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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Decifrare e Imaging Patogenesi e Cording di Published: September 9, 2015 doi: 10.3791/53130
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 3, 1, 1,2
1Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS, UMR 535, Université Montpellier, 2Centre d'études d'agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé, CNRS, FRE 3689, Université Montpellier, 3Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Santé, EA3647-EPIM, Université Versailles St Quentin

Introduction

Mycobacterium abscessus è un patogeno emergente che provoca un ampio spettro di sindromi cliniche nell'uomo. Questi includono le infezioni cutanee e polmonari croniche gravi infezioni, soprattutto incontrate in immunocompromessi e nei pazienti affetti da fibrosi cistica 1,2,3,4. M. abscessus è anche considerato come una delle principali specie di micobatteri rapida crescita responsabili di infezioni nosocomiali e iatrogene negli esseri umani. Inoltre, diversi rapporti recenti hanno evidenziato la possibilità che M. abscessus potrebbe attraversare la barriera emato-encefalica e indurre lesioni importanti del sistema nervoso centrale (CNS) 5,6. Pur essendo un produttore rapida, M. mostre abscessus inoltre diverse funzionalità patogeni che sono legati a quelli di Mycobacterium tuberculosis, tra cui la capacità di rimanere in silenzio per anni all'interno delle strutture granulomatose e di generare lesioni caseosi nei polmoni 7. Più allarmante è il basso sensibilità di M. abscessus agli antibiotici, rendendo queste infezioni estremamente difficili da trattare portando ad un significativo tasso di fallimento terapeutico 8,9. La minaccia importante di questa specie è soprattutto la sua resistenza intrinseca agli antibiotici, che è di grande preoccupazione nelle istituzioni sanitarie pubbliche di 10 e una controindicazione al trapianto polmonare 11.

M. abscessus display lisce (S) o ruvidi morfotipi (R), colonia che portano a differenti esiti clinici. In contrasto con il ceppo S, R batteri hanno una tendenza a crescere un'estremità all'altra, portando ad una fune o cavo struttura simile 12,13. Diversi studi indipendenti sulla base di modelli o cellulari o animali hanno rivelato il fenotipo iper-virulenza del R morfotipo 14,15. Da studi epidemiologici, i casi più gravi di M. infezioni polmonari abscessus sembrano essere associati con R varianti 16 che sono l'unica variante cheè stato visto a persistere per anni in un host infetto 3. La differenza morfotipo si basa sulla presenza (in S) o perdita (in R) di glycopeptidolipids-superficie associato (GPL) 12. Tuttavia, a causa delle limitazioni intrinseche dei modelli cellulari / animali usati attualmente disponibili per studiare M. infezione abscessus, le nostre conoscenze sugli eventi fisiopatologici delle varianti R o S rimane oscuro. L'infezione di topi immuno-competenti via endovenosa o aerosol porta alla colonizzazione transitoria, impedendo l'uso di topi per studiare le infezioni persistenti e in vivo droga suscettibilità test 17. Pertanto, lo sviluppo di modelli animali suscettibili alla manipolazione della risposta dell'ospite è una sfida importante. In questo contesto, i modelli non mammiferi di infezione sono stati sviluppati recentemente, compresi Drosophila melanogaster 18 che offre diversi vantaggi come il costo, velocità e etico accettabilità over il modello di topo. Il pesce zebra (Danio rerio) modello di infezione è stata anche esplorata da visualizzare, per l'imaging non invasivo, la progressione e la cronologia di M. infezione abscessus in un animale vivo 19. È importante sottolineare che una prova di concetto è stato anche istituito per dimostrare la sua idoneità per le valutazioni di antibiotici in vivo contro M. abscessus 17,20.

Il pesce zebra sono stati ampiamente utilizzati nel corso degli ultimi due decenni a studiare le interazioni tra vari agenti patogeni e il sistema immunitario dell'ospite 21. Il crescente successo di questo modello vertebrato alternativa si basa su grandi e uniche opportunità che motivati ​​e convalidati suo utilizzo per una migliore comprensione di numerose infezioni virali e batteriche 19,22,23,24,25,26,27,28,29. A differenza di molti altri modelli animali, embrioni di zebrafish sono otticamente trasparente, consentendo non invasivo imaging di fluorescenza 30. Questo hās portato a studiare M. abscessus infettato embrioni di zebrafish con dettagli senza precedenti, che si conclude con la descrizione di cording extracellulare, che rappresentano un esempio di batterica plasticità morfologica. Cording rappresenta un nuovo meccanismo di eversione del sistema immunitario e un meccanismo chiave promuovere patogenesi acuta M. infezione abscessus 19.

Questo rapporto descrive nuovi strumenti e metodi che utilizzano l'embrione zebrafish di decifrare i tratti fisiopatologiche di M. abscessus infezione e per studiare le interazioni intime tra i bacilli e il sistema immunitario innato. Innanzitutto, un protocollo microiniezione dettagliata che comprende l'elaborazione dell'inoculo batterico, preparazione embrione, e l'infezione di per sé, è presentato. Metodi specificamente adattato per valutare M. virulenza abscessus misurando diversi parametri, come la sopravvivenza di accoglienza e la carica batterica, sono presentati. Particolare attenzione è data da comemonitorare, a livello spazio-temporale, il destino e la progressione dell'infezione e la risposta immunitaria a M. abscessus usando la microscopia video. Inoltre, per indagare il contributo e il ruolo dei macrofagi durante M. abscessus infezione, i metodi per generare macrofagi-impoverito embrioni (utilizzando approcci sia genetically- o basati su chimicamente) sono descritte. Infine, i protocolli di visualizzare le specifiche interazioni con macrofagi o neutrofili utilizzando sia gli embrioni fissi o viventi sono documentati.

Lo scopo di questo rapporto è quello di stimolare ulteriori studi per gettare nuova luce in M. meccanismi di virulenza abscessus e in particolare il ruolo del cording nella creazione di un processo di infezione acuta e incontrollata.

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Protocol

Le procedure sperimentali zebrafish devono rispettare le relative norme istituzionali e governativi. Per il presente studio, esperimenti zebrafish sono stati fatti presso l'Università di Montpellier, secondo le linee guida dell'Unione europea per la movimentazione di animali da laboratorio (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) e approvati con il riferimento CEEA-LR-13007.

1. Preparazione dei reagenti e Microiniezione attrezzature

  1. Preparare pesce acqua sciogliendo 0,06 g di sale Immediata Oceano Mare in 1 l di acqua distillata 31, poi in autoclave per la sterilizzazione (120 ° C per 20 min) e conservare a 28,5 ° C per un massimo di 1 mese.
  2. Preparare metilene soluzione blu sciogliendo 1 g di blu di metilene in 1 l di acqua distillata. Aggiungere 300 ml di soluzione di blu di metilene in 1 l di acqua i pesci per ottenere acqua pesce azzurro, poi autoclave per sterilizzare e conservare a 28,5 ° C per un massimo di 1 mese.
    NOTA: Il additiil blu di metilene in acqua pesce previene la formazione di muffe.
  3. Preparazione del tampone fosfato (PBS)
    1. Preparare una soluzione madre di 10 X PBS sciogliendo 5,696 g di Na 2 HPO 4, 680 mg di KH 2 PO 4, 969 mg di KCl e 78,894 g NaCl in 1 l di acqua distillata e regolare il pH a 7,0 con HCl. Per ottenere 1 X PBS, diluire 100 ml di soluzione di 10 X PBS in 900 ml di acqua distillata e autoclave per 20 min a 120 ° C per sterilizzare.
    2. Aggiungere 0,05% di Tween 80 per ottenere 1 X PBST e conservare a temperatura ambiente per un massimo di 1 anno.
  4. Preparare oleico Acido destrosio catalasi (OADC) arricchimento sciogliendo 8,5 g di NaCl, 50 g di albumina sierica bovina, 20 g di D-glucosio, 40 mg di catalasi da fegato bovino e 0,5 g di acido oleico in 1 l di acqua distillata poi filtrare sterilizzare la soluzione conservarlo a 4 ° C per 6 mesi.
  5. Preparare 100 ml di acido metansolfonico etil-3 amminobenzoato (tricaine) soluzione madre, sciogliendo 400 mg tricaine polvere in 97,9 ml di acqua distillata. Aggiungere 2,1 ml di 1 M Tris (pH 9) per regolare il pH a 7,0 e conservare la soluzione a -20 ° C.
  6. Preparare gli aghi di iniezione microcapillare tirando capillari di vetro borosilicato (1 millimetro OD X 0,78 millimetri ID) utilizzando un dispositivo micropipetta estrattore con le seguenti impostazioni: pressione dell'aria 650; Riscaldare 999; Pull 50; Velocity 80; Tempo 200.
  7. Preparare una soluzione di agar 1,5% in acqua il pesce azzurro e versare 25 ml di agar fuso in 100 mm piatti Petri. Sulla parte superiore della agar fuso, posizionare stampi artigianali per imprimere canali specifici. "V" canali sagomate sono utilizzati per embrioni posizione mentre la "U" sono utilizzati per le uova (Figura 1) 31. Una volta solidificato, rimuovere con attenzione l'impronta.
    NOTA: Coprire l'agar con acqua pesce azzurro per evitare la disidratazione e conservare a 4 ° C per un massimo di 2 mesi.

Figura 1 Figura 1. camere di posizionamento per le iniezioni di zebrafish. (A) i canali a forma di U per le uova (pannello di sinistra) e canali a forma di V per gli embrioni (pannello di destra). Uova zebrafish / embrioni sono contenute nei canali e allineati lungo lo stesso asse. (B) Visualizzazione di camere per l'osservazione al microscopio. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. Preparazione e conservazione del M. abscessus inoculo

  1. M. condizioni di crescita abscessus
    1. Piatto fuori M. abscessus da un -80 ° C stock di glicerolo su un agar Middlebrook 7H10 contenente il 10% di OADC e 0,5% glicerolo (7H10 OADC) e integrato con l'antibiotico appropriata a seconda del marcatore di resistenza effettuati dal vettore che codifica per la proteina fluorescente. Incubare le piastrea 30 ° C per 4-5 giorni.
    2. Prendete una colonia micobatteri fluorescenza positiva e inoculare 1 ml di brodo Middlebrook 7H9 integrato con OADC, 0,2% glicerolo, 0,05% di Tween 80 (7H9 OADC / T) con l'antibiotico richiesto in un 15 ml di tubo di plastica sterile. Incubare a 30 ° C per 1 settimana senza agitare.
      NOTA: Tween 80 limita aggregazione e di aggregazione batterica.
    3. Risospendere il pre-coltura ottenuta in 2.1.2 in 50 ml Middlebrook 7H9 OADC / T in 150 cm 2 palloni di coltura tissutale a una finale 0,1 OD 600 (corrispondenti a circa 5,10 7 batteri / ml) ed incubare ulteriormente a 30 ° C per 4 giorni per ottenere una cultura esponenziale crescita (OD 600 = 0,6 a 0,8).
      NOTA: Per ridurre al minimo aggregazione, in particolare della variante di massima, di incubazione non deve superare i 5 giorni. Entrambe le varianti lisce e ruvide mostrano un tasso di crescita simile.
  2. Preparazione del M. inoculi abscessus60;
    NOTA: A causa della forte propensione del grezzo M. abscessus per formare grandi aggregati e per produrre corde, un trattamento specifico è necessario generare inoculi omogenea e controllata quantitativamente prima microiniezioni negli embrioni. Questo trattamento viene applicato anche per lisciare i batteri che producono aggregati, sebbene in misura minore rispetto al ceppo grezzo.
    1. Raccolto esponenziale crescita culture da 150 cm 2 fiasche di coltura dei tessuti per centrifugazione a 4, 000 xg per 15 minuti a temperatura ambiente in un tubo di plastica da 50 ml sterile e risospendere il pellet batterico in 1 ml 7H9 OADC / T. Aliquota 200 ml di sospensioni batteriche in provette da 1,5 ml microcentrifuga.
      NOTA: lavorare con piccoli volumi di 1 ml siringhe è necessaria per ottenere sospensioni altamente omogenei.
    2. Omogeneizzare le sospensioni batteriche con un ago 26-G (15 up-and-down sequenze), Sonicare tre volte per 10 secondi (con 10 sec pause tra ogni sonicazione sesequenza) utilizzando un sonicatore bagnomaria. Aggiungere 1 ml di 7H9 OADC / T e vortex brevemente. Centrifugare 3 min a 100 x g.
    3. Raccogliere accuratamente il surnatante-micobatteri che contiene per evitare i grumi e piscina le sospensioni omogenee in 50 ml di tubo di plastica sterile.
    4. Controllare visivamente per la presenza di eventuali aggregati batterici rimanenti.
      NOTA: Se gli aggregati sono ancora presenti, procedere ad una ulteriore fase di centrifugazione a 100 xg per 2 minuti e raccogliere il surnatante.
    5. Centrifugare la sospensione a 4.000 xg per 5 minuti, risospendere il pellet in 200 ml 7H9 OADC / T e procedere per l'iniezione.
    6. Valutare la concentrazione batterica finale placcatura diluizioni seriali (in 1 x PBST) su 7H10 OADC agar e contando unità formanti colonie (CFU) dopo 4 giorni di incubazione a 30 ° C. CFU deve essere determinata per ogni nuovo lotto.
    7. Preparare le scorte inoculi congelati memorizzando 5 aliquote microlitri a -80 & #176; C.
      NOTA: La valutazione CFU dei -80 ° C aliquote congelate è un pre-requisito per determinare il numero esatto di batteri vitali come congelamento / scongelamento può influire vitalità batterica dell'inoculo. Questi inoculi congelati sono pronti per essere utilizzati per iniezioni successive. Poiché tutti aliquote contengono lo stesso numero di CFU, permettono di iniettare batteri in modo riproducibile da un esperimento all'altro.
  3. Controllo qualità inoculo
    NOTA: Ziehl-Neelsen (specifico per micobatteri) può essere utilizzata per confrontare la qualità delle sospensioni batteriche prima e dopo le procedure descritte in 2.2 omogeneizzazione.
    1. Spot e diffondere uno goccia di sospensione batterica omogeneizzato su un vetrino e lasciarlo asciugare completamente, fissare lo striscio per almeno 30 minuti su una piastra calda impostato a 65-70 ° C e macchia con un protocollo di colorazione Ziehl-Neelsen .
    2. Osservare lo striscio batterico con un microscopio con un 100Obiettivo X e confrontarlo con uno striscio di una sospensione non trasformati batterica (Figura 2).

Figura 2
Figura 2. Preparazione del disperso M. inoculi abscessus. Ziehl-Neelsen di R o S varianti cresciuto su brodo di coltura prima di qualsiasi trattamento (pannelli superiori) o dopo il trattamento (pannelli inferiori) per ridurre le dimensioni e il numero di aggregati micobatterici (fasi successive di syringing, sonicazione e decantazione) . I batteri sono stati osservati utilizzando un microscopio con 100 X APO olio 1.4 obiettivo NA). Bar Scala:. 20 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

3. Preparazione embrioni di zebrafish

  1. La deposizione delle uova e la raccolta delle uova zebrafish
    1. Il giorno prima spegno, razza adulto zebrafish posizionando 2 maschi e 1 femmina (di solito un rapporto 2: 1 permette fertilizzazione ottimale) in una camera di allevamento, costituito da un serbatoio di pesce separata con una raccolta delle uova cesto 31.
      NOTA: cestini di raccolta delle uova sono usati per proteggere le uova di essere mangiato dai genitori e facilitare la raccolta delle uova.
    2. Al 1 HPF, uova raccolto ed embrioni solo adeguatamente sviluppate in un piatto da 100 millimetri di Petri riempita con 25 ml di acqua blu pesce (massimo 100 embrioni per piatto) e tenerli a 28,5 ° C. Uova non fecondate vengono scartati.
  2. Preparazione di embrioni di zebrafish per le iniezioni
    1. A circa 24 ore dopo la fecondazione (HPF), dechorionate gli embrioni con una pinzetta sottile in una capsula di 100 millimetri di Petri e tenerli a 28,5 ° C.
    2. Raccogliere le distanziate di 30-48 embrioni HPF con una pipetta e trasferirli su una "V" camera di posizionamento a forma riempita con 25 ml di acqua pesce contenente 270 mg / l tricaine.Posare gli embrioni correttamente nei canali utilizzando uno strumento di punta microloader fatto in casa (in casa tagliata micro punta caricatore) ottimizzato per una più facile micro-manipolazione.
      NOTA: Orientare il lato dorsale verso il basso per iniezioni endovenose in vena caudale o il lato dorsale verso l'alto per le iniezioni muscolari coda.

4. Micro-iniezione Procedura

NOTA: La procedura micro-iniezione per M. abscessus è simile a quello descritto in precedenza per M. marinum iniezioni 32. Per valutare la cronologia di M. infezione abscessus (sopravvivenza, cariche batteriche, cinetica e caratteristiche di infezione), iniezioni in vena caudale del 30 HPF embrioni sono preferiti. Per visualizzare il reclutamento di cellule immunitarie, le iniezioni sono fatte in siti localizzati, come è nei muscoli di coda a 48 HPF embrione.

  1. Diluire l'inoculo micobatterica in 1 X PBST (a seconda del numero di CFUessere somministrato come determinato al punto 2.2.6), contenente il 10% rosso fenolo per controllare l'iniezione corretto.
  2. Caricare un ago per iniezione microcapillari con 5-10 ml dell'inoculo batterico con una punta microloader, collegare l'ago microiniezione nel supporto del micromanipolatore tridimensionale collegata all'iniettore e rompere la parte superiore dell'ago con pinzette sottili per ottenere un diametro di apertura di 5-10 micron.
  3. Calibrare il volume di iniezione regolando la pressione microiniezione (20-50 hPa) e l'ora (0,2 sec).
    NOTA: Il volume di iniezione desiderato viene calibrato mediante determinazione visiva del diametro di una gocciolina espulsa nel tuorlo di un embrione.
  4. Per l'iniezione vena caudale, posizionare l'embrione con il lato ventrale rivolto verso l'ago (come descritto nella sezione 3.2.2) e posizionare la punta dell'ago vicino all'apertura urogenitale, puntando la vena caudale, e spingere delicatamente la punta dell'ago nel embrione fino a che trafigge il proprio caudregione della vena al. Consegnare il volume desiderato di preparazione batterica, di solito 1-3 nl contenente circa 100 UFC / nl.
  5. Per l'iniezione intramuscolare, posizionare l'embrione con il lato dorsale di fronte al ago (come nella sezione 3.2.2), posizionare l'ago oltre un somite e iniettare un piccolo volume (1 nl) di inoculo.
    NOTA: Come per le iniezioni vena caudale, infezioni intramuscolari sono anche difficili da eseguire. Si deve prestare attenzione al fine di evitare un sovraccarico che può danneggiare i tessuti circostanti.
  6. Al termine della procedura di iniezione, controllare la dimensione dell'inoculo iniettando volume di sospensione batterica in una goccia di PBST sterile seguita da placcatura sul 7H10 OADC e contando il CFU. Circa 100 gli embrioni possono essere iniettati con un ago.
    NOTA: Perché ruvido M. abscessus può continuare a formare aggregati nell'ago, iniezioni devono essere fatte immediatamente dopo la preparazione dell'inoculo.
  7. Trasferire i fis infetteh piastre singolarmente in 24 pozzetti contenenti 2 ml / acqua di pozzo pesce e incubare a 28.5 ° C. Embrioni iniettati con 1-3 nl 1 X PBST possono essere utilizzati come controlli.
  8. La corretta infezione di batteri fluorescenti embrioni è controllata mediante un microscopio a fluorescenza.

5. Generazione di macrofagi impoverito Embrioni

NOTA: la deplezione selettiva dei macrofagi dai tessuti è utilizzato per studiare il loro contributo e il ruolo durante l'infezione. Per visualizzare la corretta deplezione dei macrofagi, si raccomanda di utilizzare una linea transgenica con macrofagi fluorescenti, dove mCherry è specificamente espresso sotto il controllo del promotore specifico macrofago mpeg1 19.

  1. Procedura basata-lipo-clodronato
    NOTA: La procedura di lipo-clodronato permette una deplezione selettiva dei macrofagi da tessuti (ma non neutrofili) 19. Questo composto non altera né la sopravvivenza degli embrioni né affetto l'integrità dei batteri. Un protocollo dettagliato per preparare clodronato incapsulata all'interno dei liposomi è stata riportata in precedenza 33.
    1. A 24 HPF, dechorionate gli embrioni e trasferirli ad una "V" piatto a forma di iniezione riempita con acqua pesci integrato con tricaine per mantenere gli embrioni in uno stato anestetizzato fino al termine della procedura di iniezione, come descritto in 3.2.2. Orientare il lato dorsale verso il basso.
    2. Caricare un ago per iniezione microcapillare con incapsulata all'interno dei liposomi clodronato (lipo-clodronato), collegare l'ago microiniezione nel supporto del micromanipolatore tridimensionale e rompere la parte superiore dell'ago con una pinzetta fini di ottenere un diametro di 10 micron tipo apertura.
    3. Per calibrare il volume di iniezione, regolare la pressione a 20 hPa microiniezione e il tempo di iniezione a 0,2 sec. Posizionare la punta dell'ago vicino all'apertura urogenitale, puntando la vena caudale, e spingere delicatamente la punta dell'ago nelembrione fino appena fora regione vena caudale e fornire il volume desiderato di soluzione di (2-3 nl, 3 volte).
      NOTA: La sospensione lipo-clodronato è molto appiccicoso e dovrebbe essere in agitazione prima di iniezione per evitare di bloccare il sistema vascolare e l'uccisione dell'embrione. È fondamentale procedere con diverse iniezioni successive di piccoli volumi.
    4. Trasferire gli embrioni in 100 piatti mm Petri contenenti acqua i pesci e li conservano a 28,5 ° C fino a quando l'infezione.
    5. Controllare il corretto svuotamento dei macrofagi mediante microscopia a fluorescenza.
      NOTA: Completa macrofagi esaurimento è efficace per 4 giorni dopo la somministrazione lipo-clodoronate.
  2. Procedura basata-morfolino
    1. Il giorno prima deposizione delle uova, razza adulto zebrafish posizionando 2 maschi e 1 femmina separati da una barriera di plastica in una camera di allevamento.
    2. Il giorno dopo, ≈ 30 minuti dopo che la luce si accende nella struttura zebrafish, rimuovere la barriera che separamaschi e femmine. Attendere circa 20 minuti dopo l'inizio della deposizione delle uova per ottimizzare il tasso di fecondazione. Raccogliere le uova e rallentare il loro sviluppo da parte loro trasferimento in una capsula di Petri 100 millimetri riempita con acqua fredda pesce azzurro (4 ° C).
      NOTA: Il controllo della deposizione delle uova è di fondamentale importanza per gli esperimenti basati morpholinos. Morpholinos può essere iniettato solo nelle uova fino alla fase quattro celle.
    3. Raccogliere le uova con una pipetta e depositare le uova nel "U" a forma di iniezione-camera riempita con acqua fredda pesce azzurro e bloccare le uova nei canali utilizzando uno strumento di punta microloader fatto in casa.
    4. Preparare la soluzione PU.1 morfolino contenente il 10% di rosso fenolo, come descritto in precedenza 19. Caricare un ago per iniezione microcapillare con la preparazione morfolino e collegare l'ago microiniezione nel supporto del micromanipolatore tridimensionale, quindi rompere la punta dell'ago con le pinzette multa per ottena diametro di apertura punta di 5-10 micron.
    5. Per calibrare il volume di iniezione, regolare la pressione microiniezione di 20-50 hPa e il tempo di iniezione di 0,2 sec. Posizionare la punta dell'ago vicino all'uovo e spingere delicatamente la punta dell'ago attraverso il corion nell'uovo e fornire il volume della soluzione morfolino desiderato, generalmente 3-5 nl.
    6. Dopo micro-iniezione, trasferire le uova in una capsula di Petri di 100 mm in acqua i pesci e incubare a 28,5 ° C fino alla procedura di infezione ha inizio.
    7. Analizzare il corretto (completo) esaurimento dei macrofagi in morphants PU.1 al microscopio a fluorescenza, al 30 a 48 HPF..
      NOTA: a seconda della concentrazione iniettato, morpholinos pag U.1 possono influire sul numero di primi neutrofili. Per confermare il corretto svuotamento dei macrofagi senza alterare il numero di neutrofili, si consiglia di utilizzare una doppia linea zebrafish transgenico con macrofagi e neutrofili fluorescenti (con GFPespressione specificamente guidata dal promotore mpx) 19.

6. batterica Burden Quantificazione

  1. Determinazione da CFU enumerazione
    1. Al punto di tempo desiderato, di raccogliere gruppi di embrioni infetti (5 per le condizioni) in provette da 1,5 ml microcentrifuga (1 embrione / tubo), crio-anestetizzare gli embrioni di incubazione in ghiaccio per 10 minuti e eutanasia con una dose eccessiva di tricaine (300- 500 mg / L)
    2. Lavare gli embrioni con acqua sterile e dispensare due volte in una nuova provetta, lisare ogni embrione con 2% Triton X-100 diluito in PBST 1 X usando un ago 26-G e omogeneizzare la sospensione fino a completa lisi. Centrifugare la sospensione e risospendere il pellet in 1 X PBST con 0,05% di Tween 80. diluizioni seriali dei omogenati sono placcati su Middlebrook 7H10 OADC e integrati con PANTA BBL MGIT, come raccomandato dal fornitore.
      NOTA: M. abscessus essere più suscettibili di NaOH treatment di M. marinum, decontaminazione di lisati di pesce senza influenzare M. crescita abscessus può essere raggiunto con successo utilizzando l'antibiotico cocktail PANTA BBL MGIT.
    3. Incubare le piastre per 4 giorni a 30 ° C e conteggio delle colonie.
  2. Determinazione da fluorescenza Conteggio pixel (FPC) misurazioni in embrioni vivi
    NOTA: Per determinare le cariche batteriche tramite emissione di fluorescenza, immagini seriali di embrioni infetti vengono acquisiti e intensità di fluorescenza misurata da FPC (identificazione di batteri di analisi delle particelle) utilizzando una macro in casa sviluppata per il freeware ImageJ. Un'analisi particella richiede un'immagine in bianco e nero binario che si basa su una serie di soglia che permette di discriminare il segnale fluorescente di interesse dallo sfondo.
    1. Al punto di tempo desiderato, tricain-anestetizzare gli embrioni infetti (5-10 per condizione) in 35 mm capsule di Petri come descritto in 3.2.2.
    2. Rimuovere l'acqua e submerge gli embrioni e tutta la superficie piatto con 1% a basso punto di fusione agarosio in acqua i pesci, quindi allineare lateralmente gli embrioni. Coprire il agarosio solidificato con acqua i pesci contenente tricaine.
    3. Acquisire immagini di fluorescenza dell'intero embrione utilizzando un microscopio a epifluorescenza dotato di un obiettivo 10 X.
      NOTA: L'acquisizione delle immagini di fluorescenza è una fase critica del procedimento misurazioni FPC. È importante utilizzare un monitor calibrato con una sonda di calibrazione del colore. Regolazione del tempo ottimale di esposizione per ottenere uno sfondo minima durante l'acquisizione impedisce la saturazione del segnale. Le immagini devono essere in formato TIFF a 8 bit. Impostazioni identici vengono mantenute durante l'intero esperimento per scopi quantitative.
    4. Rimuovere accuratamente l'agarosio dagli embrioni con uno strumento di punta microloader fatto in casa. Questi embrioni possono essere utilizzati per analisi successive, se necessario. Prima della quantificazione della carica batterica, ogni immagine è qualità controllata. Per unnalyze le immagini e convertire l'intensità di fluorescenza in FPC per pesce, aprire il freeware ImageJ.
      NOTA: Il valore FPC riflette la carica batterica, come illustrato in precedenza utilizzando M. marinum 34.
    5. Determinare la soglia richiesta per l'analisi delle immagini utilizzando l'immagine di un embrione non infetto (diversi embrioni di controllo possono essere utilizzati per ottenere un livello soglia medio). Vai Immagine → → Regolare soglia e quindi spostare il cursore inferiore nella finestra di soglia verso destra fino lo sfondo diventa completamente nero (cioè, per ottenere un fondo deve essere a zero). Registrare il valore corrispondente.
    6. All'interno Immagine J, aprire la macro FPC (file supplementare) e seguire le istruzioni: individuare la cartella di immagini da misurare e quindi inserire la soglia precedentemente determinata e cliccare su "OK".
      NOTA: La macro sottrae automaticamente lo sfondo. Una soglia viene quindi applicato. Segnali fluorescenti sono identicato a seguito dell'analisi delle particelle.
    7. Copiare e incollare i dati dalla finestra di riepilogo per il software desiderato per l'analisi dei dati.
      NOTA: A differenza del metodo di determinazione CFU, il metodo di FPC non è invasivo e consente di riutilizzare il embrioni per successive analisi e, soprattutto, il monitoraggio delle dinamiche / cinetica della carica batterica su base individuale. E, quindi, permette di ridurre sensibilmente il numero di animali, in accordo con le norme etiche.

7. Imaging M. Gli embrioni infetti abscessus-

  1. Immagini dal vivo di M. infezione abscessus
    1. Mount embrioni tricaine-anestetizzato (vedi 3.2.2) a 1% a basso punto di fusione agarosio in una capsula di Petri 35 millimetri prima di osservazioni al microscopio a fluorescenza. Utilizzare un piatto fondo di vetro per microscopia confocale invertita o in una singola diapositiva depressione cavità per microscopia confocale in posizione verticale. Orientate l'embrione nella posizione desiderata e coperchiol'agarosio solidificato con acqua i pesci contenente tricaine.
    2. Utilizzare un microscopio a epifluorescenza con un obiettivo 10 X per acquisizione fluorescenza e trasmissione immagini sequenziali dell'intero embrione. In alternativa, utilizzare un microscopio confocale con 40X o 63X obiettivi di visualizzare l'attività delle cellule del sistema immunitario dopo un'infezione.
  2. Imaging fisso M. abscessus infettato embrioni
    1. Eutanasia gli embrioni come descritto in 6.1.1 e trasferirli provette da 1,5 ml di micro-centrifuga e fissare gli embrioni in paraformaldeide al 4% in 1 X PBST per 2 ore a temperatura ambiente o O / N a 4 ° C. Rimuovere paraformaldeide lavando gli embrioni due volte con PBST 1 X per 10 minuti.
      NOTA: Per conservare la fluorescenza, gli embrioni fisse devono essere protette dalla luce.
    2. Per preservare l'integrità dei tessuti e la fluorescenza, embrioni vengono incubati successivamente ascendente soluzioni di concentrazione glicerolo (10, 20, 30, 40 e 50% diluito in PBST) X 1, per10 min per condizione.
      NOTA: fissa gli embrioni possono essere conservati per diversi mesi nel 50% glicerolo a 4 ° C.
    3. Disporre l'embrione incorporato in 50% glicerolo in una camera di osservazione (Figura 1B) 31.
    4. Immagine utilizzando 40X o 63X obiettivi su un microscopio confocale.

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Representative Results

Anche se vari siti anatomici possono essere iniettati 32, iniezioni vena caudale sono spesso utilizzati per generare infezioni sistemiche per le successive analisi, tra cui esperimenti di sopravvivenza, la determinazione della carica batterica, attività fagocitosi o formazione cavo. Iniezioni nei muscoli posteriori sono utilizzati per valutare il reclutamento di macrofagi al sito di iniezione (Figura 3A). Per studiare e confrontare la virulenza di varianti R e S di M. abscessus, sospensioni batteriche fluorescenti vengono iniettati nella vena caudale di 30 HPF embrioni (Figura 3a) 19. In contrasto con la variante S, il morfotipo R induce una infezione più robusto e letale in embrioni di zebrafish (Figura 3B), caratterizzato dal rapido sviluppo di ascessi batteriche all'interno del sistema nervoso centrale (CNS) (Figura 3C). Iniezioni sistemiche sia con la R e varianti S portare a infezioni del sistema nervoso centrale e la differenza inle patologia e di virulenza fenotipi possono essere quantificati né con l'osservazione al microscopio a fluorescenza (Figura 3C), enumerando i CFU per pesci (Figura 3D) o determinando la FPC di immagini acquisite (Figura 3E). È importante sottolineare che, CFU e la determinazione FPC sono correlati e sottolineano di cariche batteriche più grandi per il ceppo R rispetto al ceppo S a 3 e 5 dpi. Nel complesso, questi risultati sostengono fortemente zebrafish come modello pertinente e non invasiva di infezione per studiare la cronologia del processo di infezione.

Forse una delle caratteristiche più spettacolari è stato rivelato in video-microscopia che permette la visualizzazione di cavi serpentina all'interno del sistema nervoso centrale di embrioni infettati con la variante R (Figura 4). Grazie alla trasparenza ottica degli embrioni, la cinetica di formazione R-cavo potrebbe essere monitorata e ripreso in modo non invasivo, illustrante l'elevata propensione della variante R replicare extracellularly. Questo tasso di replicazione incontrollata, combinato con distruzione cellulare / tissutale porta rapidamente allo sviluppo di ascessi e infine la morte delle larve.

I macrofagi sono noti a svolgere un ruolo importante durante l'infezione da micobatteri, in particolare guidando la formazione di granulomi 35. Due strategie complementari possono essere utilizzati per studiare M. abscessus crescita / virulenza in embrioni macrofagi impoverito: la lipo-clodronate- e procedure basate morpholino-(Figura 5A). L'infezione di embrioni macrofagi impoverito con la variante R porta ad un massiccio aumento delle cariche batteriche e la produzione del cavo, come rivelato in video-microscopio (Figura 5B), portando ad estremamente rapida morte (100% embrioni morti a 3 dpi; Figura 5C) . Questo indica chiaramente che i macrofagi sono tenuti a controllare M. infezione abscessus.

Per indagare ulteriormente il ruolo dei macrofagidurante l'infezione, specifici embrioni transgenici che ospitano i macrofagi fluorescenti rossi (MPEG1: mCherry) può essere utilizzato 19. Iniezione di M. abscessus esprimendo Wasabi nel muscolo coda o nella vena caudale induce l'una marcata reclutamento di cellule mieloidi, principalmente macrofagi, al sito di infezione. Questa assunzione porta ad fagocitosi efficiente di batteri individuali (Figura 6A-6B). Nonostante la presenza di macrofagi, microscopia confocale rivela la comparsa di grandi corde batteriche che possono fagocitare macrofagi non (figura 6C). Presi insieme, questi risultati evidenziano un nuovo meccanismo di evasione immune basato sul ruolo delle cording nella prevenzione fagocitosi micobatteri.

Figura 3
Figura 3. M. infezione abscessus in embrioni di zebrafish. (A) (Pannello superiore) l'infezione per via endovenosa eseguita iniettando fluorescente M. abscessus (mostrato in bianco) nella vena caudale (freccia 1), posteriore all'apertura urogenitale, in 30 HPF embrioni. (Pannello inferiore) infezione intramuscolare eseguita iniettando micobatteri fluorescente (mostrato in bianco) nel muscolo coda su un somite (freccia 2), in 48 HPF embrioni. (BE) 30 HPF embrioni per via endovenosa infettato da tdTomato- M. abscessus curve di sopravvivenza di embrioni (R e varianti S). (B) infettate con ≈ 300 CFU o R o varianti S o PBS iniettato controlli (n = 20). Sono mostrati i risultati rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. (C) la visualizzazione Spatiotemporal sia del R o la variante S esprime tdTomato (bianco) in tempi diversi punti dopo l'infezione eseguita da imaging di fluorescenza dal vivo. Per ogni ceppo, un rappresentante di fluorescenza e la trasmissione sovrapposizione di intere embrioni infetti è sho wn. Gli stessi embrioni sono stati ripresi a 3 e 5 dpi. (DE) cariche batteriche all'interno di embrioni infettati con varianti o R o S (≈ 200 CFU) determinato contando CFU (D) o misurazioni FPC (E). (D) CFU da lisato di singoli embrioni a vari intervalli di tempo dopo l'infezione determinata dalla placcatura sul Middlebrook 7H10 OADC integrato con PANTA BBL MGIT. I risultati sono espressi come media ± DS log (barre orizzontali) CFU per embrione da tre esperimenti indipendenti (n = 5). Misure (E) FPC di singoli embrioni viventi in vari momenti punti dopo l'infezione sulla base di analisi delle particelle utilizzando ImageJ. I risultati sono espressi come media ± DS log (barre orizzontali) FPC per embrione da tre esperimenti indipendenti (n = 5). Tutte le immagini sono state ottenute con un microscopio a epifluorescenza dotato di una fotocamera digitale a colori. t = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4. In vivo cording della variante R. 30 HPF embrioni infettati per via endovenosa con la variante di R M. abscessus e ripreso in vari momenti punti dopo l'infezione per visualizzare la progressione della formazione del cavo. La freccia rossa viene utilizzato come punto di riferimento fisso per seguire l'evoluzione spazio-temporale del cavo. Le foto DIC della parte della coda contenente il cavo serpentina crescente inscatolate (microscopio dotato di una telecamera a colori). Bar Scala:. 100 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 5. L'esaurimento dei macrofagi porta ad un aumento della proliferazione cavo. (A) Gli embrioni sono esaurite utilizzando la procedura lipo-clodronato-based o la procedura basata morfolino-. (Pannello superiore) liposomi clodronato incapsulato (lipo-clodronato) vengono iniettati per via endovenosa in 24 HPF Tg (mpeg1: mCherry) embrioni. All'interno della circolazione, lipo-clodronato è rapidamente inghiottito dai macrofagi che subiscono successiva apoptosi. (Sinistra-pannello inferiore) Iniezione della preparazione morfolino di knock-down l'espressione del gene PU.1 in fecondato Tg (mpeg1: mCherry) uova zebrafish. (Pannello destro in basso) e la correttezza esaurimento dei macrofagi in embrioni viene controllato al microscopio a fluorescenza (BC) 30 HPF-macrofagi contenenti (+) o macrofagi impoverito. (-) Embrioni (in seguito al trattamento lipo-clodronato) sono infettati con M. abscessus R esprimendo tdTomato (mostrata in bianco). (B) curve (C) di sopravvivenza degli embrioni-macrofagi contenenti o macrofagi infettati con impoverito ≈300 CFU M. abscessus R (n = 20). Sono mostrati Risultati rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. Tutte le immagini sono state acquisite con un microscopio collegato ad una telecamera a colori. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 6
Figura 6. Comportamento di macrofagi negli embrioni infetti in locale o sistemica con M. abscessus (A) 48 HPF Tg (mpeg1: mCherry). embrioni di zebrafish sono infettati per via intramuscolare con Wasabi esprimono M. abscessus R. Live imaging utilizzando un microscopio confocale per visualizzare reclutato macrofagi fagociti micobatteri individuale (in minuti dopo l'infezione, MPI). Intensità massima di proiezione mostra un intenso reclutamento di macrofagi (rosso) al sito di iniezione (microscopio confocale con acqua 40X APO 0,8 obiettivo NA). Scala bar: 20 micron (BC) 48 HPF Tg (mpeg1: mCherry). Embrioni per via endovenosa infetti da M. abscessus R esprimendo Wasabi sono stati fissati e ripreso al microscopio confocale (40X) a 4 HPI (B) e 3 dpi (C). (B) proiezione massima intensità di macrofagi (rosso) o altre cellule mieloidi, neutrofili presumibilmente (frecce), contenente micobatteri isolate (verde) vicino al sito di iniezione (microscopio confocale con olio 63X APO 1.33 obiettivo NA). Scala bar: 10 micron (C) proiezione massima intensità che mostra uno dei macrofagi (rosso) in grado di fagocitare un cavo (verde) (microscopio confocale con olio 63X APO 1.33 obiettivo NA)..Scala bar:. 5 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Il pesce zebra è recentemente emerso come un ottimo sistema modello vertebrato per lo studio delle dinamiche di infezione batterica con ampio campo e l'imaging confocale in tempo reale 36. La combinazione di sospensioni disperse micobatterici (protocollo 2.2) insieme con i metodi di micro-iniezione (protocollo 4) permette di infezioni sistemiche, riproducibili e successivo monitoraggio e visualizzazione della progressione dell'infezione con un focus particolare sulle interazioni batteriche con macrofagi ospitanti. Virulenza dei M. abscessus in vivo può essere indagato grazie all'uso di wild-type oro zebrafish 37. Per studiare le interazioni tra M. abscessus e ospitare cellule mieloidi, diverse linee di zebrafish transgenico possono essere utilizzate come Tg (mpeg1: mCherry) per visualizzare macrofagi 19. Ulteriori linee giornalista transgeniche come il come Tg (mpx: GFP) 38 o Tg (lyz: DsRed) 39 with o verde di neutrofili rosso, rispettivamente, possono anche essere utilizzati per affrontare il ruolo specifico di queste granulociti in risposta all'infezione.

M. abscessus, e in particolare la variante R, presenta una naturale tendenza a formare aggregati batterici massiccio 19, impedendo così riproducibile microiniezione. Inoltre, ciuffi il fatto che le forme varianti R molto più grandi rispetto alla variante S preclude anche il potenziale confronto dei fenotipi di virulenza per le due varianti isogeniche. Il protocollo descritto nella sezione 2 permette di ottenere omogenea e dispersi M. sospensioni abscessus per micro-iniezione in embrioni. Questa preparazione può essere applicato ad altre specie micobatteriche o ceppi mutanti che mostrano eccessive proprietà aggreganti. Dal momento che la fase di sonicazione può alterare lo strato più esterno della parete cellulare dei micobatteri, occorre prestare attenzione per valutare l'impatto di questo trattamento fisico sulla vitalità batterica per l'each nuovo ceppo.

Determinazione dei pesi batteriche basa sistematicamente su CFU conteggio dopo la placcatura embrioni lisate su agar selettivo in vari momenti dopo l'infezione, come descritto nel protocollo 6.1. Questa procedura prevede diverse limitazioni: poiché gli animali vengono sacrificati, ogni embrione (o gruppo di embrioni) possono essere utilizzati per la determinazione di un unico punto di tempo. Inoltre, questo metodo rimane precisa a causa della gran parte dei batteri che vengono uccisi e / o persi durante la lisi, successive diluizioni seriali, o principalmente da grumi. Contando il CFU è anche un compito laborioso. In alternativa, il protocollo 6.2 descrive un metodo efficiente per quantificare la M. onere abscessus che include fasi di manipolazione limitati, basato sull'analisi delle immagini fluorescenti di embrioni HIV con pixel quantificazione, come sviluppato in origine per M. marinum 40,41. Questo metodo FPC basato sull'analisi particella, mostra una buona correlazione wesimo i conteggi CFU. Allo stesso modo, combinando la microscopia a fluorescenza e quantificazione, variazioni relative numero di cellule immunitarie innate per embrioni possono essere quantificati mediante analisi di immagine utilizzando adeguate linee transgeniche.

Zebrafish embrioni possono essere utilizzate per valutare il ruolo di cellule immunitarie durante l'infezione e macrofagi esaurimento è stato trovato per influenzare negativamente la sopravvivenza di accoglienza in risposta a M. infezione abscessus. Specifico esaurimento macrofagi possono essere generati in modo efficiente utilizzando la procedura basata-lipo-clodronato (protocollo 5.1) o la procedura basata morfolino-(protocollo 5.2). Tuttavia, poiché la presenza di macrofagi è cruciale per la creazione e la manutenzione del sistema vascolare e per il corretto sviluppo embrionale, si raccomanda di ablazione produzione macrofago a 24 HPF utilizzando lipo-clodronato.

L'embrione zebrafish si presenta come un modello unico per studiare M. infezioni abscessus e il ruolo della Extracelllare condo come una strategia di sistema di sovversione immunitario. Se determinanti cordoni di controllo in M. abscessus può essere identificato, potrebbero portare allo sviluppo di opzioni terapeutiche innovative. Collegando l'uso di zebrafish con tecnologie innovative ad alto rendimento 42 apre anche il campo di scoperta di nuovi farmaci e nuovi approcci farmacologici contro questo patogeno resistente ai farmaci.

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Acknowledgments

Gli autori sono grati a K. Kissa per le discussioni utili e per fornire lipo-clodronato e L. Ramakrishnan per il dono generoso di pTEC27 e pTEC15 che permettono espressione di tdTomato e Wasabi, rispettivamente. Questa opera fa parte dei progetti dell'Agenzia nazionale di ricerca francese (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009 e DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) e il Settimo Programma Quadro della Comunità Europea (FP7-PEOPLE-2011-ITN) sotto contratto di concessione n. PITN-GA-2011-289209 per il Marie Curie Initial Training Network FishForPharma. Desideriamo inoltre ringraziare l'Associazione Gregory Lemarchal e Sconfiggere la mucoviscidosi (RF20130500835) per il finanziamento di CM Dupont.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BBL MGIT PANTA BD Biosciences 245114
Bovine Serum Albumin  Euromedex 04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver  Sigma-Aldrich C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar BD Biosciences 262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Oleic Acid Sigma-Aldrich O1008
Paraformaldehyde Delta Microscopie 15710
Phenol Red Sigma-Aldrich 319244
Tween 80 Sigma-Aldrich P4780
Agar Gibco Life Technologie 30391-023
Low melting agarose Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts  Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries  Sutter instrument Inc BF100-78-10 1 mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device  Sutter Instrument Inc Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector Tritech Research  Digital microINJECTOR, MINJ-D
Tweezers Sciences Tools inc Dumont # M5S 
Microloader Tips Eppendorf

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References

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Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet, A., Herrmann, J. L., Lutfalla, G., Kremer, L. Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (103), e53130, doi:10.3791/53130 (2015).

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