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Immunology and Infection

영상 병인과의 Cording를 해독하고 Published: September 9, 2015 doi: 10.3791/53130

Introduction

미코 농양은 인간의 임상 증후군의 넓은 스펙트럼을 일으키는 새로운 병원균이다. 이러한 피부 감염뿐만 아니라 심각한 만성 폐 감염, 주로 면역 및 낭포 성 섬유증 환자 1,2,3,4에서 발생을 포함한다. M.를 농양은 인간의 원내 및 인성 감염을 담당하는 주요 빠르게 성장하는 마이코 박테리아 종으로 간주된다. 또한, 몇 가지 최근의 보고서는 가능성을 강조하는 M. 농양은 혈액 - 뇌 장벽을 통과하여 중추 신경계 (CNS) 5,6- 중요한 병변을 유도 할 수있다. 빠른 재배자, M.를 임에도 불구하고 또한 농양 전시 육아 종성 구조 내에서 년 동안 묵비권과 폐 7 caseous 병변을 생성 할 수있는 능력을 포함하여 결핵균의 그와 관련된 여러 가지 병원성 기능. 더 놀라운 낮은 센입니다엠의 sitivity 항생제에 농양, 상당한 치료 실패율 8,9로 이어지는 치료하기가 매우 어렵습니다 이러한 감염을 렌더링. 이 종의 중요한 위협은 주로 주요 공중 보건 기관 (10)에 관심과 폐 이식 (11)에 대한 금기 사항이다 항생제에 고유의 저항이다.

M. 농양 표시 다른 임상 결과로 이어질 부드러운 (S) 또는 거친 (R) 식민지 형태 형. S 균주 달리, R 박테리아 로프 또는 끈형 구조 (12, 13)로 이어지는 단으로 성장하는 경향이있다. 세포 또는 동물 중 모델을 기반으로 여러 독립적 인 연구는 연구의 하이퍼 독성 표현형은 14, 15를 morphotype 밝혔다. 역학 연구, M.의 가장 심각한 경우 가입일 농양, 폐 감염이 연구와 관련이있는 것으로 나타납니다하는 유일한 변형 16 개의 변종이감염된 호스트 3 년 동안 지속하는 것으로 나타났습니다. morphotype 차이는 표면 관련 glycopeptidolipids (GPL) 12 (S)에 존재 또는 (R)에서 손실에 의존한다. 그러나, 현재 이용 가능한 셀룰러 / 동물 모델의 본질적인 한계는 M.에 의한 연구를 사용 농양 감염, R 또는 S 변종의 병태 생리 학적 사건에 대한 우리의 지식은 불분명 남아있다. 정맥 또는 에어로졸 경로를 통해 면역 능력이 쥐의 감염은 지속적 감염 및 생체 내 약물 감수성 검사 (17)에 대해 연구하는 마우스의 사용을 방해, 일시적 식민지로 연결됩니다. 따라서, 호스트 응답의 조작 의무가 동물 모델을 개발하는 것은 큰 도전이다. 이러한 맥락에서, 감염의 포유 동물 모델 비는 비용, 속도 및 윤리적 양호성 O 등 여러 가지 이점을 제공한다 (18)를 포함 초파리 melanogaster의 최근 개발되어왔다마우스 모델을 VER. 감염의 제브라 피쉬 (다니오 레 리오 (rerio)) 모델은 또한 비 침습적 영상, M.의 진행과 연대하여, 시각적으로 탐구하고있다 살아있는 동물 19 농양 감염. 중요한 개념의 증거는 엠에 대한 생체 내 항생제 평가에 대한 적합성을 입증하기 위해 설립되었다 17, 20 농양.

제브라 널리 다양한 병원균과 숙주 면역 시스템 (21) 사이의 상호 작용을 연구하기 위해 지난 수십 년 동안 사용되어왔다. 이 다른 척추 동물 모델의 증가 성공 동기 부여 및 다수의 바이러스와 세균 감염 19,22,23,24,25,26,27,28,29의 더 나은 이해를 위해 사용을 검증 주요 독특한 기회에 의존합니다. 대부분의 다른 동물 모델에 반해, 제브라 피쉬 배아는 비 침습적 형광 이미징 (30). 이는 헥타르 있도록 광학적으로 투명M. 공부를 LED에 농양은 세균의 형태 학적 가소성의 예를 나타내는 세포 외 cording의 설명과 남중, 전례없는 세부 제브라 피쉬 배아를 감염. Cording는 면역 체계의 파괴의 새로운 메커니즘 및 급성 엠의 발병을 촉진하는 핵심 메커니즘을 나타냅니다 농양 감염 (19).

이 보고서는 M.의 병태 생리 학적 특성을 해독하는 제브라 피쉬 배아를 사용하는 새로운 도구와 방법을 설명합니다 감염 농양과 간균과 선천성 면역 시스템 사이의 친밀한 상호 작용을 연구하는. 먼저, 그 자체 박테리아 접종원 배아 준비, 감염의 처리를 포함하는 마이크로 인젝션 상세한 프로토콜이 제시된다. 구체적 방법은 M.를 평가하도록 같은 호스트의 생존과 세균 부담 등의 다양한 매개 변수를 측정하여 농양 독성이되게됩니다. 특별한 초점은 방법에 기재되어 있습니다, 시공간 수준에서, 운명과 진행 감염과 엠에 호스트 면역 반응을 모니터링 비디오 현미경을 사용하여 농양. 또한, M. 동안의 기여와 대 식세포의 역할을 조사하기 위해 감염 농양, 방법 (genetically- 또는 화학적 기반 중 하나 방법을 사용) 대 식세포가 고갈 된 배아 설명되어 있습니다를 생성합니다. 마지막으로, 프로토콜은 고정 또는 생활 배아를 사용하여 대 식세포 나 호중구가 문서화와 특정 상호 작용을 시각화합니다.

이 보고서의 목적은 엠에 새로운 광명을 비춰하는 추가 연구를 자극하는 것입니다 농양 독성 메커니즘 및 제어되지 않은 급성 감염 프로세스의 확립에 cording 특히 역할.

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Protocol

Zebrafish의 실험 절차는 관련 기관 및 정부 규정을 준수해야합니다. 본 연구를 위해, 제브라 피쉬 실험은 실험 동물의 처리를위한 유럽 연합 (EU) 지침에 따라, 대학 몽펠리에에서 (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm)을 수행하고, 기준에 따라 승인 CEEA-LR-13007.

시약 및 미세 주입 장비 1. 준비

  1. 후 최대 1 개월 28.5 ℃에서 저장 (20 분 동안 120 ° C)를 소독하기 위해 압력솥, 1 L의 증류수 (31)에 0.06 g의 인스턴트 오션 바다 소금을 용해하여 물고기의 물을 준비합니다.
  2. 1 L 증류수에 메틸렌 블루의 1g을 용해하여 메틸렌 블루 용액을 준비합니다. 후 최대 1 개월 28.5 ℃에서 살균 및 저장하는 오토 클레이브, 푸른 물고기 물을 얻기 위해 1 L 물고기 물에 메틸렌 블루 용액 300 μl를 추가합니다.
    참고 : additi물고기 물에 메틸렌 블루의에 곰팡이의 성장을 방지 할 수 있습니다.
  3. 인산염 완충 생리 식염수의 준비 (PBS)
    1. 5.696 g의 나 2 HPO 4, 680 mg을 KH 2 PO 4, 969 mg의의 KCl과 78.894 g의 NaCl을 1 L의 증류수에 용해시켜 10 X PBS 주식 솔루션을 준비하고 HCl로 7.0 pH를 조정합니다. 1 X PBS를 얻기 살균 120 ° C에서 20 분 동안 물을 증류 제거하고, 오토 클레이브에 900ml의 10 X PBS 용액 100 mL로 희석.
    2. 최대 1 년 동안 실온에서 1 X PBST를 얻기 0.05 % 트윈 80을 추가하고 저장.
  4. 다음 용액을 멸균 필터 소 간, 1 L의 증류수에 올레산 0.5 g 8.5 g의 NaCl, 50g 소 혈청 알부민, 20g D- 글루코스, 40 mg의 카탈라제 용해 올레산 포도당 카탈라제 (OADC) 농축을 준비 최대 6 개월 동안 4 ℃에서 보관합니다.
  5. 400 mg을 용해시켜 tricai 에틸 -3- 아미노 벤조 에이트 메탄 술폰산 (tricaine) 스톡 용액 100 ㎖를 제조97.9 용액에 NE 분말은 증류수. 7.0에서 pH를 조정하고 -20 ° C에서 솔루션을 저장하기 위해 1 M 트리스 (PH 9)의 2.1 ML을 추가합니다.
  6. 다음 설정을 사용하여 마이크로 피펫 풀러 장치 사용 붕규산 유리 모세관 (1mm 외경 X 0.78 mm의 ID)를 잡아 당겨 마이크로 캐 필러 주입 바늘을 준비 : 공기압 650; 999 가열; (50)를 당겨; 속도 (80); 시간 (200).
  7. 푸른 물고기 물에 1.5 % 한천 솔루션을 준비하고 100mm 배양 접시에서 용융 한천의 25 ml에 붓는다. 녹은 한천의 위에, 특정 채널을 각인하기 위해 만든 금형을 배치합니다. "V"모양의 채널 위치 배아에 사용되는 계란 (그림 1) (31)에 사용되는 모양 "U"동안. 응고되면, 신중하게 인쇄물을 제거합니다.
    참고 : 최대 2 개월 동안 4 ℃에서 탈수 및 저장을 피하기 위해 푸른 물고기 물과 한천을 커버.

그림 1 제브라 피쉬 주사 그림 1. 위치 챔버. (A) 계란 (왼쪽 패널)와 배아를위한 V 자형 채널 (오른쪽 패널)에 대한 U 자형 채널. Zebrafish의 계란 / 배아는 채널에 배치하고 동일한 축을 따라 정렬된다. (B)보기 챔버 현미경 관찰을 위해. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 준비 및 엠의 저장 농양 접종

  1. M. 농양 성장 조건
    1. 엠을 플레이트 OADC의 10 % 및 0.5 % 글리세롤 (7H10 OADC) 및 적절한 항생제 형광 단백질을 코딩하는 벡터에 의해 운반 내성 마커에 따라 보충 함유 미들 7H10 한천 상으로 -80 ° C 글리세롤 스톡으로부터 농양. 번호판을 품어4-5일 30 ° C에서.
    2. 형광 긍정적 인 마이코 박테리아 식민지를 선택하고 15 ml의 멸균 플라스틱 튜브에 필요한 항생제 OADC 보충 1 ml의 미들 7H9 국물, 0.2 % 글리세롤, 0.05 % 트윈 80 (7H9 OADC / T)를 접종. 흔들림없이 1 주간 30 ° C에서 품어.
      참고 : 트윈 80은 응집 및 세균 집계를 제한합니다.
    3. (약 5.10 7 박테리아 / ㎖에 상응 함), 최종 0.1 OD 600 150cm 2 조직 배양 플라스크에 50 mL의 미들 7H9 OADC은 / T 2.1.2에서 얻어진 예비 배양을 재현 탁하고 4 30 ℃에서 추가 배양 일이 기하 급수적으로 성장하는 문화 (OD 600 = 0.6 ~ 0.8)을 얻었다.
      참고 : 응집을 최소화하기 위해, 특히 거친 변종, 배양 5 일 초과 할 수 없습니다. 모두 매끄럽고 거친 변이체 유사한 성장 속도를 표시.
  2. 엠의 준비 농양 접종(60);
    참고 : 인해 거친 엠의 높은 성향에 농양 큰 응집체를 형성하는 단계 및 코드를 생성하기 위하여, 특정 치료 전에 배아 microinjections에 균일하고 정량적으로 제어 접종원을 생성 할 필요가있다. 이 치료는 또한 거친 균주보다 낮은 정도이기는하지만, 골재를 생산 세균을 매끄럽게하기 위해 적용된다.
    1. 수확은 4에서 원심 분리하여 150cm 2 조직 배양 플라스크에서 문화를 기하 급수적으로 성장하고, 000 50 ml의 멸균 플라스틱 튜브에 실온에서 15 분 동안 XG 및 1 ml의 7H9 OADC / T에 박테리아 펠렛을 재현 탁. 나누어지는 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 세균 현탁액 200 μL.
      주 : 1 ml를 주사기로 작은 볼륨으로 작업하는 것은 매우 균일 한 현탁액을 얻을 필요가있다.
    2. 각 초음파 자체 사이에 10 초 휴식으로 (10 초 (15 상하 서열) 초음파 처리를 세 번 26 G 바늘 세균 현탁액을 균질화수조의 초음파기를 사용하여 quence). 간단히 7H9 OADC / T와 소용돌이의 1 ML을 추가합니다. 100 × g에서 원심 분리기 3 분.
    3. 조심스럽게 덩어리를 방지하고 50 ml의 멸균 플라스틱 튜브의 균일 한 현탁액을 풀 수있는 마이코 박테리아 함유 상층 액을 수집합니다.
    4. 결국 남아있는 세균 집계의 존재를 시각적으로 확인합니다.
      참고 : 집계가 여전히 존재하는 경우, 2 분 동안 100 XG에 추가 원심 분리 단계로 진행하고, 상층 액을 수집합니다.
    5. 원심 분리기는 현탁액 5 분 4,000 XG에 200 μL 7H9 OADC / T에 펠렛을 재현 탁하고 주사로 진행합니다.
    6. 7H10 OADC 한천에 (1 × PBST에) 연속 희석 도금 및 30 ℃에서 4 일간 배양 한 후 집락 형성 단위 (CFU)를 계산하여 최종 세균 농도를 평가합니다. CFUs 각각의 새 배치에 대한 결정되어야한다.
    7. -80 & #에서 5 μL 씩 저장하여 냉동 접종 주식 준비176; C.
      주 : -80 ° C의 동결 분취 CFU 평가는 냉동 / 해동 접종 박테리아 생존에 영향을 미칠 수 있으므로 가능한 박테리아의 정확한 수를 결정하는 필수 조건이다. 이러한 냉동 접종원 후속 주입에 사용될 준비가되었다. 모든 분취 액 CFU의 동일한 수를 포함하기 때문에, 또 하나의 실험에서 재현 가능한 방식으로 박테리아를 주입 가능.
  3. 접종 품질 관리
    주 : (마이코 박테리아에만) Ziehl-Neelsen 염색 전에 및 2.2에 기술 된 절차 균질화 후 세균 현탁액의 품질을 비교하는 데 사용될 수있다.
    1. 스폿과 유리 슬라이드에 균질화 세균 현탁액의 한 방울을 확산하고, 완전히 건조 65-70 O C 및 얼룩이 Ziehl-Neelsen 염색 프로토콜을 사용하여 설정된 핫 플레이트에서 적어도 30 분 동안 스미어를 고정 할 수 있도록 .
    2. 현미경 (100)를 이용하여 세균 도말 표본을 관찰X 목적 및 비 처리 된 세균 현탁액 스미어와 비교 (도 2).

그림 2
분산 M. 그림 2. 준비 농양 접종. R 또는 S의 Ziehl-Neelsen 염색은 (상단 패널) 어떤 치료를하기 전에 국물 매체에서 재배 변종 또는 처리 (낮은 패널) 후 마이코 박테리아 골재의 크기와 수 (해서 주입, 초음파 및 경사의 연속적인 단계)을 줄이기 위해 . 박테리아는 100 X APO 오일 1.4 NA 목표)와 현미경을 이용하여 관찰 하였다. 스케일 바 :. 20 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

3. Zebrafish의 배아를 준비

  1. 제브라 피쉬의 알을 산란 및 수집
    1. 의 전날저당 잡히기, 2 명의 남성과 1 여성을 배치하여 품종 성인 제브라 피쉬 : 달걀 수집 바구니 (31)과 별도의 수조로 구성, 번식 실에 (일반적으로 2 : 1 비율이 최적의 수정 속도를 지원한다).
      참고 : 달걀 수집 바구니는 부모에 의해 먹게되는 계란을 보호하고 계란 수확을 용이하게하기 위해 사용된다.
    2. 28.5 ℃에서 25 ml의 푸른 물고기 물 (최대 100 접시 당 배아)하고이를 유지 가득 100mm 페트리 접시에 1 HPF, 수확 계란 만 제대로 개발 된 배아에서. 비 수정란은 폐기된다.
  2. 주사를위한 제브라 피쉬 배아의 준비
    1. 약 24 시간 후 수정 (HPF)에서, 100mm 페트리 접시에 미세 핀셋으로 배아를 d​​echorionate 28.5 ℃에서 보관하십시오.
    2. 피펫을 사용하여 30-48 HPF 배아를 수집하고 물고기 물 25 ㎖를 270 ㎎ / ℓ의 tricaine을 포함 가득 "V"모양의 위치 챔버로 전송.쉽게 마이크로 조작에 최적화 된 수제 microloader 팁 도구 (집에서 클리핑 마이크로 로더 팁)를 사용하여 채널에서 제대로 배아를 놓습니다.
      참고 : 꼬리 정맥 또는 꼬리 근육 주사에 대한 위로 등의 측면에서 정맥 주사에​​ 대한 아래 등쪽의 방향을.

4. 마이크로 주입 절차

참고 : M. 용 마이크로 인젝션 절차 농양은 M.에 대해 이전에 설명 된 것과 유사하다 marinum (32)를 주사. 엠의 연대기를 평가하기 농양 감염 (생존, 세균성 부하, 운동 및 감염의 특성), 30 HPF 배아의 꼬리 정맥에 주사가 바람직하다. 면역 세포의 채용을 시각화하기 위해, 주사 48 HPF의 배아에서 꼬리 근육에 같은 지역화 된 사이트에서 이루어집니다.

  1. CFU의 수에 따라 1 × PBST (의 마이코 박테리아 접종을 희석적절한 삽입을 확인하는 10 %를 함유하는 페놀 레드, 단계 2.2.6)에서 결정된 바와 같이 투여 될 수있다.
  2. microloader 팁을 사용하여 박테리아 접종원 5-10 μL와 마이크로 캐 필러 주입 바늘을로드 인젝터에 연결된 삼차원 미세 조작기의 홀더에 마이크로 인젝션 용 바늘을 연결을 수득 미세 핀셋 바늘의 상단을 끊는 5-10 μm의 직경을 개방.
  3. 미세 주입 압력 (20 ~ 50 고전력 증폭기)와 시간 (0.2 초)을 조정하여 주입 볼륨을 보정합니다.
    주 : 필요한 주입량은 배아 노른자위로 토출 액적 직경의 육안 판정에 의해 교정된다.
  4. 꼬리 정맥 주입의 경우, (3.2.2 절에 설명 된대로) 바늘을 직면하고있는 복부 측면과 배아를 놓고 꼬리 정맥을 대상으로 비뇨 생식기 구멍에 바늘 끝 가까이, 배치, 부드럽게 배아에 바늘의 끝 부분을 밀어 그냥 caud을 관통 할 때까지알 정맥 영역입니다. 일반적으로 약 100 CFU / NL을 포함 1-3 NL, 세균 준비의 원하는 볼륨을 제공합니다.
  5. 근육 주사를 들어, (섹션 3.2.2에서와 같이) 바늘을 향 등의면 배아를 놓고 한 체절을 통해 바늘을 놓고 접종의 작은 볼륨 (1 NL)를 주입.
    참고 : 꼬리 정맥 주사에​​ 관해서는, 근육 내 감염도 수행 할 도전이다. 케어는 주변 조직을 손상 수있는 오버로드를 방지하기 위해주의해야합니다.
  6. 주사 과정의 끝에서, 7H10 OADC 도금 및 CFU를 계산 한 다음 멸균 PBST의 드롭에 세균 현탁액의 동일한 양을 주입하여 접종의 크기를 제어한다. 약 100 배아는 바늘로 주입 될 수있다.
    참고 : 때문에 거친 M. 농양이 바늘에 집계를 형성하기 위해 계속, 주사 접종 준비 직후에 수행 될 필요가있다.
  7. 감염된 FIS 이동2 ㎖ / 잘 물고기 물과 28.5 ° C에서 부화를 포함하는 시간을 개별적으로 24 웰 플레이트. 1-3 NL 1 X의 PBST 주입 배아는 컨트롤로서 사용될 수있다.
  8. 배아에 형광 박테리아의 적절한 감염은 형광 현미경을 사용하여 모니터링됩니다.

대 식세포가 고갈 된 배아의 5 세대

참고 : 조직에서 대 식세포의 선택적 고갈 감염 동안 자신의 기여와 역할을 조사하는 데 사용됩니다. 대 식세포의 적절한 고갈을 시각화하기 위해서는 mCherry 특별히 식세포 특이 MPEG1 촉진제 (19)의 제어하에 발현되는 형광 식세포와 트랜스 제닉 라인을 사용하는 것이 권장된다.

  1. 리포 - 클로드 기반 절차
    주 : 리포 - 클로드 절차는 조직에서 대 식세포의 선택 고갈 (있지만 호중구) (19)를 할 수 있습니다. 이 화합물은 둘 배아 나 AF의 생존을 변경하지 않는다박테리아의 무결성에는 영향. 리포좀 캡슐화 클로드를 제조 상세한 프로토콜은 이전에보고 된 바있다 (33).
    1. 24 HPF에서 배아를 d​​echorionate 및 3.2.2에 기술 된 바와 같이, 주입 절차의 종료까지 마취 상태에서 배아를 유지 tricaine 보충 물고기 물로 채워진 "V"자형 주입 접시로 옮긴다. 아래 등쪽의 방향을.
    2. 리포좀 캡슐화 클로드 (의 Lipo-클로드)와 마이크로 캐 필러 주입 바늘을로드 삼차원 미세 조작기의 홀더에 미세 주입 바늘을 연결하여 10 ㎛의 선단 개구 직경을 얻기 위해 미세 핀셋 바늘의 상단을 끊는.
    3. 주입 부피를 보정하기 위해, 고전력 증폭기 (20)에 마이크로 인젝션 압력 및 0.2 초의 주입 시간을 조정한다. 꼬리 정맥을 대상으로, 비뇨 생식기 구멍에 바늘 끝 가까이 배치하고 부드럽게에 바늘의 끝 부분을 밀어배아 단지 꼬리 정맥 영역을 관통하고 용액 원하는 볼륨 (2-3 NL, 3 회)를 제공 할 때까지.
      참고 : 리포 - 클로드 서스펜션은 매우 끈적이고 배아의 혈관 시스템과 살인을 막지 않도록 주입하기 전에 와동해야합니다. 그것은 작은 볼륨의 여러 연속 주사로 진행하는 것이 중요하다.
    4. 물고기의 물을 포함 100mm 페트리 접시에 배아를 전송하고 감염까지 28.5 ° C에서 보관하십시오.
    5. 형광 현미경에 의한 대 식세포의 적절한 고갈을 제어 할 수 있습니다.
      참고 : 전체 대식 세포 고갈 리포-clodoronate 투여 후 4 일 동안 유효합니다.
  2. 모르 폴리 노 기반 절차
    1. (2) 남성과 번식 실에서 플라스틱 장벽으로 구분 한 여성을 배치하여 산란, 번식 성인 제브라 피쉬 전날.
    2. 다음 날, 빛이 제브라 피쉬 시설에 온 그 이후 ≈ 30 분, 분리 장벽을 제거남성과 여성. 수정 속도를 최적화하기 위해 산란의 시작 후 약 20 분 동안 기다립니다. 계란을 수확하고 차가운 푸른 물고기 물 (4 ℃)로 가득 100mm 페트리 접시에 그들을 전송하여 자신의 개발을 느리게.
      참고 : 산란의 제어는 morpholinos 기반의 실험을 위해 매우 중요합니다. Morpholinos은 4 개의 셀 스테이지까지 알에 주입 될 수있다.
    3. 피펫을 사용하여 계란을 수집하고 차가운 푸른 물고기 물이 가득 "U"모양의 사출 실에서 계란을 예금 만든 microloader 팁 도구를 사용하여 채널에서 계란을 차단합니다.
    4. (19) 이전에 설명한 바와 같이, 페놀 레드의 10 %를 함유 PU.1의 모르 폴리 용액을 제조 하였다. 모르 폴리 제제와 마이크로 캐 필러 주입 바늘을 넣고 삼차원 미세 조작기의 홀더에 미세 주입 바늘을 연결하고 obtai하는 미세 핀셋 바늘의 선단을 끊는5-10 μm의 NA의 선단 개구 직경.
    5. 주입 부피를 보정하기 위해, 고전력 증폭기에 20-50 마이크로 인젝션 압력 및 0.2 초의 주입 시간을 조정한다. 계란에 가까운 바늘 끝을 놓고 부드럽게 원하는 모르 폴리 노 솔루션 볼륨, 일반적으로 3-5 NL을 난자에 융모막을 통해 바늘의 끝 부분을 밀어 제공합니다.
    6. 마이크로 주입 한 후, 물고기 물에 100mm 페트리 접시에 계란을 전송하고 감염 절차를 시작하기까지 28.5 ° C에서 품어.
    7. 30-48 HPF에서 형광 현미경으로 PU.1의 morphants에서 대 식세포의 적절한 (전체) 고갈을 분석합니다..
      참고 : 주입 농도에 따라, P는 u.1의 morpholinos는 초기 호중구의 수에 영향을 미칠 수 있습니다. 호중구의 수를 변경하지 않고 식세포 고갈 적절한 확인을 위해, 그것과 GFP (형광 호중구와 대 식세포 및 이중 형질 전환 지브라 피쉬 라인을 사용하도록 권장특히 MPX 프로모터에 의해 구동 식) 19.

6. 세균 부담 부량

  1. CFU 열거에 의해 결정
    1. 원하는 시점에서, 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 감염된 태아의 그룹 (조건에 따라 5) (1 배아 / 튜브), 10 분 동안 얼음에 배양하여 배아를 냉동이 - 마취와 tricaine의 과다 복용을 사용하여 안락사 (300-를 수집 500 ㎎ / ℓ)
    2. 두 번 멸균 수와 배아를 씻고 새로운 튜브를 분배,를 Lyse 각각 배아 2 % 트리톤 X-100 26 G 바늘을 사용하여 완전 용해 될 때까지 정지를 균질화 한 X PBST에 희석. 현탁액을 원심 분리기 및 0.05 % 트윈 균질의 80 연속 희석은 미들 7H10 OADC에 도금 업체에서 권장하는대로, BBL MGIT PANTA으로 보완하여 1 × PBST에 펠렛을 재현 탁.
      참고 : M. 수산화 나트륨 treatmen에 더 민감되고 농양M.보다 T 엠에 영향을주지 않고 물고기 해물의 marinum는, 오염 제거 농양 성장 성공적 BBL MGIT PANTA 항생제 칵테일을 사용하여 달성 될 수있다.
    3. 30 ° C 카운트 식민지에서 4 일 동안 번호판을 품어.
  2. 형광 픽셀로 결정 라이브 배아 (FPC) 측정 카운트
    참고 : 형광 방출을 통해 세균 하중을 결정하기는 감염된 태아의 일련의 이미지를 획득하고, FPC (입자 분석에 의한 세균의 식별)에 의해 측정 된 형광 강도는 ImageJ에 프리웨어 개발 만든 매크로를 사용. 입자 분석은 배경에서 관심의 형광 신호를 식별 할 수있는 임계 값 범위에 의존하는 이진 흑백 이미지를 필요로한다.
    1. 3.2.2의 설명에 따라 원하는 시점에서, 35mm 배양 접시에 감염된 태아 (조건에 따라 5-10) tricain - 마취.
    2. 물과 subme 제거RGE 배아와 물고기 물에 1 % 저 융점 아가로 오스와 전체 요리면, 다음 옆으로 배아를 맞 춥니 다. 물고기 물이 tricaine를 포함와 응고 아가 로스를 커버.
    3. 10 X 목적으로 표면 형광 현미경을 이용하여 전체 배아의 형광 이미지를 획득.
      주 : 형광 이미지 획득이 FPC 측정 절차의 중요한 단계입니다. 이 색상 교정 탐침 교정 모니터를 사용하는 것이 중요하다. 취득 된 신호의 포화를 방지하는 동안 최적의 노광 시간을 조정하면 최소 배경을 얻었다. 이미지는 8 비트 TIFF 형식이어야한다. 동일한 설정을 정량적 목적을 위해 전체 실험 기간 동안 유지됩니다.
    4. 수제 microloader 팁 도구를 사용하여 배아에서 조심스럽게 아가로 오스를 제거합니다. 필요한 경우, 이들 배아는 후속 분석을 위해 사용될 수있다. 세균 부하의 정량화에 앞서, 각각의 화상은 품질이 관리되어야한다. 로이미지를 nalyze 물고기 당 FPC로 형광 강도를 변환, ImageJ에 프리웨어를 엽니 다.
      주 : FPC 값이 박테리아 부담을 반영 이전에 M.를 사용하여 그림과 같이 marinum (34).
    5. 감염되지 않은 태아의 영상을 사용하여 이미지 분석에 필요한 임계치를 결정 (여러 제어 배아 평균 임계치를 획득하기 위해 사용될 수있다). →이 → 임계 값을 조정하고 배경이 완전히 검은 색이 ​​될 때까지 (즉, 제로에 있어야 배경을 구하는) 오른쪽에있는 임계 값 창에서 하단의 슬라이더를 이동하여 이미지로 이동합니다. 해당 값을 기록한다.
    6. 이미지 J 내에서 FPC 매크로 (추가 파일)을 열고 화면의 지시를 따릅니다 : 이미지의 폴더를 측정 할 찾아 이전에 결정하고 "확인"을 클릭으로 다음 임계 값을 입력합니다.
      참고 : 매크로가 자동으로 배경을 뺍니다. 임계 값은 적용된다. 형광 신호는 식별자이다입자 분석 다음 얘기들이었다.
    7. 복사는 데이터 분석에 대해 원하는 소프트웨어 요약 창에서 데이터를 붙여 넣기합니다.
      주 : CFU 결정 방법과 대조적으로, FPC 방법은 비 침습적이며 역학 모니터링, 중요한 것은, 후속 분석을 위해 배아를 재 - 사용 및 허용 / 개별적으로 세균 부담의 동력학. 이 때문에, 상당히 윤리 규정과 일치, 동물의 수를 감소 할 수있다.

7. 영상 M. abscessus- 감염된 태아

  1. 엠의 라이브 영상 농양 감염
    1. 마운트 tricaine - 마취 배아 (3.2.2 참조) 표면 형광 현미경 관찰 이전에 35mm 페트리 접시에 1 % 저 융점 아가로 오스. 반전 공 초점 현미경이나 똑바로 공 초점 현미경을위한 하나의 공동 우울증 슬라이드에서 유리 바닥 접시를 사용합니다. 원하는 위치와 덮개에 배아의 방향을물고기 물 tricaine 함유 함께 응고 아가.
    2. 전체 배아의 순차적 형광 수집 및 전송 이미지 10 X의 목적으로 표면 형광 현미경을 사용합니다. 대안 적으로, 감염 후, 면역 세포의 활성을 시각화 40X 63X 또는 목표와 공 촛점 현미경을 사용한다.
  2. 이미징 M. 고정 농양 감염 배아
    1. 6.1.1에 설명 된 배아를 안락사 4 ℃에서 RT 또는 O / N에서 2 시간 동안 1 X PBST로 4 % 파라 포름 알데히드에서 배아를 1.5 ml의 마이크로 원심 분리 튜브로 전송하고 고정한다. 10 분 동안 1 X PBST로 두 번 배아를 세척하여 파라 포름 알데히드를 제거합니다.
      참고 : 형광을 유지하려면 고정 된 배아가 빛으로부터 보호해야합니다.
    2. 조직 및 형광의 무결성을 유지하기 위해, 배아에 대해, (1 X PBST로 희석하여 10, 20, 30, 40 및 50 %)의 글리세롤의 농도의 용액을 연속적으로 증가하는 인큐베이션조건 당 10 분.
      참고 : 고정 배아는 4 ° C에서 50 % 글리세롤에 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.
    3. 볼 챔버 (도 1b) (31)에 50 % 글리세롤에 매립 배아를하다.
    4. 공 초점 현미경에 40X 또는 63X 목표를 사용하여 이미지.

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Representative Results

다양한 해부학 적 부위 (32)를 주입 할 수 있지만, 꼬리 정맥 주사는 종종 생존 실험 세균 부담 결정, 식세포 작용 활성 또는 코드를 포함하여 형성 후속 분석을위한 전신 감염을 생성하는 데 사용된다. 꼬리 근육 주사 주입 (그림 3A)의 사이트에있는 대 식세포의 모집을 평가하는 데 사용됩니다. 조사 엠의 R과 S 변종의 독성을 비교하려면 농양, 형광 박테리아 현탁액은 30 HPF 배아 (그림 3A) (19)의 꼬리 정맥에 주입된다. S 변이체는 대조적으로, R의 morphotype 중추 신경계 (CNS) (도 3c) 내에 세균성 농양의 급속한 발전에 의해 특징 지브라 피쉬 배아 (도 3B)에서 더욱 강력하고 치명적인 감염을 유발한다. R과 S 변종 모두 전신 주사는 중추 신경계 감염과 차이가 발생할병리학 및 독성 표현형은 형광 현미경 관찰 (그림 3C)에 의해, 생선 (그림 3D) 당 CFU를 열거 나 획득 된 영상의 FPC (그림 3E)을 결정하여 하나 정량화 할 수있다. 중요한 것은, CFU 및 FPC의 결정은 상관 관계 3, 5 dpi로 S 균주보다 R 균주에 대한 더 큰 세균 하중을 지적하고 있습니다. 전반적으로, 이러한 결과는 강하게 감염 프로세스의 연대기를 연구하는 감염의 적절하고 비 침습적 모델로 제브라 피쉬를 지원합니다.

아마도 가장 멋진 기능 중 하나는 R 변종에 감염된 태아의 중추 신경계 (그림 4)에서 뱀 코드를 시각화 허용 비디오 현미경으로 밝혀졌다. 배아의 광학 투명도 덕분에, R-코드 형성의 동역학은 EXT를 복제 R 변이체의 높은 성향을 나타내는, 비 침습 방식으로 모니터링 될 수있는 이미징racellularly. 세포 / 조직 파괴와 결합이 억제되지 않는 복제 속도가 빠르게 농양의 개발 및 궁극적으로 죽음에 이르게 유생.

대 식세포는 마이코 박테리아 감염 중에 특히 육아종 형성 (35)를 구동함으로써 중요한 역할을하는 것으로 알려져있다. 두 개의 상보적인 전략 M.을 연구하는데 사용될 수있다 대 식세포가 고갈 된 배아에서 농양 성장 / 독성 : 리포 - clodronate- 및 모르 폴리 노 기반 절차 (그림 5A). 비디오 현미경 (그림 5B)에 의해 계시 된 R 변형와 대 식세포가 고갈 된 배아의 감염 선도, 세균 하중과 코드 생산의 대규모 증가로 연결에 매우 빠른 죽음 (100 % 죽은 배아 3 dpi 해상도에서도 5C) . 이것은 분명히 식세포는 M.을 제어하는 데 필요한 것을 나타낸다 농양 감염.

또한 대 식세포의 역할을 알아보고자감염 동안, 적색 형광 식세포 (MPEG1 : mCherry)를 형질 형질 특정 배아 19 사용될 수있다. 사출 꼬리 근육 또는 꼬리 정맥에 고추 냉이를 표현 농양 감염의 사이트에있는 골수 세포, 주로 대 식세포의 현저한 채용을 유도한다. 이 채용 개별 박테리아의 효율적인 식세포 작용 (그림 6A-6B)에 연결됩니다. 대 식세포의 존재에도 불구하고, 공 초점 현미경은 대 식세포 (그림 6C)를 phagocytize 수없는 큰 세균 코드의 모양을 보여준다. 종합적으로, 이러한 결과는 마이코 박테리아 식균 작용을 방지 cording의 역할에 따라 면역 회피의 새로운 메커니즘을 강조.

그림 3
그림 3. M. 제브라 피쉬 배아에서 농양 감염. (A) (위 패널) 형광 M. 주입함으로써 수행 정맥 감염 30 HPF 배아의 꼬리 정맥에 (흰색으로 표시) 농양 (화살표 1) 비뇨 생식기 개통, 후방,. (하단 패널) 형광 마이코 박테리아를 주입하여 수행 근육의 감염이 48 HPF 배아에서 체절 (2 화살표)을 통해 꼬리 근육 (흰색으로 표시). (30) HPF 배아 정맥 tdTomato- M. 감염 (BE) 농양 (R과 S 변종). (B) 배아의 생존 곡선은 ≈ 300 CFU R 중 하나에 감염 또는 S는 변형 또는 PBS는 (N = 20) 컨트롤을 주입. 3 개의 독립적 인 실험에서 대표 결과가 표시됩니다. (C) R 또는 여러 번 tdTomato (흰색)을 표현하는 S 변종 중 하나의 시공간 시각화하는 형광 라이브 영상에 의해 수행 후 감염을 가리 킵니다. 각 균주의 경우, 전체 감염된 태아의 대표적인 형광 및 전송 오버레이 소입니다 WN. 같은 배아는 3, 5 dpi로 몇 군데 있었다. (DE) CFU가 계산 (D) 또는 FPC 측정 (E)에 의해 결정 R 또는 S 중 변형 (≈ 200 CFU)를 감염 배아 내 세균로드합니다. (D) 해물에서 CFU 다양한 시점에서 개별 배아의 후 감염은 BBL MGIT PANTA 보충 미들 7H10 OADC에 도금에 의해 결정. 3 개의 독립적 인 실험에서 배아 당 SD (가로 막대) CFU ± 로그인 의미로 결과가 표현된다 (N = 5). 다양한 시간이 ImageJ에를 사용하여 입자 분석을 기반으로 감염 후 포인트에서 개인 생활 배아에서 (E) FPC 측정. 3 개의 독립적 인 실험에서 배아 당 SD (가로 막대) FPC ± 로그인 의미로 결과가 표현된다 (N = 5). 모든 이미지는 디지털 컬러 카메라 장착 표면 형광 현미경으로 얻었다. T = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
엠의 R 변형과 정맥 감염 R 변종의 생체 cording에서 그림 4. 30 HPF의 배아 농양과 다양한 시간에 몇 군데는 코드 형성의 진행을 시각화하는 후 감염을 가리 킵니다. 빨간 화살표는 시공​​간 코드의 진화를 수행하기 위해 고정 된 기준점으로 사용된다. 성장하는 꾸불 꾸불 한 코드를 포함하는 꼬리 부분의 DIC 이미지 (컬러 카메라 장착 현미경) 박스형된다. 스케일 바 :. 100 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 식세포의 5 고갈이 증가 코드의 확산으로 이어집니다. (A) 배아는 리포 - 클로드 기반 절차 또는 모르 폴리 노 기반 절차를 사용하여 고갈된다. 배아 (상단 패널) 클로드 - 캡슐화 된 리포좀 (리포 - 클로드는) 24 HPF의 Tg (mCherry MPEG1)에 정맥 주입된다. 순환 내에서 리포 - 클로드 빠르게 이후의 사멸을 받아야 식세포에 의해 침몰된다. 모르 폴리 노의 준비 (왼쪽 아래 패널) 주입 노크 다운에 PU.1 유전자의 발현을 수정 된 Tg는 (MPEG1 : mCherry)에 제브라 피쉬 계란. (-). (오른쪽 아래 패널) 배아에서 대 식세포의 정확한 고갈 (BC) 30 HPF 식세포 함유 (+) 또는 대 식세포가 고갈 된 형광 현미경으로 확인한다 (리포 - 클로드 치료 다음) 배아 M.에 감염되어 tdTomato 표현 농양 R은 (백색 표시). (B) M.에 감염된 대 식세포 함유 또는 대 식세포가 고갈 된 배아의 (C) 생존 곡선 농양 R (N = 20). 3 개의 독립적 인 실험에서 대표적인 결과가 표시됩니다. 모든 이미지는 컬러 카메라에 연결된 현미경으로 인수했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6
M.와 로컬 또는 전신적 감염 배아에서 대 식세포의 그림 6. 행동 농양 (A) 48 HPF의 Tg (MPEG1 : mCherry). 제브라 피쉬 배아는 와사비 발현 M.와 근육 감염 농양 R. 라이브 imagi시각화하는 공 초점 현미경을 사용하여 NG는 (분 후 감​​염, MPI)에 개별 마이코 박테리아를 phagocytizing 대 식세포를 채용. (40X APO 물 0.8 NA 목표와 공 초점 현미경) 주사 부위에 대 식세포 (빨간색)의 강렬한 모집을 보여주는 최대 강도 투사. 스케일 바 : 20 μm의 (BC) 48 HPF의 Tg (MPEG1 : mCherry). 배아 정맥 M. 감염 사비 고정 4 HPI (B) 및도 3 dpi의 (C)에 초점 현미경 (40X)에 의해 촬상 된 발현 농양 R. (B) 대 식세포 (적색), 또는 기타 골수 세포, 아마 호중구 (화살표)의 최대 세기 투영 포함 (63X APO 오일 1.33 NA 목표와 공 초점 현미경) 주사 부위에 가까운 고립 된 마이코 박테리아 (녹색). 스케일 바 : 10 μm의 (C) 최대 강도 투사 코드 (녹색) (63X APO 오일 1.33 NA 목표와 공 초점 현미경을) phagocytize 할 수없는 하나의 대 식세포 (빨간색)를 표시합니다..스케일 바 :. 5 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

제브라 피쉬는 최근 실시간 (36)의 넓은 필드와 공 촛점 이미징을 사용하여 세균 감염의 역학을 공부하는 우수한 척추 동물 모델 시스템으로 떠오르고있다. 함께 마이크로 주입 방법 (프로토콜 4)와 분산 마이코 박테리아 현탁액 (프로토콜 2.2)의 조합은 재현 전신 감염, 후속 모니터링 및 호스트 식세포와 세균의 상호 작용에 특별한 초점을 맞춘 감염의 진행의 시각화 할 수 있습니다. 엠의 독성 생체 내 농양은 야생형 골든 지브라 피쉬 (37)의 사용 덕분에 조사 될 수있다. M. 사이의 상호 작용을 연구하는 19식세포를 시각화 : 농양 및 골수 세포를 호스트는 여러 형질 전환 지브라 피쉬 라인의 Tg (mCherry MPEG1) 등을 사용할 수있다. (38) 또는 Tg는 (lyz :을 DsRed) 39w :등의 Tg (GFP MPX) 등의 추가 유전자 변형 기자 라인i 번째의 어느 적색의 호중구 녹색, 각각, 또한 감염에 반응하여 이들의 과립구 특정 역할을 해결하기 위해 사용될 수있다.

M.의 농양, 특히 R 변이체, 따라서 재생 가능한 마이크로 인젝션을 방지 대규모 세균성 응집체를 형성하는 19 자연스러운 성향을 나타낸다. 또한, S 변이체보다 그 사실 R 변이체 형태 훨씬 큰 덩어리는 또한 두 동질 변형에 대한 병원성 표현형의 전위를 비교 배제한다. 제 2 항에 기재된 프로토콜은 균질 구하고 M. 분산 허용 배아에 미세 주입 농양 현탁액. 이 제제는 과도한 응집 특성을 표시하는 임의의 다른 미코 박테리아 종 또는 변이주에 적용될 수있다. 초음파 처리하는 단계는 최 미코 박테리아 세포벽 층을 변경할 수 있으므로주의가 E의 세균이 생존에 물리적 처리의 영향을 평가하기 위해 취해 져야한다새로운 변형을 ACH.

세균 부담의 결정은 일상적 프로토콜 6.1에 기술 된 바와 같이, 다양한 시점 후 감염에 선택적 한천 배지에 용해 배아를 도금 후 계산 CFU에 의존한다. 이 절차는 여러 제한 사항을 포함한다 : 동물을 안락사 때문에, 각각의 배아 (또는 배아의 그룹)이 단일 시점의 결정을 위해 사용될 수있다. 또한,이 방법에 의한 살해 중에 용해 및 / 또는 손실 된 박테리아 연속 희석액의 큰 비율로, 또는 응집에 의해 주로 부정확 남아있다. CFU를 계산하는 것은 힘든 작업입니다. 대안으로, 프로토콜 6.2 M.를 정량화 할 수있는 효율적인 방법을 기술 M. 위해 원래 개발 된 바와 같이, 화소 정량 감염 배아의 형광 이미지의 분석에 기초하여, 제한된 처리 단계, 농양 부담 marinum 40, 41. 입자의 분석에 기초하여,이 FPC 방법은, 상관 관계를 도시 wCFU의 countings 번째. 유사하게, 형광 현미경 및 정량화를 조합하여, 배아 당 선천성 면역 세포 수의 상대적인 변화는 적절한 트랜스 제닉 라인을 사용하여 이미지 분석에 의해 정량화 될 수있다.

제브라 피쉬 배아 악영향 M.에 응답하여 호스트의 생존에 영향을 미치는 것으로 밝혀졌다 감염 대 식세포 공핍 동안 면역 세포의 역할을 평가하기 위해 사용될 수있다 농양 감염. 특정 식세포 고갈 효율적의 Lipo-클로드 기반 프로 시저 (프로토콜 5.1) 또는 모르 폴리 노 - 기반 프로 시저 (프로토콜 5.2)를 사용하여 생성 될 수있다. 대 식세포의 존재가 확립 및 혈관계의 정정 배아 발달에 대한 유지 보수를 위해 매우 중요하기 때문에, 그럼에도 불구하고, 그것은의 Lipo-클로드로 네이트를 사용하여 HPF (24)에서 대 식세포를 생산 브레이션 권장된다.

제브라 피쉬 배아 M.를 연구 할 수있는 독특한 모델로 나타납니다 농양 감염과 extracell의 역할울라 면역 체계 파괴 전략으로 cording. 결정은 M.에 cording을 제어하는 경우 농양이 식별 될 수 있고, 그들은 혁신적인 치료법의 개발로 이어질 수있다. 혁신적인 높은 처리 기술 (42)와 함께 제브라 피쉬의 사용을 연결하면 신약 개발이 약제 내성 병원체에 대한 새로운 약물 학적 접근 방법에 필드를 엽니 다.

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Acknowledgments

저자는 도움이 토론에 대한 각각 tdTomato와 사비의 발현을 허용 pTEC27과 pTEC15의 관대 한 선물을 사러 - 클로드과 L. 라마 크리슈를 제공하는 케이 Kissa에 감사드립니다. 프랑스 국립 연구 기관의 프로젝트 (ZebraFlam ANR-10-MIDI-009과 DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) 및 유럽 공동체의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램의이 작품의 일부를 형성 (FP7-사람들-2011-ITN) 부여 계약에 따라 NO. PITN-GA-2011-289209 마리 퀴리 초기 교육 네트워크 FishForPharma합니다. 우리는 CM 듀폰에 자금을 지원하기위한 협회 그레고리 Lemarchal 및 Vaincre 라 Mucoviscidose (RF20130500835)을 감사하는 것이 좋겠다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BBL MGIT PANTA BD Biosciences 245114
Bovine Serum Albumin  Euromedex 04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver  Sigma-Aldrich C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar BD Biosciences 262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Oleic Acid Sigma-Aldrich O1008
Paraformaldehyde Delta Microscopie 15710
Phenol Red Sigma-Aldrich 319244
Tween 80 Sigma-Aldrich P4780
Agar Gibco Life Technologie 30391-023
Low melting agarose Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts  Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries  Sutter instrument Inc BF100-78-10 1 mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device  Sutter Instrument Inc Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector Tritech Research  Digital microINJECTOR, MINJ-D
Tweezers Sciences Tools inc Dumont # M5S 
Microloader Tips Eppendorf

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References

  1. Brown-Elliott, B. A., Wallace, R. J. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 716-746 (2002).
  2. Aitken, M. L., Limaye, A., et al. Respiratory outbreak of Mycobacterium abscessus subspecies massiliense in a lung transplant and cystic fibrosis center. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 185 (2), 231-232 (2012).
  3. Gilljam, M., Lindblad, A., Ridell, M., Wold, A. E., Welinder-Olsson, C. Molecular epidemiology of Mycobacterium abscessus, with focus on cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1497-1504 (2007).
  4. Roux, A. -L., Catherinot, E., et al. Multicenter study of prevalence of nontuberculous mycobacteria in patients with cystic fibrosis in France. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4124-4128 (2009).
  5. Lee, M. -R., Cheng, A., et al. CNS infections caused by Mycobacterium abscessus complex: clinical features and antimicrobial susceptibilities of isolates. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (1), 222-225 (2012).
  6. Talati, N. J., Rouphael, N., Kuppalli, K., Franco-Paredes, C. Spectrum of CNS disease caused by rapidly growing mycobacteria. The Lancet Infectious Diseases. 8 (6), 390-398 (2008).
  7. Medjahed, H., Gaillard, J. -L., Reyrat, J. -M. Mycobacterium abscessus: a new player in the mycobacterial field. Trends in Microbiology. 18 (3), 117-123 (2010).
  8. Griffith, D. E., Girard, W. M., Wallace, R. J. Clinical features of pulmonary disease caused by rapidly growing mycobacteria. An analysis of 154 patients. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1271-1278 (1993).
  9. Nessar, R., Cambau, E., Reyrat, J. M., Murray, A., Gicquel, B. Mycobacterium abscessus: a new antibiotic nightmare. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (4), 810-818 (2012).
  10. Sanguinetti, M., Ardito, F., et al. Fatal pulmonary infection due to multidrug-resistant Mycobacterium abscessus a patient with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 39 (2), 816-819 (2001).
  11. Griffith, D. E., Aksamit, T., et al. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 175 (4), 367-416 (2007).
  12. Howard, S. T., Rhoades, E., et al. Spontaneous reversion of Mycobacterium abscessus a smooth to a rough morphotype is associated with reduced expression of glycopeptidolipid and reacquisition of an invasive phenotype. Microbiology (Reading, England). 152 (Pt 6), 1581-1590 (2006).
  13. Chardi, A., Olivares, F., Byrd, T. F., Julián, E., Brambilla, C., Luquin, M. Demonstration of cord formation by rough Mycobacterium abscessus variants: implications for the clinical microbiology laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 49 (6), 2293-2295 (2011).
  14. Byrd, T. F., Lyons, C. R. Preliminary characterization of a Mycobacterium abscessus mutant in human and murine models of infection. Infection and Immunity. 67 (9), 4700-4707 (1999).
  15. Catherinot, E., Clarissou, J., et al. Hypervariance of a rough variant of the Mycobacterium abscessus type strain. Infection and Immunity. 75 (2), 1055-1058 (2007).
  16. Catherinot, E., Roux, A. -L., et al. Acute respiratory failure involving an R variant of Mycobacterium abscessus. Journal of Clinical Microbiology. 47 (1), 271-274 (2009).
  17. Bernut, A., Le Moigne, V., Lesne, T., Lutfalla, G., Herrmann, J. -L., Kremer, L. In vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium abscessus using the embryonic zebrafish test system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (7), 4054-4063 (2014).
  18. Oh, C. -T., Moon, C., Jeong, M. S., Kwon, S. -H., Jang, J. Drosophila melanogaster for Mycobacterium abscessus infection. Microbes and Infection / Institut Pasteur. 15 (12), 788-795 (2013).
  19. Bernut, A., Herrmann, J. -L., et al. Mycobacterium abscessus cording prevents phagocytosis and promotes abscess formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), E943-E952 (2014).
  20. Dubée, V., Bernut, A., et al. β-Lactamase inhibition by avibactam in Mycobacterium abscessus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (4), 1051-1058 (2015).
  21. Torraca, V., Masud, S., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Macrophage-pathogen interactions in infectious diseases: new therapeutic insights from the zebrafish host model. Disease Models Mechanisms. 7 (7), 785-797 (2014).
  22. Alibaud, L., Rombouts, Y., et al. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Molecular Microbiology. 80 (4), 919-934 (2011).
  23. Clay, H., Volkman, H. E., Ramakrishnan, L. Tumor necrosis factor signaling mediates resistance to mycobacteria by inhibiting bacterial growth and macrophage death. Immunity. 29 (2), 283-294 (2008).
  24. Palha, N., Guivel-Benhassine, F., et al. Real-time whole-body visualization of Chikungunya Virus infection and host interferon response in zebrafish. PLoS pathogens. 9 (9), e1003619 (2013).
  25. Mostowy, S., Boucontet, L., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS pathogens. 9 (9), e1003588 (2013).
  26. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10 (11), 2312-2325 (2008).
  27. Van der Sar, A. M., Appelmelk, B. J., Vandenbroucke-Grauls, C. M. J. E., Bitter, W. A star with stripes: zebrafish as an infection model. Trends in Microbiology. 12 (10), 451-457 (2004).
  28. Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O’Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infection and Immunity. 78 (4), 1495-1508 (2010).
  29. Levraud, J. -P., Disson, O., et al. Real-time observation of Listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infection and Immunity. 77 (9), 3651-3660 (2009).
  30. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
  31. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
  32. Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  33. Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 83-93 (1994).
  34. Adams, K. N., Takaki, K., et al. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145 (1), 39-53 (2011).
  35. Ramakrishnan, L. Looking within the zebrafish to understand the tuberculous granuloma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 783, 251-266 (2013).
  36. Davis, J. M., Clay, H., Lewis, J. L., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of Mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  37. Lamason, R. L., Mohideen, M. -A. P. K., et al. SLC24A5, a putative cation exchanger, affects pigmentation in zebrafish and humans. Science (New York, NY). 310 (5755), 1782-1786 (2005).
  38. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  39. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC developmental biology. 7, 42 (2007).
  40. Takaki, K., Davis, J. M., Winglee, K., Ramakrishnan, L. Evaluation of the pathogenesis and treatment of Mycobacterium marinum in zebrafish. Nature Protocols. 8 (6), 1114-1124 (2013).
  41. Stoop, E. J. M., Schipper, T., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Models Mechanisms. 4 (4), 526-536 (2011).
  42. Carvalho, R., de Sonneville, J., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PloS One. 6 (2), e16779 (2011).

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감염 문제 (103) 제브라 피쉬 감염 발병 기전 선천성 면역 대 식세포 마이크로 주입 형광 현미경 라이브 영상 cording.
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Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet, A., Herrmann, J. L., Lutfalla, G., Kremer, L. Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (103), e53130, doi:10.3791/53130 (2015).

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