोरोसेंट एम इंजेक्शन लगाने के द्वारा किया जाता नसों में संक्रमण 30 HPF भ्रूण में दुम नस में (सफेद में दिखाया गया है) abscessus (1 तीर) मूत्रजननांगी खोलने के लिए, पीछे,। (कम पैनल) फ्लोरोसेंट माइक्रोबैक्टीरिया इंजेक्शन लगाने के द्वारा किया जाता Intramuscular संक्रमण 48 HPF भ्रूण में, एक विखंड (2 तीर) पर पूंछ की मांसपेशी में (सफेद में दिखाया गया है)। 30 HPF भ्रूण नसों tdTomato- एम से संक्रमित (इ) abscessus (आर और एस वेरिएंट)। (बी) भ्रूण के जीवित रहने घटता ≈ 300 CFU आर या तो से संक्रमित या एस वेरिएंट या पीबीएस (एन = 20) नियंत्रण इंजेक्शन। तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्रतिनिधि परिणाम दिखाए जाते हैं। (सी) आर या विभिन्न समय पर tdTomato (सफेद) व्यक्त एस संस्करण या तो के spatiotemporal दृश्य प्रतिदीप्ति रहते इमेजिंग के द्वारा प्रदर्शन के बाद संक्रमण बताते हैं। प्रत्येक तनाव के लिए, पूरे संक्रमित भ्रूण के एक प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति और ट्रांसमिशन ओवरले थानेदार है WN। एक ही भ्रूण 3 और 5 डीपीआई पर imaged थे। (डे) CFU गिनती (डी) या पांचवें वेतन आयोग माप (ई) द्वारा निर्धारित आर या एस या तो वेरिएंट (≈ 200 सीएफयू) से संक्रमित भ्रूण के भीतर बैक्टीरियल लोड होता है। (डी) lysate से सीएफयू विभिन्न बिंदुओं पर समय व्यक्तिगत भ्रूण के बाद संक्रमण बीबीएल MGIT PANTA के साथ पूरक Middlebrook 7H10 OADC पर चढ़ाना द्वारा निर्धारित की। तीन स्वतंत्र प्रयोगों से भ्रूण प्रति एसडी (क्षैतिज पट्टियों) सीएफयू ± लॉग ऑन मतलब के रूप में परिणाम व्यक्त कर रहे हैं (एन = 5)। विभिन्न समय ImageJ का उपयोग कण विश्लेषण के आधार पर बाद संक्रमण बिंदुओं पर अलग-अलग रहने वाले भ्रूण से (ई) पांचवें वेतन आयोग माप। तीन स्वतंत्र प्रयोगों से भ्रूण प्रति एसडी (क्षैतिज पट्टियों) पांचवें वेतन आयोग ± लॉग ऑन मतलब के रूप में परिणाम व्यक्त कर रहे हैं (एन = 5)। सभी छवियों को एक डिजिटल कैमरा रंग के साथ सुसज्जित एक epifluorescence माइक्रोस्कोप के साथ प्राप्त किया गया। टी = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
एम आर संस्करण के साथ नसों के द्वारा संक्रमित आर संस्करण की विवो मुताबिक चित्रा 4। 30 HPF भ्रूण abscessus और विभिन्न समय पर imaged की हड्डी गठन की प्रगति की कल्पना करने के बाद संक्रमण बताते हैं। लाल तीर की हड्डी के spatiotemporal विकास का पालन करने के लिए एक निश्चित संदर्भ बिंदु के रूप में प्रयोग किया जाता है। बढ़ रही टेढ़ा कॉर्ड युक्त पूंछ के हिस्से के डीआईसी चित्र (एक रंग कैमरा से लैस माइक्रोस्कोप) बॉक्सिंग कर रहे हैं। स्केल सलाखों:। 100 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा मैक्रोफेज 5. कमी वृद्धि हुई कॉर्ड प्रसार के लिए होता है। (ए) भ्रूण लाइपो-clodronate आधारित प्रक्रिया या morpholino आधारित प्रक्रिया का उपयोग कर समाप्त हो रहे हैं। भ्रूण: (शीर्ष पैनल) Clodronate समझाया लिपिड (लाइपो-clodronate) 24 HPF टीजी (mCherry MPEG1) में नसों में इंजेक्शन कर रहे हैं। संचलन के भीतर, लाइपो-clodronate तेजी से बाद में apoptosis से गुजरना कि मैक्रोफेज से घिरा हुआ है। Morpholino तैयारी की (वाम-कम पैनल) इंजेक्शन तोड़े नीचे करने के लिए pu.1 जीन की अभिव्यक्ति निषेचित टीजी (MPEG1: mCherry) में zebrafish अंडे। (-)। (राइट-नीचे पैनल) भ्रूण में मैक्रोफेज की सही कमी (बीसी) 30 HPF बृहतभक्षककोशिका युक्त (+) या बृहतभक्षककोशिका समाप्त प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा जाँच की है (लाइपो-clodronate इलाज के बाद) भ्रूण एम से संक्रमित हैं tdTomato व्यक्त abscessus आर (सफेद में दिखाया गया है)। (बी) एम से संक्रमित बृहतभक्षककोशिका युक्त या बृहतभक्षककोशिका समाप्त भ्रूण (सी) जीवन रक्षा घटता abscessus आर (एन = 20)। तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्रतिनिधि परिणाम दिखाए जाते हैं। सभी छवियों को एक रंग कैमरे से जुड़ा एक माइक्रोस्कोप के साथ हासिल किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
एम के साथ या तो स्थानीय या प्रणालीबद्ध संक्रमित भ्रूण में मैक्रोफेज की चित्रा 6 व्यवहार abscessus (ए) 48 HPF टीजी (MPEG1: mCherry)। zebrafish भ्रूण वसाबी व्यक्त एम साथ intramuscularly संक्रमित हैं abscessus आर लाइव Imagiकल्पना करने के लिए एक confocal खुर्दबीन का उपयोग एनजी (मिनट के बाद संक्रमण, एमपीआई) में व्यक्तिगत माइक्रोबैक्टीरिया phagocytizing मैक्रोफेज भर्ती किया था। (40X एपीओ पानी 0.8 एनए उद्देश्य के साथ confocal खुर्दबीन) एक इंजेक्शन साइट के लिए मैक्रोफेज (लाल) की तीव्र भर्ती दिखा अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण। स्केल पट्टी: 20 माइक्रोन (BC) में 48 HPF टीजी (MPEG1: mCherry)। भ्रूण नसों एम से संक्रमित वसाबी तय की और 4 HPI (बी) और 3 डीपीआई (सी) में confocal माइक्रोस्कोपी (40X) द्वारा imaged थे व्यक्त abscessus आर। (बी) बृहतभक्षककोशिका (लाल) या अन्य माइलॉयड कोशिकाओं, शायद न्यूट्रोफिल (तीर) की अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण युक्त (63X एपीओ तेल 1.33 एनए उद्देश्य के साथ confocal खुर्दबीन) इंजेक्शन की साइट के लिए करीब पृथक माइक्रोबैक्टीरिया (हरा)। स्केल पट्टी: 10 माइक्रोन (सी) अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण एक कॉर्ड (हरा) (63X एपीओ तेल 1.33 एनए उद्देश्य के साथ confocal खुर्दबीन) का भक्षण करने में असमर्थ एक बृहतभक्षककोशिका (लाल) दिखा।।स्केल पट्टी:। 5 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

zebrafish हाल ही में वास्तविक समय 36 में विस्तृत क्षेत्र और confocal इमेजिंग का उपयोग बैक्टीरिया के संक्रमण की गतिशीलता के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट हड्डीवाला मॉडल प्रणाली के रूप में उभरा है। एक साथ सूक्ष्म इंजेक्शन तरीकों (प्रोटोकॉल 4) के साथ छितरी माइक्रोबैक्टीरियल निलंबन (प्रोटोकॉल 2.2) के संयोजन प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रणालीगत संक्रमण, और बाद में निगरानी और मेजबान मैक्रोफेज साथ बैक्टीरियल बातचीत पर विशेष ध्यान देने के साथ संक्रमण की प्रगति के दृश्य की अनुमति देता है। एम की डाह विवो में abscessus जंगली प्रकार सुनहरा zebrafish 37 का उपयोग करने के लिए धन्यवाद की जांच की जा सकती है। एम के बीच बातचीत का अध्ययन करने के लिए मैक्रोफेज 19 कल्पना करने के लिए: abscessus और माइलॉयड कोशिकाओं की मेजबानी, कई ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों टीजी (mCherry MPEG1) के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। 38 या टीजी (lyz: DsRed) 39 डब्ल्यू: जैसे टीजी (GFP MPX) के रूप में अतिरिक्त ट्रांसजेनिक संवाददाता लाइनोंith या तो लाल न्यूट्रोफिल की हरी, क्रमशः, यह भी संक्रमण के जवाब में इन granulocytes की विशिष्ट भूमिका का पता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

एम abscessus, और विशेष रूप से आर संस्करण है, इस प्रकार प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य सूक्ष्म इंजेक्शन रोकने, बड़े पैमाने पर बैक्टीरियल समुच्चय 19 फार्म के लिए एक स्वाभाविक प्रवृत्ति दर्शाती है। इसके अलावा, एस संस्करण की तुलना में तथ्य यह है कि आर संस्करण रूपों बहुत बड़ा झुरमुटों भी दो isogenic वेरिएंट के लिए डाह phenotypes के संभावित तुलना निवारण होता है। धारा 2 में वर्णित प्रोटोकॉल समरूप प्राप्त करने और एम छितरी की अनुमति देता है भ्रूण में सूक्ष्म इंजेक्शन के लिए abscessus निलंबन। यह तैयारी अत्यधिक कुल गुण प्रदर्शित किसी अन्य माइक्रोबैक्टीरियल प्रजाति या उत्परिवर्ती उपभेदों के लिए लागू किया जा सकता है। Sonication कदम सबसे बाहरी माइक्रोबैक्टीरियल कोशिका दीवार परत को बदल सकता है, देखभाल के लिए ई बैक्टीरियल व्यवहार्यता पर इस भौतिक उपचार के प्रभाव का आकलन करने के लिए लिया जाना चाहिएनई नस्ल आक।

बैक्टीरियल बोझ का निर्धारण नियमित तौर पर प्रोटोकॉल 6.1 में वर्णित के रूप में, विभिन्न समय बिंदुओं के बाद संक्रमण पर चयनात्मक अगर मध्यम पर lysed भ्रूण चढ़ाना के बाद गिनती सीएफयू पर निर्भर करता है। यह प्रक्रिया कई सीमाओं में शामिल हैं: जानवरों euthanized हैं, के बाद से प्रत्येक भ्रूण (या भ्रूण के समूह) एक ही समय बिंदु के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, इस विधि की वजह से सेल के दौरान मौत हो गई और / या खो रहे हैं कि बैक्टीरिया, बाद में धारावाहिक dilutions का एक बड़ा हिस्सा है, या मुख्य रूप से clumping द्वारा गलत बनी हुई है। CFU गिनती भी एक श्रमसाध्य कार्य है। एक विकल्प के रूप में, प्रोटोकॉल 6.2 एम यों के लिए एक कुशल विधि का वर्णन एम के लिए मूल रूप से विकसित रूप में, पिक्सेल मात्रा का ठहराव से संक्रमित भ्रूण के फ्लोरोसेंट छवियों के विश्लेषण के आधार पर सीमित निपटने के कदम भी शामिल है कि abscessus बोझ Marinum 40,41। कण विश्लेषण के आधार पर यह पांचवें वेतन आयोग विधि, एक अच्छा संबंध डब्ल्यू पता चलता हैसीएफयू countings ith। इसी तरह, माइक्रोस्कोपी और प्रतिदीप्ति मात्रा का ठहराव के संयोजन से, भ्रूण प्रति सहज प्रतिरक्षा सेल संख्या में रिश्तेदार परिवर्तन पर्याप्त ट्रांसजेनिक लाइनों का उपयोग कर छवि विश्लेषण द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।

Zebrafish भ्रूण प्रतिकूल एम के जवाब में मेजबान अस्तित्व को प्रभावित करने के लिए पाया गया था संक्रमण और मैक्रोफेज कमी दौरान प्रतिरक्षा सेल की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता abscessus संक्रमण। विशिष्ट बृहतभक्षककोशिका कमी कुशलता लाइपो-clodronate आधारित प्रक्रिया (प्रोटोकॉल 5.1) या morpholino आधारित प्रक्रिया (प्रोटोकॉल 5.2) का उपयोग कर उत्पन्न किया जा सकता है। मैक्रोफेज की उपस्थिति स्थापना और नाड़ी तंत्र का और सही भ्रूण के विकास के लिए रखरखाव के लिए महत्वपूर्ण है के बाद से फिर भी, यह लाइपो-clodronate का उपयोग कर 24 HPF पर मैक्रोफेज उत्पादन काटकर अलग करने की सिफारिश की है।

zebrafish भ्रूण एम अध्ययन करने के लिए एक अनूठा मॉडल के रूप में प्रकट होता है abscessus संक्रमण और extracell की भूमिकाular एक प्रतिरक्षा प्रणाली तोड़फोड़ की रणनीति के रूप मुताबिक। निर्धारकों एम में मुताबिक नियंत्रित करते हैं abscessus पहचाना जा सकता है, वे अभिनव चिकित्सीय विकल्पों में से विकास करने के लिए ले जा सकता है। अभिनव उच्च throughput प्रौद्योगिकियों 42 के साथ एक साथ zebrafish के उपयोग को जोड़ने में भी दवाओं की खोज और इस दवा प्रतिरोधी रोगज़नक़ के खिलाफ नए औषधीय दृष्टिकोण करने के लिए क्षेत्र को खोलता है।

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Acknowledgments

लेखकों उपयोगी विचार विमर्श के लिए और क्रमश: tdTomato और वसाबी की अभिव्यक्ति की अनुमति है कि pTEC27 और pTEC15 की उदार उपहार के लिए लाइपो-clodronate और एल रामकृष्णन को उपलब्ध कराने के लिए लालकृष्ण किस्सा लिए आभारी हैं। फ्रांस के राष्ट्रीय अनुसंधान एजेंसी की परियोजनाओं (ZebraFlam ANR-10-मिडी-009 और DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) और यूरोपीय समुदाय के सातवें फ्रेमवर्क कार्यक्रम के इस काम रूपों हिस्सा (FP7 से लोगों-2011-ITN) अनुदान समझौते के तहत नहीं। PITN-जीए-2011-289209 मैरी क्यूरी प्रारंभिक प्रशिक्षण नेटवर्क FishForPharma के लिए। हम मुख्यमंत्री ड्यूपॉन्ट के वित्त पोषण के लिए एसोसिएशन ग्रेगरी Lemarchal और Vaincre ला Mucoviscidose (RF20130500835) का शुक्रिया अदा करना भी चाहते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BBL MGIT PANTA BD Biosciences 245114
Bovine Serum Albumin  Euromedex 04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver  Sigma-Aldrich C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar BD Biosciences 262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Oleic Acid Sigma-Aldrich O1008
Paraformaldehyde Delta Microscopie 15710
Phenol Red Sigma-Aldrich 319244
Tween 80 Sigma-Aldrich P4780
Agar Gibco Life Technologie 30391-023
Low melting agarose Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts  Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries  Sutter instrument Inc BF100-78-10 1 mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device  Sutter Instrument Inc Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector Tritech Research  Digital microINJECTOR, MINJ-D
Tweezers Sciences Tools inc Dumont # M5S 
Microloader Tips Eppendorf

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References

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संक्रमण अंक 103, Zebrafish संक्रमण रोगजनन सहज प्रतिरक्षा मैक्रोफेज सूक्ष्म इंजेक्शन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी लाइव इमेजिंग मुताबिक।
इमेजिंग रोगजनन और के मुताबिक गूढ़ रहस्य और<em&gt; माइकोबैक्टीरियम abscessus</em&gt; Zebrafish भ्रूण में
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Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet,… More

Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet, A., Herrmann, J. L., Lutfalla, G., Kremer, L. Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (103), e53130, doi:10.3791/53130 (2015).

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