Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Decifrar e Imagem Patogênese e Cording de Published: September 9, 2015 doi: 10.3791/53130
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 3, 1, 1,2
1Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques, CNRS, UMR 535, Université Montpellier, 2Centre d'études d'agents Pathogènes et Biotechnologies pour la Santé, CNRS, FRE 3689, Université Montpellier, 3Unité de Formation et de Recherche des Sciences de la Santé, EA3647-EPIM, Université Versailles St Quentin

Introduction

Mycobacterium abscessus é um agente patogénico emergente que faz com que um largo espectro de síndromes clínicos em seres humanos. Estes incluem infecções cutâneas, bem como infecções pulmonares crônicas graves, principalmente encontrados em imunocomprometidos e em pacientes com fibrose cística 1,2,3,4. M. abscessus também é considerado como um dos principais rápido crescimento espécies de micobactérias responsáveis ​​por infecções hospitalares e iatrogênica em seres humanos. Além disso, vários relatórios recentes em destaque a possibilidade de que M. abscessus pode atravessar a barreira sangue-cérebro e induzir lesões importantes no sistema nervoso central (SNC) 5,6. Apesar de ser um cultivador rápido, M. exposições abscessus também várias características patogênicas que estão relacionados com os do Mycobacterium tuberculosis, incluindo a capacidade de permanecer em silêncio durante anos dentro de estruturas granulomatosas e gerar lesões caseosas nos pulmões 7. Mais alarmante é a baixa sensensibili- de M. abscessus aos antibióticos, tornando estas infecções extremamente difícil de tratar levando a uma taxa de insucesso terapêutico significativo 8,9. A ameaça importante desta espécie é principalmente a sua resistência intrínseca a antibióticos, que é de grande preocupação em instituições de saúde públicas 10 e uma contra-indicação para transplante pulmonar 11.

M. abscessus exibe lisas (S) ou ásperas morfotipos (R) da colônia que levam a desfechos clínicos diferentes. Em contraste com a estirpe S, R bactérias têm uma tendência para crescer uma extremidade à outra, levando a uma corda ou cabo, como a estrutura 12,13. Vários estudos independentes com base em modelos celulares e animais seja revelado o fenótipo hiper-virulência do morfotipo R 14,15. A partir de estudos epidemiológicos, os casos mais graves de M. infecções pulmonares abscessus parecem estar associados com R 16 variantes que são a única variante quetem sido visto a persistir por anos em um hospedeiro infectado 3. A diferença morfotipo depende da presença (em S) ou perda (em R $) de glycopeptidolipids associada de superfície (GPL) 12. No entanto, devido às limitações inerentes dos modelos celulares / animais actualmente disponíveis utilizados para estudar M. infecção abscessus, o nosso conhecimento sobre os eventos fisiopatológicos das variantes R ou S permanece obscura. A infecção de ratos imuno-competentes através de via intravenosa ou aerossóis conduz à colonização transiente, o que dificulta a utilização de ratos para estudar infecções persistentes e in vivo para os testes de susceptibilidade droga 17. Por conseguinte, o desenvolvimento de modelos animais susceptíveis à manipulação da resposta do hospedeiro é um grande desafio. Neste contexto, os modelos não-mamíferos de infecção foram recentemente desenvolvidos, incluindo Drosophila melanogaster 18 que oferece várias vantagens, tais como custos, velocidade e ética o aceitabilidadeVer o modelo de mouse. O modelo de peixe-zebra (Danio rerio) de infecção também tem sido explorada para visualizar, por imagem não-invasivo, a progressão e cronologia da M. abscessus infecção em um animal vivo 19. Importante, uma prova de conceito também foi criado para demonstrar a sua aptidão para avaliações in vivo de antibióticos contra M. abscessus 17,20.

O peixe-zebra têm sido amplamente utilizados durante as duas últimas décadas para estudar as interacções entre vários agentes patogénicos e o sistema imune do hospedeiro 21. O crescente sucesso deste modelo vertebrado alternativa depende de grandes e únicas oportunidades que motivaram e validados a sua utilização para uma melhor compreensão das inúmeras infecções virais e bacterianas 19,22,23,24,25,26,27,28,29. Ao contrário da maioria dos outros modelos animais, embriões de peixe-zebra são opticamente transparentes, permitindo que imagens de fluorescência não-invasivo 30. Esta has levou a estudar M. abscessus infectado embriões de peixe-zebra com detalhes sem precedentes, culminando com a descrição dos cordões extracelular, que representam um exemplo de plasticidade morfológica bacteriana. Cordões representa um novo mecanismo de subverter o sistema imunitário e um mecanismo de chave promover patogénese de M. aguda infecção abscessus 19.

Este relatório descreve novas ferramentas e métodos que utilizam o embrião de peixe-zebra para decifrar os traços fisiopatológicos da M. abscessus infecção e para estudar as interacções entre os bacilos íntimas e do sistema imune inato. Em primeiro lugar, um protocolo detalhado microinjecção que inclui o processamento do inoculo bacteriano, preparação de embriões, e infecção por si só, é apresentada. Métodos especificamente adaptado para avaliar M. virulência abscessus medindo vários parâmetros, tais como a sobrevivência do hospedeiro e a carga bacteriana, são apresentados. É dado especial relevo sobre comopara monitorar, a um nível de espaço-temporal, o destino e a progressão da infecção e da resposta imune do hospedeiro a M. abscessus usando microscopia de vídeo. Além disso, para investigar a contribuição eo papel dos macrófagos durante M. abscessus infecção, métodos para gerar macrófagos-empobrecido embriões (usando abordagens quer genetically- ou baseados em quimicamente) são descritos. Finalmente, os protocolos para visualizar as interações específicas com macrófagos ou neutrófilos seja utilizando embriões fixos ou vivem são documentados.

O objetivo deste relatório é estimular novos estudos para lançar uma nova luz em M. mecanismos de virulência abscessus e particularmente o papel de cordões no estabelecimento de um processo de infecção aguda e descontrolada.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Procedimentos experimentais de peixes-zebra deve cumprir os regulamentos institucionais e governamentais relevantes. Para o presente estudo, as experiências de peixe-zebra foram feitas na Universidade Montpellier, de acordo com as orientações da União Europeia para o manuseio de animais de laboratório (http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm) e aprovado sob a referência CEEA-LR-13007.

1. Preparação dos Reagentes e Equipamento Microinjeção

  1. Prepare peixes de água por dissolução de 0,06 g de sal do mar Instant Ocean em 1 L de água destilada 31, em seguida, autoclave para esterilizar (120 ° C por 20 min) e armazenar a 28,5 ° C por até 1 mês.
  2. Preparar a solução de azul de metileno por dissolução de 1 g de azul de metileno em 1 L de água destilada. Adicione 300 ml de solução de azul de metileno em 1 L de peixes de água para obter água azul peixes, então autoclave para esterilizar e armazenar a 28,5 ° C por até 1 mês.
    NOTA: O additiem de azul de metileno em água peixe impede o crescimento de fungos.
  3. Preparação de Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS)
    1. Prepara-se uma solução estoque de 10 X PBS por dissolução de 5,696 g de Na 2 HPO 4, 680 mg de KH 2 PO 4, 969 mg de KCl e 78,894 g de NaCl em 1 L de água destilada e ajustar o pH para 7,0 com HCl. Para obter 1 X PBS, dilui-se 100 ml da solução de 10 x PBS, em 900 ml de água destilada e em autoclave durante 20 min a 120 ° C para se esterilizar.
    2. Adicionar 0,05% de Tween 80 para se obter 1 X PBST e armazenar a temperatura ambiente durante até 1 ano.
  4. Prepare ácido oleico Dextrose Catalase (OADC) enriquecimento por dissolução de 8,5 g de NaCl, 50 g de Albumina de Soro Bovino, 20 g de D-glucose, 40 mg de catalase de fígado de bovino e 0,5 g de ácido oleico em 1 L de água destilada, em seguida, filtrar esterilizar a solução e armazená-lo a 4 ° C durante até 6 meses.
  5. Preparação de 100 ml de ácido metanossulfónico acetato de 3-aminobenzoato de metilo (tricaina) da solução, por dissolução de 400 mg tricaine pó em 97,9 ml de água destilada. Adicionar 2,1 ml de Tris 1 M (pH 9) para ajustar o pH a 7,0 e armazenar a solução a -20 ° C.
  6. Prepare as agulhas de injeção microcapilar puxando capilares de vidro de borosilicato (1mm OD X 0,78 milímetros ID) usando um dispositivo micropipeta extrator com as seguintes configurações: pressão de ar de 650; Aquecer 999; Puxe 50; Velocity 80; Tempo 200.
  7. Preparar uma solução agar 1,5% na água azul peixe e despeje 25 ml de agar derretido em 100 mm placas de petri. Na parte superior do agar derretido, colocar moldes caseiros, a fim de imprimir canais específicos. "V" -shaped canais são usados ​​para embriões posição, enquanto o "U" em forma de ovos são utilizados para (Figura 1) 31. Uma vez solidificado, retire cuidadosamente a marca.
    NOTA: Cubra o agar com água azul de peixes para evitar a desidratação e armazenar a 4 ° C por até 2 meses.

Figura 1 Figura 1. câmaras de posicionamento para injecções de peixe-zebra. (A) canais em forma de U para ovos (painel esquerdo) e canais em forma de V para embriões (painel direito). Ovos de peixe-zebra / embriões são colocados nos canais e alinhadas ao longo do mesmo eixo. Câmaras (B) Visualização para observação microscópica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Preparação e armazenamento do M. abscessus inóculo

  1. M. condições de crescimento abscessus
    1. Placa out M. abscessus a partir de um estoque de -80 ° C em glicerol agar Middlebrook 7H10 uma contendo 10% de OADC e 0,5% de glicerol (7H10 OADC) e suplementado com o antibiótico apropriado, dependendo do marcador de resistência transportado pelo vector que codifica a proteína fluorescente. Incubar as placasa 30 ° C durante 4-5 dias.
    2. Pegue uma colônia micobactérias fluorescência positivo e inocular 1 ml de caldo Middlebrook 7H9 suplementado com OADC, 0,2% de glicerol, 0,05% Tween 80 (7H9 OADC / T) com o antibiótico necessário em um tubo de 15 ml de plástico estéril. Incubar a 30 ° C durante 1 semana sem agitação.
      NOTA: Tween 80 restringe aglomeração e agregação bacteriana.
    3. Ressuspender o pré-cultura obtida em 2.1.2 em 50 mL de meio Middlebrook 7H9 OADC / T de 150 cm 2 frascos de cultura de tecidos para uma final de 0,1 OD 600 (correspondente a cerca de 5,10 7 bactérias / ml) e incubar ainda mais a 30 ° C durante 4 dias para se obter uma cultura exponencial de crescimento (OD600 = 0,6 a 0,8).
      NOTA: Para minimizar a aglomeração, especialmente da variante áspero, incubação não deve exceder 5 dias. Ambas as variantes lisas e ásperas apresentar uma taxa de crescimento semelhante.
  2. Preparação do M. inóculos abscessus60;
    NOTA: Devido a alta propensão de áspero M. abscessus para formar grandes agregados e para produzir cordas, um tratamento específico é necessário para gerar inóculos homogénea e quantitativamente controlada antes microinjections nos embriões. Este tratamento também é aplicado para suavizar as bactérias que produzem agregados, embora em menor grau do que a estirpe rugosa.
    1. Colheita culturas crescendo exponencialmente a partir de 150 cm 2 frascos de cultura de tecido por centrifugação a 4 000 x g durante 15 min à temperatura ambiente num tubo de plástico de 50 ml estéril e ressuspender o sedimento de bactérias em 1 ml de 7H9 OADC / T. Alíquota de 200 ul de suspensões bacterianas em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
      NOTA: Trabalhando com pequenos volumes em seringas de 1 ml é necessário obter suspensões altamente homogêneos.
    2. Homogeneizar as suspensões bacterianas com uma agulha 26 G (15 up-and-down sequências), sonicar três vezes durante 10 segundos (com 10 intervalos entre cada sec sonicação SEquência) usando um sonicador de banho de água. Adicionar 1 ml de 7H9 OADC / T e vortex brevemente. Centrifugar 3 min a 100 x g.
    3. Recolher cuidadosamente os sobrenadantes contendo micobactérias para evitar as aglomerações e concentrem as suspensões homogêneas em um tubo de 50 ml de plástico estéril.
    4. Verifique visualmente quanto à presença de eventuais agregados bacterianos remanescentes.
      NOTA: Se agregados ainda estão presentes, proceder a uma etapa de centrifugação adicional a 100 xg por 2 min, e recolher o sobrenadante.
    5. Centrifugar a suspensão a 4000 xg durante 5 min, ressuspender o sedimento em 200 ul 7H9 OADC / T e proceder à injecção.
    6. Avaliar a concentração bacteriana final, por plaqueamento de diluições em série (1 x em PBST) em ágar 7H10 OADC e contagem de unidades formadoras de colónias (CFU) após 4 dias de incubação a 30 ° C. UFC deve ser determinado para cada novo lote.
    7. Preparar inóculos stocks congelados, armazenando 5 mL alíquotas a -80 & #176; C.
      NOTA: A avaliação CFU dos -80 ° C aliquotas congeladas é um pré-requisito para determinar o número exacto de bactérias viáveis ​​como congelamento / descongelamento podem afectar a viabilidade bacteriana do inoculo. Estes inóculos congelados estão prontos para serem utilizados para injecções subsequentes. Uma vez que todas as alíquotas contêm o mesmo número de CFU, que permitem a injecção de bactérias de forma reprodutível a partir de uma experiência para outra.
  3. Inóculo de controlo de qualidade
    NOTA: a coloração de Ziehl-Neelsen (específicos para micobactérias) pode ser utilizado para comparar a qualidade das suspensões bacterianas antes e após os procedimentos de homogeneização descritos em 2.2.
    1. Spot e espalhar-se uma gota da suspensão bacteriana homogeneizada sobre uma lâmina de vidro e deixe-o secar completamente, fixar o esfregaço por pelo menos 30 min em uma placa quente a 65-70 ° C e mancha usando um protocolo de coloração de Ziehl-Neelsen .
    2. Observe a mancha bacteriana com um microscópio usando um 100Objectivo X e comparar com um esfregaço de uma suspensão não-processado bacteriano (Figura 2).

Figura 2
Figura 2. Preparação de disperso M. inóculos abscessus. Ziehl-Neelsen de R ou S variantes cultivadas em meio de caldo, antes de qualquer tratamento (painéis superiores) ou após o tratamento (painéis inferiores) para reduzir o tamanho e o número de agregados de micobactérias (etapas sucessivas de syringing, sonicação e decantação) . As bactérias foram observadas utilizando um microscópio com 100 X de óleo 1.4 NA objetivo APO). Barras de escala:. 20 um favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Preparar embriões Zebrafish

  1. Desova e coleta de ovos de peixe-zebra
    1. Um dia antes de spenhor, raça adulto peixe-zebra, colocando 2 machos e 1 fêmea (geralmente uma proporção de 2: 1 permite uma taxa de fertilização óptima) para uma câmara de criação de animais, que consiste de um tanque de peixe separada com um cesto de recolha 31 de ovo.
      NOTA: cestas de coleta de ovos são utilizados para proteger os ovos de ser comido pelos pais e facilitar a colheita de ovos.
    2. Em 1 hpf, ovos e embriões de colheita única devidamente desenvolvidas em um prato de 100 milímetros Petri cheio com 25 ml azul peixes de água (no máximo 100 embriões por placa) e mantê-los em 28,5 ° C. Ovos não-fertilizados são descartados.
  2. Preparação de embriões de peixes-zebra para injecções
    1. Por volta das 24 horas pós-fecundação (hpf), dechorionate os embriões com uma pinça fina em um prato de 100 milímetros Petri e mantê-los a 28,5 ° C.
    2. Recolher os 30-48 embriões HPF utilizando uma pipeta e transferi-los para um "V" em forma de câmara de posicionamento preenchido com 25 mL de água de peixe contendo 270 mg / L tricaina.Coloque os embriões corretamente nos canais usando uma ferramenta de ponta microloader caseiro (ponta carregador micro caseiro cortada) otimizado para uma micro-manipulação mais fácil.
      NOTA: Orientar o lado dorsal para baixo para injeções intravenosas na veia caudal ou o lado dorsal para cima para injeções musculares cauda.

4. Micro-injecção Procedimento

NOTA: O procedimento de micro-injecção para M. abscessus é semelhante à descrita anteriormente para o M. marinum injeções 32. Para avaliar a cronologia do M. abscessus infecção (sobrevivência, cargas bacterianas, e as características da cinética de infecção), são preferidas as injecções na veia da cauda de 30 hpf embriões. Para visualizar o recrutamento de células imunes, as injeções são feitas em sites localizados tais como é nos músculos da cauda em 48 hpf embrião.

  1. Dilui-se o inoculo por micobactérias em 1 X PBST (dependendo do número de CFU paraser administrada como determinado no passo 2.2.6), contendo 10% de vermelho de fenol para verificar uma injecção adequada.
  2. Carregar uma agulha de injecção microcapilar com 5-10 ul do inoculo bacteriano utilizando uma ponta de microloader, ligar-se a agulha de microinjecção no suporte do micromanipulador tridimensional ligado ao injector e cortar a parte superior da agulha com uma pinça fina para obter um abertura de diâmetro de 5-10 | im.
  3. Calibra-se o volume de injecção através do ajuste da pressão microinjecção (20-50 hPa) e tempo (0,2 seg).
    NOTA: O volume de injecção necessária é calibrado por determinação visual do diâmetro de uma gota expelido para a gema de um embrião.
  4. Para injecção na veia caudal, posicionar o embrião com o lado ventral de frente para a agulha (como descrito na secção 3.2.2) e colocar a ponta da agulha perto da abertura urogenital, direccionamento da veia caudal, e empurrar suavemente a ponta da agulha para dentro do embrião até que ela só perfura a CAUDregião veia ai. Entregar o volume desejado da preparação bacteriana, geralmente 1-3 nl contendo cerca de 100 CFU / nl.
  5. Para injecção intramuscular, posicione o embrião com o lado dorsal de frente para a agulha (como no ponto 3.2.2), coloque a agulha sobre uma somite e injetar um volume pequeno (1 nl) de inóculo.
    NOTA: Quanto a injeções veia caudal, infecções intramusculares também são um desafio para executar. Cuidados devem ser tomados para evitar uma sobrecarga que pode lesar os tecidos circundantes.
  6. No final do procedimento de injecção, controlar o tamanho do inoculo através da injecção do mesmo volume de suspensão bacteriana numa gota de PBST estéril seguido por plaqueamento em 7H10 OADC e contagem de CFU. Cerca de 100 embriões podem ser injectadas com uma agulha.
    NOTA: Devido áspero M. abscessus podem continuar a formar agregados na agulha, injecções necessitam de ser feito imediatamente após a preparação do inoculo.
  7. Transfira os fis infectadosh placas individualmente em 24 poços contendo 2 ml / poço de água de peixe e incuba-se a 28,5 ° C. Os embriões injectados com 1-3 nl PBST 1 X podem ser utilizados como controlos.
  8. Adequado da infecção de bactérias fluorescentes em embriões é monitorizada utilizando um microscópio de fluorescência.

5. Geração de Macrófagos depletados Embriões

NOTA: a depleção selectiva de macrófagos de tecidos é usado para investigar o seu contributo eo papel durante a infecção. Para visualizar a depleção de macrófagos apropriada, é recomendado o uso de uma linha transgénica com macrófagos fluorescentes, onde mCherry é especificamente expresso sob o controlo do promotor específico de macrófago MPEG1 19.

  1. Procedimento baseado em Lipo-clodronate
    NOTA: O procedimento de lipo-clodronate permite uma depleção seletiva de macrófagos de tecidos (mas não os neutrófilos) 19. Este composto não altera a sobrevivência de embriões nem affect a integridade das bactérias. Um protocolo detalhado para preparar clodronato encapsulada em lipossomas tem sido relatado previamente 33.
    1. Aos 24 hpf, dechorionate os embriões e transferi-los para um "V" em forma de prato de injecção cheia de água de peixe complementado com tricaina para manter os embriões em um estado anestesiado até o final do procedimento de injecção, tal como descrito em 3.2.2. Orientar o lado dorsal para baixo.
    2. Carregar uma agulha de injecção microcapilar com encapsulada em lipossomas clodronato (lipo-clodronato), ligar-se a agulha de microinjecção no suporte do micromanipulador tridimensional e cortar a parte superior da agulha com uma pinça fina para obter um diâmetro de 10 um de abertura da ponta.
    3. Para calibrar o volume de injecção, microinjecção ajustar a pressão a 20 hPa e o tempo de injecção para 0,2 seg. Coloque a ponta da agulha perto da abertura urogenital, visando a veia caudal, e empurre a ponta da agulha noembrião até que apenas penetra a região veia caudal e entregar o volume desejado de solução (2-3 nl, 3 vezes).
      NOTA: A suspensão de lipo-clodronato é muito pegajoso e devem ser agitadas antes da injecção para evitar o bloqueio do sistema vascular e morte do embrião. É fundamental proceder a várias injecções sucessivas de pequenos volumes.
    4. Transferir os embriões em placas de 100 mm de petri contendo água de peixe e mantê-los em 28.5 ° C até que a infecção.
    5. Controlar a depleção adequada de macrófagos por microscopia fluorescente.
      NOTA: a depleção de macrófagos completa é eficaz durante 4 dias após a administração lipo-clodoronate.
  2. Procedimento baseia-morfolino
    1. O dia antes da desova, raça adulto peixe-zebra, colocando 2 machos e 1 fêmea separadas por uma barreira de plástico numa câmara de criação.
    2. No dia seguinte, ≈ 30 min depois que a luz acende-se na instalação de peixe-zebra, remover a barreira de separaçãomachos e fêmeas. Aguarde cerca de 20 minutos após o início da desova para otimizar a taxa de fertilização. Colher os ovos e retardar seu desenvolvimento, transferindo-os em uma placa de Petri 100 milímetros cheio de água peixe azul frio (4 ° C).
      NOTA: O controlo da desova é crucial para as experiências baseadas em morpholinos. Morpholinos só pode ser injetado nos ovos até à fase quatro células.
    3. Recolher os ovos usando uma pipeta e depositar os ovos para baixo no "U" de injecção de câmara em forma de enchido com água fria peixe azul e bloquear os ovos nos canais usando uma ferramenta de ponta microloader caseiro.
    4. Preparar a solução de PU.1 morfolino que contém 10% de vermelho de fenol, tal como previamente descrito 19. Carregar uma agulha de injecção microcapilar com a preparação morfolino e ligar-se a agulha de microinjecção no suporte do micromanipulador tridimensional, em seguida, romper a ponta da agulha com uma pinça fina para obtina abertura da ponta diâmetro de 5-10 mm.
    5. Para calibrar o volume de injecção, ajustar a pressão microinjecção 20-50 hPa, e o tempo de injecção para 0,2 seg. Coloque a ponta da agulha perto do ovo e empurre a ponta da agulha através da chorion no ovo e entregar o volume da solução morfolino desejado, tipicamente 3-5 nl.
    6. Após micro-injecção, transferência dos ovos numa placa de Petri de 100 mm em água de peixe e incuba-se a 28,5 ° C até que o processo de infecção começa.
    7. Analisar o bom (completo) depleção de macrófagos em morphants PU.1 por microscopia fluorescente em 30 a 48 hpf..
      NOTA: Dependendo da concentração injetada, morpholinos p U.1 também pode afetar o número de início de neutrófilos. Para confirmar a adequada depleção de macrófagos, sem alteração do número de neutrófilos, é recomendado o uso de uma linha de peixes-zebra transgénicos com dupla fluorescentes macrófagos e neutrófilos (com GFPespecificamente a expressão conduzida pelo promotor MPX) 19.

6. A quantificação bacteriana Burden

  1. Determinação por CFU enumeração
    1. No ponto de tempo desejado, os grupos de recolher embriões infectados (5 por condições) em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml (1 embrião / tubo), Cryo-anestesiar os embriões por incubação em gelo durante 10 min e a eutanásia através de uma dose excessiva (entre 300 e tricaina 500 mg / L)
    2. Lavar os embriões com água esterilizada, duas vezes e, dispensar-se em um novo tubo, lisam cada embrião com 2% de Triton X-100 diluído em PBST, 1 X usando uma agulha 26 G e homogeneizar a suspensão até lise completa. Centrifugar a suspensão e ressuspender o sedimento em 1 X PBST com 0,05% de Tween 80. As diluições em série do homogeneizado são colocadas em meio Middlebrook 7H10 suplementado com OADC e BBL MGIT PANTA, tal como recomendado pelo fornecedor.
      NOTA: M. abscessus sendo mais suscetíveis a NaOH treatment de M. marinum, descontaminação de lisados ​​de peixe sem afetar M. abscessus crescimento pode ser conseguido com sucesso utilizando o cocktail de antibióticos BBL MGIT PANTA.
    3. Incubar as placas durante 4 dias a 30 ° C e a contagem de colónias.
  2. Determinação por Fluorescência Pixel Contagem medições (FPC) em embriões vivos
    NOTA: Para determinar as cargas bacterianas através de emissão de fluorescência, as imagens seriadas de embriões infectados são adquiridos e intensidade de fluorescência medido pela CPE (identificação de bactérias por análise de partículas) usando um macro caseiro desenvolvido para o ImageJ gratuito. Uma análise de partículas requer uma imagem binária a preto e branco que se baseia em uma gama limiar que permite discriminar o sinal fluorescente de interesse a partir do fundo.
    1. No ponto de tempo desejado, tricain-anestesiar embriões infectados (5-10 por condição) em placas de petri de 35 mm, como descrito em 3.2.2.
    2. Retire a água e submerge os embriões e a superfície prato inteiro com 1% de baixo ponto de fusão agarose em água de peixe, em seguida, alinhe lateralmente os embriões. Cubra a agarose solidificada com água contendo peixes tricaina.
    3. Adquirir imagens de fluorescência de todo o embrião usando um microscópio de epifluorescência, com uma objectiva 10 x.
      NOTA: A aquisição de imagem de fluorescência é uma etapa crítica do processo de medições FPC. É importante usar um monitor calibrado com uma sonda de calibração de cores. Ajustando o tempo de exposição óptima para se obter um fundo mínimo durante a aquisição impede a saturação do sinal. As imagens devem estar em formato TIFF de 8 bits. Configurações idênticas são mantidos durante todo o experimento para fins quantitativos.
    4. Remova cuidadosamente a agarose dos embriões com uma ferramenta de ponta microloader caseiro. Estes embriões podem ser utilizados para análises posteriores se necessário. Antes da quantificação da carga bacteriana, cada imagem deve ser de qualidade controlada. Para umnalyze as imagens e converter a intensidade de fluorescência em FPC por peixes, abrir o freeware ImageJ.
      NOTA: O valor FPC reflete a carga bacteriana, como mostrado anteriormente usando M. marinum 34.
    5. Determinar o limiar requerido para análise de imagem utilizando uma imagem de um embrião não infectado (vários embriões de controlo pode ser usado para obter um limiar médio). Vá a Image → Ajustar → Limite e, em seguida, mova o controle deslizante inferior na janela do limiar para a direita até que o fundo torna-se completamente preta (ou seja, para obter um fundo deve ser de zero). Grave o valor correspondente.
    6. Dentro Imagem J, abra a macro FPC (arquivo suplementar) e siga as instruções: localize a pasta de imagens a ser medido e, em seguida, entrar no limiar como previamente determinado e clique em "OK".
      NOTA: A macro subtrai automaticamente o fundo. Um limiar é então aplicada. Sinais fluorescentes são identicadas na sequência da análise de partículas.
    7. Copie e cole os dados da janela de resumo para o software desejado para a análise de dados.
      NOTA: Em contraste com o método de determinação de CFU, o método FPC é não-invasivo e permite a re-utilizar os embriões para análises posteriores e, sobretudo, monitoramento da dinâmica / cinética da carga bacteriana em uma base individual. É, portanto, permite reduzir significativamente o número de animais, de acordo com regras éticas.

7. Criação de Imagens M. Os embriões infectados abscessus-

  1. Imagens ao vivo de M. infecção abscessus
    1. Montagem embriões anestesiados-tricaina (ver 3.2.2) em 1% baixo ponto de fusão agarose em uma placa de Petri 35 milímetros antes de observações de microscopia de epifluorescência. Use um prato fundo de vidro para microscopia confocal invertido ou em um único slide depressão cavidade para microscopia confocal vertical. Orientar o embrião para a posição desejada e a tampaa agarose solidificada com água contendo peixes tricaina.
    2. Use um microscópio de epifluorescência, com um objectivo de 10 X para aquisição e de transmissão de fluorescência imagens seqüenciais de todo o embrião. Em alternativa, usar um microscópio confocal com 40X ou 63X objectivos para visualizar a actividade de células imunitárias após uma infecção.
  2. Imagem fixa M. abscessus embriões infectados
    1. Eutanásia os embriões como descrito em 6.1.1 e transferi-los para tubos de 1,5 ml de micro-centrífuga e fixar os embriões em 4% de paraformaldeído em 1 X PBST durante 2 h à TA ou O / N a 4 ° C. Remover paraformaldeído por lavagem dos embriões duas vezes com 1 X PBST, durante 10 min.
      NOTA: Para preservar fluorescência, embriões fixos devem ser protegidos da luz.
    2. Para preservar a integridade dos tecidos e de fluorescência, os embriões foram incubados sucessivamente crescente em soluções de concentração de glicerol (10, 20, 30, 40 e 50% diluído em PBST, 1 X), para10 min por condição.
      NOTA: Fixa embriões podem ser armazenados durante vários meses em glicerol a 50% a 4 ° C.
    3. Deite o embrião incorporado em 50% de glicerol em uma câmara de visionamento (Figura 1B) 31.
    4. Imagem usando 40X ou 63X objetivos em um microscópio confocal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Apesar de vários sítios anatômicos podem ser injetados 32, injeções veia caudal são muitas vezes utilizados para gerar infecção sistêmica para análises posteriores, incluindo experiências de sobrevivência, determinação carga bacteriana, atividade fagocitose ou a formação do cordão umbilical. As injecções nos músculos da cauda são usados ​​para avaliar o recrutamento de macrófagos no local da injecção (Figura 3A). Para investigar e comparar a virulência de R e S variantes de M. abscessus, suspensões bacterianas fluorescentes são injectados na veia caudal de 30 embriões HPF (Figura 3A) 19. Em contraste com a variante de S, R morfotipo induz uma infecção mais robusta e letal em embriões de peixe-zebra (Figura 3B), caracterizado por o rápido desenvolvimento de abcessos bacterianos dentro do sistema nervoso central (SNC) (Figura 3C). Injeções sistêmicas com tanto a variantes S e R levar a infecções do SNC e diferença emA patologia e fenótipos de virulência pode ser quantificada quer por observação de microscopia de fluorescência (Figura 3C), o enumerando CFU por peixe (Figura 3D) ou por determinação do CPE de imagens adquiridas (Figura 3E). Importante, UFC e determinação FPC estão correlacionados e apontam para maiores cargas bacterianas para a estirpe R do que a estirpe S a 3 e 5 dpi. No geral, estes resultados suportam fortemente peixe-zebra como um modelo relevante e não-invasiva de infecção para estudar a cronologia do processo de infecção.

Talvez uma das características mais espectaculares foi revelado por microscopia de vídeo que permite a visualização cabos serpentina dentro do SNC de embriões infectados com a variante I (Figura 4). Graças à transparência óptica dos embriões, a cinética de formação de R-cabo pode ser monitorizada e trabalhada de um modo não-invasivo, que ilustra a alta propensão da variante R para replicar extracellularly. Esta taxa de replicação não controlada, combinado com a destruição celular / tecido provoca rapidamente o desenvolvimento de abcessos e em última instância a morte das larvas.

Os macrófagos são conhecidos por desempenhar um papel importante durante a infecção por micobactérias e, em particular por dirigir a formação de granulomas 35. Duas estratégias complementares podem ser usadas para estudar M. crescimento abscessus / virulência em embriões com depleção de macrófagos: os procedimentos baseados morfolino lipo-clodronate- e (Figura 5A). A infecção de embriões com depleção de macrófagos com a variante R conduz a um aumento maciço nas cargas bacterianas e produção de cabos como revelado por vídeo-microscopia (Figura 5B), levando a extremamente rápida morte (100% embriões mortos em três dpi; Figura 5C) . Isto indica claramente que os macrófagos são necessários para controlar M. abscessus infecção.

Para investigar adicionalmente o papel dos macrófagosdurante a infecção, os embriões transgénicos albergando macrófagos específicos fluorescentes vermelhas (MPEG1: mCherry) pode ser usado 19. A injecção de M. abscessus expressando Tempero no músculo da cauda ou na veia caudal induz uma acentuada do recrutamento de células mielóides, principalmente macrófagos, no local da infecção. Este recrutamento leva a fagocitose eficaz de bactérias individuais (Figura 6A-6B). Apesar da presença de macrófagos, microscopia confocal revela o aparecimento de grandes cabos bacterianas que os macrófagos não pode fagocitam (Figura 6C). Tomados em conjunto, estes resultados destacam um novo mecanismo de evasão imune baseada no papel dos cordões na prevenção de fagocitose de micobactérias.

Figura 3
Figura 3. M. infecção abscessus em embriões de peixe-zebra. (A) (painel superior) infecção intravenosa realizada por injecção de M. fluorescente abscessus (mostrado em branco) na veia caudal (seta 1), para a abertura posterior urogenital, em 30 hpf embriões. (Painel inferior) infecção intramuscular realizada por injecção de micobactérias fluorescente (mostrado em branco) no músculo da cauda durante um somito (seta 2), em 48 hpf embriões. (SER) 30 hpf embriões intravenosamente infectados com M. tdTomato- abscessus (R e variantes s). (B) Curvas de sobrevivência de embriões infectados com ≈ 300 CFU R ou S variantes ou injectados com PBS controlos (n = 20). Os resultados representativos de três experiências independentes são apresentados. (C) visualização espacial e temporal da quer a R ou S expressando a variante tdTomato (branco) a vários tempos pós-infecção aponta realizado por imagiologia de fluorescência vivo. Para cada cepa, a fluorescência e transmissão sobreposição representante de embriões infectados integrais é sho WN. Os mesmos embriões foram fotografadas em 3 e 5 dpi. (DE) cargas bacteriana dentro embriões infectados com R ou S variantes (Å 200 CFU) determinados por CFU contagem (D) ou medições FPC (E). (D) CFU de lisado de embriões individuais em vários pontos de tempo após a infecção determinada por plaqueamento em meio Middlebrook 7H10 suplementado com OADC BBL MGIT PANTA. Os resultados são expressos como média ± DP log (barras horizontais) CFU por embrião a partir de três experiências independentes (n = 5). Medições (E) FPC a partir de embriões vivos individuais em vários pontos de tempo após a infecção com base na análise das partículas utilizando o ImageJ. Os resultados são expressos como média ± DP log (barras horizontais) FPC por embrião a partir de três experiências independentes (n = 5). Todas as imagens foram obtidas em microscópio de epifluorescência equipado com uma câmera de cor digital. t = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
30 Figura 4. HPF in vivo cordões da variante R. Embriões infectados por via intravenosa com a variante de R M. abscessus e fotografada em vários pontos de tempo após a infecção para visualizar a progressão de formação de cordão. A seta vermelha é utilizado como um ponto de referência fixo, a fim de seguir a evolução espaço-temporal do cabo. As imagens DIC da parte da cauda contendo a crescente cabo de serpentina está encaixotado (microscópio equipado com uma câmera de cor). Barras de escala:. 100 mm Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

0 / 53130fig5.jpg "/>
Figura 5. O esgotamento dos macrófagos conduz a um aumento da proliferação cabo. (A) Os embriões são esgotados usando o procedimento de lipo-clodronato-base ou o processo à base de morfolino. (Painel superior) lipossomas-encapsulada clodronato (lipo-clodronate) são injectados por via intravenosa em 24 hpf Tg (mpeg1: mCherry) embriões. Dentro da circulação, lipo-clodronato é rapidamente engolido por macrófagos que se submetem a apoptose subsequente. (Esquerda inferior do painel) Injeção da preparação morfolino para knock-down a expressão do gene PU.1 em fertilizado Tg (mpeg1: mCherry) ovos de peixe-zebra. (Direito-down painel) O esgotamento correto de macrófagos em embriões é verificada por microscopia de fluorescência (BC) 30 hpf contendo macrófagos (+) ou depleção de macrófagos. (-) Embriões (após o tratamento lipo-clodronate) estão infectadas com M. abscessus R expressando tdTomato (mostrado em branco). (B) curvas (C) de sobrevivência dos embriões empobrecido macrófagos contendo macrófagos ou infectadas com M. ≈300 CFU abscessus R (n = 20). Os resultados representativos de três experiências independentes são apresentados. Todas as imagens foram obtidas com um microscópio ligado a uma câmera de cor. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6. Comportamento dos macrófagos em embriões infectados localmente ou sistemicamente com M. abscessus (A) 48 hpf Tg (mpeg1: mCherry). embriões de peixe-zebra são infectados por via intramuscular com Wasabi expressando M. abscessus R. Imagi ao vivong utilizando um microscópio confocal para visualizar recrutados macrófagos phagocytizing indivíduo micobactérias (em minutos após a infecção, MPI). Projeção intensidade máxima mostrando um intenso recrutamento de macrófagos (vermelho) ao local da injecção (microscópio confocal com água 40X APO 0,8 NA objetivo). Barra de escala: 20 mm (BC) 48 hpf Tg (mpeg1: mCherry). Embriões intravenosamente infectados com M. abscessus R expressando Tempero foram fixos e visualizados por microscopia confocal (40X) a 4 HPI (B) e 3 ppp (C). (B) de projecção máxima intensidade de macrófagos (vermelho) ou outras células mielóides, presumivelmente neutrófilos (setas), contendo micobactérias isoladas (verde) perto do local da injeção (microscópio confocal com óleo de 63X APO 1,33 NA objetivo). Barra de escala: 10 mm (C) máxima intensidade de projeção que mostra um macrófago (vermelho) incapaz de fagocitar um cordão (verde) (microscópio confocal com óleo de 63X APO 1,33 NA objetivo)..Barra de escala:. 5 m Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

O peixe-zebra emergiu recentemente como um excelente sistema modelo para o estudo dos vertebrados dinâmica da infecção bacteriana usando um campo largo e de imagem confocal em tempo real 36. A combinação de suspensões de micobactérias dispersas (protocolo 2.2), juntamente com métodos micro-injecção (protocolo 4) permite infecções sistêmicas, reprodutíveis e posterior acompanhamento e visualização da progressão da infecção com um foco especial sobre as interações bacterianas com macrófagos de acolhimento. Virulência de M. abscessus in vivo pode ser investigado, graças à utilização de peixe-zebra de tipo selvagem de ouro 37. Para estudar as interações entre M. abscessus acolher e células mielóides, várias linhas de peixes-zebra transgénicos podem ser utilizadas, tais como Tg (MPEG1: mCherry) para visualizar os macrófagos 19. Linhas repórter transgênicas adicionais, como o como Tg (mpx: GFP) 38 ou Tg (lyz: DsRed) 39 wom de neutrófilos, quer verde vermelho, respectivamente, podem também ser utilizados para tratar o papel específico destes granulócitos em resposta à infecção.

M. abscessus, e em particular a variante I, apresenta uma tendência natural para formar agregados bacterianos maciças 19, impedindo, assim, a micro-injecção reprodutível. Além disso, os aglomerados ao facto de as formas variantes R muito maiores do que a variante S opõe-se também a comparação de potencial de virulência para os fenótipos das duas variantes isogénicas. O protocolo descrito na secção 2 permite a obtenção homogênea e dispersa M. abscessus suspensões de micro-injeção em embriões. Esta preparação pode ser aplicada a qualquer outra espécie de micobactérias ou estirpes mutantes que exibem propriedades de agregação excessiva. Uma vez que o passo de sonicação pode alterar a camada mais exterior da parede celular micobacteriana, deve ser tomado cuidado para avaliar o impacto desse tratamento físico na viabilidade bacteriana e paraach nova estirpe.

Determinação de cargas bacterianas depende rotineiramente na contagem de CFU após o plaqueamento embriões lisadas em meio de agar selectivo em vários pontos de tempo após a infecção, tal como descrito no protocolo 6.1. Este procedimento inclui várias limitações: uma vez que os animais são sacrificados, cada embrião (ou grupo de embriões) pode ser usado para a determinação de um único ponto de tempo. Além disso, este método permanece impreciso devido a uma grande proporção de bactérias que são mortos e / ou perdidos durante a lise, diluições em série subsequentes, ou principalmente pela aglutinação. Contando o UFC é também uma tarefa trabalhosa. Como uma alternativa, o protocolo 6.2 descreve um método eficiente para quantificar a M. fardo abscessus que inclui passos de manuseamento limitados, com base na análise de imagens fluorescentes de embriões infectados com quantificação de pixel, tal como foi desenvolvido originalmente para M. marinum 40,41. Este método de CPE com base em análise de partículas, mostra uma boa correlação Wom as contagens UFC. Do mesmo modo, através da combinação de microscopia de fluorescência e quantificação, mudanças relativas no número de células imunitárias inatas por embrião pode ser quantificado por análise de imagem utilizando linhas transgénicas adequadas.

Embriões de peixe-zebra pode ser utilizado para avaliar o papel das células imunitárias durante a depleção de macrófagos e infecção foi encontrada para afetar adversamente a sobrevivência do hospedeiro em resposta a M. abscessus infecção. Depleção de macrófagos específica pode ser gerada de forma eficiente usando o procedimento baseado no de lipo-clodronato (protocolo 5.1) ou o processo à base de morfolino (protocolo 5.2). No entanto, uma vez que a presença de macrófagos é crucial para o estabelecimento e a manutenção do sistema vascular e para o desenvolvimento embrionário correcta, recomenda-se a ablação da produção de macrófagos na 24-lipo HPF usando clodronato.

O embrião de peixe-zebra aparece como um modelo único para estudar M. infecções abscessus eo papel da extracelularular cordões como uma estratégia de subversão do sistema imunitário. Se determinantes controlar cordões em M. abscessus podem ser identificados, que poderiam conduzir ao desenvolvimento de opções terapêuticas inovadoras. Associar a utilização do peixe-zebra em conjunto com tecnologias de alto rendimento inovadoras 42 também abre o campo para a descoberta de medicamentos e novas abordagens farmacológicas contra este patógeno resistente a medicamentos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Os autores agradecem a K. Kissa para discussões úteis e para a prestação de lipo-clodronate e L. Ramakrishnan pelo dom generoso de pTEC27 e pTEC15 que permitir a expressão de tdTomato e Wasabi, respectivamente. Este trabalho faz parte dos projetos da Agência Nacional de Investigação francesa (ZebraFlam ANR-10 MIDI-009 e DIMYVIR ANR-13-BSV3-007-01) e Sétimo Programa-Quadro da Comunidade Europeia (FP7-PEOPLE-2011-ITN) sob acordo de subvenção não. PITN-GA-2011-289209 para a Marie-Curie de Formação Inicial Rede FishForPharma. Gostaríamos também de agradecer à Associação Gregory Lemarchal e Vaincre La mucoviscidose (RF20130500835) para o financiamento CM Dupont.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BBL MGIT PANTA BD Biosciences 245114
Bovine Serum Albumin  Euromedex 04-100-811-E
Catalase from Bovine Liver  Sigma-Aldrich C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar BD Biosciences 262710
Difco Middlebrook 7H9 Broth BD Biosciences 271310
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Sigma-Aldrich A5040
Oleic Acid Sigma-Aldrich O1008
Paraformaldehyde Delta Microscopie 15710
Phenol Red Sigma-Aldrich 319244
Tween 80 Sigma-Aldrich P4780
Agar Gibco Life Technologie 30391-023
Low melting agarose Sigma-Aldrich
Instant Ocean Sea Salts  Aquarium Systems Inc
Borosilicate glass capillaries  Sutter instrument Inc BF100-78-10 1 mm O.D. X 0.78 mm I.D.
Micropipette puller device  Sutter Instrument Inc Flamming/Brown Micropipette Puller p-87
Microinjector Tritech Research  Digital microINJECTOR, MINJ-D
Tweezers Sciences Tools inc Dumont # M5S 
Microloader Tips Eppendorf

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brown-Elliott, B. A., Wallace, R. J. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria. Clinical Microbiology Reviews. 15 (4), 716-746 (2002).
  2. Aitken, M. L., Limaye, A., et al. Respiratory outbreak of Mycobacterium abscessus subspecies massiliense in a lung transplant and cystic fibrosis center. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 185 (2), 231-232 (2012).
  3. Gilljam, M., Lindblad, A., Ridell, M., Wold, A. E., Welinder-Olsson, C. Molecular epidemiology of Mycobacterium abscessus, with focus on cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1497-1504 (2007).
  4. Roux, A. -L., Catherinot, E., et al. Multicenter study of prevalence of nontuberculous mycobacteria in patients with cystic fibrosis in France. Journal of Clinical Microbiology. 47 (12), 4124-4128 (2009).
  5. Lee, M. -R., Cheng, A., et al. CNS infections caused by Mycobacterium abscessus complex: clinical features and antimicrobial susceptibilities of isolates. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (1), 222-225 (2012).
  6. Talati, N. J., Rouphael, N., Kuppalli, K., Franco-Paredes, C. Spectrum of CNS disease caused by rapidly growing mycobacteria. The Lancet Infectious Diseases. 8 (6), 390-398 (2008).
  7. Medjahed, H., Gaillard, J. -L., Reyrat, J. -M. Mycobacterium abscessus: a new player in the mycobacterial field. Trends in Microbiology. 18 (3), 117-123 (2010).
  8. Griffith, D. E., Girard, W. M., Wallace, R. J. Clinical features of pulmonary disease caused by rapidly growing mycobacteria. An analysis of 154 patients. The American Review of Respiratory Disease. 147 (5), 1271-1278 (1993).
  9. Nessar, R., Cambau, E., Reyrat, J. M., Murray, A., Gicquel, B. Mycobacterium abscessus: a new antibiotic nightmare. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 67 (4), 810-818 (2012).
  10. Sanguinetti, M., Ardito, F., et al. Fatal pulmonary infection due to multidrug-resistant Mycobacterium abscessus a patient with cystic fibrosis. Journal of Clinical Microbiology. 39 (2), 816-819 (2001).
  11. Griffith, D. E., Aksamit, T., et al. An official ATS/IDSA statement: diagnosis, treatment, and prevention of nontuberculous mycobacterial diseases. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 175 (4), 367-416 (2007).
  12. Howard, S. T., Rhoades, E., et al. Spontaneous reversion of Mycobacterium abscessus a smooth to a rough morphotype is associated with reduced expression of glycopeptidolipid and reacquisition of an invasive phenotype. Microbiology (Reading, England). 152 (Pt 6), 1581-1590 (2006).
  13. Chardi, A., Olivares, F., Byrd, T. F., Julián, E., Brambilla, C., Luquin, M. Demonstration of cord formation by rough Mycobacterium abscessus variants: implications for the clinical microbiology laboratory. Journal of Clinical Microbiology. 49 (6), 2293-2295 (2011).
  14. Byrd, T. F., Lyons, C. R. Preliminary characterization of a Mycobacterium abscessus mutant in human and murine models of infection. Infection and Immunity. 67 (9), 4700-4707 (1999).
  15. Catherinot, E., Clarissou, J., et al. Hypervariance of a rough variant of the Mycobacterium abscessus type strain. Infection and Immunity. 75 (2), 1055-1058 (2007).
  16. Catherinot, E., Roux, A. -L., et al. Acute respiratory failure involving an R variant of Mycobacterium abscessus. Journal of Clinical Microbiology. 47 (1), 271-274 (2009).
  17. Bernut, A., Le Moigne, V., Lesne, T., Lutfalla, G., Herrmann, J. -L., Kremer, L. In vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium abscessus using the embryonic zebrafish test system. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (7), 4054-4063 (2014).
  18. Oh, C. -T., Moon, C., Jeong, M. S., Kwon, S. -H., Jang, J. Drosophila melanogaster for Mycobacterium abscessus infection. Microbes and Infection / Institut Pasteur. 15 (12), 788-795 (2013).
  19. Bernut, A., Herrmann, J. -L., et al. Mycobacterium abscessus cording prevents phagocytosis and promotes abscess formation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (10), E943-E952 (2014).
  20. Dubée, V., Bernut, A., et al. β-Lactamase inhibition by avibactam in Mycobacterium abscessus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 70 (4), 1051-1058 (2015).
  21. Torraca, V., Masud, S., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Macrophage-pathogen interactions in infectious diseases: new therapeutic insights from the zebrafish host model. Disease Models Mechanisms. 7 (7), 785-797 (2014).
  22. Alibaud, L., Rombouts, Y., et al. A Mycobacterium marinum TesA mutant defective for major cell wall-associated lipids is highly attenuated in Dictyostelium discoideum and zebrafish embryos. Molecular Microbiology. 80 (4), 919-934 (2011).
  23. Clay, H., Volkman, H. E., Ramakrishnan, L. Tumor necrosis factor signaling mediates resistance to mycobacteria by inhibiting bacterial growth and macrophage death. Immunity. 29 (2), 283-294 (2008).
  24. Palha, N., Guivel-Benhassine, F., et al. Real-time whole-body visualization of Chikungunya Virus infection and host interferon response in zebrafish. PLoS pathogens. 9 (9), e1003619 (2013).
  25. Mostowy, S., Boucontet, L., et al. The zebrafish as a new model for the in vivo study of Shigella flexneri with phagocytes and bacterial autophagy. PLoS pathogens. 9 (9), e1003588 (2013).
  26. Prajsnar, T. K., Cunliffe, V. T., Foster, S. J., Renshaw, S. A. A novel vertebrate model of Staphylococcus aureus reveals phagocyte-dependent resistance of zebrafish to non-host specialized pathogens. Cellular Microbiology. 10 (11), 2312-2325 (2008).
  27. Van der Sar, A. M., Appelmelk, B. J., Vandenbroucke-Grauls, C. M. J. E., Bitter, W. A star with stripes: zebrafish as an infection model. Trends in Microbiology. 12 (10), 451-457 (2004).
  28. Vergunst, A. C., Meijer, A. H., Renshaw, S. A., O’Callaghan, D. Burkholderia cenocepacia creates an intramacrophage replication niche in zebrafish embryos, followed by bacterial dissemination and establishment of systemic infection. Infection and Immunity. 78 (4), 1495-1508 (2010).
  29. Levraud, J. -P., Disson, O., et al. Real-time observation of Listeria monocytogenes-phagocyte interactions in living zebrafish larvae. Infection and Immunity. 77 (9), 3651-3660 (2009).
  30. Meijer, A. H., Spaink, H. P. Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).
  31. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio Rerio). , (2007).
  32. Benard, E. L., van der Sar, A. M., Ellett, F., Lieschke, G. J., Spaink, H. P., Meijer, A. H. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  33. Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 83-93 (1994).
  34. Adams, K. N., Takaki, K., et al. Drug tolerance in replicating mycobacteria mediated by a macrophage-induced efflux mechanism. Cell. 145 (1), 39-53 (2011).
  35. Ramakrishnan, L. Looking within the zebrafish to understand the tuberculous granuloma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 783, 251-266 (2013).
  36. Davis, J. M., Clay, H., Lewis, J. L., Ghori, N., Herbomel, P., Ramakrishnan, L. Real-time visualization of Mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  37. Lamason, R. L., Mohideen, M. -A. P. K., et al. SLC24A5, a putative cation exchanger, affects pigmentation in zebrafish and humans. Science (New York, NY). 310 (5755), 1782-1786 (2005).
  38. Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
  39. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC developmental biology. 7, 42 (2007).
  40. Takaki, K., Davis, J. M., Winglee, K., Ramakrishnan, L. Evaluation of the pathogenesis and treatment of Mycobacterium marinum in zebrafish. Nature Protocols. 8 (6), 1114-1124 (2013).
  41. Stoop, E. J. M., Schipper, T., et al. Zebrafish embryo screen for mycobacterial genes involved in the initiation of granuloma formation reveals a newly identified ESX-1 component. Disease Models Mechanisms. 4 (4), 526-536 (2011).
  42. Carvalho, R., de Sonneville, J., et al. A high-throughput screen for tuberculosis progression. PloS One. 6 (2), e16779 (2011).

Tags

Infecção Edição 103, Peixe-zebra infecção patogenia imunidade inata macrófagos micro-injecção a microscopia de fluorescência imagens ao vivo cordões.
Decifrar e Imagem Patogênese e Cording de<em&gt; Mycobacterium abscessus</em&gt; Em embriões Zebrafish
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet,… More

Bernut, A., Dupont, C., Sahuquet, A., Herrmann, J. L., Lutfalla, G., Kremer, L. Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (103), e53130, doi:10.3791/53130 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter